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晴好不容易楚楚可怜地哀求他让她说话..谁叫晴这么没头脑呢?
路上,他一直没有说一句话,只是默默地带着在空中漂浮,不知道是速度太快还是怎么的,晴感觉跟没动似的.
四周,已从白茫茫的一片变得色彩丰富起来,行走、漂浮、飞翔、蠕动的生物越来越多,似乎快到这个奇怪的地方的聚焦点。
这本来就是个奇怪的地方,有着奇怪的生物,奇怪的魔法师,更奇怪的是,这些生物们都独来独往,感觉,像是谁都不认识谁。
“到了。”
一个急刹,晴簌地冲了出去。
“该死!”晴不会魔法,她冲到点定住,就从空中掉了下,还好,这不是那个世界,晴没有感觉到痛。
“啊——————————”
一声锐利的尖叫声响彻这个奇怪的地方。
晴捂住耳朵,朝“地面”...
天啊,这是地面吗?圆不溜湫的,一件花格子裙,一头假发似的卷发,胀得鼓鼓的小腿,缩脚的小红细高根鞋(穿这鞋怎么走路?!它肯定踩烂了几十双,不!起码几千双这样的鞋!),这是人,一个胖妇女!不!这不是人,胖妇女生物! 原来,晴是掉在了这个胖妇女生物的身上才不痛的!!
霎时,刚才还在自顾自地行走、漂浮、飞翔、蠕动的生物全部围了过来。
“它是谁?”(晴:我是人,应该用“她”,而不是“它”,笨蛋生物!) 为什么它们都不注意自己的同类,而关注晴?
“挖卡卡,它好奇怪哦!”(晴:装嫩!)
“这,这..它,她是人,人类!!!”(晴:人类么,我就是人类有什么好稀奇的,比你们这些笨蛋生物高级得多!!)
“人类!?!人类!人类几百年前毁了我们家族,我们要报仇!!”(晴:我们人类毁了这些笨蛋生物的家族?历史书上没讲啊!)
“对!我们要报仇!报仇!”
“报仇!”
晴:无语ing..
“不要怕,”(该死,谁怕了!)一只手搭上了晴的肩膀,“正如你所想,它们的确是笨蛋,而且,它们说的话绝对不会付诸行动,第二天它们什么都忘记了。”
“你不是啊。”
“不,我以前是,但从我降世以来,身体里就像存放了两个生物,我身体里另外那个生物它说的话我总是会无条件执行,执行的时候没有任何知觉,
“有一天,我杀了这个地方一个生物,从此,我很害怕,虽然什么事它们第二天都会忘记,我想我也会忘记,就那次第二天,我没有忘记,我依然记得我昨天杀了它,
“以后,我身体里的那个生物再没给我任务,而我走了很远,一直走到这个地方的尽头,
影片中有两个年龄、外貌完全相同的青年女性─一个波兰人、一个法国人,她们都叫维洛尼卡,生活习性完全一致:她们都爱好音乐、擅长歌唱,有着相同的举止和习惯,并且都有家族遗传性心脏病。她们之间时空揆隔,没有血缘关系,没有来往接触,但她们彼此能感觉到对方的存在。当波兰的维洛尼卡死去时,法国的维洛尼卡感到悲伤,似乎自己正在被埋葬。影片中有许多细节表现两人间的神秘联系,她们都喜欢随身携带一个玻璃球,法国的维洛尼卡在梦中,球体竟然映出了已经逝去的波兰的维洛尼卡离家时同样的景象。
情节、人物的神秘性是许多影片用来吸引人的叙事因素,但《维洛尼卡的双重生活》并不“耸人听闻”,其叙事风格是散文化的,淡淡的带着些许忧伤,总体格调则呈现着温馨的暖意,这是由其影调风格带来的。全片都在使用金黄色滤镜片,所有的场景,包括波兰的维洛尼卡的葬礼都笼罩在一片暖色调中。这种主观性的光效很大程度上凸显出基耶斯洛夫斯基的影片立意,他不是要简单地叙说一个神秘的故事,而是要通过这个极致化的、带有寓言色彩的故事,让观众去参与一个发现。影片的片头是两个婴孩时期的维洛尼卡分别在母亲的引领下,或仰望浩瀚星空,或俯视一枚春天的新叶,于是一个认识世界和生命的过程开始了。不仅是这部影片,几乎基耶斯洛夫斯基的所有影片都在引领观众感悟生命、体察人生,他的艺术中洋溢着人类生命的灵光,并将其罩上了一层神秘的、有时甚至近乎神圣的色彩。所有影片中的人物都是彼此纠葛的,由此构成戏剧性情节;但基耶斯洛夫斯基影片中的人物通常不是依靠情节设置,而是通过生命中难以言说的神秘联系走到了一起。
基耶斯洛夫斯基这样独特结构影片的方式表现出强大的人文关怀,他是很久以来人们所期待的艺术家,他的影片充盈着日渐失落的人类最宝贵的内涵:情感的慰藉、人性的关怀、爱的启迪和对世界与未来的巨大悲悯。可是,面对残忍的现实逻辑,这种人性关注的声音常常显得弱小无力,常常被淹没在更为狰狞强悍的“血雨腥风”中。1994年的戛纳电影节上,基耶斯洛夫斯基带来了试图以“爱”拯救世界的《红色》,他如同热情莽撞、孤军奋战的堂吉诃德,固执地以信仰的力量改变世界的冷漠状态。而美国的“神奇小子”塔伦蒂诺带来了枪弹横飞、鲜血淋漓的《低级小说》,那是一个人性迷失、无爱的暴力世界。结果,后者取得了胜利,人们承认了残忍的人性法则,向暴力伸出了棕榈枝。而基耶斯洛夫斯基也就此引退,《红色》成为他为人类在世纪末进行的最后绝唱。
撰写这篇文章时,内心充满忧伤,1996年3月13日是一个令世界影坛黯然失色的日子,基耶斯洛夫斯基猝然离世。他去世后所留下的缺憾是无法弥补的,基耶斯洛夫斯基对被痛苦现实困扰的人类表现出了真诚的眷顾和脉脉深情的怜惜,并且尝试以艺术的温情弥合心灵的创痛,他为人类构筑了一个可以舒展疲惫身心、寄托灵魂的精神家园。今后的日子,我们还会遇到这样的大师吗?
基耶斯洛夫斯基1941年6月27日出生于波兰,1969年毕业于波兰洛兹电影学院,1970年至1978年在华沙纪录片厂任导演,先后拍摄了《工厂》、《小孩》、《初恋》、《生活故事》、《医院》、《年龄不同的七女子》等13部影片。1975年,他执导了首部剧情片《人员》。此后,又拍了《疤》、《影迷》、《无止无休》等影片。使他取得国际声誉的影片是1987至1989年间为波兰电视台拍摄的10集系列故事片《十诫》,其中“关于杀人的短片”和“关于爱情的短片”作为电影单片发行,前者获得1987年戛纳电影节评委会奖和欧洲影展最佳影片奖。
1991年的《维洛尼卡的双重生活》是在法国拍摄的,影片中维洛尼卡的扮演者伊莱娜・雅各布作为一名欧洲演员,与眩目喧闹的好莱坞明星形成鲜明对比,含蓄的美中有种恒久的气息,在噪杂矫饰的都市熏染下仍保留着难得的宁静、恬淡,不能简单地用类似“纯洁”、“善良”、“美丽”、“沉静”等字眼来形容她的气质,只能说她是现代社会中难得的一个“纯正”的女人,既有女性的激情,又有母性的慈爱,既现代,又传统。雅各布的表演与基耶斯洛夫斯基的出色导演技巧共同完成了一部艺术杰作,雅各布本人也因此获得了戛纳电影节最佳女演员的奖誉,她后来又主演了基耶斯洛夫斯基的另一部影片《红色》。
1993年至1994年间,基耶斯洛夫斯基完成了再次轰动国际影坛的《蓝・白・红》三部曲,影片立意源自法国国旗的三种颜色,它们分别代表“自由、平等、博爱”,三部影片依次阐述了三个主题。在这三部曲中,基耶斯洛夫斯基依然延续一贯风格,用包蕴着哲理性内涵的叙事场景表达对当代人生存状态的深刻理解。
最后想提及的是,基耶斯洛夫斯基电影生涯的最后一个镜头,是在《红色》中,女主人公瓦伦蒂娜在红色背景下,面含忧郁的注视。这也是基耶斯洛夫斯基对我们永恒的注视,给我们温暖、给我们希望、也给我们思考……
这个班的学生不简单
九月的校园,到处洋溢着学生们欢乐的笑声。我一个人来到学校的林阴小路散步。“hi!武老师,新来的?”一个坐在树上的学生说。我点了点头,问他:“你是哪个班的?”“3(0)”话音刚落,那个学生就不见了。我正纳闷,上课铃响了。我急忙走向教学楼。
来到班上,所有的学生都在打闹着。我推开门,重重地咳嗽了一声。“啪”一条滑溜溜的东西落在我头上。我一把捉下那个东西一看:“啊啊啊啊啊!蛇!”一条正吐着芯子的蛇在我面前摇晃着,我顿时感到头晕眼花,身子往旁边一歪,后来发生什么我不知道,只听见全班同学一个劲地喊:“老师,老师……”
(未完待续)
咳嗽
当食物呛入气管、吸入刺激性气体时,咳嗽能将呼吸道异物或分泌物排出体外,这样的咳嗽不能强忍。
而反复咳嗽可能是支气管炎、肺炎等呼吸系统疾病的表现。中医讲“五脏六腑皆令人咳,非独肺也”,过敏性鼻炎、支气管哮喘、血管神经性水肿、心脏病引起的肺淤血,甚至外耳道异物都会引发咳嗽。因此,如果出现不明原因的咳嗽时,应尽快去医院就诊。
耳鸣
用手捂住耳朵,你会觉得耳朵里嗡嗡作响,这是因为外界嘈杂的声音被阻隔,让你听到了耳旁组织的血流声。首都医科大学耳显微外科主任戴海江教授介绍,寂静的环境能够放大我们的听力,但如果你平时也能听到“脑袋里鸣叫”,耳中出现铃声、哨声、波浪声、蝉鸣声等,而周围环境并没有相应声源时,就得小心了。耳鸣专家表示:“我诊治过不少耳鸣患者,从外表上看,他们至少比实际年龄老10岁。”严重的耳鸣不但影响听力,干扰正常睡眠,还会引起焦虑、烦躁或抑郁等一系列精神问题。
噪音是引起耳鸣最常见的原因。当某个频率的噪声损伤了听神经末梢细胞时,就会产生相应频率的耳鸣。实际上,超过安全噪声标准(80~90分贝A声级)的噪音都有可能造成耳鸣及耳聋。滥用药物也是一个重要因素,研究发现,包括心得安、异搏定、布洛芬在内的多种常用药物都可能引起耳鸣。此外,高血压、冠心病、糖尿病等常见慢性病也可使微循环发生障碍,从而导致耳鸣。
听神经末梢细胞一旦造成损伤很难恢复如初,但通过营养神经药物等治疗手段可以缓解症状。已有耳鸣的人切忌酗酒、吸烟、熬夜等不良习惯。
磨牙
睡觉时牙齿咬得咯吱响,醒后面部肌肉紧张、酸痛,并伴有头痛,如果你有此症状,很可能患上了“磨牙症”。引起磨牙的原因很多,侧卧位或俯卧位睡觉、牙齿咬合异常,都会让人不自主地磨牙;磨牙还可能是胃肠功能紊乱、肠道寄生虫、尿酸增多症等的表现。另外,口腔是人体首先兴奋的部位,当人们工作紧张、精神压力增大时,也可能磨牙。
别看磨牙事小,长期磨牙会引起牙齿及牙周组织的广泛损耗,不但可能引发牙周疾病,还会导致面容苍老,影响美观。如果经常磨牙,可在睡前用毛巾热敷上下颚,能松弛咬合肌肉,尽量放松自己,适当做些体操、泡泡热水澡、听听轻音乐等。
打鼾
偶尔打呼噜不必紧张。如果鼾声响亮不均匀,而且有晨起口干、白天疲乏无力、嗜睡、头脑昏昏沉沉、反应迟钝、注意力不集中、记忆力减退等情况,那可能是得了阻塞性睡眠呼吸暂停综合征。睡眠时常出现呼吸暂停,会导致血液中氧含量明显减少,使机体处于缺氧状态,这不但影响睡眠质量,还会引发心脑血管及内分泌系统疾病。
研究发现,肥胖者、男性、孕妇等都是打鼾的高发人群。如果打鼾者一觉醒来有口干舌燥、头晕、头痛,白天困倦、嗜睡,甚至工作或开车时睡着,以及记忆力减退、注意力不集中、反应迟钝等表现,最好去医院就诊。
关节响
关键词:神经生长因子受体;PRL瘤;生物学特性
PRL瘤是临床常见的具有高分泌功能的良性肿瘤,约占所有垂体腺瘤的40%~60%[1],其主要临床表现为闭经、溢乳、不孕(育)、高泌乳素血症、垂体占位性病变。既往研究认为神经生长因子(NGF)对PRL瘤有负性调节作用[2],本研究旨在探讨PRL瘤表达p75-NGFR与其生物学特性的关系。
1 资料与方法
1.1一般资料 选取2008年2月~2013年10月我院收治的82例PRL瘤患者作为研究对象,其中男性37例,女性45例;年龄19~65岁,平均(38.1±8.5)岁;术前泌乳素水平300~600 ng/ml 26例,100~300ng/ml 40例,50~100ng/ml 16例;肿瘤体积5.6~47.2 mm3,平均(16.7±7.5)mm3;肿瘤直径≤10 mm 27例,肿瘤直径>10 mm 55例;非侵袭性肿瘤45例,侵袭性肿瘤37例。
1.2方法
1.2.1 p75-NGFR表达检测 ①标本处理及免疫组化:PRL瘤组织标本均常规石蜡包埋,作5 mm连续切片,用抗生蛋白链菌素生物素复合体(SABC)法作免疫组化染色。以PBS代替一抗为阴性对照,用已知的阳性片为阳性对照。②计算标记指数:在光学显微镜400倍视野下,每张切片随机取10个高倍视野,每个视野计数100个细胞,总共计数1000个细胞。标记指数=(1000个细胞内染色为阳性的细胞数/1000)×100%。③结果判断:标记指数
1.2.2 PRL瘤侵袭性判断标准[3] 有下列情况之一者认为肿瘤具有侵袭性:①术前影像学检查显示肿瘤包绕单侧或双侧颈内动脉,或侵入海绵窦生长;②术中可见鞍底骨质破坏;③术后鞍底硬膜送检有肿瘤细胞浸润。
1.3统计学分析 采用SPSS17.0统计软件,计数资料用百分率(%)表示,计量资料用均数±标准差(MEAN±SD)表示。p75-NGFR表达阳性率比较采用四格表χ2检验,ALD比较采用成组设计t检验,P
2 结果
2.1 PRL瘤患者p75-NGFR表达阳性率 82例PRL瘤患者,32例p75-NGFR表达阳性,阳性率为39.0%。
2.2 p75-NGFR与PRL瘤生物学特性的关系 男性组与女性组p75-NGFR表达阳性率、ALD相比差异无统计学意义(P>0.05);血清泌乳素≤300 ng/ml组p75-NGFR表达阳性率、ALD显著高于血清泌乳素>300 ng/ml组(P10mm组(P
3 讨论
垂体腺瘤是目前临床上常见的良性肿瘤,约占颅内肿瘤的10%,在颅内肿瘤中仅低于脑胶质细胞瘤与脑膜瘤[4]。根据细胞分泌功能分类法,垂体腺瘤可以分为PRL瘤、生长激素垂体腺瘤、促肾上腺皮质激素垂体腺瘤等,其中以PRL瘤最为常见。值得注意的是,临床上可见部分PRL瘤患者呈侵袭性生长且生长速度快,术后很快就出现复发,并且易并发垂体瘤卒中,但是其发生机制至今尚未完全明确[5]。
NGF是第一个发现的神经营养家族成员,它通过结合NGFR发挥维持与促进神经元细胞的存活、分化、成熟的作用。NGFR可以分为高亲和力受体、低亲和力受体两大类,本研究中p75-NGFR是一个分子量为75kD的跨膜糖蛋白,属于NGF的低亲和力受体,它可结合神经营养家族每一个成员,其主要作用是调节酪氨酸激酶活性,促进NGF结合高亲和力受体TrkA,诱导细胞凋亡等[6]。有研究认为PRL瘤表达p75-NGFR明显高于其他类型垂体腺瘤[7],但有关PRL瘤表达p75-NGFR与其生物学特性关系的研究较少见。为此,本研究共分析82例PRL瘤患者,结果显示32例p75-NGFR表达阳性,阳性率为39.0%。通过进一步分组、对比分析,结果显示男性组与女性组p75-NGFR表达阳性率、ALD相比差异无统计学意义(P>0.05);血清泌乳素≤300 ng/ml组p75-NGFR表达阳性率、ALD显著高于血清泌乳素>300 ng/ml组(P10mm组(P
参考文献:
[1]Vozniak OM.Technical peculiarities of trans-sphenoidal surgical interventions for prolactin-secreting pituitary adenoma[J].Klin Khir,2013,32(10):59-62.
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[3]何跃,雷霆,张华楸,等.神经生长因子受体在垂体泌乳素腺瘤中的表达及其与肿瘤生物学特点的相关性研究[J].中国临床神经外科杂志,2006,11(12):727-730.
[4]Bakhtiar Y,Arita K,Hirano H,et al.Prolactin-producing pituitary adenoma with abundant spherical amyloid deposition masquerading as extensive calcification[J].Neurol Med Chir(Tokyo),2010,50(11):1023-1026.
[5]Rotondo F,Kovacs K,Macdonald RL,et al.Non-small cell bronchial carcinoma metastasizing into a prolactin-producing pituitary adenoma[J].Int J Surg Pathol,2013,21(1):68-71.
[关键词] 丹参; 水杨酸; PAL和TAT; 迷迭香酸; 钙通道抑制剂; 钙调素拮抗剂
水杨酸(salicylic acid,SA)是一种有效的诱导子,被广泛应用于多种药用植物以提高其次生代谢物的合成积累量。如用SA诱导可以显著提高东莨菪中的托品烷生物碱含量[1]、红豆杉中的紫杉烷和紫杉醇含量[2-3]、肉苁蓉培养细胞中苯乙醇苷的含量[4]、丹参细胞培养物中丹酚酸B的含量[5]。钙作为植物体内重要的第二信使,主要介导包括诱导子在内的许多刺激因子所引发的细胞信号转导进程,信号的变化发生在生理反应之前[6]。钙离子可将诱导子信号传递给下游的靶酶进而激活靶酶,并通过酶的作用合成多种次生代谢物质[7]。研究表明,用诱导子处理欧芹细胞后,2 min内可出现Ca2+内流增加[8]。水杨酸处理可以引起植物胞质Ca2+浓度增加,胞外Ca2+螯合剂EGTA、质膜Ca2 +通道抑制nifedipine,LaCl3均可减弱水杨酸的诱导效应[9]。胞内钙库Ca2+释放参与了壳聚糖诱导茜草细胞合成蒽醌的信号转导过程[10]。麦角固醇处理烟草细胞引起细胞质中钙离子的双峰型短暂增加,钙离子通道抑制剂可以阻止或影响钙峰的发生[11]。以上结果说明,钙离子对植物次生代谢物质的合成积累有非常重要的作用[12]。
迷迭香酸(rosmarinic acid, RA)是植物体内的一种酚酸类次生代谢物,具有较强的抗氧化、抗菌、抗炎、保肝、抑肿瘤等作用[13]。迷迭香酸是丹参Salvia miltiorrhiza Bunge中指标性成分丹酚酸B的合成前体,也是丹参中重要的有效成分之一。本项目组前期研究发现,SA可以调控丹参培养细胞中迷迭香酸合成的2个关键酶苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)和酪氨酸氨基转移酶(tyrosineaminotransferase,TAT)的活性,从而催化丹酚酸B及其合成前体迷迭香酸的生物合成[14-15]。用外源Ca2+处理丹参悬浮培养细胞发现,不同浓度的外源Ca2+对迷迭香酸合成及其相关酶活性均产生了影响,推测胞外Ca2+内流可能参与了迷迭香酸的合成[16]。但是,对于SA是如何被丹参细胞内的信号分子感受、传递并引起酚酸类化合物合成代谢的一系列过程还不清楚,对胞内外钙离子是否参与SA诱导丹参迷迭香酸的生物合成过程的研究还不够深入。
本研究以丹参幼苗为材料,考察SA诱导子对丹参迷迭香酸生物合成及其合成关键酶PAL和TAT活性的影响;并利用质膜钙通道抑制剂Vp(verapamil,异搏定)和LaCl3、钙调素拮抗剂TFP(trifluoperazine,三氟拉嗪)和胞内钙通道上IP3受体抑制剂LiCl处理,进一步研究胞内、胞外Ca2+在SA诱导丹参幼苗合成迷迭香酸过程中的作用,为探讨诱导子诱导植物次生代谢物合成的作用机制奠定基础。
1 材料
1.1 仪器
HC-3018R型高速冷冻离心机(长沙湘仪);UV-240型紫外分光光度计(上海美谱达);优普UPH-IV-90超级组合型超纯水机;GM-033 型隔膜真空泵,抽气速度20 L·min1,10 μm;LC-10ATVP型液相色谱仪(日本岛津公司),包括SPD-10AVP型紫外检测器,shim-pack VP-ODS型色谱柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),LC-10ATVP输液泵,7725i型进样器(4.6 mm×250 mm,5 μm),数据采集系统Class VP色谱工作站。
1.2 试剂
色谱级甲醇、乙腈购自美国TEDIA试剂公司,色谱级磷酸购自西安试剂厂,对照品迷迭香酸(纯度≥98%;批号 111106),购自中国食品药品检定研究院。Vp(verapamil,异搏定)和TFP(trifluoperazine,钙调素拮抗剂)均购自Sigma公司,LaCl3购自上海山浦集团,LiCl购自Amresco公司。α-酮戊二酸 (K0005,WOLSEN),DTT(C8166,Sanland Chemical),酪氨酸(F20090915,国药集团), Vit B6 (01-079,北京奥博星),L-苯丙氨酸 (F20100805,国药集团),PVP (101210,上海蓝季),EDTA-2Na (分析纯,广州金华大)。
1.3 材料来源与处理
丹参种子来源于陕西天士力植物药业有限公司商洛丹参GAP药源基地。将种子用自来水浸泡24 h后进行发芽处理。发芽温度为25 ℃恒温,发芽床为滤纸或双层纱布。待种子发芽后转入营养钵温室培养,培养基质为营养土,生长温度25 ℃,光照12 h·d1,光照度400 μmol·m2·s1,相对湿度75%,每隔1 d用自来水浇灌。
2 方法
2.1 水杨酸诱导处理
待丹参幼苗叶龄50 d时(约8~10片真叶),选取形态、长势、大小基本一致的幼苗,分为4组,在叶片上(包括叶面和叶背)喷洒3种不同浓度的SA水溶液(以喷洒蒸馏水为对照),喷至叶片上药液欲滴为止。分别在喷施 SA后的不同的时间(0,8,12,24,48,72 h)取样,液氮冷冻,储存在-80 ℃冰箱。用来检测迷迭香酸积累量,PAL,TAT活性,确定SA适宜的诱导时间。
2.2 钙通道抑制剂/钙调素拮抗剂处理
当丹参幼苗叶龄50 d时(约有8~10片真叶),选取生长状态基本一致的幼苗分成12组(6组为抑制剂/拮抗剂处理,6组为抑制剂/拮抗剂+水杨酸处理),分别单独喷施质膜钙通道抑制剂Vp,LaCl3,胞内钙调素拮抗剂TFP,胞内钙通道抑制剂LiCl,以及抑制剂/拮抗剂的组合Vp+LaCl3,TFP+LiCl。喷施抑制剂/拮抗剂后60 min再喷施水杨酸(以蒸馏水作为对照)。各处理分别取样后迅速用液氮冷冻,储存在-80 ℃冰箱。根据前期试验筛选,Vp的处理浓度为250 μmol·L-1,LaCl3 处理浓度为4 mmol·L-1,TFP 处理浓度为200 μmol·L-1,LiCl处理浓度为4 mmol·L-1。
2.3 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性检测
按照文献[15]的方法进行。将处理后的丹参幼苗叶片剪成约1 cm×1 cm的方块并精确称重。加入 4 mL 4 ℃下预冷的提取介质 (含 0.05 mol·L-1硼酸缓冲液,5.0 mmol·L-1巯基乙醇,1.0 mmol·L-1 EDTA-2Na,5%甘油,PVP,pH 8.8),冰浴下迅速研磨匀浆后,过滤,滤液在4 ℃下4 000 r·min1离心 15 min,上清液用于检测酶活性。酶活性的测定系统包含: 酶液 0.5 mL, 硼酸缓冲液 (pH 8.8) 2 mL,0.02 mol·L-1 的L-苯丙氨酸1 mL、蒸馏水 1 mL;对照不加L-苯丙氨酸,用1 mL蒸馏水代替。反应液于 37 ℃水浴中保温 60 min 后加入 0.2 mL 6 mol·L-1 HCl终止反应。在290 nm下测定吸光度,以每分钟A变化0.1为1个酶活单位U。
式中,Vt酶液总体积(mL);FW样品鲜重(g);Vs测定时取酶液的体积(mL);ν 反应液总体积(mL);t反应时间(h)。
2.4 酪氨酸氨基转移酶(TAT)活性检测
按照文献[15]的方法进行。将处理后的丹参幼苗叶片剪成约1 cm×1 cm的方块并精确称重。加入 4 mL 4 ℃下预冷的提取介质(0.1 mol·L-1磷酸钾缓冲液,0.1 mmol·L-1 EDTA,80 mmol·L-1α-酮戊二酸,0.2 mmol·L-1 Vit B6,1 mmol·L-1 DTT,pH 7.3),冰浴下迅速研磨匀浆后,过滤,滤液在4 ℃下 12 000 r·min1离心 30 min,上清液用于酶活性的检测。测定系统含有酶液 0.2 mL,0.2 mol·L-1磷酸钾缓冲液 (pH 7.5) 3 mL,10 mmol·L-1α-酮戊二酸 0.2 mL,88 mmol·L-1酪氨酸0.2 mL,0.2 mmol·L-1 Vit B6 0.1 mL。反应液于 37 ℃水浴中保温 30 min 后加入 0.5 mL 10 mol·L-1 NaOH终止反应。然后于37 ℃水浴中继续保温 30 min。
在331 nm下测定反应液吸光度,以每分钟A变化0.1为1个酶活单位U。
式中,Vt酶液总体积(mL);FW样品鲜重(g);Vs测定时取酶液的体积(mL);ν 反应液总体积(mL);t反应时间(h)。
2.5 迷迭香酸的提取及含量检测
按照文献[15]的方法。收获不同处理的丹参幼苗叶片,在47 ℃真空干燥箱中干燥至恒重。将干燥的叶片研碎成粉末,称取0.01 g左右置具塞试管中,用70∶30的甲醇-水溶液在超声波提取器中提取45 min。提取液在8 000 r·min1下离心10 min,上清液再用0.22 μm微孔滤膜过滤后待检测。
含量检测采用高效液相色谱法(HPLC)。色谱条件为:shim-pack VP-ODS型色谱柱(4.6 mm ×150 mm, 5 μm);流动相乙腈-水-磷酸(25∶75∶0.1);流速 1 mL·min1;进样量 10 μL;检测波长 285 nm;柱温 25 ℃。
2.6 数据分析
采用SPSS软件进行相关性分析和显著性检验,用Graphpad软件进行误差分析。实验为单因素完全随机设计,每个试验3~4重复。
3 结果与分析
3.1 水杨酸对丹参幼苗迷迭香酸合成及其关键酶活性的影响
3.1.1 水杨酸诱导丹参幼苗合成迷迭香酸的适宜浓度和时间 用0.5,2.0,4.0 mmol·L-1的SA处理丹参幼苗,分别在诱导后的不同时间检测丹参叶片中的迷迭香酸合成积累量,考察适宜的诱导浓度和诱导时间。与对照相比,3种浓度的水杨酸均提高了丹参叶片中迷迭香酸的合成积累量(图1)。但不同浓度的SA对迷迭香酸的合成积累具有差异性,诱导效果最好的是2.0 mmol·L-1的SA,其次是4.0,0.5 mmol·L-1;从诱导时间方面来看,迷迭香酸质量分数在SA诱导前仅为(16.36±1.39)mg·g1,SA诱导后的8 h含量有所提高,诱导后24 h时迷迭香酸含量达到峰值,随后逐渐下降,但始终高于对照。2.0 mmol·L-1的SA诱导迷迭香酸的最大积累量可达到(40.51±2.16) mg·g1,比对照提高了1.97倍;0.5 mmol·L-1的SA诱导迷迭香酸的最大积累量达到(28.91±1.51) mg·g1,比对照提高了1.41倍;4.0 mmol·L-1的SA诱导迷迭香酸的最大积累量达到(37.85±4.58) mg·g1,比对照提高了1.84倍。
综上所述,2.0 mmol·L-1的SA可以显著提高丹参幼苗叶片中迷迭香酸的合成积累量(P
3.1.2 水杨酸对丹参幼苗迷迭香酸合成相关酶活性的影响 用0.5,2.0,4.0 mmol·L-1的SA处理丹参幼苗,检测不同浓度的水杨酸处理丹参叶片后PAL和TAT活性变化。与对照相比,3种浓度的水杨酸均提高了丹参叶片中迷迭香酸合成相关酶的活性(图2)。但不同浓度的SA对关键酶合成积累具有差异性,其中诱导效果最好的是2.0 mmol·L-1,其次是4.0,0.5 mmol·L-1的SA;从诱导时间来看,关键酶活性在SA诱导后的12 h达到峰值,随后逐渐下降。0.5 mmol·L-1的水杨酸诱导后PAL,TAT在12 h的酶活分别是对照的1.47,1.15倍;2.0 mmol·L-1的SA诱导后PAL,TAT在12 h的酶活分别是对照的1.66,1.62倍;4.0 mmol·L-1的水杨酸诱导后PAL,TAT在12 h的酶活分别是8 h的1.47,1.32倍,均差异显著(P
由此可知,不同浓度的水杨酸诱导对迷迭香酸的积累和关键酶活性有着不同的效应。结合图1发现,水杨酸对迷迭香酸和酶活性的影响是激发式的,即随着诱导后时间的延长,次生代谢物质含量和酶活性上升到一定的水平后逐渐下降,趋于平稳。综上所述,2.0 mmol·L-1的SA可在较短的时间内诱导丹参幼苗合成较多的迷迭香酸,且对幼苗生长没有造成伤害(数据未显示)。因此,在后续的试验中均以2.0 mmol·L-1的SA作为诱导子。
3.2 钙通道抑制剂/钙调素拮抗剂抑制水杨酸诱导丹参幼苗合成迷迭香酸
3.2.1 胞外钙通道抑制剂抑制水杨酸诱导丹参幼苗合成迷迭香酸 分别用浓度为250 μmol·L-1的Vp,4 mmol·L-1的LaCl3预先处理60 min后,再用浓度为2.0 mmol·L-1的SA处理,考察胞外钙通道抑制剂对水杨酸诱导丹参幼苗合成迷迭香酸的影响(图3)。
SA诱导丹参幼苗叶片后,迷迭香酸含量从(3.34±0.42) mg·g1提高到(7.73±0.33) mg·g1,显著高于对照组(P
3.2.2 胞内钙通道抑制剂/钙调素拮抗剂抑制水杨酸诱导丹参幼苗合成迷迭香酸 分别用浓度为200 μmol·L-1的TFP,4 mmol·L-1的LiCl处理60 min后,再用2.0 mmol·L-1的SA处理,考察胞内钙通道抑制剂/钙调素拮抗剂对水杨酸诱导丹参幼苗合成迷迭香酸的影响(图4)。
钙调素拮抗剂TFP和胞内钙通道抑制剂LiCl单独处理时,TFP和LiCl处理组迷迭香酸的含量均低于对照组。与水杨酸处理组的迷迭香酸积累量相比,SA+TFP处理使迷迭香酸含量降低5.49 mg·g1,SA+LiCl处理使迷迭香酸含量降低4.67 mg·g1,抑制效果均达到显著水平(P
植物次生代谢过程中,诱导子或生理性刺激使细胞质膜或者液泡膜上的钙离子通道打开,胞内Ca2+浓度上升[22]。Ca2+作为第二信使,通过信号级联放大,使得细胞核编码相关蛋白的表达,从而产生次生代谢物质[7]。钙离子通道阻断剂可以使钙离子通道开放程度减弱或使其开放时间缩短,阻止或减弱Ca2+流入细胞质从而减弱或阻碍诱导子的诱导作用。异搏定是一种质膜钙通道抑制剂,它可以使钙通道开放程度减弱,还可以使其开放时间缩短[23]。如诱导子在促进长春花悬浮细胞吲哚生物碱合成中,添加抑制剂异搏定后使吲哚生物碱含量降低,钙离子的流入参与这一过程[24]。LaCl3是质膜钙通道抑制剂,能通过阻止Ca2+的跨膜流动而使其不能发挥信史作用,从而有效地抑制诱导子诱导的植物细胞或组织的防御反应[24]。如LaCl3可以阻止真菌诱导后吲哚生物碱合成过程中的Ca2+流入和Ca2+依赖的信号转导[22]。钙调素拮抗剂TFP在有钙离子参与的条件下能抑制CaM依赖的调节功能,导致靶酶不能被激活、次生代谢物质无法形成[25]。LiCl 是IP3受体的抑制剂,可抑制磷酸肌醇再生,导致小麦原生质体内钙离子含量显著减少[26]。本研究发现,水杨酸诱导提高了丹参幼苗迷迭香酸的合成量及其相关酶的活性,钙通道抑制剂/钙调素拮抗剂处理均可抑制水杨酸诱导丹参叶片中迷迭香酸的生物合成及其相关酶的活化。但胞外钙通道抑制剂与胞内钙通道抑制剂/拮抗剂联合处理的效果并没有比单独处理的效果强,说明2种抑制剂/拮抗剂之间可能会发生某种相互抑制或拮抗作用。
前期用外源钙离子处理丹参培养细胞发现,丹参细胞中迷迭香酸合成量与外源施加的Ca2+浓度显著相关,外源Ca2+影响迷迭香酸的生物合成是通过影响胞内Ca2+浓度而实现[16]。说明胞内外的钙离子在水杨酸诱导丹参迷迭香酸合成过程中发挥着重要的信号转导作用,主要机制是水杨酸诱导丹参后激活胞内钙信号,钙信号通过信号级联放大作用,激活下游的关键酶,关键酶通过控制次生代谢物质的合成来响应水杨酸诱导植物次生代谢物的生物合成。
综上所述,水杨酸可以诱导丹参迷迭香酸合成积累量增加和PAL,TAT关键酶的活化,胞外钙通道抑制剂异搏定(Vp),LaCl3,胞内钙调素拮抗剂三氟啦嗪(TFP)、胞内钙通道抑制剂LiCl均可抑制水杨酸诱导的迷迭香酸生物合成及其相关酶活化,说明钙离子参与了水杨酸诱导丹参迷迭香酸生物合成的信号转导。
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Regulation effects of intracellular and extracellular Ca2+ on biosynthesis of
rosmarinic acid induced by salicylic acid in young seedlings of Salvia miltiorrhiza
CAO Rong-rong, DANG Xiao-lin, XING Bing-yu, ZHANG Jing-yi, DONG Juan-e*
(College of Life Sciences, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling 712100, China)
[Abstract] Objective: To investigate the effect of intracellular and extracellular Ca2+ on the biosynthesis of rosmarinic acid (RA) induced by salicylic acid in young seedlings of Salvia miltiorrhiza. Method: Young seedlings of S. miltiorrhiza were used to select an optimal concentration of salicylic acid(SA), and then use the optimal concentration of SA to investigate the effects of extracellular Ca2+ channel inhibitors Verapamil,LaCl3, intracelluar calmodulin antagonist TFP and intracelluar Ca2+ channel inhibitors LiCl on the biosynthesis of RA and related enzymes. Result: SA increased the accumulation of RA and the activities of PAL and TAT, especially the SA of 2 mmol·L-1 after 24 h. SA improved the accumulation of RA to (40.51±2.16) mg·g1, which was 1.97 times than that of control, and the activities of PAL, TAT were 1.42 times and 1.29 times than those of the control. However, Vp,LaCl3, TFP, LiCl inhibited the effects of SA evidently. Conclusion: Ca2+ plays a key role in the regulation of the induction process.
答案真是出乎我们的意料。看上去自由自在,无拘无束的飞行动物和游水动物,它们的运动似乎恰恰遵循着严格的规律。科学家们通过大量的观察和试验,发现飞行动物和游水动物的运动过程中存在着一个神秘的常数,那就是它们的翅膀或尾巴的振动频率、振幅以及运动速度三者之间的关系――振动频率乘以振幅再除以运动速度,计算得到的数值总是落在0.2~0.4之间。
比如,世界上最小的鸟类――蜂鸟,其双翅展开仅有10厘米左右,飞翔时振幅大约是20厘米。蜂鸟的飞行速度非常快,大约能达到50米/秒。而科学家们以往观察到的蜂鸟飞行时双翅振动频率在50赫兹-70赫兹之间,根据上述公式计算出来的蜂鸟的运动常数就落在0.2~0。4之间。
与蜂鸟体形相差悬殊的海豚也是科学家们观察的一个对象。成年海豚的体长一般在3米左右,在大海里游动时,海豚及尾巴摆动的振幅大约是1米,频率是每分钟30次左右,游泳速度是每小时100千米。根据公式计算出来的海豚的运动常数是0.3,也落在0.2~0.4之间。
这不仅仅是巧合。研究者们做了大量的试验,发现几乎所有的飞行动物和游水动物的运动机制中都存在这个神奇的常数。事实上,只有当这一运动常数的值处于0.2~0.4之间时,动物们才能达到最佳的运动状态。
虽然目前科学家们还不清楚为什么会存在这个运动常数,它的值又为什么恰恰落在0.2~0.4之间,但这一神奇的常数似乎像物理学中著名的光速不变原理那样放之四海而皆准,也像光速一样神秘。它能够帮助生物学家们根据动物化石的身体构造判断出那些早已灭绝了的动物曾经具有怎样的运动速度。甚至,不能排除,这一常数很可能对外星生物也同样适用。很多科学家都表示:“如果在其他星球上真的存在游水生物或飞行生物的话,我们相信,它们的运动也遵循着同样的规律。”
此外,这一常数还能帮助军方研制出各种高性能的飞行器。比如说,一个翼长15厘米、翼振振幅为10厘米的机械间谍如果要做最有效的飞行的话,其最佳翼振频率应该在30次/秒左右。目前,美国军方已经着手研制类似鸟的有冀飞行器,在配备上微型摄像之后,这样的机械鸟将可能渗入敌方的任何机密要塞进行刺探。当然,他们最感兴趣的还是能够研制出体积更小,无孔不入的机械昆虫,相信这一天的到来也为时不远。
(选自《科学之谜》2005年11期)
阅读训练:
1.文章开头有何特点?这样写有何好处?
答:____
2.“无拘无束的飞行动物和游水动物,它们的运动似乎恰恰遵循着严格的规律”,这一“规律”指什么?
答:_____
3.文章为何仅以蜂鸟、海豚为例来说明这一神秘的运动常数?
答:_____
4.“无拘无束的飞行动物和游水动物”为何会存在这一神秘的运动常数?
答:_____
5.请举例说说文章的语言十分准确这一特点。
答:______
6。你还知道生物界其他一些神秘的规律吗?请写出一两个来。
答:_____
7.人们了,解这一神秘的运动常数有何作用?
答:____
这个东西被人匆匆地命名为“飞棍”,它在照片中的外表呈圆柱棍子状,两侧有多片膜状物,那些晶莹透明的膜状物究应该是它能移动的秘密——“翅膀”,飞行时会如波浪般不停扭动。它似乎更爱成群结队地出现,能在全方位发现它的身影,而且大小不一,可速度绝对能用“音速”相称……
飞棍是真实的神秘还是虚幻的骗局?是外星生命制造并留在下的新型生物?或许是从地球的内部飞出的活化石?还是地球上另一种未被发现的高级智慧生物?这些问题似乎只能在疑惑中不了了之了。
但是,还没等这个问号沉寂下去,一个另所有人都啼笑皆非的答案却一下子公诸于我们眼前。这些所谓的神秘生物,其实只要它停下来,它那身神秘的衣纱就不复存在了,你所看到的,将是一些平凡的昆虫或小鸟,飞棍现象,原来只是因为照相机快门的曝光时间比那些飞行生物扇动翅膀的频率低而已。假如蜜蜂翅膀的频率是1/300秒,用一个曝光时间只有1/60秒的相机拍摄,在画面上看到的则是昆虫身体划出的直线或弧线,还有翅膀扇动所留下波浪状的痕迹。
蛇,大约出现在一点五亿年前的侏罗纪时期,远早于人类历史,而它们却坚毅的生活到现今,令我产生了极大的兴趣,其中,我最感兴趣的便是——黑曼巴蛇。
黑曼巴蛇在毒蛇界中,身长仅此于眼镜王蛇。而且黑曼巴蛇在非洲地区被称为“死神”、“最恐怖的杀手”,其中还包括了一些传言,传说仅一条黑曼巴就杀死了一头成年雄狮。
据当地史书记载:黑曼巴俊郎美丽,令人心仪而又心怀畏惧,是地球上非常神秘的生物之一。曼巴属共有白唇曼巴、绿曼巴、简氏曼巴以及黑曼巴几种,这是以前唯一一条关于曼巴属生物的信息,因此黑曼巴就变的很神秘。
还有一种黑曼巴,就是帝王黑曼巴,它则是黑曼巴中的王者,任何动物,甚至是成群的狮子也会避而远之。
传说它在短距离内比汗血宝马跑的还快,又传说一条遭围捕的帝王黑曼巴在几分钟内就杀死了围捕它的13个捕蛇人。不过,这是真是假我们难辨。