前言：一篇好文章的诞生，需要你不断地搜集资料、整理思路，本站小编为你收集了丰富的凝胶色谱法主题范文，仅供参考，欢迎阅读并收藏。
Abstract:Objective To establish a method for determining high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection. Methods Quantification of high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection was determined by Sephadex G10 column chromatography with external standard method. The mobile phase consisted of 0.1 mol／L phosphate buffer(pH7.0) and supper pure water．The flow rate was 1.0 mL／min and detection wavelength 254 nm. Results The content of high molecular weight impurities in different batches of cefepime hydrochloride injection was less than 0.5％．Conclusion This method was sensitive and accurate for determining high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection.
Key words: cefepime hydrochloride; sephadex G-10; high molecular weight impurities
注射用盐酸头孢吡肟（cefepime hydrochloride）是20世纪90年代上市的第四代头孢菌素，本品抗菌谱广，药效强。实验研究表明，控制产品中高分子杂质是减少β-内酰胺类抗生素过敏反应的重要途径之一 ［1］。《中国药典》2005年版采用凝胶色谱自身对照外标法定量测定β内酰胺类抗生素中的聚合物，而盐酸头孢吡肟不能完全缔合，无法采用“自身”对照外标法定量，根据《中国药典》2005年版二部阿莫西林聚合物检验方法，可以用结构与研制产品类似，且能够完全缔合的其他药物制备对照品，进行自身对照外标法定量［2-3］。本文用与头孢吡肟结构及分子量相近的头孢噻肟作对照品，建立了测定注射用盐酸头孢吡肟中高分子杂质(头孢吡肟聚合物)的方法。
1 仪器与试药
1.1 仪器
DHLA电脑恒流泵(上海泸西分析仪器厂)，UVD6802紫外检测仪(上海金达生化仪器厂)，HW2000色谱工作站(南京色谱软件有限公司)。
1.2 试药
头孢噻肟对照品(批号130483-200102，中国药品生物制品检定所)；注射用盐酸头孢吡肟(批号060330、060731、060830，广州白云山天心药业股份有限公司)。
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸、氢氧化钠均为分析纯；水为二次重蒸馏水；葡聚糖凝胶(Sephadex)G10和蓝色葡聚糖2000为Amersham Bioscience公司产品。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为玻璃色谱柱（40 m×1.5 cm），内填Sephadex G10凝胶；流动相A为pH7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠21.85 g和磷酸二氢钠6.08 g，加水1 000 mL，调pH值为7.0)，流动相B为超纯水；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm。
2.2 系统适用性试验［4］
分别以流动相A、B为流动相，取0.1 mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液200 μL注入色谱仪，理论塔板数按蓝色葡聚糖2000峰计算分别为1 968、1 639，拖尾因子分别为1.7、1.1，在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000保留时间的比值为1.01，对照溶液主峰和供试品溶液中聚合物与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值都在0.93～1.07之间，另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液200 μL，连续进样5次，峰面积的相对标准偏差为0.35％。
2.3 标准曲线绘制
取头孢噻肟对照品约0.25 g置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分别置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别取上述溶液各200 μL，记录色谱图，以质量浓度(ρ)为横坐标， 峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，回归方程为：ρ=8.714×106A+31788(n=5，r=0.9998)。实验表明，在0.025～0.4 mg/mL质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。
2.4 精密度和稳定性试验
配制每1 mL含100 μg的头孢噻肟对照溶液，精密量取200 μL注入色谱仪，连续进样5次，计算峰面积的RSD为0.35％。将测定溶液放置1、2、4 h，分别测定峰面积，计算峰面积的RSD为0.27％。
2.5 检测灵敏度试验
取头孢噻肟对照品适量，精密称定，用水稀释制成一系列浓度的溶液，精密量取上述溶液200 μL注入色谱仪，以流动相B为流动相进行测定，记录色谱图。最小检测限(S/N＝3)为0.025 mg/mL，最小定量限(S/N＝10)为0.076 mg/mL。
2.6 重复性试验
取同一批号样品依法重复测定6次，得高分子杂质含量分别为0.09％，0.1％，0.1％，0.1％，0.1％，0.1％，RSD为4.15％。实验表明方法的重复性良好。
2.7 样品的测定
取头孢噻肟对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.2 mg的对照溶液。取供试品适量约相当于头孢吡肟0.2 g ，精密称定，置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，立即精密量取200 μL注入色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图，见图1。另精密量取对照溶液200 μL注入色谱仪，以流动相B为流动相，同法测定。按外标法以峰面积计算，含头孢吡肟聚合物以头孢吡肟计算(头孢噻肟:头孢吡肟＝1.0∶0.94)，3个批号（060330、060731、060830）的样品测定结果分别为0.3%、0.2%和0.1%。
图1 注射用盐酸头孢吡肟高分子杂质检查图谱（略）
Fig.1 Chromatograms of high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection
3 讨论
高分子杂质会随样品放置时间的延长而增加，而高分子杂质是引起β内酰胺类抗生素过敏反应的主要原因之一，故有必要对其进行检测。《中国药典》2005年版标准增强了对高分子杂质检测的要求。本方法按照《中国药典》2005年版标准要求进行研究检测，经试验结果表明，本方法灵敏、准确、简便，可用于注射用盐酸头孢吡肟的质量控制。
【参考文献】
［1］ 李哲媛，李玉凤，范兵. 阿莫西林中高分子杂质的测定与质量分析［J］. 中国现代应用药学杂志，2006，23(4)：326-327.
［2］ 霍秀敏.β内酰胺类抗菌素分子杂质的研究［J］.药品评价，2005，2(5)：324-326.
关键词溴系阻燃剂；气相色谱负化学源质谱；高效液相色谱串联质谱；乳制品；固相萃取
1引言
自20世纪70年代以来，溴系阻燃剂（BFRs）被广泛应用于各类产品中，但其在生产、使用和产品废弃过程中不断释放到周围环境中，并通过食物链富集放大，由此带来的环境污染和人群健康危害已成为热点问题[1，2＼]。多溴联苯醚（PBDEs）、四溴双酚A（TBBPA）和六溴环十二烷（HBCD）是当前产量最大及使用时间最长的3种溴系阻燃剂。在2009年《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》缔约方大会已明确将多溴联苯醚中的五溴和八溴联苯醚列为持久性有机污染物并建议禁用。TBBPA已被欧盟列入优先控制化学品名单，我国则由于TBBPA产量和消费量巨大，已成为TBBPA污染最严重的国家[3＼]。HBCD于2013年被确定为持久性有机污染物，我国目前也是HBCD的主要生产和使用[4＼]。
随着传统阻燃剂陆续禁限用，新型溴系阻燃剂（NovelBFRs，NBFRs）逐步推广。例如十溴二苯乙烷（DBDPE）作为十溴二苯醚替代品，自2005年在我国投产以来，年均增幅达80%[5＼]。其它NBFRs（如五溴甲苯（PBT））也逐渐推广。在大气、河流底泥、生物体等多基质中均已发现NBFRs残留[6＼]，甚至在青藏高原和极地地区也发现了BTBPE等NBFRs，表明部分NBFRs也具有持久性有机污染物的特征[7＼]。
乳制品是当前消费量快速增长的一大类食品，尤其是婴幼儿配方乳消费量巨大，因此乳制品中环境污染物的污染水平需持续监控。现有研究多针对PBDEs和HBCD等传统BFRs，极少涉及乳制品中NBFRs的监测[8＼]。本研究采用凝胶渗透色谱结合固相萃取技术建立乳制品中多种BFRs的同时前处理技术，并采用色谱质谱技术建立仪器分析方法，本方法稳定可靠，适用于乳制品中BFRs的多残留检测，也可用于母乳或其它富含脂肪的食品样本的检测。
2实验部分
2.1仪器与试剂
Agilent7890B5977A气相色谱质谱仪、Agilent12006410高效液相色谱三重四级杆质谱仪（美国安捷伦公司）；AccuPrepMPS全自动凝胶渗透净化系统（美国J2Scientific公司）。
农残级或色谱级正己烷、甲醇、二氯甲烷、丙酮、环己烷、乙酸乙酯（美国J&T.Baker公司或迪马公司）；硅胶（德国默克公司），使用前经500℃烘烤5h后加入98%浓H2SO4制成44%酸化硅胶；优级纯浓H2SO4（98%）、无水Na2SO4（北京化工厂）。LCSi固相萃取柱（500mg，3mL，美国Supelco公司）。PBDEs混合标准样品（BDECM）包括美国环境保护署1614草案中列出的环境中优先关注的8种PBDEs单体：BDE28，47，99，100，153，154，183和209；新型溴系阻燃剂单体，五溴甲苯（PBT）、五溴乙苯（PBEB）、六溴苯（HBB）、2，3二溴丙基2，4，6三溴苯基醚（DPTE）、1，2双（2，4，6三溴苯氧基）乙烷（BTBPE）和十溴二苯乙烷（DBDPE）；内标：3，3′，4，4′，四溴联苯醚（BDE77）和2，2′，3，3′，4，4′，六溴联苯醚（BDE128），上述标准品均购于美国AccuStandard公司。αHBCD，βHBCD，γHBCD和TBBPA及同位素内标13C12BDE209，13C12αHBCD，13C12βHBCD，13C12γHBCD和13C12TBBPA均购自美国WellingtonLaboratories公司。
2.2样品处理
提取：纯牛奶、酸奶、奶粉等奶制品或母乳样品，根据脂肪含量取3～15g（确保脂肪含量约1g），经冷冻干燥机冻干后，于研钵中研碎后置于纤维素提取套筒中，加入内标BDE77、BDE128各1ng，13C12BDE209、13C12TBBPA与13C12α，β，γHBCD各10ng，加标实验时需再加入不同浓度的待测物混合标准液，随后以正己烷/丙酮（1KG-3∶KG-51，V/V）索氏提取16h以上。
自动凝胶色谱净化：索氏提取后蒸去溶剂，以重量法计算脂肪含量，加入乙酸乙酯/环己烷（1KG-3∶KG-51，V/V）复溶至6mL。自动凝胶净化系统采用低压填充柱，填料为50gBioBeadsSX3，柱规格50cm×2cmi.d.；紫外检测器检测波长240nm；流动相为乙酸乙酯/环己烷（1KG-3∶KG-51，V/V），流速5mL/min，进样量5mL，收集20～45min流出组分并减压蒸发至近干，加2mL正己烷复溶，待下一步净化。
酸化硅胶净化：采用自制酸化硅胶净化柱，于20cm×1cm玻璃柱中自下而上依次装填1cm高无水Na2SO4，5g酸化硅胶，1cm高无水Na2SO4。酸化硅胶柱经10mL正己烷淋洗后上样，先用30mL正己烷，再用10mL二氯甲烷洗脱待测物，洗脱液旋转蒸发至近干，加2mL正己烷复溶，待固相萃取柱分离。
方法的检测限（LOD）实验以牛奶为加标基质，测定最低加标水平的响应，计算信噪比（S/N），以S/N=3和S/N=10时对应的浓度为检出限（LOD）和定量限（LOQ）。各化合物的保留时间、线性方程、相关系数（R2）、LOD和LOQ结果见表1。各待测物的标准曲线的相关系数R2为0.9989～0.9998，表明标准曲线线性良好。
3.3.2加标回收实验以经检测无待测物残留的某品牌纯牛奶为空白基质进行加标回收实验，取样量10g，加标水平如表2所示，每个加标水平按本方法平行测定5次，加标回收率及RSD列于表2。BTBPE回收率普遍偏低且RSD值较高，说明BTBPE在前处理过程中不稳定且有较高损失，其余待测物平均回收率在80.1%～114.7%之g，RSD在0.87%～14.9%之间。
3.3.3基质效应采用提取后添加法考察HPLCMS/MS分析中的基质效应，即比较两组溶液的待测物信号峰面积，其中组1为标准品溶液，组2为某空白纯牛奶样提取液中添加标准品所得溶液，则基质效应（ME）=基质溶液中待测物峰面积/纯溶剂中待测物峰面积。通过对0.1，1.0和10ng/g3个浓度水平的测定，发现乳制品测定时存在基质抑制效应，HBCD和的基质效应比TBBPA更加明显。TBBPA的ME在0.84～0.95之间，αHBCD的ME为0.71～0.93，βHBCD和γHBCD的ME比较接近，均在0.6～0.8之间。为降低基质效应的影响，除了对样品前处理方法和检测条件进行优化之外，采用稳定性核素标记物（13C12HBCD和13C12TBBPA）作为内标是必不可少的。
3.4实际样品测定
应用所建立方法检测8份市售奶制品样本以ZH（及从某妇幼保健院采集的2份母乳样本，结果见表3。在PBDEs、TBBPA和HBCD3种传统阻燃剂中，BDE28，47和99检出率较高，但BDE209污染水平较高，TBBPA和HBCD在母乳中的污染水平比乳制品要高，因为BFRs多具有生物蓄积性，因此处在食物链高端的人类体内BFRs含量普遍高于处在食物链低端的食草类动物。HBCD的3个异构体中，由于代谢速度差异和体内生物转化，导致βHBCD和γHBCD在生物体内含量普遍低于αHBCD，本研究中αHBCD检出率较高而βHBCD和γHBCD均未检出，与文献＼[13＼]结果类似。在NBFRs中，DBDPE可能由于检出限较高的关系均未检出。PBT在所有样本中均可检出，HBB，DBTE和BTBPE检出率也较高，说明随着NBFRs的迅速推广应用，食品中NBFRs的污染水平也可能随之升高，需持续关注。ZH）
3.5小结
以索氏提取、凝胶色谱和固相萃取为前处理方法，GCNCI/MS和HPLCMS/MS为仪器分析方法，建立了乳制品中18种溴系阻燃剂的检测方法，并实现了18种溴系阻燃剂的同时提取与净化。本方法稳定可靠，可用于食品及生物样品中溴系阻燃剂的多残留分析。
References
1（#FrommeH，BecherG，HilgerB，VolkelW.Int.J.Hyg.Environ.Health，2016，219（1）：1-23
2YuG，BuQ，CaoZ，DuX，XiaJ，WuM，HuangJ.Chemosphere，2016，150：479-490
3TIANYuPing，WUJianJun，WANGDongHui，LIYiRui，ZHAYueZhen.JournalofInstrumentalAnalysis，2007，26（z1）：652-653
田玉平，吴建军，王东辉，李易瑞，查月珍.HTK分析测试学报，2007，26（z1）：652-653
4LiuK，LiJ，YanS，ZhangW，LiY，HanD.Chemosphere，2016，148：8-20
5ZHANGSheng，GUXiaoYu.PlasticsAdditives，2013，6：12-15
张胜，谷晓昱.HTK塑料助剂，2013，6：12-15
6HESongJie，LIMingYuan，JINJun，WANGYing，HEChang，BUYunJie，TIANYang.ChineseJ.Anal.Chem.，2012，40（10）：1519-1523
何松洁，李明圆，金军，王英，何畅，卜云洁，田D.HTK分析化学，2012，40（10）：1519-1523
7XiaoH，ShenL，SuY，BarresiE，DejongM，HungH，LeiYD，WaniaF，ReinerEJ，SverkoE，KangSC.Environ.Pollut.，2012，161：154-161
8FrommeH，BecherG，HilgerB，VlkelW.Int.J.Hyg.Environ.Health，2016，219：1-23
9PapachlimitzouA，BarberJL，LosadaS，BersuderP，LawR.J.Chromatogr.A，2012，1219：15-28
10MontieEW，LetcherRJ，ReddyCM，MooreMJ，RubinsteinB，HahnME.Mar.Pollut.Bull.，2010，60（8）：1160-1169
关键词： 凝胶色谱法；凝胶电泳法； 血红蛋白
G633.91
DNA和蛋白质技术包括DNA的粗提取与鉴定、PCR技术和血红蛋白的提取和分离等，是开展分子生物学研究的基本技术。蛋白质是生命活动不可或缺的物质。血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中的氧气和二氧化碳的运输。
一、 血红蛋白蛋白质提取和分离的原理
血红蛋白蛋白质提取和分离的原理是根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以分离不同种类的蛋白质。
二、 血红蛋白蛋白质提取和分离技术方法有凝胶色谱法和电泳法。
凝胶色谱法是根据分子量的大小来分离蛋白质的，而电泳法是根据各种分子带电性质的差异以及分子本身形状、大小的不同来把蛋白质分离开的。
1. 凝胶色谱法
凝胶色谱法分离蛋白质的原理：在多孔球体的凝胶内，蛋白质相对分子质量的大小不同，大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子通过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。相对分子质量的不同蛋白质因此得以分离。凝胶材料是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。
2.凝胶电泳法
电泳法是带电颗粒在电场中向电荷相反的电极移动的现象。凝胶电泳法原理是：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向和阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同，因而可聚集形成不同的条带，因而达到分离的目的。影响蛋白质分子运动速度的因素中，蛋白质的电荷性质决定蛋白质运动方向，蛋白质带电荷量的多少决定电场作用力的大小，分子形状和大小形成阻力大小，蛋白质的运动速率由电荷量、分子形状和分子大小共同决定。
实验探究 蛋白质为什么带有带电荷？
蛋白质是由氨基酸组成的，还有一个羧基和一个氨基，在一定的PH下，蛋白质可解离的基因会带上电荷。
三、实验操作步骤
蛋白质的提取和操作一般分为五个阶段：材料的选择和预处理、粗分离（细胞的破碎）、提取、纯化（包括盐析，层析，有机溶剂提取，有机溶剂沉淀等）和浓缩干燥及保存。我们取哺乳动物红细胞（猪的新鲜血液）为材料，来进行血红蛋白的分离方法。
1.样品处理及粗分离
⑴ 样品前处理 包括细胞的破碎有机械方法、物理方法和化学及生物化学方法。
⑵ 细胞器的分离 从样品水溶液中提取、用有机溶剂提取、利用表面活性剂提取和对提取物进行保护。
①样品分离器材：离心机，0.9%的NaCl溶液和20mmol/L的磷酸缓冲液。
②步骤包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液和透析。采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用低速短时间离心（500r/min离心2min），然后用胶头吸管吸上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的0.9%的NaCl溶液，缓慢搅拌10min，低速短时离心，如此重复洗涤三次，直至上清液不再呈现黄色为止。将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。然后转移到离心管中，以2000r/min的速度离心10min，就可以明显看到试管中溶液分四层，从上往下数，第一层为无色透明的甲苯层，第二层为白色波层固体，是脂溶性物质沉淀层，第三层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第四层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的分层液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，静置后分出下层的红色透明液体。取1mL血红蛋白溶液装入透析袋子中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度20%mmol/L的磷酸缓冲液中（PH为7.0），透析12h即可。
⒉ 凝胶色谱操作
⑴凝胶色谱柱的制作 取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端磨平。玻璃管两端色上合适的橡皮塞，中间打孔，孔径为0.5mL插入移液管，在色V柱下端用移液管头部作出口部位，连接一细的尼龙管，用螺旋塞控制尼龙管的打开与关闭，尼龙管的另一端放入收集色谱液的收集器内。
⑵ 凝胶色谱柱的装填凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成配成凝胶悬浮液，在于下端连接的
尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，轻轻敲动色谱柱使凝胶装填均匀。并立即用20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤，使凝胶装填紧密。
⑶血红蛋白样品的加入和洗脱 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平，关闭出口。用吸管小心地将透析后的样品加到色谱柱的顶端，并打开下端出口，是样品渗入凝胶床内。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，并加入20mmol/L的磷酸缓冲液到适当的高度，连接洗脱瓶，打开下边出口，进行洗脱。待红谱柱接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，连续收集。
⒊ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
⑴原理 蛋白质在十二烷基硫酸钠（SDS）和巯基乙醇的作用下，分子中的二硫键还原，氢键等打开，形成按1.4gSDS/1g蛋白质比例的SDS-蛋白质多肽复合物，该复合物带负电，故可在聚丙烯酰胺凝胶电泳中向正极迁移，且主要由于凝胶的分子筛作用，迁移速率与蛋白质的分子量大小有关，因此可以浓缩和分离蛋白质多肽。
聚丙烯酰凝胶电泳分离蛋白质多数采用一种不连续的缓冲系统，主要分为较低浓度的成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲液，其pH值和离子强度也相应不同，故电泳时，样品中的SDS-多肽复合物沿移动的界面移动，在分离胶表面形成了一个极薄的层面，大大浓缩了样品的体积，即SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应。
⑵具体操作包括：①红细胞的洗涤 ；②色谱柱填料的处理；③凝胶色谱柱的装填；④蛋白质的分离。
关键词 超高效液相色谱；番茄酱；苏丹红染料；检测
中图分类号 O657.7+1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）09-0279-02
苏丹红染料是非生物合成的亲脂性偶氮化合物，一般不溶于水，易溶于有机溶剂，常用于汽油、机油、鞋油和汽车蜡等工业产品的着色[1]。近年来苏丹红染料被部分违法商家添加到食品表面着色以改善感官度[2]。据世界卫生组织的国际癌症研究机构（IARC）1995年确定，苏丹红属第三类致癌物质，它能够使老鼠和兔子患癌症。如果长期大剂量摄入会增加人体致癌的危险性。欧盟国家已在1995年禁止其作为食用色素，我国在《食品添加剂使用卫生标准》中也禁止将苏丹红作为食品添加剂使用[3]。在全国范围对食品中苏丹红染料进行了大规模的检测，并将其纳入了相关产品的必检指标[2]。
番茄酱是西餐中的一种重要调味品，是增色、添酸、助鲜、郁香的调味佳品。被大量用于意大利粉中，也可蘸炸鸡、炸鱼和薯条。国内对辣椒酱中苏丹红染料的检测有较多报道[2-4]，但番茄酱较少。而国内已有文献报道检测苏丹红染料残留方法均为高效液相色谱法（HPLC）[1-2，4]，但是方法普遍存在样品分析时间长、检出限高等缺点。而UPLC由于采用了1.7 μm的小粒子填充柱，柱效提高，有更好的分离效率，缩短了检测时间。超高效液相色谱快速检测苏丹红染料的方法具有简单、灵敏度高和稳定性好等特点，能够满足批量样品检测的工作要求。
1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1 番茄酱样品。来自于市场上购买的若干份各种品牌的番茄酱。
1.1.2 试剂。苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ对照品（购自Dr.Ehrenstorfer GmbH）。乙腈（德国Merck公司，色谱纯）；乙腈、丙酮、正己烷、无水硫酸钠（广州化学试剂厂，AR）；中性氧化铝（上海五四化学试剂有限公司，层析用）。
1.1.3 仪器与设备。电子天平（Precisa公司）；旋涡混合器（上海精科实业有限公司 XW-80A）；离心机（Sigma公司 3-30k）；高速匀浆机（IKA公司T-18 basic）；振荡器（IKA公司 Ks501digital）；旋转蒸发仪（瑞士BUCHI公司 Rotavapor R-210）；氮吹仪（天津恒奥 HGC-24A）；Waters超高效液相色谱仪（带紫外检测器）；规格为20 mm×150 mm的玻璃层析柱、铁架台。
1.2 试验方法
1.2.1 样品的提取。称取10 g（精确到0.01 g）番茄酱于100 mL离心管中，加入20 mL乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1，匀浆，加入5 g无水硫酸钠振荡，5 000 r/min离心5 min，上清液移入鸡心瓶，残渣用15 mL乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1重复提取1次，5 000 r/min离心5 min，合并上清液于鸡心瓶，旋转蒸发至近干。用5 mL正己烷溶解残渣，备用。
1.2.2 净化。向层析柱加入5 cm高的中性氧化铝粉，用5 mL正己烷预洗，不收集。备用液直接过柱，用10 mL丙酮∶正己烷（v/v）=5∶95洗脱，收集。50 ℃氮吹至近干，用1 mL流动相溶解定容，过0.22 μm滤膜，上机。
1.2.3 色谱条件。色谱柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（2.1 mm×50.0 mm，1.7 μm）；流动相：乙腈∶水（v/v）=88∶12，等度洗脱；流速0.3 mL/min；柱温30 ℃；进样量10 μL；检测波长为510 nm。
2 结果与分析
2.1 提取溶剂的选择
食品中苏丹红染料检测的相关报道中提取溶剂通常有乙腈和正己烷，这2种溶剂对苏丹红染料的溶解度相对较好。但正己烷提取所需的溶剂量相对较多，且对苏丹红有干扰峰，而用乙腈作为提取液时未见有干扰峰[3]。本方法通过对乙腈、正己烷、正己烷∶丙酮（v/v）=3∶1和乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1等4种提取溶剂对比，回收率都在75%以上。但在乙腈中加入一定量的丙酮有助于更好地溶解提取，回收率可达到83%以上。综合考虑，选择乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1为提取苏丹红染料的提取溶剂。
2.2 净化条件的选择
国内文献报道苏丹红染料前处理有2种方式[1，5]。一种是样品提取液未经净化就直接过滤膜上机分析。这样简化了样品前处理过程，大大缩短了样品整体检测时间。但由于番茄酱中基质比较复杂，样品经乙腈∶丙酮（v/v）=9∶1提取后存在大量的干扰物质，影响目标物质的定量。本方法采用的UPLC色谱柱只有1.7 μm，大量基质干扰物质会沉积在色谱柱进样口和柱头中，导致色谱分离能力降低，影响色谱柱寿命。另一种是使用凝胶渗透色谱（GPC）进行净化，GPC是利用多孔凝胶对样品组份按照分子体积大小进行分离的一种色谱方法。用GPC对样品进行苏丹红染料净化时，天然色素和食用油类等大分子物质先流出，随后是小分子。宋 欢等[6]就用凝胶渗透色谱法测定辣椒及其制品中苏丹红含量，净化效果好，样品洁净无杂峰干扰，仪器实现了自动化连续处理，减少了工作量。但GPC价格昂贵又需要专人维护，不易普及。
本试验分别比较了某品牌商品化的3、6、12 mL中性氧化铝固相萃取小柱及手动填充中性氧化铝粉玻璃层析柱的净化效果。通过加标回收比对，结果发现3、6 mL柱的回收率都低于40%，12 mL柱的回收率高于60%，但平行测试中结果偏差较大，用商品化的中性氧化铝不太适合于苏丹红染料的前处理净化。综合考虑，本试验采用手动填充中性氧化铝玻璃层析柱进行净化，减少了检测成本，4种苏丹红染料在3 min内完全分离出峰，测试的结果符合相关要求（图1）。
2.3 方法标准曲线、检出限及定量限
取4种苏丹红染料标准品，分别配制成质量浓度为100、200、400、600、800、1 000 μg/L的系列标准溶液。在1.2.3的色谱条件下，以峰面积为y值，标准溶液的浓度为x值进行线性回归分析，求得相关的线性方程。按本方法测定结果，以3倍信噪比（S/N）确定分析物的检出限，10倍信噪比（S/N）为定量限。回归方程、相关系数以及定量的限详见表1。
2.4 回收率与精密度
以不含4种苏丹红染料的番茄酱作为空白基质添加一定量的混合标准品，做添加回收试验，每个添加浓度重复测定6次，同时做空白试验[7-11]。结果表明，4种苏丹红染料添加回收率在83.1%～90.1%，相对标准偏差（RSD）为5.6%～7.2%（表2）。说明该方法具有较好的精密度和回收率，可以满足痕量分析要求。
3 结论
通过优化提取溶剂、样品净化等前处理建立了超高效液相色谱，同时测定番茄酱中4种苏丹红染料的残留量。本方法采用超高效液相色谱法实现了苏丹红染料残留量快速高效的分离，大大节约了试剂，并降低了有机溶剂对环境的污染，较好的灵敏度和精密度满足实际样品检测的需要，加回收率在83.1%～90.1%，相对标准偏差（RSD）为5.6%～7.2%，适用于番茄酱中苏丹红Ⅰ、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅲ和苏丹红Ⅳ染料的残留检测。
4 参考文献
[1] 吴银良，李存，刘勇军，等.高效液相色谱法快速测定鸭肉和鸭蛋中苏丹红染料[J].分析化学（FENXIHUAXUE）研究简报，2008，36（6）：843-845.
[2] 李勇竞.高效液相色谱法快速测定辣椒酱中的苏丹红[J].安徽预防医学杂志，2010，16（5）：354-356.
[3] 曹起灵，李锐，方忠意，等.超高效液相色谱法测定饲料中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的含量[J].饲料工业，2008，29（12）：61-62.
[4] 陈俊波.高效液相色谱法检测食品中苏丹红Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的研究与应用[J].安徽化工，2007，33（1）：60-61.
[5] 肖义夫，顾万江.高效液相色谱法同时测定食品中的金澄Ⅱ和苏丹红Ⅰ-Ⅳ[J].现代预防医学，2007，34（8）：1547-1549.
[6] 宋欢，连庚寅，杜丽君，等.凝胶渗透色谱-液相色谱法测定辣椒及其制品中的对位红和苏丹红[J].食品科学，2006，27（12）：611-613.
[7] 魏建华，张林田.高效液相色谱法同时测定食品成品中的对位红和苏丹红[J].中国卫生检验杂志，2007，17（9）：1608-1610.
[8] 朱永红，李根荣.高效液相色谱法同时检测调味品中的苏丹红和对位红[J].中国调味品，2006（12）：48-50.
[9] 骆和东，贾玉珠，朱宝平，等.凝胶净化液相色谱法同时检测染红食品中对位红和苏丹红染料[J].理化检验：化学分册，2006，42（2）：86-90.
关键词：HPLC法；阿昔洛韦；眼用凝胶；含量
单纯疱疹病毒性角膜炎又称单疱角膜炎，是由单纯疱疹病毒诱发的角膜感染引起的一类眼科疾病，是目前世界上危害最为严重的眼科疾病之一[1]，阿昔洛韦（aciclovior）因其选择性高、副作用小、药物耐受好且为高特异性抗单纯疱疹病毒药物，成为目前单疱角膜炎最佳治疗药物。早期眼部用药治疗多采用眼膏或滴眼剂，因使用方便、患者接受性好等特点，被广泛应用，但近期研究发现，由于滴眼剂在眼内停留时间较多，且容易被体内吸收，药物生物利用率低，重复多次应用又可能引发较多副作用[2]。凝胶型眼用制剂的出现，有效解决了上述问题。阿昔洛韦凝胶剂可有效解决单疱角膜炎治疗需反复用药、生物利用率低等问题。如何快速测定此类眼用凝胶中主成分含量，有效监测此类药物质量，成为众多药学所关注的问题。
1 材料与方法
1.1仪器与试药 岛津LC-20A型高效液相色谱仪；离心机（北京医用离心机厂）；甲醇、冰醋酸均由国药集团化学试剂有限公司提供，均为色谱醇；阿昔洛韦对照品（中国药品生物制品检定所，批号：150913-151102）；阿昔洛韦凝胶（江苏圣宝罗药业有限公司，国药准字H19991377，批号为：140911、150212、150622）。
1.2方法
1.2.1方法学验证
1.2.1.1色谱条件 色谱柱：ZorbaxExtendC18不锈钢柱（250 mm×4 mm，5 μm），流动相：水-甲醇-冰醋酸（90∶10∶0.1），检测波长：252nm，进样量10 μl，1.0 mL/min流速，柱温为室温（25℃）。
1.2.1.2溶液的制备
1.2.1.2.1供试品溶液的制备 精密称取0.3 g阿昔洛韦凝胶，加入流动相25 ml稀释，充分混匀后，于3000 r/min，离心5 min，取上清液，0.2 um微孔滤膜过滤，取续滤液做供试液。
1.2.1.2.2对照溶液的制备 精密量取阿昔洛韦对照品15 mg，置于100 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。
1.2.1.3系统适用性试验
1.2.1.3.1空白对照结果 试验中的空白溶剂选择为流动相，取流动相适量，除不加样品外其余操作同“1.2.1.2.1”制备空白对照，取10 ul进液相252 nm扫描，未见任何杂质峰，对测定不会造成影响，可考虑作为空白溶剂。
1.2.1.3.2精密度试验 精密量取20 μL对照品溶液，重复进样6次，分别测定峰面积，并计算其相对标准偏差RSD=1.2%（
1.2.1.3.3重复性试验 精密称取同批号阿昔洛韦凝胶6份，根据供试品“1.2.1.2.1”项操作制备溶液，取10 μL溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，可得到6份供试品溶液的相对标准偏差RSD=0.9%（
1.2.1.3.4稳定性试验 取供试品溶液与对照品溶液，分别在0 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h精密量取10 μL注入液相色谱仪，进样测定，对照品溶液峰面积的RSD为1.16%（
1.2.1.3.5回收率考察 分别精密称取约10 mg同一批次的阿昔洛韦凝胶，保存至3个锥形瓶内，依次加阿昔洛韦对照品2.23 mg、5.17和10.31 mg，根据制作“1.2.1.2.1”项步骤，取续滤液10 ul进针，对峰面积进行测定，分别计算回收率为101.23%、101.18%和99.79%，平均回收率为100.67%，RSD为1.32%，与药典标准相符。
1.2.1.4线性关系考察 精密称取阿昔洛韦对照品13.4 mg置于100 ml量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取0.05 ml、0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.80 ml、1 ml、2 ml、5 ml、6 ml置于10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得系列标准溶液，分别取10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，并以峰面积对其浓度进行线性回归，得线性方程为：Y=633417X-52341，（r=0.9996），结果表明，阿昔洛韦浓度在0.12～1.44 ug/mL范围内与峰面积线性关系良好。
1.2.2样品中阿昔洛韦含量测定 在同一色谱条件下分别测定阿昔洛韦对照品溶液与3批阿昔洛韦凝胶供试品溶液（取供试品0.2 g），采用峰面积归一化法和自身对照法（不加校正因子），对供试品内含有的阿昔洛韦含量进行测定。
2 结果
结果显示，通过上述色谱条件测定阿昔洛韦凝胶中阿昔洛韦含量，与标识量比较结果显示，三个批次的样本含量分别为101.23%、100.49%、100.37%，RSD
3 讨论
阿昔洛韦（C8H11N5O3）属嘌呤类抗病毒药物[3]，本文首先通过对其进行全波段扫描，确定252 nm作为其检测波长，因此时吸收最大；前期试验及文献调查显示，凝胶中存在大分子物质，可能导致色谱柱堵塞，进而影响测定，经试验分析在酸性流动相处理后，对应高聚物配合离心可有效去除，故考虑先对样品稀释后离心，排除干扰；在色谱条件选择上，本文参考了早期[4]的文献报道，结合本实验室条件优选所得。
经方法学考察可知，本次实验所选方法准确性高、精密度好、重现性和相关性均符合相关要求，且比较自身对照法和面积归一化法，发现两组结果基本一致，提示二者均可用于其含量计算。
参考文献：
[1]胡汉昆，吴东方，刘薇芝.高效液相色谱法测定阿昔洛韦眼凝胶中阿昔洛韦的含量[J].HeraldofMedicine，2010，29（12）：1644-1645.
[2]谢爱丽，王维.HPLC法测定阿昔洛韦乳膏（Ⅱ）中阿昔洛韦的含量[J].海峡药学，2013，25（4）：41-42.
关键词：气相色谱;气质联用;农药残留分析
目前,农药残留分析方法很多,其中以色谱技术为主。常见色谱方法有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法、液相色谱-质谱联用法,新兴色谱技术如免疫亲合色谱法、凝胶渗透色谱法等。气相色谱-质谱联用(GC-MS)既具有气相色谱高分离效能,又具有质谱准确鉴定化合物结构的特点[1],可同时、准确、快速测定微量的多种农药残留。
1农药残留的现状及危害
20世纪50年代以来,化学合成农药在全世界的广泛应用,无疑在防治病虫害、铲除杂草、增加农业产量方面发挥了举足轻重的作用,对人类社会进步和生产力发展起到了巨大的促进和推动作用。但是农药是一类有毒化学物质,而且是人们主动投放到环境中的[2],长期大量使用,对环境生物安全和人体健康产生了较大的不利影响。近年来因农药污染造成人和牲畜中毒的事件屡见报道,特别是蔬菜、水果类食品的中毒。目前,农药已成为世界上主要的污染源之一,田间喷洒的农药只有10%～30%粘附在作物上,其他大部分通过各种方式散播出去,污染大气、土壤和水等[3]。
2农药残留分析技术
农药残留分析是对复杂混合物中痕量农药的母体化合物、有毒代谢物、降解产物和农药杂质进行的分析,是一种需要精细的微量操作手段和高灵敏度的痕量检测技术[2]。随着人们对食品、环境安全的日益关注以及新的、更高要求的农药残留限量标准的出台,农药残留分析技术发展迅速。现代农药残留分析技术通常包括样品前处理和测定两部分。
2.1样品前处理技术
目前,已报道或已取得广泛应用的新技术主要有:固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、超临界流体提取(SFE)、加速溶剂萃取(ASE)、微波辅助萃取(MAE)等[4]。
2.1.1固相萃取(SPE)。固相萃取是液固萃取和液相色谱柱技术相结合的发展,其基本原理是利用固体吸附剂对液体样品中目标化合物或杂质的吸附,选用合适强度的洗脱溶剂,使目标化合物选择性地洗脱或保留在柱上,与样品基体和干扰物分离,从而达到分离和富集的目的。固相萃取节省时间,可减少杂质引入,对操作者安全,重现性好,同时对农药残留物能够快速富集。
2.1.2固相微萃取(SPME)。固相微萃取是一种新型的无溶剂化样品前处理技术,由Pawliszyn在1989年首次报道。固相微萃取以特定的固体(一般为纤维状萃取材料)作为固相提取器将其浸入样品溶液或顶空提取,然后直接进行GC、HPLC等分析[5]。该技术集采样、萃取、浓缩、进样于一体,灵敏度高、成本低、所需样品量少,重现性及线性好,操作简单、方便快捷。它通过吸附/脱吸附技术,富集样品中的挥发性和半挥发性成分,克服了一些传统样品处理技术的缺点,已经广泛应用于水、食品、环境以及生物样品分析。SPME技术在食品分析中的应用很广泛,如酒、果汁、蔬菜、肉、蛋等。还用于食品中其他一些有害残留组分的分析上,如牛奶中的磺胺类和四环素类抗生素残留;熏制火腿中的致癌物N-亚硝胺;谷物中丙烯酞胺残留以及人乳中多氯联苯及其他含氯有机化合物的分析等[6]。
2.1.3超临界流体提取(SFE)。超临界流体(SCF)是临界温度(Tc)和临界压力(Pc)状态下的高密度流体。超临界流体既具有液体对溶质有较大溶解度,又具有气体易于扩散和运动的特点。由于超临界流体的粘度、密度、扩散系数、溶剂化能力等性质随温度和压力变化很大[7],因此对选择性的分离非常敏感。早在1879年,Hannay等就发现超临界乙醇流体对无机盐固体具有显著的溶解能力,但超临界萃取技术(SFE)却是在近30年才迅速发展起来的一种新型物质分离、精致技术[8]。付玉杰等[9]用SCF-CO2技术萃取甘草中甘草次酸,并与索氏提取法、超声法进行了比较,提取率是索氏提取法的13倍、超声法的5倍,且溶剂用量小,周期短。目前,SFE已应用于植物样品、动物组织、土壤、水等样品中多种杀虫剂、杀菌剂和除草剂的萃取。
2.1.4凝胶渗透色谱(GPC)。凝胶渗透色谱是一种快速净化技术,它是基于体积排阻的分离机理,通过具有分子筛性质的固定相,用来分离相对分子质量较小的物质,并且可以分析不同分子体积、具有相同化学性质的高分子同系物。GPC现已广泛应用于农药残留分析中脂类提取物与农药的分离,是含脂类食物样品农药残留分析的主要净化手段[10]。陆继伟等[11]经冰浴超声提取,GPC净化,测定了灵芝中24种有机磷农药的残留量,回收率在75.28%~117.18%,RSD在3.19%~15.57%,效果较好。
2.1.5加速溶剂萃取(ASE)。加速溶剂萃取是在提高温度(50～200℃)和压力(1 000~3 000Pa)下用溶剂萃取固体或半固体样品的新型样品前处理方法。相比于其他萃取方法,ASE法具有快速、溶剂用量少、萃取效率高、安全等优点[12],已被美国EPA收录为处理固体样品的标准方法之一。ASE现已在环境、药物、食品等领域得到广泛应用,特别是在残留检测方面,被用于土壤、动植物组织、蔬菜和水果等样品中的PCB、多环芳烃、有机磷杀虫剂、苯氧基除草剂等有害物质的萃取。
2.1.6微波辅助萃取(MAE)。微波辅助萃取是微波和传统的溶剂萃取法相结合后形成的一种新萃取方法。它是利用微波能来提高萃取速率的一种最新发展起来的技术。微波萃取具有设备简单、萃取效率高、重现性好、快速、节省试剂、污染小等优点,有较大的推广价值。Onuska等[13]用多种溶剂从泥渣中微波提取有机氯农药残留,实验仅用3.5min就获取了索氏萃取法6h的结果。Lopez-Avila等[14]以乙烷-丙酮(体积比为1∶1)为溶剂,在115℃下从土壤中提取有机物,萃取15min,45种有机氯农药中的38种回收率在80%~120%,并证明用微波萃取法所得的有机氯农药的回收率比索氏萃取或超声波萃取法至少提高7%。
2.2GC及GC-MS在样品测定中的应用
>> 铜仁市碧江区珍珠花生中10种农药残留测定 甘薯中5种有机磷农药残留的快速测定方法 直接提取法检测有机氯农药残留方法探寻 大米中7种有机磷农药的残留分析方法研究 气相色谱法测定土豆中8种有机氯农药残留 我国土壤中残留有机氯农药的研究 蔬菜和水果中有机氯类，拟除虫菊酯类农药多残留检测方法 GC法测定30种黔产中药材中11种有机氯农药残留 气相色谱法测定草莓中9种有机磷农药残留方法研究 探究有机磷残留农药在蔬菜中的检测方法 土壤中有机氯农药分析方法研究 徐州养牛带生鲜奶中有机氯农药残留水平研究 基于QuEChERS净化―气相色谱法检测蔬菜中16种有机磷农药残留 蔬菜中有机磷类和氨基甲酸酯类农药残留的检测方法研究 气相色谱―电子捕获检测器测定黄瓜中多种有机氯农药和除草剂残留 基质分散固相萃取―气相色谱法测定茶叶中13种有机氯和拟除虫菊酯类农药残留 蔬菜中有机磷农药残留的快速检测方法分析 果蔬中有机磷农药残留检测方法 产妇体内有机氯农药残留对血中4种生殖激素水平的影响 传感器技术在有机磷农药残留检测中的应用 常见问题解答 当前所在位置：l.
[2] 农业标准出版研究中心.蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基甲酸酯类农药多残留的测定：NYT 761-2008[S].北京：中国农业出版社，2010.
[3] 岳永德，朱鲁生.农药残留分析[M].北京：中国农业出版社，2004.
【摘要】 目的从玉郎伞(YLS)中分离出玉郎伞多糖，并对其化学组成进行研究。方法YLS经醇提后的药渣用热水提取，乙醇沉淀，Sevag试剂脱蛋白，采用DEAE纤维素（DEAE52）柱层析分离纯化，气相色谱和薄层色谱分析其组成。结果分离得到的YLS多糖经Sephadex75凝胶柱层析，硫酸-苯酚法以及高效凝胶渗透色谱法(HPGPC) 证实为单一多糖，紫外扫描显示无核酸和蛋白特征吸收峰，薄层色谱和气相色谱表明由葡萄糖和阿拉伯糖组成。结论YLS多糖首次从YLS中提取获得，为YLS主要成分之一。
【关键词】 玉郎伞 多糖 分离纯化 组成玉郎伞（YLS）
原植物经考证为蝶形花科植物疏叶崖豆Millettia pulchra Kurzvarlaxior (Dunn) Z. Wei的块根。民间常用于高血压病、跌打损伤和风湿病的治疗，也用于治疗智力减退、消化不良、营养不良和病后虚弱等。药理实验表明，YLS多糖能明显延长小鼠游泳时间、耐缺氧时间及耐高温时间，显著提高小鼠血清SOD、GSHPx活性及减少MDA含量，具有较好的抗衰老作用［1］。本实验对YLS多糖作了分离纯化并对其组成性质进行研究。现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 材料与试剂玉郎伞饮片，购于南宁医药公司；D木糖，生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司，批号011130；L（＋）－鼠李糖，生化试剂，北京化学试剂公司，批号011204；阿拉伯糖，生化试剂，武汉生命技术有限公司，批号030625；葡萄糖，分析纯，上海伯奥生物科技有限公司，批号030305；D（＋）半乳糖，生化试剂，sigma ，批号 B002211。DEAECellulose52， whatman 批号010410；Sephadex G75， pharmacia， 批号：279867；胰蛋白酶，美国sigma，批号030409。用于气相色谱分析的试剂均为色谱纯，其余试剂为分析纯。
1.2 仪器1525 WATERS高效液相色谱仪，美国 WATERS公司；4890D气相色谱仪，美国Agilent公司；TU1800SpC紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。
2 方法
2.1 粗多糖的提取 玉郎伞饮片粉碎后，加70%乙醇回流提取除去脂溶性杂质，药渣加蒸馏水煮3次，3 h/次，合并滤液，离心分离，浓缩至适当体积，加入5倍量95%乙醇，醇析24 h，过滤，依次用95%乙醇、丙酮洗涤多次，沉淀物加蒸馏水溶解，加入适量胰蛋白酶，摇匀，37 ℃水浴保温12 h，采用Sevage法除去蛋白［2］，药渣用蒸馏水溶解，透析48 h，除去小分子杂质及色素，透析后浓缩至适当体积，加5倍无水乙醇，醇析8 h，收集沉淀物，真空干燥得YLS粗多糖。
2.2 多糖纯化 YLS粗多糖适量，加蒸馏水溶解，上已处理好的DEAE52纤维素（OH，400 mm×26 mm）柱层析，用蒸馏水洗脱，流速1 ml·min-1，分部收集，每管5 ml，用硫酸苯酚法显色［3，4］，收集合并含糖洗脱液，用旋转蒸发仪蒸干洗脱液，得白色YLS多糖。
2.3 多糖的纯度鉴定
紫外光谱：取上述分离纯化后的多糖，配成0.1%水溶液，在TU1800SpC紫外可见分光光度计对200～400 nm区间扫描。
凝胶柱层析：YLS多糖经Sephadex G75柱层析，蒸馏水洗脱，流速0.1 ml/min，每管1 ml分部收集，苯酚硫酸显色，以管号为横坐标，光密度为纵坐标，根据分部收集中出现的峰数和形状断定多糖的纯度。
高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)［5］：美国Waters高效液相色谱仪，2410示差折光检测器（附加GPC软件）。色谱柱为日本TOSOH公司TSKgel G3000 pWxl凝胶色谱柱(300 mm×7.8 mm)，流动相为0.7%硫酸钠水溶液，流速0.6 ml·min-1，柱温35 ℃，进样量20 μl。
2.4 多糖的组成分析
薄层色谱分析［6，7］： 将60 mgYLS多糖加入8 ml 2 mol·l-1的硫酸中，加入N2除O2封管，105 ℃烘箱中水解8 h，水解液用饱和Ba(OH)2溶液中和，离心去除BaSO4沉淀，上清液减压浓缩至干，得多糖水解物备用。取1%的多糖水解物于高效硅胶G薄层板（10 cm×20 cm）上点样，以标准单糖为对照。
展开系统：醋酸乙酯∶异丙醇∶乙酸∶水＝11∶4∶4∶1（V/V）
显色：10%硫酸乙醇溶液，喷雾后于105 ℃加热10 min。
气相色谱分析［4，6，8］：取上述水解多糖30 mg按下列步骤进行，加入30 mg盐酸羟胺和1.0 ml吡啶于90 ℃恒温水浴中振荡，加热反应30 min，取出冷却至室温，加入1.0 ml醋酸酐，于90 ℃恒温水浴中乙酰化30 min，生成具有挥发性的糖腈乙酸酯衍生物。反应产物用旋转蒸发仪蒸干，残渣用2 ml氯仿溶解，取样，进行气相色谱分析，以标准单糖衍生物为对照。
色谱条件：Hp Agilent 4890D气相色谱仪。色谱柱为石英毛细管柱Hp5（0.53 mmid×15 m）；FID检测器（氢火焰）；柱室温度200 ℃；气化温度270 ℃；燃气H2，0.22 MPa；载气N2，0.19 MPa，空气助燃0.30 MPa；进样量1 μl；程序升温，开始时，150 ℃保持1 min，接着以5 ℃·min-1升至200 ℃，并于200 ℃保持10 min。
3 结果
分离纯化得到的YLS多糖呈白色粉沫，易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂。
3.1 紫外光谱分析YLS多糖在250～280 nm之间无吸收，说明其中无蛋白质、氨基酸及核酸(见图1)。
3.2 凝胶柱层析洗脱曲线为单一洗脱峰，表明所得多糖纯度较高(见图2)。
3.3 HPGPC测定结果 在图谱中只有单一峰，证明纯度较高（见图3）。
3.4 薄层色谱分析见图4。在薄层板上从左至右依次为木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖和YLS多糖水解样品（有两个斑点，分别表示为YLS R1和YLS R2）。结果表明，玉郎伞多糖主要由葡萄糖和阿位伯糖组成（各糖Rf值见表1）。表1 YLS多糖水解物和标准单糖的Rf
3.5 气相色谱分析 YLS多糖水解物在气相色谱上出现两个峰，其保留时间分别为9.456 min和14.980 min，与阿拉伯糖和葡萄糖的保留时间一致(见图5～6)，说明YLS多糖是由阿拉伯糖葡萄糖两种糖组成，与薄层色谱的结果相符，其百分组成（面积归一化法）见表2。表2 YLS多糖成分单糖百分组成
4 讨论
本实验利用较为常规的方法提取YLS多糖，经DEAE52和Sephadex G75分离纯化，紫外、凝胶柱层析、气相色谱分析，证明所得多糖纯度较高，并首次证实YLS多糖是由葡萄糖和阿拉伯糖组成。YLS中多糖含量多，作用广泛，具有较高的研究和开发价值。
【参考文献】
［1］ 黄忠仕，黄仁彬，林 兴，等. 龙眼参粗多糖抗衰老作用的实验研究［J］. 中华现代中西医杂志，2004，2（2）:97.
［2］ 张国升，樊明月，张佳美，等. 芦根多糖的提取及含量测定［J］. 安徽中医学院学报，2002，21(1):51.
［3］ 贡济宇，于 波，于 澎，等. 酚硫酸法测定灵芝多糖含量的实验研究［J］. 长春中医学院学报，2002，18（1）:45.
［4］ 程荷凤，蔡 春，李小凤. 化橘红多糖的分离纯化及其组成的气相色谱分析［J］. 广东医学院学报，1998，16（1）:15.
［5］ 吕志华，于广利，赵 峡，等. 不同标准品对HpGpC法测定多糖相对分子质量的影响［J］. 中国新药杂志，2002， 11（3）:220.
［6］ 程 霜，冯泽静. 冬瓜多糖的分离与鉴定［J］. 粮油加工与食品机械，2002，9：44.
关键词：气相色谱法；中药；应用；定性鉴别
气相色谱是一种非常成熟的分析化学的分支，俄国植物学家茨维特1903年发现色谱，接着马丁和辛格1941年提出分配色谱的概念，然后1952年又发明了气-液色谱。而我国在1956年就对气相色谱做了很多的研究，并且广泛应用在化工、石油、药物等方面。随着科技的不断发展，气相色谱也有了很大的发展，并且其应用范围不断扩大。在我国，中药的质量研究是中药研究和应用的重难点，发现中药中发挥药效的物质、有毒的物质、药效发挥的机理，然后控制中药的质量，可以有效的确保重要的安全和药效。中药成分的化学结构复杂多样，同时由于中药的产地、品种、收获期、加工和制剂的生产工艺不同可能会导致中药的质量发生变化。为了能够保证中药的安全和药效，需要一种分析方法能够直观、可靠、简单的体现出中药药效发挥作用的方法以控制中药的质量。所以气相色谱可以应用于中药的定性分析、定量分析、中药杂质成分分析和有毒成分分析等方面。
1 气相色谱法应用于中药的定性鉴别
控制中药质量的首要办法就是鉴别中药的品种和真伪。如果严格控制原料和工艺条件就可以保证中药制剂成分组成的稳定。气相色谱可以对具有挥发性和热稳定性的物质进行分离和分析，所以气相色谱和质谱联合使用时就适合研究中药中挥发性成分的指纹图谱。苏薇薇等研究了乌鸡白凤丸的气相色谱指纹特征，认为这种方法可以对乌鸡白凤丸的真伪进行鉴别。冯毅凡等应用气相色谱分析了华佗再造丸和主要药味的指纹图谱，根据指纹图谱可以得到各个成分的含量，然后评价华佗再造丸的优劣。欧阳臻等应用气相色谱-质谱联用技术对不同产地的17个茅苍术样品进行了分析，对茅苍术挥发油的指纹图谱进行研究，对结果进行计算以后，发现不同产地的茅苍术和道地产地的比较有很大的差异，为鉴别与评价茅苍术的质量以及区别真品和伪品提供了一定的参考依据。气相色谱-质谱联用技术也能对复杂的糖类物质进行定性分析，并且具备很大的优势。在研究白术多糖时，梁中焕分析了白术水溶性多糖（AMP），显示单糖由Glc、Gal、Rha、Man组成，其组成比例为7.36：1.00：3.05：1.52，AMP甲基化后，水解还原乙酰化后得到甲基化糖醇乙酸酯，在进行气相色谱-质谱联用分析，得出AMP中糖的连接方式和每种连接键的比例。廖远熹等应用静态顶空-毛细管气相色谱法检测6种不同产地柴胡的挥发性成分，然后联合应用检索和保留指数的方法定性分析检出的挥发性成分，得出的结论是6种柴胡定性相对含量大于0.2%的挥发性成分有60个，在这些挥发性成分中脂肪醛类物质占25%～44%，比重最大。
2 气相色谱法应用于中药的定量分析
一般的中药含量检测主要是测定已经知道的成分或者指标性成分，测定的成分个数很少，只有一两个主要成分。逐渐提高的中药质量标准和不断发展的质量控制技术使测定成分的种类也在增多，特别是中药复方，一般都要求对很多成分进行测定。气相色谱的分离能力很强，所以经常用于测定中药中的挥发性成分，例如芳香醇，同时气相色谱也可以测定中药中发生衍生化反映的其它成分，例如生物碱。2005年版一部的《中国药典》应用气相色谱测定的中药成分的含量有47项，2010年版一部的《中国药典》增加到了75相。刘宇等建立的应用气相色谱对檀香通胶囊中冰片和薄荷脑两种组分含量进行测定，然后严格控制檀香通胶囊的质量。刘云召等应用在应用水蒸气蒸馏法对糙叶败酱植物的三个不同位置的挥发油分别提取以后，在应用气相色谱-质谱联用技术对其化学成分进行分析和鉴定，在对结果进行分析以后的得出糙叶败酱的根、根茎、茎、叶中的挥发性成分无论是在化学组成还是在成分含量上都存在着一定的差异。
3 气相色谱法应用于检测中药的杂质成分和毒性成分
杂质指的是在制备和贮存药物的过程中，由于药物本身的性质和和合成方法很有可能产生一定的杂质，一般指的是有机杂质，主要包括残留溶剂和手性化合物中没有特殊毒性的对映体。他们的来源主要是最初的原料和本身具有的杂质、生产过程中发生反应时的中间产物以及发生副反应的产物、中药成品在贮存过程中降解产物等。如果中药产品中含有杂质灰度中药的药性和稳定性产生影响，甚至会危害人的健康。因此检测中药的质量、控制中药的纯度可以有效的保证中药产品的安全有效。国际人用药品注册和医药技术协会准则要求药物中的杂质不得超过0.1%，而毒性药物的要求更高，如果药物中杂质高于这个水平就要应用选择性好的办法对其进行定量分析，特别是对于高于0.1%的杂质要对其毒性进行研究。
郭万周等应用毛细管气相色谱对南阳道地药材唐半夏的有机农药残留进行测定，结果表明这种方法非常简，分离很高效，分析很迅速，有很高的的灵敏度，可以广泛应用于分析有机氯农药方面。
虽然气相色谱可以对物质进行分离，可以将主要成分对微量成分的干扰排除，可是这种方法对样品提出了可以气化的要求，因此样品的挥发性是限制方法使用的一个重要因素。根据有关统计显示在将近300万个有机化合物中，能够和字节应用气相色谱进行分析的只有20%。所以气相色谱的应用有一定的限制。
综上所述，气相色谱方法的应用有一定的限制，可是近期出现了很多新的领域，使其发展方向为灵敏度更高、选择性更强、更加简捷。气相色谱在中药的质量研究中发挥的作用越来越大，它的不断发展必将促进中药质量的研究水平和控制水平，就能建立一个全面有效的现代中药质量监控体系，使中药的发展和国际化有一定的技术基础。
参考文献
[1]谌英武，朱卫华，赖少友.气相色谱键合固定相的制备及其应用[J].武汉化工学院学报，2000，22（3）：8-10.
[2]欧阳臻，杨凌，宿树兰，等.茅苍术挥发油的气相色谱-质谱指纹图谱研究[J].药学学报，2007，42（9）：968-972.
[3]梁中焕，郭志欣，张丽萍.白术水溶性多糖的结构特征[J].分子科学学报，2007，23（3）：185-188.
[4]廖远熹，王昊阳，郭寅龙，等.中药柴胡挥发性成分的静态顶空-气相色谱-质谱分析[J].质谱学报，2005，26（3）：187-192.
[5]庄婉娥，弓振斌，叶江雷，等.凝胶渗透色谱净化-气相色谱-质谱法同时测定金银花中33种农药残留组分[J].分析化学，2010，38（6）：811-816.
[6]卢敏，胡振波，王颖峰，等.气相色谱法测定小金胶囊中麝香酮的含量[J].医药导报，2012，31（1）：75-76.