坚定的锡兵精选(九篇)

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第1篇：坚定的锡兵范文

刘某于2006年经老乡介绍来到了山西省某县的一家煤矿公司当了一名井下工人。虽说下井又累又危险，但每个月四五千的工资，干别的是不可能挣到的，刘某也没啥技术，他就想趁着还有把子力气，多攒点钱供孩子上学。2011年12月的一天晚上，正在井下的工作面打锚杆时，刘某的衣服不慎绞在了钻杆上，还没等他反应过来，锚头已经重重打到了胸脯上。刘某当时就觉得胸疼得厉害，井下的班长赶紧让其他人扶着他升井，然后送到了就近的煤矿医院。经诊断，刘某右侧第八肋软骨骨折。当时公司支付了住院期间的医疗费，刘某听别人说还应该有别的赔偿，但他还想继续在公司上班，因此没有向公司提出赔偿。刘某继续上班后，胸部一直疼的厉害，自己买了止疼药也没管用，他觉得奇怪，按照医生的说法，他现在恢复的还不错，应该不至于这么疼了，刘某有点担心，就自己来到了医院又做了次检查，诊断结果为：肺大泡、肺气肿。医生一看检查结果，就问他是干什么的，得知刘某一直在井下工作，医生就说该病很可能是因为长期在井下吸入有害气体所致，如果再发展下去那就是矽肺病了。原本以为下井工作就是累点脏点，有危险也是瓦斯爆炸、塌方和透水等事故，没想到还有矽肺病。医生说这个病很严重，如果不及时治疗会有生命危险。回到公司后，刘某就去找公司领导，提出给自己治疗，却遭到了领导的拒绝。无奈之下，刘某在工友的指点下，来到了农民工工作站求助。

律师了解情况后，告诉刘某，他肋骨受伤和肺部的职业病都属于工伤，但由于伤害的性质不一样，所以需要分别处理。律师首先整理好相关材料后向社会保障局提出了工伤认定，要求认定刘某肋骨骨折为工伤；至于职业病的工伤认定，需要先经过职业病诊断才行。由于刘某当时肋骨受伤有很多工人在场，公司为他支付了医疗费，对受伤的事实也不否认，因此刘某肋骨骨折的工伤认定很快就做出了。拿到工伤认定书后，刘某却一点也高兴不起来，因为此时他的肋骨骨折已经基本痊愈，但肺部的毛病却越来越严重，而此时他还不知道自己该去哪里做职业病诊断。律师四处打听后，得知山西省职业病医院可以做职业病诊断，律师就帮助刘某将材料递交给了医院，但医院检查后认为刘某缺少有关劳动关系、工种、工作岗位等单位证明，因此拒绝为其作职业病诊断。律师提出，刘某肋骨骨折已经确认了工伤，工伤证上也表明了他的工作单位，劳动关系已经认定，为什么不能做职业病诊断？但医院方面认为，除了确认目前的劳动关系外，用人单位必须要出具工种、工作时间等具体工作资料。刘某很失望，这些东西自己哪能拿的来啊？律师考虑后，提出一方面让他继续就肋骨骨折申请劳动能力鉴定；另一方面，则向劳动仲裁委提出申请，要求确认他与公司的劳动关系、工种、工作岗位及时间。很快，刘某肋骨骨折经鉴定为九级伤残，而仲裁委经审理后也做出了裁决书：确认了刘某与公司存在劳动关系，并对其工作岗位和工作时间也做出了认定。收到仲裁裁决书后，律师整理了材料再次递交给了职业病医院。医院做出了职业病诊断，确认刘某为煤工尘肺一期。根据这一诊断证明，社会保障局做出了工伤认定，确认刘某所患的职业病为工伤。原本以为没办法的事，在律师的帮助下柳暗花明竟然拿到了工伤证。刘某这下有信心了，在律师的帮助下讨要自己应得的赔偿。

律师提醒：职业病是工伤的一种情形，但申请工伤认定前，必须先经过有资质的医疗机构进行职业病诊断，而职业病诊断需要劳动关系、工作岗位、工作时间等资料。农民工朋友若认为自己可能患职业病，就要先收集相关证据，尤其是确认劳动关系的证据。

摘自《农民工法律援助中心》

第2篇：坚定的锡兵范文

关键词：专业性 科学性 严谨性

随着人们生活水平的提升，越来越多的社会群众开始关注医疗事业的发展情况，但从数据上来说，医疗纠纷发生频率有逐年上升趋势，其中涉及到病患死亡的医疗纠纷的社会影响比过去更加强烈。法医病理鉴定能够快速、直接地查明病患死亡原因，明确医疗纠纷中双方责任的同时提供最有力的科学证据，对解决医疗纠纷具有重要意义。

一、法医病理学鉴定内容

首先，通过法医病理学鉴定，对病患死亡原因进行确认。通过科学化的鉴定方法，将病患体内多处损伤、多种外伤进行分类，从而对致死伤进行精确定位。

其次，对致死的伤患部位确定后，就可以进一步对死亡原因进行病理学上分析，进而明确死亡原因。将死亡原因和死亡机制分析清楚，对接下来的医患事故原因分析和医疗纠纷责任归咎提供一定的信息支持。

此外，医疗纠纷一旦需要进行司法鉴定，简单的死亡原因确认和医患事故原因分析是远不能解决纠纷的根本问题的。而法医病理学方面的鉴定可以将医疗过程中的某些具体细节进行确认，对医患事故产生的原因进行细致分析，判断医疗单位是否存在过失、过失有多少，还是病患接受治疗时间太晚而错失治疗时机等。

二、法医病理学鉴定的优势

（一）比一般医学鉴定在程序上更具优势。一般的医疗纠纷发展到后期阶段都会上升到民事诉讼阶段，而相应的民事诉讼中有时会有司法鉴定请求，这种时候由一般的医学鉴定机构进行尸检在程序上不具合法性，在结果上不具权威性，而专业的法医病理学鉴定能够直接参与到民事诉讼中的司法鉴定程序中，其程序上具备合理性，并且法医尸检的程序比一般医学鉴定程序严格、内容也更加全面，因此其鉴定结果更具专业性。

（二）比一般医学鉴定的结果更具针对性且更加准确。法医鉴定人员都进行过专业的病理学学习，并且法医鉴定人员学习的医学鉴定技术更具专业指向，是专门为司法鉴定进行证据服务的鉴定。且法医比一般医科人员接触尸体的时间更多，因此比一般医科人员更加了解尸体的一些特征、特性和变化规律，因此尸检结果更具准确性。

（三）比一般医学鉴定更加严格。这里的严格指的是人员上的严格和结果上的责任概念。法医鉴定人员是专职人员，法医人员接受过专业化培训，具备更高的职业素质，并且专门的管理部门，只在有法医鉴定需求时参与尸体鉴定。因此不容易受到社会势力或是舆论方面的干扰，并且鉴定条件要求、流程要求更加严格，从而能够对尸体鉴定结果做到负责。

三、法医病理学鉴定的重要性

（一）解决医疗纠纷的要求

很多医疗纠纷由一般医学鉴定组织来进行尸体鉴定的相关操作，其结果很难达到“服众”的效果，反而可能使医院或进行鉴定的医疗组织陷入舆论危机、信誉危机等。而能够进行法医鉴定的病理学组织的成员都是经过专业化训练，受专门部门管理，其团队的的专业性和个人素质并非一般病理学组织可以相比。因此由法医组织对尸体进行病理学鉴定不仅能够在结果上更加精确，而且更具权威，能够在医疗纠纷的司法鉴定过程中通过责任的明确，过失程度的确认的方式对医疗纠纷的决绝起到决定性的作用。

（二）医学自身的要求

首先，医学发展需要对各种各样的致死原因、死亡机制就行严格准确的数据、信息统计，进而可以对这些致死原因、死亡机制进行研究，了解人类死亡过程中的一些医学学理上、病理学上的变化过程，这是医学发展的需求。

其次，医学本身具备严谨性的要求，而医疗纠纷中责任混乱，明确尸体死亡原因、机制，弄清楚尸体生前的各种病理现象和原因是医学严谨性的要求之一，此外分清医疗责任是医学严谨性的另一要求。

（三）医学发展的要求

随着社会经济的进步发展，相应的科教文卫事业也要相应发展，其中群众对卫生事业的发展需求增长速度最快。

法医病理学的尸体鉴定能够对一些疑难情况下产生的医疗纠纷原因有一个理性的鉴定结果，还原尸体还处于活体状态时的身体状态的具体情况，进而产生与尸体相关的病理学认识，为以后的医学实践和医学发展进行经验的积累，进而促进相关的医疗事业的发展和医用器械、医疗科学的进步和发展。

（四）司法鉴定程序的要求

大多数涉及到民事赔偿责任的医疗纠纷都会进行司法鉴定程序，而司法鉴定程序需要由一支专业素质较强、责任感出众的病理学鉴定团队来执行。如果由一般的病理学医学组织来进行相关的尸体鉴定，科学性和结果的准确性就难以保证。而准确性不足的尸检结果对司法仲裁来说是不足以成为证据，甚至会成为阻碍司法审判的错误信息，从而影响审判公平原则，极不利于建立法律权威。长久以往将会阻碍我国法制社会建设进程。

四、结语

法医病理学的尸检对还原尸体病理现象，致死原因、死亡机制的病理学变化有重要意义，是促进医学、病理学发展的重要内容和环节。并且，法医病理学尸检还对司法审判有重要意义，司法审判中很多赔偿责任的确定都需要法医病理学尸检结果提供信息和证据支持。综合来说，我国的法医病理学正处于发展阶段，在未来的时间内，法医病理学的发展方向应当更加大众化更加普及。

参考文献：

[1]宋国建，范少罡.当法医病理鉴定遭遇穆斯林风俗习惯时[J].中国司法鉴定，2012，（06）.

[2]陈晓峰.法医病理鉴定参与医疗纠纷尸检的重要性及常见问题防范[J].中国卫生标准管理，2015，（26）.

[3]李良贤，张建军.老年人肺动脉栓塞猝死病例栓塞形成的高危因素及法医病理鉴定特点[J].法制博览，2015，（25）.

第3篇：坚定的锡兵范文

的依据。

【关键词】 乙型肝炎病毒；DNA定量检测；关系

为了探讨乙型肝炎病毒 DNA的定量检测和临床的关系 ， 本次研究选取 2010年 6月 ～2012年 6月期间来河南省宜阳县人民医院肝病专科就诊的 128例患者的临床资料进行回顾性分析 ， 所选取的患者均通过 ELISA（酶联免疫吸附试验 ）来检测乙型肝炎的病毒血清标志物 ， FQ-PCR（荧光定量聚合酶连反应 ）来检测 HBV-DNA的含量。现将大致研究结果报告如下。 1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取 2010年 6月至 2012年 6月期间来本院肝病专科就诊的128例患者， 其中男73例， 女55例， 年龄在 12～76岁之间 ， 平均 （34.8±14.5）岁 ， 所选取的患者都符合病毒性肝炎的诊断标准。且各类型的肝炎患者之间的资料没有明显的差异， 结果具有可比性。

1. 2 检测的仪器和试剂 HBV血清检测标志物检测试剂盒和 HBV核酸扩增荧光检测试剂盒；荧光定量聚合酶链反应（PCR）分析仪均产自上海科华生物技术公司。

1. 3 方法 在患者晨起空腹时抽取 5 ml静脉血 ， 将血清离心分装在 -20℃下保存备用。然后通过 ELISA（酶联免疫吸附试验 ）来检测乙型肝炎的病毒血清标志物 ， 操作步骤按照试剂盒的规定进行。通过 FQ-PCR（荧光定量聚合酶连反应 ）来检测 HBV-DNA的含量 ， 每一次检验都设立强阳性、弱阳性以及阴性作为内标 ， 将四个已经通过的阳性标准品作为外标。在进行检测时做好室内的质控。

1. 4 观测的指标 观测患者血清学的诊断指标和 HBV?DNA的阳性率以及定量检测的结果情况；血清学的诊断分组：第一组为HBcAb、HBeAg、HBsAg， 第二组为HBcAb、HBeAg、HBsAg， 第三组为HBeAg、HBsAg， 第四组为HBcAb、HBsAg， 第五组为HBeAb、HBcAb、HBsAb， 第六组为HBcAb、HBeAb， 第七组为 HBsAb以及全阴。

1. 5 统计学方法 采用 SPSS16.0统计学软件对数据进行统计学处理， 以 P

2 结果

128例患者血清学的诊断指标和 HBV-DNA的阳性率以及定量检测的结果情况， 详见表1。

3 讨论

近几年 ，发展了多种准确的、敏感的、先进的用于 HBV?DNA定量检测的方法 ， 根据其原理主要有酶标记探针 PCR技术和荧光标记探针的 PCR技术。后者省时 ， 自动化的程度高 ， 而且可以免除 PCR后处理的步骤 ， 减少了 PCR产物对环境的污染， 现在已经成为了 HBV-DNA定量检测的主要方法。采用该方法对 HBV-DNA进行定量检测的范围为 3～8， 如果检测的值比最低的检测水平 -3低 ， 将结果判断为阴性。在进行数据统计时 ， 将阴性的结果忽略不计或者计算为 0， 而求得 HBV-DNA对数的平均值的计算结果 ， 这种方法是不合理的。如果要合理的反映不同类型的乙型肝炎病毒患者体内的HBV-DNA的含量 ， 应该采用中位数的差异 H来进行 HBV?DNA的含量比较。

我国现在属于乙型肝炎大国 ， 发病率在全世界排在前几位。有研究表明 ， HBsAg的流行率大约为 9.75%， 当人体感染了乙型肝炎病毒之后会出现不同的症状以及临床表现。HBeAg呈阳性表示患者体内的乙型肝炎病毒在活跃的复制 ， 表明其具有很强的传染性[2]。HBcAb、HBeAg、HBsAg的HBV-DNA的阳性率为 98.6%， ， HBeAg、HBsAg为 100%， 说明本组患者的 HBeAg阳性血清指标的模式组主要为第一组和第三组 ， 而且其 HBV-DNA的阳性率以及 HBV-DNA的定量都比其他各组要高， 说明 HBeAg有可能与 HBV-DNA的含量之间存在一定的正相关性[3]。HBcAb、HBeAg、HBsAg为

25.2%， HBV-DNA 的对数的平均值为 （5.03±1.86）， HBcAb、HBsAg为20%， HBV-DNA 的对数的平均值为（6.28±0.48）， 说明当 e系统的抗原阴转时 ， HBV-DNA还是有可能被检测到 ， 虽然其含量比第一组和第三组低。HBeAb、HBcAb、HBsAb为 14.5%， HBV-DNA 的对数的平均值为 （3.54±0.45）， 说明HBsAb是一种保护性的抗体。

综上所述 ， 各种类型的乙型肝炎患者都有一定程度HBV-DNA复制 ， HBeAg的阳性患者其 HBV-DNA的水平最高 ， 将 HBV-DNA和 HBeAg定量联合进行诊断 ， 可以为早期的乙型肝炎筛查以及治疗提供可靠的依据。

参考文献

[1]李金明 . 乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题 .中华检验医学杂志 ， 2006，29（5）：385.

第4篇：坚定的锡兵范文

目前，生产上对黄瓜白粉病的防治以化学药剂（唑类杀菌剂）为主，但随着化学药剂的长期大量使用，白粉病菌对化学药剂的抗性逐年增强1，并且化学药剂在瓜条内的农药残留直接威胁着人类健康。国内外相关研究表明生防微生物对黄瓜白粉病菌也具有较好的抑制作用，但相关研究正处于实验室研究阶段。本研究旨在从土壤中分离筛选出对黄瓜白粉病具有明显防效的生防菌株，为黄瓜白粉病的安全防治提供优良的生物资源，服务于农业生产。 

1材料与方法 

1.1材料 

土样：采自天津西青、静海、武清黄瓜温室根际土壤，共28份。 

病原菌：黄瓜白粉病菌（Erysiphe cucurbitacearum）、黄瓜灰霉病菌（Botrytis cinerea）。 

1.2拮抗细菌的分离与室内筛选 

土壤细菌的分离：称量土壤样品10 g，加入到装有100 mL水的三角瓶中，摇床振荡培养（160 r/min）30 min。将土壤悬浮液系列稀释至10-1～10-6，取稀释浓度为10-4和10-5各100 μL涂至LB平板上，37℃培养24 h。 挑取不同形状的单菌落于LB斜面上，37℃培养24 h后4℃冰箱保存。 

拮抗细菌的室内筛选：采用平板对峙培养法测定分离出的细菌菌株对黄瓜灰霉病菌的抑制作用。待对照长满平皿时测量菌落生长直径，计算菌株的拮抗率。将拮抗率60%以上的菌株保存于20%甘油的冻存管中。 

1.3温室盆栽防治试验 

拮抗细菌发酵液的制备：将拮抗性良好的菌株转接在LB平板上活化24 h后接种至LB液体培养基中，恒温摇床培养48 h（28℃，160 r/min），制成菌体含量为108 cfu/mL的菌体发酵液原液。 

盆栽防治试验：营养钵中播种黄瓜（品种为津优3号），黄瓜白粉病发病初期将拮抗细菌发酵原液2倍稀释液均匀喷洒在黄瓜叶片上，间隔1周后喷施第二次。每处理10株幼苗，重复3次，以喷洒清水处理为对照。第二次喷药1周后分级调查黄瓜白粉病的发病情况2，计算拮抗细菌的防治效果。 

1.4拮抗菌株鉴定 

1.4.1形态鉴定观察菌落的形态、颜色、边缘、透明度、凹凸度等，革兰氏染色观察菌体形态。 

1.4.2生理生化鉴定细菌的生理生化特性（革兰氏染色、芽孢染色、柠檬酸盐的利用等）分析参照植物病原细菌鉴定试验指导（第三版）3～6。 

1.4.316s rDNA分子鉴定采用Lysis方法提取防效好的菌株基因组DNA，以原核生物16S rDNA保守序列通用引物进行PCR扩增。PCR反应体系（50 μL）为：模板DNA 1 μL，Taq Buffer 25 μL，引物P0和P1各1 μL，用双蒸水补足至50 μL。PCR反应程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，51℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃ 10 min。扩增产物经测序后，通过Blast程序对该序列和GenBank中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较。 

2结果与分析 

2.1拮抗细菌的分离与筛选 

第5篇：坚定的锡兵范文

关键词：南酸枣；内生细菌；芒果炭疽病菌；防治效果

中图分类号：Q939.95文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2398-03

Identification of Choerospondias axillaris Endophytic Bacterial Strain WYG5 and Its Effects on Preservating Postharvest Mango

WU Jia-fei，LI Xiao-yu，FAN Yong-mei，LIU Zhi-qiang

（College of Environment and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

Abstract：Strain WYG4，isolated from Choerospondias axi11aris（Roxb1） Burttet Hill，had higher antagonistic effects against Colletotrichum gloeosporioides， with antagonistic activity of 32% in plate. According to its morphological，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence，the strain WYG5 was identified as Bacillus megaterium. Its fermentation broth and fermentation filtrate had obvious effects on preservating postharvest mango. After 9 d and 12 d treatment，the controlling effects were up to 60.76%， 59.50% and 43.59%，34.19%， respectively.

Key words：Choerospondias axillaris； endophytic bacteria； Colletotrichum gloeosporioides； control effect

基金项目：国家自然科学基金项目（31160377）；国家科技支撑计划项目（2012BAK01B05）

南酸枣（Choerospondias axillaris）为漆树科南酸枣属落叶大乔木，多年生，又名五眼果、酸枣树、山枣子等，主要分布于云南、广东、广西、湖南、湖北、江西、福建、浙江、贵州等地区[1]，其树皮和果实可以入药，树皮主治疮疡、汤火伤、阴囊湿疹；鲜果则消食滞，治食滞腹痛；果核醒酒解毒，治风毒起疙瘩成疮或疡痈[2]。

植物内生菌是指在其生活史的一定阶段生活在活体植物组织内，而不引起植物明显病害的微生物[3]。许多研究表明植物中的内生细菌对宿主具有抗病促生的能力，作为生物菌剂在生物防治方面和促进植物生长方面有着重要的应用价值[4，5]。试验从南酸枣体内分离出一株内生细菌WYG5，发现其对芒果炭疽病菌具有较好的拮抗效果，利用常规方法结合16S rDNA序列分析对该菌株进行了鉴定，并测定了其对采后芒果的保鲜防病效果，为其今后应用奠定基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试材料南酸枣采自海南大学儋州校区，内生细菌WYG5从南酸枣中经组织表面消毒分离获得。芒果炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz）由海南大学环境与植物保护学院提供，芒果品种为台农l号。

1.1.2培养基LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母粉 5 g，NaCl 10 g，去离子水1 L；PDA培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，去离子水1 L。

1.2方法

1.2.1菌株培养菌株WYG5经活化后接入LB培养基，37 ℃、180 r/min 振荡培养2 d，收集发酵液，12 000 r/min离心5 min，将上清液利用0.22 μm的滤膜除菌过滤，得到发酵滤液。

1.2.2 菌株WYG5的鉴定采用常规鉴定方法进行[6]。菌株基因组DNA利用Bacterial DNA Kit（50）试剂盒提取，利用16S rDNA通用引物（5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，5′-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）进行基因扩增，由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，将所测序列在GenBank中进行Blast分析，根据Blast结果利用MEGA 5.0软件以邻近相接法构建系统进化树。

1.2.3菌株WYG5皿内拮抗活性测定 在直径9 cm的PDA平板中央接种1块直径为5 mm芒果炭疽病菌的菌饼，菌丝面朝下，同时在菌饼两侧2 cm处各接入一环内生细菌WYG5，以不接内生细菌为对照，每处理3次重复，28 ℃培养2～3 d，十字交叉法计算皿内拮抗活性。

1.2.4菌株WYG5对芒果的防病效果取健康无病、大小均一、约八成熟芒果果实，用75%酒精表面消毒后，自然晾干备用。处理液包括发酵液、10倍稀释发酵液、发酵滤液、10倍稀释发酵滤液，以去离子水处理为对照。处理时将果实分别于各处理液中浸泡10 min，晾干后装入保鲜盒中放置，在处理后第6、9、12 天共调查3次，逐次记录并累加炭疽病病果数和病级，计算病指和防效，并对防效进行方差分析。具体方法参照国家标准GB/T 17980.98-2004进行。

果实发病程度分级方法如下，0 级：无病；1 级：病斑面积占果实面积的5%以下；3 级：病斑面积占果实面积的 6%～15%；5 级：病斑面积占果实面积的 16%～25%；7 级：病斑面积占果实面积的 26%～50%；9 级：病斑面积占果实面积的 50%以上。试验数据采用DPS处理，进行差异显著性分析。

病情指数= [∑（各级病果数×相对级数）/（调查总果数×9）]×100

防效=[（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照病情指数]×100%。

2结果与分析

2.1菌株WYG5的鉴定

菌株WYG5在培养基上菌落呈圆形，浅黄色，边缘整齐，表面有凸状隆起，干燥，不透明，革兰氏染色阳性，芽孢染色阳性，菌体杆状，周生鞭毛。菌株WYG5 的形态和生理生化特征与东秀珠等[6]描述的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）特征相同。对菌株WYG5的16S rDNA序列进行PCR扩增，产物经纯化后测序，得到 1 515 bp的碱基序列。将16S rDNA 序列进行BLAST分析，发现它与多株巨大芽孢杆菌菌株的同源性均在99%以上。选取GenBank中的8株芽孢杆菌属的细菌与菌株WYG5一起，利用软件MEGA 5.0构建出基于16S rDNA序列的系统发育树（图1）。由图1可以看出，菌株WYG5与巨大芽孢杆菌的同源性最高，结合形态观察和生理生化特征分析，确定菌株WYG5为巨大芽孢杆菌。

2.2菌株WYG5皿内拮抗活性的测定

采用十字交叉法测定菌株WYG5对芒果炭疽病菌的皿内拮抗活性，结果表明，该内生细菌对芒果炭疽病菌有明显的拮抗作用，能够有效抑制该病原菌菌丝在PDA培养基中的扩展，抑制率达到32%。

2.3菌株WYG5对芒果的防病效果

内生细菌WYG5的不同处理液对采后芒果的保鲜防病效果见表1。6 d相对于芒果保鲜来说时间较短，6 d时对照组病情指数仅为7.04，处理防效虽高但意义不大，故重点讨论了9 d和12 d的防效。其中菌株发酵液及发酵滤液处理9 d时的防效分别为60.76%和59.50%，不存在显著差异；12 d时的防效分别为43.59%和34.19%，存在极显著差异，发酵液的保鲜防病效果明显优于发酵滤液。稀释10倍发酵液处理9 d时的防效为54.43%，与发酵液处理不存在显著差异，而处理12 d时两处理防效差异极显著。稀释10倍发酵滤液处理9 d和12 d时的防效均极显著低于发酵滤液的防效。

3结论与讨论

巨大芽孢杆菌作为植物内生细菌已有报道，如农倩等[7]从水稻体内分离到一株巨大芽孢杆菌B196，对水稻纹枯病菌的生长具有较强的抑制作用，盆栽和田间防效分别为64.29%和55.13%；林天兴等[8]从苦豆子中分离出48株对棉花枯萎病菌和黄萎病菌有较强拮抗作用的内生细菌，并对其遗传多样性进行了分析，发现这些菌株分别属于Bacillus atrophaeus、Bacillus subtilis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus pumilus、Serratia marcescens；张鑫等[9]从无纹紫背苔叶片中分离出一株内生菌z12，鉴定为巨大芽孢杆菌，发现其对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及水稻纹枯病菌均有较强的抑制作用；林娜等[10]从山苍子的根、茎、叶和果中分离出内生细菌52株，其中一株对辣椒疫霉病的防治效果较好，且可促进辣椒植株生长。试验从南酸枣中分离到一株对芒果炭疽病菌拮抗作用较强的菌株WYG5，通过形态观察、生理生化测定及16S rDNA序列分析，鉴定将该菌株为巨大芽孢杆菌，经测定该菌株发酵液及发酵滤液对采后芒果均有明显的保鲜防病效果，处理9 d后防效分别为 60.76%和 59.50%，12 d后的防效分别为43.59%和34.19%，有关该菌的抗病机理及抑菌活性物质还有待进一步研究。

参考文献：

[1] 熊冬生，浦跃武，吴晓英.南酸枣植物在药物方面的研究概况及其应用前景[J].广东药学，2000，10（5）：8-10.

[2] 江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海人民出版社，1977.

[3] 姜怡，杨颖，陈华红，等.植物内生菌资源[J].微生物学通报，2005，32（6）：146-147.

[4] 卢镇岳，杨新芳，冯永君.植物内生细菌的分离、分类、定殖与应用[J].生命科学，2006，18（1）： 90-94.

[5] 张颖，王刚，郭建伟，等.利用小麦内生细菌防治小麦全蚀病的初步研究[J].植物病理学报，2007，37（1）： 105-108.

[6] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京： 科学出版社，2001.

[7] 农倩，陈雪凤，黎起秦，等.水稻内生细菌B196的鉴定及其对水稻纹枯病的防治作用[J].中国生物防治学报，2011，27（1）：99-103.

[8] 林天兴，李超，龚明福.拮抗性苦豆子内生细菌的遗传多样性[J].安徽农业科学，2011，39（24）： 14673-14675.

第6篇：坚定的锡兵范文

［摘要］目的 探讨不同位点微卫星不稳定性（MSI）和杂合性缺失（LOH）与慢性粒细胞白血病（CML）各期的关系。方法 应用多重PCR技术检测CML病人不同时期8、9、17号染色体上5个微卫星位点的MSI和LOH。结果 在D8S555位点，CML加速、急变期（AP+BC）病人的MSI发生率明显高于慢性期（CP）病人，差异有显著意义（ P =0.009）;8号染色体上D8S555、D8S559位点MSI发生率明显高于9、17号染色体上D9S67、TP53A1/A2、AFMa127xg9位点 ，AFMa127xg9位点LOH发生率明显高于其他4个位点，差异有显著性（ χ 2 =1.858～9.946，P < 0.05、0.01）。结论 微卫星遗传不稳定性是CML发生和转化过程中的常见事件;不同位点微卫星不稳定性在CML病情演变中所起作用不同;AFMa127xg9位点附近可能存在与CML发生、发展密切相关的新抑癌基因。

［关键词］ 染色体不稳定性;杂合性缺失;微卫星重复;白血病，髓样，慢性

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the relationship between the frequency of microsatellite instability （MSI） on differ-ent chromosome and chronic myeloid leukemia （CML） at different stages. MethodsUsing multiplex-PCR，the MSI and loss of heterozegosity （LOH） on 5 microsatellite loci of chromosome 8， 9 and 17 in chronic myeloid leukemia were detected. Results The frequency of MSI at D8s555 locus in patients with CML at chronic， accelerated， blastic stages was significant differences （ P =0.009）. CML patients showed higher frequency of MSI on D8S555 and D8S559 loci than that of at D9S67 and AFMa127xg9 loci （ χ2 =5.680， 8.096; P

［KEY WORDS］chromosomal instability; loss of heterozygosity; microsatellite repeats; leukemia， myeloid， chronic

微卫星（MS）是广泛存在于原核及真核细胞基因组中的简单串联重复的DNA序列，约占人类基因组的10%［1］。由于微卫星DNA具有丰富的多态性、高度的杂合性以及较低的重组率等特点，已被广泛应用于人类基因组计划中的基因制图、遗传病诊断、法医学等各个领域。近年来，人们发现微卫星在恶性肿瘤及相关疾病中可表现出不稳定性（MSI）和杂合性缺失（LOH），因而对微卫星的监测成为寻找和定位抑癌基因、探讨肿瘤发生机制的一个重要方法［2，3］。慢性粒细胞白血病（CML）是一种造血干细胞起源的血液系统恶性肿瘤，其病程发展经历慢性期、加速期和急变期。对于慢性期转变为加速期的机制 尚未研究清楚。本文用多重PCR技术检测CML不同时期的多个微卫星位点的MSI和（或）LOH，以期探索其与CML发生及病情进展的关系。

1 对象与方法

1.1 对象 CML病人37例，来自青岛大学医学院附属医院，包括慢性期（CP）27例，加速期和急变期（AP+BC）10例;男20例，女17例;年龄12～70岁，中位年龄47.1岁。诊断依据文献［4］标准。选择同期5例健康查体志愿者作为正常对照组。

1.2 方法

1.2.1标本制备 收集CML病人的骨髓标本，正常对照组外周血，同时刮取口腔黏膜标本做自身对照，参考本室常规方法分别提取骨髓、外周血与口腔黏膜标本DNA备用。

1.2.2引物合成 选取与CML病人不同时期染色体改变密切相关的8、9、17号染色体上5个微卫星位点:D8S555、D8S559、D9S67、TP53A1/A2、 AFMa127xg9 ，从基因库中查出其引物序列，由上海生物工程技术服务有限公司合成所需引物，引物序列见表1。

表1 第8、9、17号染色体5个微卫星位点引物序列 （略）

1.2.3PCR扩增 将引物分成两组，用多重PCR方法同时扩增病人的骨髓（或正常对照组的外周血）和口腔黏膜DNA。

1.2.4产物分析 将扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，用凝胶成像分析仪分析是否存在MSI和（或）LOH。

1.3 统计学处理 用卡方检验（包括校正检验和精确检验法）。

2 结果

2.1 各期CML病人MSI和（或）LOH发生率比较 27例CP病人中14例发生MSI和（或）LOH，10例AP+BC病人中8例发生了MSI和（或）LOH，二者比较，差异无显著性（ P =0.152）。

2.2 不同微卫星位点MSI和（或）LOH的发生率及其比较 在D8S555位点，CML CP病人的MSI发生率为7.4%，AP+BC为40.0%，但未见LOH。进展期（AP+BC）病人的MSI发生率明显高于CP病人，差异有显著性（ P =0.009）。同时出现两个和两个以上位点改变者10例，其中CP病人6例，AP+BC病人4例，二者差异无显著性（ P =0.407）。8号染色体的D8S555、D8S559位点MSI的发生率明显高于9、17号染色体的3个位点，差异均有显著意义（ χ2 = 5.680、8.096，P

表2 CML病人各期不同微卫星位点的MSI、LOH发生情况（略）

2.3 正常对照组的MSI和（或）LOH发生情况 正常对照组5例外周血细胞与口腔黏膜细胞DNA电泳、银染后得到的条带都完全相同，未见到MSI和（或）LOH。

3 讨论

慢性白血病是一种克隆性、多能造血干细胞疾病，发病率为1/100 000，发病高峰在50～60岁之间。其临床特征为:髓系增生，白细胞增多伴嗜碱粒细胞增多，脾大。病情发展最终由慢性期进展到加速期，最后到致命的急变期。特征性的染色体异常t（9，22）（q34:q11）导致bcr-abl融合基因的形成，其产物bcr/abl酪氨酸激酶的活性比野生型abl酪氨酸激酶的活性更强，这在CML的发病中起重要作用［5］。一般认为，CML急变时70%的病人可以出现额外的染色体异常，这种变化的出现比血液学和临床表现的恶化要早几个月，可作为估计预后的有价值的指标［6］。分子生物学技术的发展对CML的发病机制及病程演变的研究起了进一步推动的作用。PCR技术检测微卫星的不稳定性在研究CML发生发展机制中被广泛应用。WADA等［7］检测了19例CML进展期和20例慢性期病人的5个不同微卫星位点的MSI，结果显示，进展期有10例病人检测到至少2个微卫星位点的MSI，而20例慢性期病人中没有1例检测出同样位点的MSI，认为由于复制和修复机制缺陷导致微卫星不稳定性这一频繁事件的发生同CML进展关系密切。OHYASHIKI等［8］用荧光技术对73例不同类型白血病的7个微卫星标记进行连续研究发现，在CML慢性期没有微卫星不稳定性，而急变期时微卫星不稳定性出现的频率明显升高，达25%，且出现多个位点不稳定性者占50%以上，因此认为，多个基因位点的不稳定性与CML的急变有关联。李戈等［9］检测17例CML加速期和急变期病人的2个微卫星标记，发现有8例出现MSI或LOH，表明慢性白血病在加速期和急变期检出微卫星不稳定性的频率明显高于慢性期。本文结果显示，进展期病人D8S555位点处的MSI发生率明显高于慢性期病人，与文献报道相符;同时也观察到所选的其他4个位点上，加速期和急变期病人发生一个或多个位点的MSI和（或）LOH的频率与慢性期病人无显著性差异;8号染色体的2个位点D8S555、D8S559的MSI发生率明显高于9、17号染色体的3个位点，而17号染色体的AFMa127xg9位点LOH发生率明显高于其他4个位点，在9q34上的D9S67位点和17号染色体的TP53A1/A2位点上MSI和（或）LOH发生率都较低，且只发生在慢性期，这说明CML的演变是一个遗传学改变高度异质性的过程，微卫星遗传不稳定性广泛存在于疾病全过程，不同微卫星的改变在这一过程中发挥的作用也不同。MORI等［10］对17例处于由慢性期向急变期进展的CML病人的10个微卫星标记进行研究，也没有发现MSI，认为这些微卫星区域改变没有参与CML的进展。另外，MEZA等［11］研究发现，CML出现额外染色体异常如+8、i（17q）的频率具有地区民族差异。所以，我们分析不同文献结果不同的原因除与所选择的微卫星位点不同有关外，可能还与人种、地域等因素造成的微卫星多态性有关。如何科学选择微卫星位点检测慢性白血病不同时期的MSI和LOH的临床意义还有待于更多、更进一步的研究。

［参考文献］

［1］ WEISSENBANCH J， GYAPAY G， DIB C， et al. A second-generation linkage map of the human genome ［J］. Nature， 1992，359:794-801.

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［3］ 吴 春梅，谭齐贤，王化泉. 白血病微卫星杂合性缺失的研究［J］.青岛大学医学院学报，2001，37（2）:92-95.

［4］ 张 之南，沈悌.血液病诊断及治疗标准［M］. 第2版. 北京:科学出版社， 1998:168-185.

［5］ DALEY G Q， VAN ETTEN R A， BATIMORE D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the p210 bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome ［J］. Science， 1990，247:824-833.

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［9］ 李 戈，宋玉华，钱林生， 等. 微卫星Mfd41和DCC的遗传不稳定性与CML病程发展关系研究 ［J］.中华血液学杂志，1998，19（8）:405-408.

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第7篇：坚定的锡兵范文

【关键词】高脂血症；载脂蛋白；动脉粥样硬化指数

载脂蛋白（apo）是脂蛋白（Lp）颗粒外层的蛋白质部分，是脂蛋白组成中的关键物质，已经阐明各种载脂蛋白与脂代谢的关系非常密切，其主要功能是维持脂蛋白结构与脂类运输，调控脂代谢存在酶的活力，以及作为细胞表面Lp受体的配体，而参与脂蛋白代谢，从人和动物血浆和淋巴液中分离的多种apo中明确存在于人血浆中的有APOA-Ⅰ、AⅡ、AⅣ、B-100、B-48。CⅠ、CⅡ、CⅢ、D（即AⅢ）、E、F、G及apo（a）等用于动脉粥样硬化（AS）风险度估计的指标是APOA-Ⅰ、APOB-100[1]。

APOA-Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白质，它的血清浓度代表HDL水平，正常情况下APOB占低密度脂蛋白（LDL）中蛋白质的97%及低密度脂蛋白（VLDL）中蛋白质的37%左右，所以APOB水平主要反应LDL水平，但VLDL多时，APOB也会有所增高，通常认为HDL是动脉粥样硬化的防御因素，而LDL是致病因素，所以血清APOA-Ⅰ减少及APOB升高，提示动脉粥样硬化发生的危险性增加，APOA-Ⅰ/APOB-100比值，被称为动脉粥样硬化指数[2]。

1标本来源与方法

住院患者空腹静脉血，同时用生化分析仪做胆固醇、甘油三脂、其中一项或两项均高者，再用联合免疫电泳去测其血清中APOA-1，与APOB-100的含量。

3讨论

从表1可以看出，随着年龄的增加，其APOA-Ⅰ的水平在下降，APOB-100的水平相对增高，胆固醇的含量也随着年龄的增加而增高，A/B比值，随着年龄的增加而减少，甘油三脂的含量随着年龄的增加而增高，通过P值可以看出，各年龄组的测定结果有显著性差异。

从表2可以看出，高血脂病人当中63.3%患者血清APOA-Ⅰ与APOB-100的含量仍维持在正常水平。

其二者的比值也在正常水平，其平均比值为1.5。说明高血脂人群中，有少数人载脂蛋白含量未发生改变，而大多数病人已发生改变，根据有关资料报道，A/B的正常参考值为1.3±0.56比值小于1.3就预示着疾病的存在，比值越小，疾病严重程度越深。

从表3可以看到高血脂病人当中，48.9%患者血清APOA-Ⅰ的含量仍维持在正常水平，其A/B的平均比值为1.36，51.1%的患者血清APOA-Ⅰ的含量下降，其A/B的平均值为0.9。

从表4可以看到高血脂病人当中，88.9%患者血清APOB-100的含量明显增高，其A/B的平均比值为1.11，而11.1%的患者血清APOB-100仍维持在正常水平，其A/B的平均比值为1.35。

综上所述，用联合免疫电泳测人血清APOA-Ⅰ，APOB-100方法简易，准确性高，在冠心病危险的预测上APOB的测定，可能比总胆固醇测定更好、更有意义。

参考文献

[1]李健斋.血清载脂蛋白免疫测定及其标准化问题.中华医学检验杂志，1992，15（1）：47.

[2]吴希云.载脂蛋白A1和载脂蛋白B的测定在肝病中的意义.全国肝病实验室诊断论文汇编，74-75.

第8篇：坚定的锡兵范文

【摘要】 目的： 构建携带人白细胞介素10(hIL10)和人肝细胞生长因子(hHGF)双基因的重组腺病毒载体。方法： 分别以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF重组质粒为模板，PCR扩增获得hIL10和hHGF基因片段，与pIRES连接成为hIL10IREShHGF，测序正确后酶切，与pDC315连接，获得穿梭质粒pDC315hIL10IREShHGF，与腺病毒包装系统转染293细胞，包装产生重组腺病毒hIL10hHGF，PCR鉴定后，扩增病毒，并测定病毒滴度。用重组腺病毒转染BEL7402和WRL68细胞，ELISA法检测上清液中hIL10和hHGF的含量。结果： 成功构建了重组腺病毒hIL10hHGF，扩增纯化后测得重组腺病毒滴度为1×109 pfu/ml，转染BEL7402和WRL68细胞72 h后，表达hIL10的量分别为(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml，表达hHGF的量分别为(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml。结论： 本实验为进一步研究AdhIL10hHGF在动物体内抗肝炎、肝纤维化作用奠定了基础。

【关键词】 白细胞介素10; 肝细胞生长因子; 腺病毒载体

[Abstract] Objective: To construct the recombinant adenovirus vector carrying human interlerkin10(hIL10) and human hepatocyte growth factor(hHGF).Methods： We amplified hIL10 and hHGF genes by PCR with plasmids pDC316hIL10EGFP and pCDNA3hHGF， respectively， and subcloned into pIRES to generate hIL10IREShHGF. Confirmed by sequence analysis， the hIL10IREShHGF genes were inserted into the vector pDC315， then the shuttle plasmid pDC315hIL10IREShHGF was constructed， which was cotransfected with the adenovirus skeleton plasmid into 293 cells to obtain the recombinant adenovirus vector hIL10hHGF. After identified the target genes by PCR， the recombinant adenovirus was propagated and the viral titer was determined. hIL10 and hHGF proteins in the virusinfected BEL7402 and WRL68 cells were measured by ELISA. Results： We obtained recombinant adenovirus vector of hIL10hHGF successfully. After propagation， the titer of the recombinant adenovirus was 1×109 pfu/ml. The recombinant adenovirus could express hIL10 and hHGF in BEL7402 and WRL68 cells effectively. The concentrations of hIL10 were(6 271.7±5.2) pg/ml and(350.6±12.4) pg/ml respectively， and the concentrations of hHGF were(20 827.1±345.5) pg/ml and(201.6±10.1) pg/ml respectively. Conclusion： The recombinant adenovirus vector hIL10hHGF seted the foundation for the gene therapy of hepatitis and cirrhosis in animals.

[Key words] interlukin10; heptocyte growth factor; adenovirus vector 肝炎、肝炎后肝硬化严重危害人类健康，通过基因治疗手段来预防和减轻肝损伤是近年来人们研究的一个新方向。IL10是一个多效性细胞因子， 具有广泛的生物学作用。研究表明内源性IL10 对肝细胞具有保护作用，而且给予外源性IL10 也显示了明显的抗肝细胞损伤作用[1，2]。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor， HGF)被认为是最强的肝再生促进剂，是一种具有多功能的生物大分子，它有强效的抗肝炎、促肝再生作用[3，4]。本研究拟构建人IL10和HGF双表达的重组腺病毒hIL10-HGF，为腺病毒介导IL10及HGF基因治疗肝炎、预防肝损伤建立实验基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 质粒和菌株 含HGF基因的质粒pCDNA3HGF由江苏省人民医院血液科惠赠，含hIL10基因的质粒pDC316EGFPhIL10，pIRES，pDC315，pDC312，大肠埃希菌菌株Top10、腺病毒骨架质粒、腺病毒包装细胞HEK293细胞和肝癌BEL7402、正常肝脏WRL68细胞均由南京师范大学生命科学学院细胞生物学实验室惠赠。

1.1.2 酶类和主要试剂 限制性内切酶、T4连接酶、Taq DNA聚合酶、Pyrobest DNA，DNA 标准参照物、蛋白酶K购自Takara公司;DMEM购自Gibco BRL公司;DMSO为Amresco公司产品;胎牛血清购自杭州四季清公司，56℃灭活30 min;转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;0.22 μm无菌滤器及滤膜购自Millipore公司;胶回收纯化试剂盒及质粒提取试剂盒购自AXYGEN公司，引物由上海生工公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 PCR法扩增目的基因 以pDC316hIL10EGFP和pCDNA3hHGF为模板，hIL10上下游引物5′端分别引入NheI和EcoRI的位点，上游引物P1：5′CGGCTAGCACCATGCACAGCTCAGCACTGC3′;下游引物P2：5′GAGAATTCTCAGTTTCGTATCTTC3′;HGF上下游引物5′端分别引入XbaⅠ和SalⅠ酶切位点，P3：5′GCTCTAGAACCATGTGGGTGACCAAACTC3′;下游引物P4：5′GAGTCGACCTATGACTGTGGTAC 3′; 94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，72℃连续延伸7 min。扩增完毕后进行胶回收获得目的片段。

1.2.2 测序质粒的构建与鉴定 NheⅠ，EcoRⅠ和XbaⅠ，SalⅠ分别酶切pIRES及目的片段，割胶回收纯化，用T4 DNA连接酶与hIL10，hHGF连接，片段∶载体=3∶1(摩尔比)。将连接产物转化Top10感受态，涂布于含50 mg/L氨苄西林的LB琼脂平板，37℃，220 r/min恒温摇床振摇16 h。抽提质粒，30 μl ddH2O溶解。取10 μl抽提质粒和载体pDC312分别用NheⅠ，SalⅠ酶切，产物电泳，割胶回收hIL10IREShHGF片段和线性化载体pDC312，T4 DNA连接酶连接，转化，抽提质粒，酶切鉴定。取鉴定阳性的质粒1～2 μl送上海生工公司测序，测序正确的质粒命名为pDC312hIL10IREShHGF。

1.2.3 重组穿梭质粒的构建与鉴定 NheⅠ、SalⅠ酶切pDC312hIL10IREShHGF，0.8%琼脂糖凝胶电泳，回收产物，30 μl ddH2O溶解，T4 DNA连接酶连接，转化Top10感受态，与含50 mg/L氨苄西林的LB琼脂平板筛选，挑取20个最小克隆接种至2 ml LBAmp+(50 μg/ml)液体培养基，37℃，220 r/min恒温摇床振摇过夜，取菌液进行菌液电泳，选出可疑阳性的菌株进行PCR鉴定，确定含2 200 bp和540 bp条带后，选两个阳性菌株进行大量扩增，采用碱裂解法抽提质粒，获得pDC315hIL10IREShHGF。

1.2.4 腺病毒的包装、鉴定及扩增 2 μg质粒和2 μg腺病毒骨架质粒共转染HEK293细胞，37℃ 5%CO2培养5～7 d，细胞病变，-80℃、37℃水浴冻融5次收集病毒，再次感染HEK293细胞，最终收集的PBS重悬病毒上清，PCR鉴定，分别以含目的基因的重组穿梭质粒、重组腺病毒及不含目的基因的重组腺病毒为模板进行扩增，反应条件同“1.2.1”，鉴定后-80℃分装保存。重组腺病毒命名为AdhIL10hHGF。

1.2.5 TCID50法滴定重组腺病毒效价 10%的培养液调整HEK293细胞为1×105个/ml，接种至96孔板，100 μl/孔，培养24 h;分别加入10-1～10-12浓度的病毒，留最后两孔加入无血清培养基作为对照孔，每组设8孔，培养10 d，每天观察细胞病变效应情况。

1.2.6 重组腺病毒载体在BEL7402和WRL68中的表达 取BEL7402和WRL68细胞传于6孔板，贴壁后24 h吸弃培养液，灭菌PBS(1×)洗2～3遍，加入MOI=20的AdhIL10hHGF转染液，45 min摇匀1次，90 min后弃去转染液，加入含5%胎牛血清的DMEM，培养72 h，显微镜下观察细胞有无变圆和蚀斑现象，ELISA检测上清液中hIL10和hHGF的含量。

2 结 果

2.1 目的片段PCR扩增结果

以pDC316EGFPhIL10和pCDNA3hHGF为模板，PCR扩增出预期片段，约540 bp的hIL10基因片段和2 200 bp的hHGF基因片段(图1)。

2.2 pIREShIL10hHGF和 pDC312hIL10IREShHGF的酶切鉴定结果

用NheⅠ，SalⅠ酶切pIREShIL10hHGF产生3 400 bp和5 400 bp的两个片段(图2a)，用XbaⅠ，SalⅠ酶切pDC312hIL10IREShHGF产生2 200 bp的hHGF和4 540 bp的两个片段(图2b)，证明为预期质粒，可用于后续实验。

2.3 pDC315hIL10IREShHGF的筛选、鉴定及扩增结果

pDC312hIL10IREShHGF质粒用NheⅠ和SalⅠ双酶切，释放3 400 bp大小的片段，与用NheⅠ和SalⅠ双酶切的pDC315连接得到pDC315hIL10IREShHGF，进行PCR鉴定，证实所得质粒正确(图3a-d)。

(a)菌液电泳筛选，M: DL15000标准参照物，1：pDC315质粒，2、3、5、7为可能阳性质粒pDC315hIL10IREShHGF; (b)菌液PCR筛选pDC315hIL10IREShHGF，M: DL15000 标准参照物，1:阴性对照，2: pDC316EGFPhIL10质粒阳性对照，6，10为hIL10阳性;(c)第6，10号菌液PCR鉴定，M: DL15000标准参照物，1: pCDNA3hHGF质粒阳性对照;(d)大提质粒pDC315hIL10IREShHGF鉴定，M: DL15000标准参照物，1: pDC315质粒，2-4: 质粒pDC315hIL10IREShHGF

图3 pDC315hIL10IREShHGF鉴定

Fig 3 Identification of pasmid pDC315hIL10IREShHGF

2.4 病毒滴度测定结果

重组腺病毒质粒转染HEK293细胞4～10 d可见细胞病理效应，细胞形态变圆，细胞核增大，细胞贴壁性降低，有死亡漂浮的细胞等。扩增病毒的滴度为1×109 pfu/ml。

2.5 AdhIL10hHGF的PCR鉴定结果

AdhIL10hHGF经PCR鉴定，扩增出2 200 bp的hHGF 和540 bp的hIL10条带，证实所得病毒正确(图4)。

M1: 10000 标准参照物，1，2: hHGF阳性，3，4: hIL10阳性，M2: DL2000 标准参照物

图4 腺病毒扩增后PCR鉴定

Fig 4 PCR identification of AdhIL10hHGF

2.6 AdhIL10hHGF在BEL7402和WRL68中的表达

BEL7402和WRL68细胞感染AdhIL10hHGF 72 h后，ELISA检测上清液中hIL10和hHGF的含量，结果表达hIL10的量分别为(6 271.7±5.2) pg/ml和(350.6±12.4) pg/ml，表达hHGF的量分别为(20 827.1±345.5) pg/ml和(201.6±10.1) pg/ml 。

3 讨 论

肝炎、肝炎后肝硬化和肝癌严重危害人类健康，尽管经过数十年，几代科学家的共同努力，对这些疾病的诊断及治疗已取得了重要进展，但对绝大多数晚期病例尚缺乏有效治疗手段。通过基因治疗手段来预防和减轻肝损伤是近年来人们研究的一个新方向。

肝细胞生长因子在肝脏中主要由非实质性细胞如肝星状细胞和血窦内皮细胞分泌，Kupffer细胞也少量分泌，实验表明[5]，HGF是肝细胞生长和DNA合成最强大的刺激剂， HGF通过旁分泌和自分泌机制启动肝脏再生，刺激肝细胞的生长。在肝纤维化的过程中，HGF起到了抑制肝纤维化的作用，还可用来治疗急慢性肾功能不全、肺炎、肺纤维化、外伤、胃溃疡以及循环系统等疾病。HGF的这种广泛而有效的药理治疗作用，促使众多的医药研究者们投入到HGF的开发研究中。用HGF治疗疾病也可采取蛋白制剂给药，但因HGF半衰期较短，因而需要大量反复应用才能维持局部较高的药物浓度，有时即使重复应用也难达到有效的浓度，因此应用蛋白制剂费用较高，故近年来兴起基因治疗的方法。

人IL10 主要由单核细胞、巨噬细胞、T和B淋巴细胞分泌，现已证实Th1和Th2细胞受刺激后均可分泌IL10，肝内kupffer细胞也可分泌，而且是肝内IL10 的主要来源[6]。IL10具有维持机体免疫反应稳定，抑制病原体引起对机体有害炎症反应的功能。IL10在控制局部炎症特性上对肝脏起保护作用，并通过抑制炎症介质的释放、核因子κB活性等途径阻止肝纤维化的发生和发展[7]。因此IL10具有潜在的强大抗肝纤维化作用，有望成为抗肝纤维化基因治疗新的有效目的基因。

腺病毒载体是目前发展得较快的载体系统，它以遗传毒性低、致病性小、宿主范围广、滴度高、感染效率高和装载容量大等优势已广泛用于基因治疗，也为体内外转染肝细胞进行基因治疗提供了有力的保证[8]。保护肝细胞的基因治疗目的基因既要能快速表达，又不必长时间持续地表达，这也正是我们构建携带人IL10基因和HGF基因的腺病毒载体进行体内转染肝细胞研究的重要出发点之一。

本实验通过PCR鉴定、限制性酶切分析及序列测定，均证明已正确构建重组穿梭质粒pDC315hIL10IREShHGF，并在HEK293细胞中与腺病毒骨架质粒同源重组，成功包装重组腺病毒hIL10hHGF。本研究所构建的AdhIL10hHGF能在体外感染肝脏细胞和肝癌细胞，并成功表达出hIL10和hHGF，为进一步研究AdhIL10hHGF在动物体内抗肝炎、肝纤维化作用奠定了基础。

参考文献

[1] Zhang LJ， Wang XZ. Interleukin10 and chronic liver disease[J]. World J Gastroenterol，2006，12(11):1681-1685.

[2] De′Broski RH， Tatyana O， Charles P， et al. IL10 and TGFβ redundantly protect against severe liver injury and mortality during acute schistosomiasis[J]. J Immunol，2008，181(10):7214-7220.

[3] Lindroos PM， Zarnegar R， Michalopoulos GK， et al. Hepatocyte growth factor rapidly increases in plasma before DNA synthesis and liver regeneration stimulated by partial hepatectomy and carbon tetrachloride administration[J]. Hepatology， 1991，13(4):743-750.

[4] Thatch KA， Schwartz MZ， Yoo EY， et al. Modulation of the inflammatory response and apoptosis using epidermal growth factor and hepatocyte growth factor in a liver jnjury model: a potential approach to the management and treatment of cholestatic liver disease[J]. J Pediatr Sur， 2008，43(12 ):2169-2173.

[5] Masson S， Daveau M， Francois A，et al. Upregulated expression of HGF in rat liver cells after experimental endotoxemia: a potential pathway for enhancement of liver regeneration[J]. Growth Factors， 2001，18(4): 237-250.

[6] Platzer C， Dcke W， Volk H，et al. Catecholamines trigger IL10 release in acute systemic stress reaction by direct stimulation of its promoter/enhancer activity in monocytic cells[J]. J Neuroimmunol， 2000，105(1):31-38.

第9篇：坚定的锡兵范文

1、正确、工整地抄写下面的汉字。(5分)

端 希 朋 从 竹

2、读拼音，写汉字。(24分

bì 　fēnɡ　 yǐnɡ lánɡ

水　秀 倒 　画

yā ōu 　 　 dù 　 　 yàn

乌 海 鹃 大

yǒnɡ yǒnɡ qí 　qí

远　敢　好　下

chì chì cónɡ 　 cónɡ

脚膀　花　顺

zhuān xīn 　zhì zhì tiān chánɡ rì jiǔ

3、写出带有下列偏旁的字。(4分)

4、填上合适的词语(6分)

一( 把 )雨伞 ( 欢乐 )的泼水节 ( 飞快 )地前进

一( )黑板 ( )的蝴蝶谷 ( )地爬行

一( )针 ( )的鸟窝 ( )地计算

5、照样子写词语。(6分)

(1)黑乎乎绿油油

( 2 )马马虎虎 平平安安

6、选词填空。(8分)

传扬　表扬

(1)老师常常()学习有进步的同学。

(2)胜利的消息很快在村子里(　)开来。

激动　感动

(3)仙人被沉香的孝心(　)了，送他一把神斧。沉香拿着神斧，想到就要劈开华山，见到妈妈，心

里很(　)。

黄黄的　蓝蓝的　尖尖的　茂密的

(4)星期天，我坐在阳台上画画，我先在纸上画了一片(　)森林。又在森林的上方画了(　)

天空和几朵白云，然后，我在森林中画了几只小鸟，(　)羽毛，(　)小嘴，可爱极了。最后，我给

画儿起了一个名字：小鸟的家。

二、按课文内容完成练习。(23分)

1.把词语补充完整(6分)

来 往 烘 托 活 虎

习 武 五 颜 中 外

2.按课文内容填空。(17分)

① 节，家家 。我一边吃 　 　 ，一边听爷爷讲有关月

亮的故事。春节到了,我们一起吃 ,去 年。(5分)

②我想变 　的星星，我想变　 的新月。最后，我看见小

小的 　，真想变成大大的 。(4分)

③ 好雨知时节，当春乃发生。 ， 。(4分)

④ 通过学课文，我们读懂了许多有趣的故事：《狐假虎威》说的是：狡猾的

借着老虎的 ，把百兽吓跑了。《黑板跑了》讲的是物理学家

的故事。他搞科学研究非常 。(4分)

三、课外阅读(12分)

1.安徒生是( )国的童话作家，世界文学童话创始人，被世人公认是 “童话”。

A.中国 B.美国 C.丹麦

2.《海的女儿》中的小公主最后化成了( )

A.泡沫 B.海水 C.海草 D.小精灵

3.《打火匣》中士兵用火擦打火匣，马上出现了( )

A. 巫婆 B.狗 C.公主

4.《卖火柴的小女孩》中的小女孩最后在亮光中看到了( )

A.烤鹅 B.圣诞树 C.奶奶 D.糖果

5.《野天鹅》中，妹妹编织( )救了十一位哥哥。

A.披风 B.衣服 C.帽子 D.鞋子

6.《坚定的锡兵》中，只有一只脚的锡兵，最后变成了什么?( )

A.锡块 B.锡勺子 C.锡心 D.锡兵

四、看图写话。(12分)

仔细看图，接着开头的话编个小故事。

花伞借给谁?

小花猫有一把花伞。一天，下大雨了，青蛙、乌龟、小鸭、大公鸡从它的门前走过。

一、识字写字(53分)

1、端 希 朋 从 竹

2、碧、峰、影、廊 鸦、鸥、杜、雁 永、勇、奇、棋子

赤、翅、丛、从 专心致志 天长日久

3、菠、萝 朗、腿 裙、衫 松、树

4、块 迷人 慢慢

根 小巧 飞快

5、(1)黄灿灿 红通通

(2)家家户户 高高兴兴

6、(1)表扬 (2)传扬 (3)感动 激动

(4)茂密的 蓝蓝的 黄黄的 尖尖的

二、按课文内容完成练习。(23分)

1、寒暑 云月 生龙

练功 六色 古今

2、

(1)中秋 团圆 月饼 饺子 拜

(2)眨眼 弯弯 荷塘 荷叶

(3)随风潜入夜，润物细无声。

(4)狐狸 威风 安培 专心

三、课外阅读(12分)

1、C 2、A 3、B 4、C 5、A 6、A