生物信息学分析精选(九篇)
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第1篇：生物信息学分析范文
摘要：
采用RACE技术，获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶（ANS）基因的cDNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明，CsANS全长cDNA为1000bp，其中ORF（OpenReadingFrame）为957bp，编码320个氨基酸，含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域；分离得到CsANS基因上游调控序列1010bp，其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1（光响应元件）、circadian（生物钟相关元件）等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明，该基因在全光照处理（CK）时表达量较高，75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。
关键词：
茶树武夷奇种C18，无性系。灌木型，中叶类，中生种。是福建省武夷山市茶叶研究所从武夷群体种中选育的优良品系。芽叶紫红色，茸毛较密，节稍长。且芽叶生育力强，发芽较密，持嫩性较强，是一种稀有的特色茶树资源。武夷奇种C18芽叶呈现红紫色，花青素含量较高[1-2]。研究表明，花青素是茶树叶片呈现“红紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途径已有较为深入的研究，其中花青素合成酶（Anthocyaninsynthase，ANS）是将无色花青素经氧化脱水形成红紫色花青素的关键酶[1]。环境信号激活花青素合成途径中相关基因的表达[4]。在花青素合成的前期，光能调控相关基因的表达，弱光可以抑制或下调基因的表达，从而减少花青素的合成；而强光可以诱导花青素合成相关基因的表达，使花青素的含量增加[5]。光信号调控转录因子与启动子结合的强弱，并影响结构基因的表达，其表达量也会随之发生相应的变化[1]。目前在茶树上，ANS基因的启动子还未克隆。本研究根据已有的茶树ANS基因的EST（Expressedsequencetags）序列，采用同源克隆和GenomeWalking方法，克隆了紫叶茶树的ANS基因及分离5′调控序列，再利用生物信息学法，预测了启动子的顺式作用元件，采用荧光定量PCR技术，分析ANS在不同光照条件下的表达模式，有助于揭示ANS在紫色茶树叶片对环境信号响应过程中的作用，解析光强对武夷奇种C18ANS基因的调控机理，为紫芽茶树特异种质的创制和利用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与处理1.1.1植物材料试验材料为武夷奇种C18，由福建省武夷山市茶叶研究所资源圃提供。选取武夷奇种C18的成熟叶片，迅速用液氮处理，置－80℃冰箱保存,用于基因组DNA的提取，克隆CsANS启动子序列。
1.1.2遮光处理试验在福建省武夷山市茶叶研究所资源圃中完成。2015年4月中旬，挑选生长发育良好、整齐一致、树形基本相似的植株27株，分为3组（每9株为1组，每重复3株），挂牌标记，并对其进行同一高度的修剪。待茶树芽头萌动之时，开始遮光处理。设2个处理：分别用75%和60%的黑色遮荫网遮光，以全光照处理为对照。经过15d的遮光处理，取经遮光处理和全光照处理（CK）的武夷奇种C18叶片（第一叶位），经锡箔纸分装于－80℃保存，用于荧光定量PCR检测。
1.1.3试剂FHPlantDNAKit(北京德曼特尔生物科技有限公司)；PrimerStar(TaKaRa公司)；AgaroSeGelDNAExtractionKit(TaKaRa公司)；SMARTerRACE5′/3′Kit(TaKaRa公司)；染色体步移试剂盒(TaKaRa公司)；pEASY-BluntZeroCloningKit(福州都拜特生物技术有限公司)；引物合成及样品测序由铂尚生物技术（上海）有限公司完成。
1.2方法
1.2.1茶树叶片总RNA及基因组DNA的提取本试验参照多糖多酚植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶树总RNA；采用FHPlantDNAKit(北京德曼特尔生物科技有限公司)试剂盒提取紫叶茶树基因组DNA。
1.2.2茶树CsANS5′RACE、3′RACE及全长ORF的PCR扩增cDNA第一链的合成按RevertAidTMFirst-StrandcDNASynthesisKi试剂盒说明书进行。根据已报道的拟南芥、葡萄、茶树等ANS基因序列，用DNAMAN设计同源克隆引物。上游引物：5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′，下游引物：5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR扩增体系：12.5µLEx-Taqmix，2µLcDNA模板，0.5µLANS-R，0.5µLANS-F，补ddH2O至25µL体系。94℃预变性4min，94℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸3min，35个循环，最后72℃延伸10min进行PCR扩增。在其ORF两端设计特异引物qANS-R：5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qANS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′扩增全长序列。
1.2.3CsANS基因启动子的克隆根据TaKaRaGenomeWalkingKit引物设计原则，在已知的茶树ANS基因（GenBank收录号为AY830416.1）的已知序列区（最好不少于500bp）分别设计3条反向且退火温度较高的特异性引物SP1、SP2和SP3，再与试剂盒中提供的4种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4进行热不对称PCR反应[6]，经过3次巢式PCR反应获得已知序列的侧翼序列。用于扩增ANS基因启动子序列的特异性引物情况详见表1。以提取的武夷奇种C18茶树叶片DNA为模板，按照TaKaRaGenomeWalkingKit说明和林玉玲等[7]的方法进行ANS基因启动子的克隆。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带克隆至pMD18-T载体，37℃连接过夜后进行转化测序（铂尚生物技术有限公司）。
1.2.4荧光定量PCR表达分析分别提取遮光75%、60%和全光照处理（CK）的武夷奇种C18第一叶位总RNA，用逆转录试剂盒（TaKaRa）反转录成cDNA，稀释10倍作模板。以18S-rRNA基因为内参（18SⅠ：5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′，18SⅡ：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′）。运用DNAMAN软件，按照荧光定量PCR引物设计原则，设计荧光定量PCR引物（ANS-R：5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′，ANS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。参照SYBRPrimeScriptTMRT-PCRKit（TaKaRa）说明书，进行荧光定量PCR扩增体系：cDNA模板1µL，2×SYBRPremixEx-TaqTM5µL，上下游引物（10µmol•L-1）各0.2µL，用RNase-freeH2O补足至10µL。95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃复性34s，共40个循环。每份样品设3次重复。试验数据应用MicrosoftExcel2007软件，采用2-ΔΔCt法计算其相对表达量[8]；应用SPSS软件对结果进行差异显著性分析。应用MicrosoftExcel2007软件作柱状图。
1.2.5生物信息学分析CsANS序列通过在线NCBI的Blast功能进行氨基酸序列同源性比较；通过Protparam软件对基因的分子量、等电点进行预测，初步分析目的基因的功能；通过TMHMM和TMPred软件进行蛋白质跨膜结构的预测；SignalP4.1进行信号肽预测；在线SOPMA预测蛋白质二级结构。ProtCompVersion9.0进行亚细胞定位预测。启动子序列通过在线PlantCAR[9]及Place软件[10]预测其顺式作用元件的种类、分布情况和生物学功能[11]。通过在线软件BDGP[12]预测转录起始位点及可能的核心启动子区域。
2结果与分析
2.1茶树CsANS基因cDNA全长克隆
2.1.1茶树CsANS基因PCR结果分析经PCR扩增回收测序及使用DNAman软件拼接获得CsANS基因全长序列1000bp（GenBank收录号为KT215319）。（图1）该序列包含1个完整的阅读框（15~977bp），编码320个氨基酸，该基因含有起始密码子ATG、终止密码子TAA，并含有保守功能结构域DIOX-N、20G-Fell-Oxy，属于DIOX-N和20G-Fell-Oxy超级家族。
2.1.2茶树CsANS基因的进化分析将武夷奇种C18茶树ANS基因的氨基酸序列与已知的茶树、高丛越橘（Vacciniumcorymbosum）、和甘薯（Ipomoeabatatas）等11种植物ANS基因的氨基酸序列进行同源进化树分析（图3）。发现所克隆的ANS蛋白与同属茶树ANS蛋白（登录号：AY830416.1）的一致性高达100%。与其他物种比较，发现茶树ANS蛋白在亲缘关系上与高丛越橘最近，同源性为78%。
2.1.3CsANS基因氨基酸生物信息学分析通过ProtParam软件对CsANS氨基酸进行基本信息分析可知，CsANS基因编码320个氨基酸；相对分子量36113.6kD；理论等电点pI为6.23；负电荷残基（Asp+Glu）为46个，正电荷残基（Arg+Lys）为43个；不稳定指数为41.05，属于不稳定蛋白；脂溶系数为：88.97，平均疏水性（GRAVY）为－0.397；分子式：C1626H2576N432O472S12，总原子数为5118，氨基酸组成中谷氨酸含量最高，占总氨基酸的10.3%；其次为甘氨酸，占6.9%，其他氨基酸占82.8%。利用在线软件TMHMMServerv.2.0工具预测CsANS蛋白的跨膜螺旋区，如图4显示，该蛋白不是膜蛋白，无跨膜螺旋区。使用TMpred预测也显示蛋白都分布在膜外，无跨膜蛋白。通过在线软件COILS对CsANS氨基酸预测，在CsANS蛋白的25个氨基酸左右预测到强超螺旋信号。经过SignalP-4.1预测信号肽显示，CsANS编码的氨基酸不含信号肽，不是分泌蛋白。对氨基酸的二级结构预测显示CsANS编码的氨基酸中α螺旋结构较多，有125个占所有氨基酸的39.06%，其次为无规则卷曲占31.87%，延伸链占17.81%，β折叠所占比例最低为11.25%。通过ProtCompVersion9.0软件进行亚细胞定位预测，其亚细胞定位在细胞质。
2.2CsANS基因启动子克隆
2.2.1CsANS基因启动子扩增结果以武夷奇种C18的DNA为模板，经3轮巢式PCR反应后，扩增到1条大于1000bp的目的片段（图5）。将该片段进行克隆、测序，结果显示，获得的片段实际长度为1236bp。序列经过分析整理后，以ATG为起始位点，得到茶树CsANS上游长度为1010bp的DNA序列。
2.2.2茶树CsANS启动子转录起始位点的预测经过启动子转录起始位点在线预测，茶树CsANS基因1010bp的5′端调控序列可能存在3处核心启动子区域，位于35~85、316~366、480~530bp，分值分别为0.96、1和0.88，可能的转录起始位点分别为G、C和T。此结果可推测位于316~366bp的序列很可能就是该基因真正的核心启动子区域，转录起始位点为位于第357bp的C（图6）。
2.2.3茶树CsANS基因启动子顺式元件分析启动子生物学功能的在线预测结果表明，CsANS基因启动子区域中，除了含有大量的核心启动子元件如CAAT-box和TATA-box之外，还存在多种顺式元件，如脱落酸相关元件ABRE，厌氧诱导相关的元件ARE，热应激反应相关元件HSE，昼夜控制调节元件circadian，低温应答元件LTR，光响应相关元件Sp1、ACE、I-box及MYB结合位点等（表2）。
2.3相对荧光定量PCR表达分析以18S-rRNA为内参，采用实时荧光定量PCR对不同遮光处理及未处理的武夷奇种C18叶片CsANS基因表达进行了分析，结果（图7）表明，其表达量在全光照处理（CK）时较高，75%遮光时较低。随着遮光度增加，呈现下调趋势。说明茶树叶片在光照强时花青素合成酶（ANS）表达量高，光照弱时表达量低。
3讨论
CsANS是紫叶茶树花青素合成的最后一个酶，也是将无色花青素经氧化脱水形成红紫色花青素的最关键酶，此中间产物进一步与3-O-葡萄糖基转移酶（3GT）偶联并且被传送到液泡中，形成显色的3-O-糖苷化花青苷[13]，在植物色泽形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用转座子标签技术从玉米的A2突变体中鉴定和克隆得到[15]，近年来在茶树（AY830416.1）、拟南芥（AT4G2288）、小麦（T.aestivum，AB247921）[16-17]等多种植物中也已经得到其克隆。本研究从武夷奇种C18中克隆得到了CsANS的cDNA全长序列，该基因编码的蛋白具有典型ANS蛋白的保守结构域：DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N（吗啡合成非血红素加氧酶的N-末端）是蛋白质与2-酮戊二酸/铁（Ⅱ）依赖性双加氧酶活性的高度保守的N-末端区域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶结构域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依赖的氧化酶超家族组成，该家族包括脯氨酰4-羟化酶α亚基的C末端。全酶由一个α2β2复合物组成，α亚基是其主要的活性位点。能够催化反应：前胶原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前胶原反式-4-羟基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。与其他已知的ANS蛋白相比，CsANS编码的氨基酸具有较高的同源性，它与高丛越橘（JN654701.1）的同源性较高，一致性为78%。所以推断CsANS与高丛越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物学功能类似。环境信号激活花青素苷合成途径，并促使茶树叶片开始积累花青素[18-20]。
第2篇：生物信息学分析范文
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通过多重序列比对筛选保守序列是生物信息学方法的基础，几乎所有的注释序列的意义、研究序列结构的方法都是建立在此基础上的。保守序列是指病毒在进化过程中基因组序列保持不变或变异很小的序列。在进化过程中，变化很小或者不变的序列往往承担着极其重要的功能，一旦出现变化，功能就会受影响或者被破坏，物种就有被淘汰的危险。因此，保持不变或变化很小的序列可能具有相同的功能。国际上已有专门的数据库（如Blocks、PROSITE和IDENTIFY）和分析软件（如BLAST、DNAsis、FASTA、GCG、MOST、Emotif和Tool）用于保守序列的分析。
本研究利用生物信息学方法对欧文氏杆菌基因组进行分析，发现了71个与铁代谢相关的基因，分别参与了欧文氏杆菌中铁载体的生物合成以及铁的运输、吸收、贮存和调控。
参考文献：
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第3篇：生物信息学分析范文
关键词：结核分枝杆菌；pst S1基因；扩增；生物信息学
结核病（Tuberculosis， TB ）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， MTB）所致的、以呼吸系统感染为主的慢性传染病。世界卫生组织全球结核病疫情报告表明，当前结核病已成为可治性感染疾患中头号致死疾病[1]。到目前为止对结核分枝杆菌的研究已经发现了很多特异性的抗原，但还没有一个单抗原能达到WHO对结核诊断抗原的阳性率要求，即总阳性率大于80%，特异性大于95%[2]。动物实验表明，结核分枝杆菌分泌蛋白Pst S1是比较重要和相对特异的一种抗原，可引起特异的保护性免疫反应。因此，可用作亚单位疫苗。本研究对pst S1基因进行扩增，利用生物信息学方法对该基因进行分析，为构建新型结核疫苗、制造诊断试剂和设计药物靶点提供理论依据。
1材料和方法
1.1材料
DNA标准分子量marker、2×PCR Master Mix、细菌基因组提取试剂盒、DNA电泳凝胶回收试剂盒购自Promega公司，Agarose购自西班牙，其他试剂均为国产分析纯，结核分枝杆菌为潍坊市第二人民医院患者体内分离。
1.2方法
1.2.1 引物的设计
根据GenBank报道的结核分枝杆菌pst S1基因序列，自行设计特异性引物，序列如下：P1：gtggaattcgtgaaaattcgtttgcat； P2：atactcgaggctggaaatcgtcgcgat。均由上海生物工程公司合成。
1.2.2 结核分枝杆菌基因组DNA的提取
将结核分枝杆菌接种于苏通液体培养基中，37℃培养4周，取3ml培养物80℃，灭活2h，按照细菌基因组提取试剂盒的操作说明操作（该步在市疾病预防控制中心生物安全三级实验室中完成）。
1.2.3 pst S1基因的扩增和生物信息学分析
以MTB基因组DNA为模板，按照常规PCR条件进行扩增。扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，61℃复性1min，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸8min。将扩增出的pst S1基因送上海生物公司进行测序，然后利用DNA Star5. 0软件中对pst S1基因的测序结果进行分析，测其蛋白的二级结构。
2结果
2.1 pst S1基因的测序结果及编码蛋白的分子特征
测序结果表明， 扩增的pst S1基因的全长1112bp， 与GenBank中公布的标准株H37Rv的pst S1基因的核酸序列相比较同源性为92.7%。GC含量为64.95%，编码362个氨基酸。推导出的蛋白分子质量约为38kD，含有74个强碱性氨基酸（K，R），28个强酸性氨基酸（D，E），101个疏水性氨基酸（A， I， L， F，W，V），68个极性氨基酸（N，C，Q， S，T，Y），等电点为11.989。
2.2pst S1基因编码蛋白结构预测及可读框分析
用Chou-Fasman法分析Pst S1基因编码蛋白的二级结构，可见有11个α螺旋、5个β折叠和32个β转角。一般认为α螺旋、β折叠结构较规则，形态固定，常处于蛋白质的内部；而β转角和无规则卷曲多处于蛋白质的表面，有利于抗体空间构象上与抗原的嵌合，其膜外的β转角可能是具有较强免疫原性的区域，见图1。通过分析还可见该基因含有多个ORF，其中最长的一个是756bp，可能是编码序列。
2.3 pst S1基因的亲水性、疏水性以及抗原性分析
运用生物信息学软件DNAstar6.0的Protean对pst S1基因表达蛋白的亲水性和疏水性预测分析，表明pst S1基因的含有多个较强的亲水区，可能是形成抗原表位的重要部位。用Jameson-Wolf方法抗原性分析显示pst S1有多个明显的具有抗原活性的结构域 ，抗原性指数最强为1.7，结合Hopp-Woods方法进行亲水性分析，表明这些结构域的亲水性普遍较强，二级结构预测显示该基因含有大量β转角结构，结合AMPHI方法预测该基因含有21个免疫优势辅T淋巴细胞抗原位点，7个含有特定基序（motif）的潜在T 淋巴细胞抗原决定簇。综合上述分析，表明这个基因可能含有良好的抗原
3讨论
在结核分枝杆菌已发现的特异性抗原中，Pst S1抗原是目前公认的血清学诊断的最佳单抗原，并发展有多个商品化的试剂盒[3]。Pst S1蛋白是一种磷酸盐转运蛋白 [4]，以膜蛋白和分泌蛋白的形式存在，能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，特异性较强。通过分析发现，该株结核杆菌与GenBank中公布的标准株H37Rv的pst S1基因的核酸序列相比较同源性为92.7%，变异程度较小；该基因编码蛋白含有多个β转角结构，有利于抗体空间构象上与抗原的嵌合；含有多个明显的具有抗原活性的结构域和免疫优势辅T 淋巴细胞抗原位点，抗原性较强；并且该菌株的生物学特性与其它株相比基本相同，对常见的抗结核药物具有耐药性。所以该菌株具有一定的代表性，其分泌蛋白不仅可能是治疗结核病的新的切人点，而且有可能作为新型亚单位疫苗用于防止结核病复发。本研究成功扩增了Pst S1基因，为地方结核病的防治以及进一步研究其生物学功能和潜在的临床应用前景奠定了基础。
参考文献：
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第4篇：生物信息学分析范文
【摘要】 目的：从欧猥迭宫绦虫成虫cDNA文库中识别出膜联蛋白E1（Annexin E1）基因，并对其进行生物信息学分析和功能预测。方法：从欧猥迭宫绦虫cDNA文库中获取Annexin E1基因的核酸序列，应用NCBI、ExPASy等多种生物信息学在线分析工具结合Vector NTI Advance 10、Geneious Pro等软件包，对所获基因及其编码蛋白的基本理化特征、亚细胞定位、保守功能域、抗原表位、二级结构及拓扑结构等进行预测，建立蛋白质三级空间结构模型及构建其分子进化树。结果：Annexin E1编码354个氨基酸残基，理论分子量为40168.0Da，具有4个完整的保守功能域。位于细胞内，无信号肽及跨膜结构，存在6个潜在抗原表位。二级结构主要以α 螺旋为主，结构和功能有关的位点高度保守，具有多个磷酸化位点。在进化的过程中与绦虫类亲缘较近，而与脊椎类亲缘较远。结论：Annexin E1编码蛋白及潜在的抗原表位与宿主同源性低，可能作为研发新型免疫诊断方法的理想分子靶标。
【关键词】 欧猥迭宫绦虫；膜联蛋白；结构；功能；生物信息学
［ABSTRACT］ Objective: To identify the Annexin E1 gene from cDNA library of Spirometra erinaceieuropaei adult worm and predict its structure and function by applying the bioinformatics. Methods: Nucleic acid sequences of Annexin E1 gene was obtained from cDNA library of Spirometra erinaceieuropaei， and application tools were provided by bioinformatics websites and other bioinformatics software packages such as Vector NTI Advance 10， Geneious Pro etc. The status of encoded proteins were predicted including the basic physical and chemical properties， subcellular localization， conservative functional domains， domains， antigenic epitopes， secondary structure and topology， etc. Besides， tertiary structure of the protein was established based on homology modeling， undertook multisequence homological alignment and phylogenetic analysis. Results: Annexin E1 encoded 354 amino acid residues with a theoretical molecular 40168.0Da. The main secondary structure was αhelix with four complete conservative domains. Structure and function of the highly conserved sites were with multiple phosphorylation sites. It contained no signal peptide and transmembrane helices， six potential antigenic epitopes， locates outside of membrane. In evolution， it was close relative to tapeworm and distant relative to the vertebrate. Conclusions: Homology is low between encoded protein and potential antigen epitopes of Annexin E1 and host′s， it might be a desirable molecular target for immunological tests.
［KEY WORDS］ Spirometra erinaceieuropaei; Annexin; Structure; Function; Bioinformatics
欧猥迭宫绦虫（Spirometra erinaceieuropaei）又名曼氏迭宫绦虫（Spirometra mansoni），是迭宫属寄生虫研究的重要模式生物，寄生于人体可引起裂头蚴病［1］。Annexin是一类钙依赖的磷脂结合蛋白超家族，广泛分布于各种真核生物细胞中，约占细胞总蛋白质的2%左右，具有多种生物学功能，在细胞中主要参与膜转运及膜表面一系列依赖于钙调蛋白的活动。Annexin超家族各成员在结构上具有高度保守性，C端均具有由约70个氨基酸残基组成的4个保守重复序列，而其N末端由于氨基酸序列、长度不同而功能各异［2］。目前，国内、外关于寄生虫Annexin基因家族的研究较少，其具体生物学功能尚不清楚。本研究在构建欧猥迭宫绦虫成虫全长cDNA文库、5′端表达序列标签（EST）测序的基础上，利用生物信息学方法对欧猥迭宫绦虫Annexin E1基因及编码的蛋白质进行了理化性质、物种进化、空间结构等分析及预测，为其重组蛋白表达、纯化及作为研发新型免疫诊断抗原的侯选分子靶标等研究提供基础。
邬强等.欧猥迭宫绦虫膜联蛋白E1基因的生物信息学分析
1 材料与方法
1.1 材料
欧猥迭宫绦虫Annexin E1基因源自欧猥迭宫绦虫成虫的cDNA文库，通过EST 5′端大规模随机测序，归并unigene后进行初步生物信息学分析，发现基因号GDTC004_G12的氨基酸水平与Annexin家族高度相似性，且5′端完整，然后进行3′端延长测序至Poly（A）拼接获得。其他寄生虫及模式生物的Annexin核酸序列及蛋白质序列均源自美国国立生物技术信息中心数据库，所获物种及Genbank序列号为：猪带绦虫（Taenia solium， AY998562.1）、日本血吸虫（Schistosoma japonicum， FN315079.1）、马来丝虫（Brugia malayi， XP_001894032）、黑腹果蝇（Drosophila melanogaster， NM_167519.1）、秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans， AAA99775）斑马鱼（Danio rerio， AAI54294）、拟南芥（Arabidopsis thaliana， NP_196584）、非洲爪蟾（Xenopus laevis， NP_001082442.1）、原鸡（Gallus gallus， XM_421623.2）、小鼠（Mus musculus， NM_009674.3）、人（Homo sapiens， BT007975.1）。
1.2 方法
将基因的核苷酸、编码氨基酸序列与Genbank中的数据进行比对，鉴定其来源，判断与其他物种基因的一致性及是否为全长；将该蛋白氨基酸序列进行多序列同源比对分析，并与其他物种的Annexin进行比对，用Geneious Pro 4.8.2以NJ法构建出分子进化树；采用蛋白质专家分析工具ExPASy和Vector NTI Advance 10对蛋白质的基本理化性质进行预测；应用TargetP、Tmpred和PredictProtein等程序对蛋白质的亚细胞定位、跨膜和信号肽情况进行推测；通过Motif scan、InterproScan、ScanProsite、Pfam及BepiPred等对模体、功能域、催化位点、抗原表位等进行预测；运用PredictProtein、COILS等工具对蛋白质的二级结构进行预测；在SWISSMODEL中寻找空间结构同源模板，优化产生该蛋白的三维结构模型，并用Rastop软件进行可视化分析。
2 结果
2.1 保守功能域、蛋白质功能基序、蛋白质结构域预测
利用Blastn进行核酸水平相似性的搜索，没有得到与该基因序列高度相似的基因。经ORF finder程序寻找开放阅读框架，显示该基因全长为1250bp，编码区为50～1112bp，编码354个氨基酸，具Poly（A）尾，具体序列如下。
该氨基酸序列具有4个完整的保守功能域（3196aa， 103176aa， 208274aa， 284348aa），为全长基因，确定为Annexin家族成员（已提交Genbank，Accession: HM572242），见图1。
图1 Annexin E1保守功能域结构
2.2 Annexin E1与其他物种Annexin氨基酸序列多序列比对、同源性及分子进化分析
海南医学院学报 Vol.16 No.9 Sep.2010
Annexin E1氨基酸序列与其他物种Annexin氨基酸序列进行多序列比对，在多个氨基酸位点上各物种间完全相同，高度保守。Blastp氨基酸序列相似性分析结果表明，欧猥迭宫绦虫Annexin E1与猪带绦虫、日本血吸虫的相似性最高，分别为60.4%、42.3%，而与人、小鼠等脊椎动物的相似性最低，均低于33.2%。选取了11个代表性物种的膜联蛋白，使用Geneious Pro 4.8.2软件用NJ算法构建出分子进化树，见图2。结果表明欧猥迭宫绦虫Annexin E1与脊椎动物的亲缘关系较远，而与其他寄生虫的亲缘关系接近。
图2 annexin E1蛋白分子进化树
2.3 蛋白质的基本理化性征
通过Expasy的protprom工具及Vector NTI Advance 10软件可得出以下的预测结果，Annexin E1编码354个氨基酸，理论分子质量为40168.0 Da，理论等电点为6.28，理论分子式为C1773H2858N486O544S15，天冬氨酸和谷氨酸共51个，精氨酸和赖氨酸共49个。280nm处水溶液中消光系数在35870和36120之间，如果成熟的Annexin E1蛋白N末端为甲硫氨酸时，在体外的哺乳动物网状细胞中的半衰期为30h，在酵母菌和大肠杆菌中半衰期分别为20h和10h。不稳定系数为39.95，可认为是稳定蛋白。脂肪系数为90.40，总平均亲水性为0.504，说明该蛋白为疏水蛋白。
2.4 细胞内蛋白质亚细胞定位、信号肽、跨膜结构及潜在抗原表位的预测
经targetP1.1 server分析，Annexin E1蛋白存在于胞内，不在线粒体中，无信号肽序列，为非分泌性蛋白质。将Annexin E1蛋白通过TMHMM 2.0分析，该蛋白不存在跨膜结构。利用TMpred等对细胞的亲水、疏水性分析，Annexin E1大部分肽段基本上都具有较强的疏水性。经BepiPred分析，该蛋白质可能存在6个潜在抗原线性表位（232aa， 149164aa， 179200aa， 246254aa， 260268aa， 333341aa）。与人Annexin家族进行同源性比对发现，位于232aa位点的潜在表位的相似性最低，低于9.4%，故可能是较为理想的特异性诊断抗原表位。
2.5 蛋白质二级结构预测
Annexin E1氨基酸序列的二级结构及拓扑结构预测结果显示其以α 螺旋为主，占62.15%，β折叠、转角占2.54%，无规则卷曲占35.31%，见图3。
注：第一行为编号，第二行为氨基酸序列，第三行代表预测结果，其中H代表α螺旋，E代表β折叠、转角，···代表无规则卷曲，L代表环形loop结构。
图3 annexin E1二级结构
2.6 蛋白质的三级结构预测
在SWISSMODEL中找到一个同源性最高的模板1wa3a，其同源性为39%，可根据其晶体结构进行同源建模［3］。进行再次比对，保守部位对齐，调整主链中各原子的位置，进行模型优化，产生其空间结构模型，见图4。4个保守功能域均由α螺旋组成，以黄色螺旋标出。232aa段抗原表位在图中以红色部分标出。抗原表位上还包括了一个依赖蛋白激酶C的磷酸化位点，以蓝球标出。
图4 annexin E1蛋白三级结构
3 讨论
Annexin超家族由超过1000种不同基因表达产物组成，广泛存在于大多数真核生物细胞中，物种间高度保守［4］。目前Annexin超家族可以分为A、B、C、D、E 5个家族，E族主要存在于各类寄生虫细胞，故本研究中将新发现的欧猥迭宫绦虫Annexin命名为Annexin E1。近年来国内、外研究发现Annexin具有多种生物学功能，包括胞吐作用中的膜融合、囊泡运输、信号转导、钙离子通道的形成、调控炎性反应、参与凝血过程、参与细胞凋亡、细胞分化和细胞骨架蛋白间的相互作用等［5］。采用基因抑制、基因敲除及RNA干扰等技术提示了不同Annexin的生物功能的新见解。目前，对Annexin家族的研究主要集中在A家族，即脊椎动物的Annexin，其与心血管疾病、肿瘤、炎症、糖尿病及自身免疫病等密切相关，而对其他4个家族的Annexin研究甚少［6］。Zhang等［7］从猪带绦虫续绦期cDNA文库中克隆出Annexin B1，证明其为研发预防囊尾蚴病疫苗的有效保护性抗原，并参与类似脊椎动物Annexin的炎症、细胞凋亡过程。后续研究中发现Annexin B1可被分泌到细胞外，与人嗜酸性细胞膜结合致使钙离子流入并诱导细胞凋亡，很可能是猪带绦虫抵制宿主防御的新机制［8］。
本研究通过对欧猥迭宫绦虫Annexin E1基因进行生物学信息学分析和预测，发现该蛋白属于Annexin家族的一员，具有很高的种属特异性。与该家族的其他成员一样，具有位于C端由4个功能域组成的中心结构域，呈圆盘状，具有凸面和凹面。其中凸面包含膜磷脂结合位点及钙离子结合位点，面向细胞膜。N端位于圆盘结构的凹面，包括蛋白水解位点、磷酸化位点及细胞质蛋白结合位点，为膜联蛋白的调节区［9］。该蛋白不存在于细胞膜上，不含信号肽，不是分泌蛋白，这也其他Annexin家族一致。其是否可发生类似Annexin A族及猪带绦虫Annexin B1不依赖信号肽而转运出细胞的现象，尚待其他研究来证实。
人体裂头蚴病主要依靠从局部检查出虫体作出诊断，应用裂头蚴粗抗原作为免疫辅助诊断，临床误诊率较高，若有特异的诊断性抗原，就能及早诊断、治疗。欧猥迭宫绦虫Annexin E1的二级结构含有无规则卷曲结构，说明其有成为抗原的潜力。本研究发现Annexin E1与人Annexin家族各成员的同源性均低于25%，其潜在的主要抗原表位（232aa段）与同区域宿主蛋白的同源性更低，故可以利用基因重组技术，将其制成重组抗原，或是合成含有特征抗原决定簇的多肽抗原，相对于传统的抗原物质，其特异性、敏感性很可能更高，继而可研制出合适的新型诊断性抗原。
参考文献
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第5篇：生物信息学分析范文
【关键词】 sla?dr基因; 湖南大围子猪; 基因克隆; 异种移植
cloning and bioinformatics analysis of sla?dr genes in hunan daweizi pigs
wang yan1, xing xiao?wei1, xue li?qun2, huang sheng?qiang2, wu xiao?li1, wang wei1*
1cell transplantation & gene therapy center, third xiangya hospital of central south university, changsha 410013; 2department of animal science and technology, hunan agriculture university, changsha 410128, china
[abstract] aim: to evaluate the potential of daweizi pigs as xenotransplantation dnors from pigs to humans by analyzing the characteristics of sla?dr genes in hunan daweizi pigs. methods: sla?dra and sla?drb genes were amplified by rt?pcr, cloned into pucm?t vectors, sequenced and analyzed through blast in ncbi and related software in expasy. results: the sla?dra and sla?drb genes were 1 177 bp and 909 bp nucleotides in length, which contain opening reading frame (orf) and encode 252 and 266 amino acids respectively. comparing the sla?dra and sla?drb genes with their counterpart sequences of human, the homologies of amino acid sequences were 82% and 73% respectively. the amino acids in sla dr α chain of daweizi pigs from position 124 to 136, which bind to human cd4, showed only two differences with hla dra: a lleval change at position 127 and a serthr change at position 136. the amino acids in sla dr β chain of daweizi pigs from position 134 to 148, which bind to human cd4, were identical with hla?drb. further comparison with sla sequences published in genbank indicated that sla?drb gene found in daweizi pigs has polymorphism while the homology of sla?dra gene is up to 100%. conclusion: the cloned sla?dra and sla?drb in hunan daweizi pigs has high polymorphism with hla?dra and hla?drb in human, indicates that daweizi pigs have some advantages as xenotransplantation dnors from pigs to humans.
[keywords]swine leukocyte antigen dr allele (sla?dr); daweizi pigs; gene cloning; xenotransplantation
同种异体器官移植已成为治疗终末期器官衰竭的一种有效手段, 猪被认为是异种移植最理想的供体来源[1]。然而, 如何解决免疫排斥问题仍是阻碍临床大规模应用的主要问题之一[2]。猪的主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex, mhc), 又称作猪白细胞抗原(swine leukocte antigen, sla), 是由紧密连锁的高度多态基因座所组成的染色体的一个遗传区域, 它作为主要组织抗原, 参与移植排斥反应, 是引起异种移植急性细胞性排斥的主要遗传因素[3]。通过对供体猪种进行筛查, 尽可能选择与人类mhc同源性较高的猪种将有助于提高异种移植物在人体内的存活时间, 为临床大规模开展将猪器官或细胞异种移植到人提供理想的供体猪种来源。
中国具有丰富的猪种种质资源, 不同的地域分布形成了猪种的多样性和遗传的相对稳定性, 为异种移植提供了可贵的研究和利用资源[4]。湖南大围子猪是我国特有的地方猪种之一, 亦是湖南省著名地方优良猪种, 具有繁殖力强、 抗逆性强、 耐粗饲、 肉质好、 生长慢、 饲料效率高等种质性状。但是, 大围子猪能否作为异种移植的供体, 尤其是该猪种细胞表面sla特性如何, 目前尚不清楚。本研究将克隆湖南大围子猪sla?dr基因, 分析其sla?dra和sla?drb基因特性, 比较与人cd4 分子结合部位大围子猪sla?dr编码氨基酸与人类相应dra、 drb的同源性, 为评价湖南大围子猪在异种移植中的应用前景, 提供免疫学方面的依据。
1 材料和方法
1.1 材料 总rna抽提试剂盒购自美国gentra公司; cdna第一链合成试剂盒购自fermentas 公司; pucm?t载体、 引物、 电泳试剂等购自上海生工生物工程技术服务有限公司; pcr高保真克隆酶easy?a购自stratagene公司; dna marker(100 bp ladder)购自晶美生物工程公司; 湖南大围子猪来自湖南望城大围子猪保种基地。
1.2 方法
1.2.1 湖南大围子猪sla?dra和sla?drb基因引物设计 根据genbank数据库中已登录的明尼苏达小型猪(minnesota miniature swine)的sla?dr序列(登录号为m93028, ab205163), 采用pcrdesn软件设计以下引物。sla?dra: 上游引物 : 5′?ggc atc taa gga gaa aat gac?3′; 下游引物: 5′?cca ctc aaa gtt tat tgt att cag?3′, 预计扩增片段大小为1 177 bp; sla?drb: 上游引物: 5′?ttg tcc tct cct gtt ctc cag?3′; 下游引物: 5′?tag gac gca gag cat agc agg?3′, 预计扩增片段大小为909 bp。
1.2.2 rt?pcr扩增湖南大围子猪sla?dra和sla?drb基因 在湖南大围子猪保种群中随机挑选两头个体, 以700 ml/l乙醇消毒耳尖取耳样组织, 按rna抽提试剂盒(gentra公司)说明书方法提取总rna。测定每一样品总rna的浓度, 模板定量为1 μg rna, 按revertaidtm first strand cdna synthesis kit说明书方法逆转录合成cdna第一链。以合成的cdna为模板进行pcr扩增, 20 μl pcr反应体系中, 分别加入下列物质: depc处理水13.5 μl, pcr缓冲液2 μl, 25 mmol/l mgcl2 1.6 μl, 10 mmol/l dntp混合物0.5 μl, 50 mmol/l上、 下游引物各0.2 μl, 模板1.6 μl, easy?a 高保真酶0.4 μl。在pe9700 型pcr 扩增仪上完成pcr扩增, 扩增条件如下: 先95℃预变性2 min 30 s, 94℃变性40 s, 58℃～59℃退火40 s, 72℃延伸40 s, 完成35个循环, 最后72℃延伸5 min, 置 4℃保温。取3.5 μl pcr扩增产物, 1.5 g/l琼脂糖凝胶电泳, 以鉴定pcr扩增结果。
1.2.3 湖南大围子猪sla?dra和sla?drb基因克隆与鉴定 连接反应在10 μl体系中进行: 双蒸水3 μl、 pcr产物1 μl、 pucm?t载体1 μl混匀后加入5 μl solutionⅰ, 16℃水浴连接过夜, 转化感受态大肠杆菌jm109(采用cacl2法制备), 4℃静置30 min后放入42℃水浴中热休克90 s, 加入300 μl预热的lb培养基, 37℃下振荡培养(200 r/min) 45 min, 将菌液平铺于含氨苄青霉素的固体培养基上, 37℃恒温箱中培养过夜。挑取单克隆, 在含氨苄青霉素200 mg/l的液体lb培养基中培养, 以菌液为模板, pcr鉴定为阳性克隆, 抽提质粒, 送上海英骏生物技术有限公司双向测序。
1.2.4 湖南大围子猪sla?dra和sla?drb基因生物信息学分析 用ncbi homepage中的orf对湖南大围子猪sla?dra和sla?drb基因的开放阅读框进行识别; 用expasy服务器中的prosite scan软件对sla?dra和sla?drb基因的功能域进行预测; 用ncbi中的blast及expasy服务器中的clustalw等软件对获得的sla?dra和sla?drb基因的序列结构进行比较分析。
2 结果
2.1 湖南大围子猪sla?dra和sla?drb基因rt?pcr扩增结果 rt?pcr扩增结果显示, 两头湖南大围子猪sla?dra和sla?drb均有特异性扩增条带, 大小分别为1 177 bp和909 bp, 与预期扩增片段大小一致(图1)。
2.2 湖南大围子猪sla?dra基因测序结果 测序大围子猪sla?dra基因, 结果表明: 来源于两个不同个体的sla?dra基因序列是一致的, 其cdna全长均为1 177 bp, 包含一个759 bp的完整的开放阅读框, 推测编码252个氨基酸。生物信息分析发现, sla?dra第1～23 位氨基酸为信号肽, 第24～107位氨基酸为α1 功能区, 第108～202位氨基酸为α2 功能区, 第203～252位氨基酸为穿膜和胞浆功能区。推测sla?dra蛋白中有1个camp和cgmp依赖的蛋白激酶磷酸化位点, 6个n?肉蔻酰化位点, 2个n?糖基化位点, 2个蛋白激酶c磷酸化位点, 1个酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位点。
2.3 湖南大围子猪sla?drb测序结果 测序大围子猪sla?drb基因, 结果表明: 来源于两个不同个体的sla?drb基因序列是一致的, 其cdna 全长为909 bp, 包含一个完整的开放阅读框, 大小为801 bp, 推测编码266个氨基酸。生物信息分析发现, sla?drb蛋白序列第1～29 位氨基酸为信号肽, 第30～123 位氨基酸为α1 功能区, 第124～217 位氨基酸为α2 功能区, 第218～266位氨基酸为穿膜和胞质功能区。推测sla?drb蛋白包括3个n?肉蔻酰化位点, 1个n?糖基化位点, 3个蛋白激酶c磷酸化位点, 1个酪蛋白激酶ⅱ磷酸化位点。
2.4 湖南大围子猪sla?dr与人类相应hla?dr同源性比较 大围子猪sla?dra与人类的hla? dra(bc071659)相比较, 在核苷酸水平同源性为88%, 编码的氨基酸序列同源性为82%。sla dr α链与人cd4 分子结合部位介于第124至136位氨基酸, 大围子猪sla?dra在此结合区域与人类相应的dra存在两个氨基酸差异, 即: 第127 位(vallle), 第136位(thrser)(图2)。
大围子猪sla?drb与人类的hla?drb*09012(ay622551)相比较, 在核苷酸水平同源性为82%, 编码的氨基酸序列同源性为73%。sla dr β 链与人cd4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸, 大围子猪sla?drb在此结合区域与人类相应的drb相比氨基酸序列源性为100%(图3)。
2.5 湖南大围子猪sla?dr基因与genbank里其它猪种序列同源性比较 大围子猪与nih小型猪d单倍型(m93028)、 湖南沙子岭猪(ef143987) sla?dra编码的氨基酸同源性为100%, 与genbank里已发表的其它猪种的相应基因比较, 同源性高达99%以上。大围子猪sla?drb基因与genbank登录的许多猪种核苷酸和氨基酸序列同源性分别是93%～95%, 89%～95%, 并根据氨基酸比较结果建立种系进化树(图4)。
3 讨论
免疫排斥反应仍是目前异种移植面临的最大难题, 其中供受体组织相容性是研究异种移植排斥反应的关键问题。因此, 组织相容性复合物即白细胞抗原是筛选供体时必须考虑的因素。异种猪抗原(主要是猪白细胞抗原sla)是引起异种移植t淋巴细胞介导的急性细胞性排斥反应的主要遗传因素[2]。sla被人t淋巴细胞识别存在直接识别和间接识别途径[3]。在直接识别途径中, 猪sla?ⅱ类抗原经自身抗原提呈细胞(apc)处理, 提呈给人cd4+t辅助细胞参与免疫排斥反应。人t细胞对猪异种抗原的间接识别是指猪的异种抗原以外源性蛋白质抗原的方式为人apc摄取、 加工后, 引起人特异性cd4+ t细胞的激活与效应。在异种移植细胞性排斥反应中, 异种抗原被人t细胞识别到底哪种识别途径占优势目前尚不清楚。andres等[5]认为在异种胰岛移植中, 种系差异越小直接识别途径占优势, 种系差异越大、 间接识别途径占优势。因此, 对sla?ⅱ类基因的深入研究将有助于猪人异种器官移植的供受体配型选择, 有助于攻克异种移植排斥反应, 筛选异种移植供体。
目前, 国内外都积极致力于研究各猪种的sla, 筛选异种移植供体, 更好的为异种移植应用于临床服务。国外对yucatan小型猪[6]、 westran猪[7]等, 国内对中国西双版纳微型猪[8]、 湖南沙子岭猪[9]、 广西猪、 贵州香猪、 云南小耳猪[10, 11]等猪种作为研究模型, 通过克隆、 测序分析sla基因, 研究sla在异种移植排斥反应的发生机制中的作用。吴群等[12]对中国海南五指山猪进行研究, 指出五指山猪种在与人类mhc遗传基因水平相似性方面有一定优势; 在与人cd4相结合部位, 五指山猪sla?drb参与结合的关键氨基酸残基与人类完全相同, 并且通过基因工程对五指山猪sla?dra分子两个不同的氨基酸残基进行必要的修饰和改造, 使其成为理想的异种移植供体。
湖南大围子猪是湖南省著名的地方优良猪种, 具有繁殖力强、 抗逆性强、 耐粗饲、 肉质好、 生长慢、 饲料效率高等种质性状。本研究首次克隆湖南大围子猪的sla?dra和sla?drb序列。sla位于猪的第七号染色体, 由i类、 ⅱ类和ⅲ类3个基因簇组成。sla?i类基因和sla?ⅲ类基位于7号染色体的短臂, sla?ⅱ类基因则位于染色体长臂上。研究表明: sla?ⅱ类抗原的基因主要有β链基因和α链基因两种, 分别编码sla?i类抗原的β肽链和α肽链。编码sla?ⅱ类抗原β链的基因座sla?dr和sla?dq已被证明存在显著的等位基因多态性, 而这种多态性与sla?ⅱ类抗原的生物学特性又是密切相关。生物信息分析发现, sla?dra基因为高度保守序列, 各猪种间dra基因同源性高达99%以上, 而sla?drb基因在各猪种间具有丰富的多态性, 这一结论与文献报道一致。
大围子猪sla?dra 和sla?drb 与人类相应的dra、 drb相比, 氨基酸同源性分别为82%和73%。人cd4分子在排斥反应中发挥重要作用, sla dr α链与人cd4 分子结合部位介于第124～136 位氨基酸, 大围子猪sla?dra在该结合区域与人类相应的dra存在两个氨基酸差异, 即: 第127 位(lleval), 第136 位(serthr); sla dr β链与人cd4 分子结合部位位于第134至148位氨基酸, 大围子猪sla?drb在该结合区域与人类相应的drb相比氨基酸序列同源性为100%。该结果说明, 湖南大围子猪sla?dr基因与人的相应基因组织相容性较好, 可在异种移植排斥反应中以直接识别途径即人cd4+t细胞直接识别猪细胞表面的sla?ⅱ分子。
总之, 通过本研究首次成功克隆了湖南大围子猪sla?dra 和sla?drb基因序列, 发现该猪种与人类相应的dra和drb有高度同源性, 在免疫学特性方面具有一定的优势, 提示该猪种可作为异种移植侯选供体。
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第6篇：生物信息学分析范文
[关键词] 基因芯片；子宫内膜异位症；生物信息学分析；靶基因；microRNA
[中图分类号] R711.710.46 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）04（a）-0012-05
[Abstract] Objective To analyze and predict the expression of endometriosis （EMs） genes by bioinformatics methods， in order to provide a new basis for revealing the essence of EMs at the gene level and developing new treatment drugs. Methods Download gene dates which were related to EMs in Gene Expression Omnibus（GEO）， were mined and analyzed by a series of bioinformatics tools， such as protparam， MotiScan， SignalP 4.0， NetPhos 2.0， TMHMM， GO， KEGG， STRING， BRB-Array Tools. Results 91 EMs related genes and 54 microRNA had been found in this study. These genes mainly involved in the process of cell proliferation regulation， cell apoptosis regulation and chemotaxis. Protein interaction network predicted 19 important EMs-related protein targets. Combined with target gene data mining， 134 EMs-related target genes were found. Conclusion Using bioinformatics method to analyze gene microarray data can acquire inner information of organisms， and provide new diagnostic markers and diagnostic thoughts for the early diagnosis of EMs.
[Key words] Microarray； Endometriosis； Bioinformatics； Target gene； MicroRNA
子m内膜异位症（endometriosis，EMs）是一种常见的慢性妇科疾病，在女性人群中，发病率为10%～15%[1]，其临床表现为不孕、痛经、慢性盆腔痛、痛等[2]，给年轻的女性带来巨大的痛苦和经济负担。EMs是在子宫腔外部出现经过增殖、出血和再生的子宫内膜样组织，其发病机制尚不清楚[3-4]。由于EMs病因复杂，目前主要治疗手段是手术和激素治疗，但该病的复发率高，达40%～50%[5]。因此，亟需新的有效的EMs治疗方法。
基因调控在EMs的发展中起重要作用[6]。研究EMs患者的基因特征是开发新疗法的有效步骤[7-8]，基因芯片数据能够大规模地揭示基因遗传背景。根据基因芯片数据可以发现，免疫内分泌的功能障碍是影响子宫内膜异位的重要因素[9]。生物信息学被应用于整理基因表达、基因功能、基因产物以及细胞功能相关的大量信息，来鉴定发病过程中的关键因子，预测合适的治疗靶标[10]。目前这种方法已被用于改进肝细胞癌[11]、淋巴瘤[12]和口腔癌的诊断[13]。基因芯片技术与生物信息学分析的结合能够为疾病的分子生物学研究提供新的研究视角。
本研究应用基因芯片分析软件BRB-Array Tools对基因芯片公共数据库的EMs相关基因和microRNA进行数据挖掘，并进行microRNA的靶基因预测。用生物信息学的方法对EMs的相关基因进行通路和功能的分析，找出EMs相关蛋白质相互作用的网络调控的关键靶标，研究EMs的发病机制，为进一步在基因水平上揭示EMs的本质和发现药物治疗靶点、开发治疗新药提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从美国国立生物信息技术中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的公共基因芯片数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）[14]下载与EMs相关的基因和microRNA。
1.2 方法
①把EMs相关基因上传到String（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）数据库在线分析工具（http：//）[15-16]可获得EMs相关基因蛋白-蛋白相互作用的网络，筛选节点（Hub）蛋白。
②把EMs相关基因上传到DAVID（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery）[17]，用功能注释工具（Functional Annotation Tool），研究EMs相关基因参与FOTERM_MF_5以及GOTERM_BP_5基因本体数据库（Gene Ontology，GO）[18]的分子功能和生物过程，分析EMs相关基因参与的PANTHER-PATHWAY和KEGG-PATHWAY数据库中的生物学通路。
③应用PicTar2005[19]、TargetScan 5.1[20]、miRanda V5[21]3种软件预测靶基因，有两种或两种以上的软件同时预测到的结果则认为可靠。
2 结果
2.1 EMs相关基因的筛选
从公共基因芯片数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）下载与EMs相关的基因，共得到91个相关基因，结果见表1。
2.2 EMs相关基因的分析
对91个EMs相关基因编码的蛋白进行蛋白-蛋白的相互作用网络分析显示，处于网络节点的蛋白质有19个基因与之对应，分别是EGF、RELA、VEGFA、PCNA、PTEN、PIKCA、MDM2、MMP9、MMP1、NGF、PGR、PTGS2、IL11B、IL6、IL10、CD44、TP53、TNF、FOXO1，f明它们可能在致病中发挥着重要作用。GO富集分析结果显示，EMs相关基因主要涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞代谢、信号转导、趋化作用等反应过程（图1）。生物学通路分析表明，EMs相关基因主要参与细胞因子受体互作、肿瘤通路、造血细胞系、Jak-STAT信号等生物学的通路（图2）。
2.3 microRNA的靶基因预测
在PubMed数据库中检测到54个EMs相关的microRNA，联合靶基因的数据挖掘和预测，共得到134个EMs的相关基因。
3 讨论
EMs给社会和妇女带来了严重的临床上和经济上的负担，因此，需要将研究和资源的效用最大化来提高对疾病的了解，以便发展新的有效的治疗方法。随着近几年生物信息学技术的兴起，基因芯片技术已经成为生物医学研究的基本方法。基因芯片是一种大规模高效率获取生物信息的新型技术，能够检测分析各个组织内的表达基因的差异，随着计算机技术的快速提高和生物数据的急剧增长，生物信息学这一刚刚兴起的学科得到了前所未有的迅速发展[22]，尤其是应用生物信息学方法发现新基因和基因芯片，利用已知的核酸序列作为探针，与互补的靶核苷酸序列相互杂交，再进行信号的监测，最终完成定量或者定性的分析，在预防和新药开发、辅助诊断疾病方面有广阔的前景。生物信息学是涉及应用物理学、数学、生物学、化学、计算机等交叉学科的一门新兴学科，应用现有的分析软件和公共数据库，可以探索生物分子结构和功能特性，为后续研究提供新的研究思路和方向。EMs的生物学过程复杂，决定了从基因组水平筛选与转移相关表型的功能基因成为EMs治疗研究的重要方向[23]。
本研究发现，EGF、RELA、VEGFA、PCNA、PTEN、PRKCA、MDM2、MMP9、MMP1、NGF、PGR、PTGS2、IL11B、IL6、IL10、CD44、TP53、TNF、FOXO1在EMs相关基因编码蛋白-蛋白的作用网络中起到节点蛋白的作用，推测这些基因对EMs的发病起重要作用。本研究通过GO富集分析和通路分析发现，EMs相关基因主要与细胞增殖调控、细胞凋亡调控、趋化作用有关。
综上所述，本文应用生物信息学的方法对基于基因芯片数据库挖掘的EMs基因及蛋白进行分析，为揭示EMs相关基因及microRNA的结构、功能、蛋白的相互作用提供了重要依据，发现了关键基因在EMs发生发展过程中可能起到重要的作用，为日后进一步研究EMs的发病机制、发现药物治疗的靶点，及为临床治疗和预防提供了新的切入点。
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第7篇：生物信息学分析范文
【摘要】
目的 应用生物信息学分析软件预测细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白（Eg. ferritin）氨基酸序列的结构与功能。方法 利用DNAman、NCBI/BLAST公共数据库对目的基因的同源性进行比较分析。应用DNAstar、Biosun 等生物分析软件对铁蛋白的二级结构、抗原表位进行预测分析，应用SWISSMODEL对蛋白的三维结构进行模拟。结果 检索Eg. ferritin氨基酸序列在其功能区的130AA内同源性为97.7%。不同生物间的同源性平均达40.79%。生物软件预测：Eg. ferritin的分子量约16.7 kD，含非极性氨基酸68个，预测其抗原表位肽段为7N-12E，36H -43V， 55S-62H， 69Q-76R， 82A-89E， 102I-107E， 117A -124S，129L-136T。结论 Eg. ferritin的结构和功能及其抗原表位的预测对选取有价值的抗原肽段提供了依据。
【关键词】 细粒棘球蚴中国大陆株；铁蛋白；生物信息学；预测分析
Abstract: Objective To predict the structure and function of Eg.ferritin using bioinformatics method. Methods Homology of ferritin gene was analyzed Using DNAman and NCBI/BLAST database and second structure and antigen peptide of Eg.ferritin and imitate 3D structure of Eg.ferritin was predicted using DNAstar， Biosun et.al. biological softwares to. Results Deduced ferritin amino acid sequence homology was 97.7% in the 130AA and average homology of different species was 40.79% with the published ferritin gene. And it had 68 nonpolar amino acids and had 9 antigen peptide such as 7N-12E， 36H -43V， 55S-62H， 69Q-76R， 82A-89E， 102I-107E， 117A-124S， 129L-136T. Conclusions Using softwares to predict Eg.ferritin structure and antigen peptide can provide some theoretical bases for selecting some valuable antigen peptides.
Key words： echinococcus granulosus；ferritin；bioinformatics；predicting analysis
铁蛋白（ferritin) 是普遍存在于生物体内的一种保守性较高的多功能多亚基蛋白，它不仅调节体内铁的含量，而且在抵抗氧化损害、调节细胞增殖及机体的免疫反应等方面发挥了重要作用［1-4］。据此推断铁蛋白在寄生虫的生理代谢活动中担负着十分重要的作用，因此，它也成为各种寄生虫疫苗研究中备受关注的候选分子。本文通过生物信息学方法预测细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白（Eg. ferritin）氨基酸序列的结构与功能，为进一步研究其生物学功能提供线索，为其在肝包虫的诊断、药物研发和疫苗筛选方面提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
Eg. ferritin基因由本实验室通过RT-PCR成功扩增，其它寄生虫ferritin氨基酸序列源自GenBank。
1.2 方法
通过DNAman、DNAstar对重组基因序列进行分析并推算出其编码的氨基酸序列。通过NCBI、BLAST在线软件将Eg. ferritin cDNA序列与同源性较高的其它动物ferritin基因序列进行同源性分析。通过蛋白质分析软件Biosun和DNAStar将肽链的二级结构（secondary structure）、亲水性参数（hydrophilicity）、抗原性参数（antigenicity）、可塑性参数（flexibility）、表面可能性（Surface Probability）等5种参数综合进行抗原表位的预测。
2 结果
2.1 Eg. ferritin基因开放阅读框基因序列
DNAman 软件对测序后的铁蛋白基因序列进行分析，测序结果表明该基因开放阅读框为435bp，基因序列，见图1。
2.2 Eg. ferritin氨基酸序列的同源性分析
NCBI/Genbank/BLAST进行氨基酸序列的比较分析结果表明，推导的铁蛋白氨基酸序列是由145个氨基酸残基组成，与已知Genbank中ferritin氨基酸序列比较，并且在其功能区内的130AA同源性达97.7%。有三处氨基酸残基 (阴影加黑标记) 与发表序列存在差异，见图2。
用DNAman 对不同生物的铁蛋白氨基酸序列进行同源性分析，其中与牛带绦虫(Taenia saginata)、日本血吸虫(Schistosoma japonicum)、人铁蛋白H链、曼氏血吸虫(Schistosoma mansion)和肝片虫(Fasciola hepatica)的ferritin平均同源性达40.79%。图3（见封2）中黑色标记区域同源性达100%，粉色为75%，绿色为50%，黄色为33%。
2.3 Eg. ferritin二级结构的预测和蛋白三维结构的模拟
Biosun软件对蛋白二级结构的预测发现二级结构中α螺旋水平较高，而且该Eg. ferritin在真核及原核生物中未发现信号序列酶切位点，也未发现穿膜结构域（图4）。DANstar 对Eg. ferritin的氨基酸序列进行预测，见表1。表1 Eg.ferritin所含氨基酸种类（略）
DNAstar和Biosun软件对Eg. ferritin亲水性参数、可塑性参数以及抗原表位肽段进行预测，两种软件的预测结果基本符合，见表2、3。表2 Eg. ferritin中20种氨基酸可塑性参数（略）表3 Eg.ferriti抗原肽段的预测（略）
3 讨论
随着基因组和功能基因组研究的深入，生物信息学理论和方法也得到了迅猛发展和广泛应用。利用生物信息学方法对蛋白的二级及三级结构进行分析和模拟是一种快捷有效的方法［5-6］。本实验室于2006年成功克隆出细粒棘球蚴中国大陆株Eg. ferritin［7］并注册到GenBank。经DNAman软件对本室扩增的Eg. ferritin基因序列进行分析，发现该序列与互联网上检索序列(肯尼亚株)有所不同：检索的基因序列为522bp，而我们得到的基因序列长度为562bp，并推导出其包含145AA。在NCBI/BLAST公共数据库中氨基酸序列在130AA内同源性达97.7%。Thompson研究认为细粒棘球绦虫在长期的演化过程中会引起遗传基因的改变［8］，据此我们考虑该基因可能是我国细粒棘球蚴虫株特有的，有望作为预防当地包虫病疫苗的候选基因，可能在虫株的鉴别诊断上也有一定的应用价值。
利用DNAman等生物学软件推导铁蛋白的氨基酸序列，预测其蛋白质二级结构和抗原表位，以及模拟其三级结构。经软件分析的结果来看，铁蛋白是生物体中的一个保守性很高的蛋白，并在长期进化过程中被保留下来，其具有的相同氨基酸序列，可能是影响整个铁蛋白功能的核心区即功能域；DNAstar，Biosun对其二级结构进行了预测，结构显示在Eg.ferritin中α螺旋水平较高，说明该蛋白的柔韧性和弹性较好，具有较好的稳定性，在真核及原核生物中未发现信号序列的酶切位点和跨膜结构域，并且两软件对铁蛋白抗原肽段的预测结果基本一致，提高了预测的可靠性。这些区域和结构的确认为铁蛋白功能的进一步探索提供了一定的参考资料，并且为后续选取Eg. ferritin中有抗原价值的肽段，制备多肽段联合疫苗提供了一种可借鉴的手段。
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第8篇：生物信息学分析范文
一、创设和谐的课堂气氛，制造快乐
赞可夫认为，扎实地掌握知识，与其说是靠多次的重复，不如说是靠理解，靠内部的诱因，靠学生的情绪状态而达到的.学生学习物理的主要心理障碍是畏难思想，或者说是缺乏学好物理的自信心，因此教师在教学中应该尽量消除学生心理上的紧张情绪和压抑感，创造一个轻松和谐的教学环境.
古人云“亲其师，才能信其道.”物理教师直接影响学生的物理学习兴趣.所以教师在工作中要投入极高的热情，认真负责，时时观察学生的喜怒哀乐，随时表达教师的关爱之心，在无形中接近师生之间的关系，增强了教师的亲和力.学生对教师的喜欢，对教师的崇拜会很快转移到物理课的学习中，从而很快地接受教师的教诲.
二、创设自主空间，引导学生乐于探究
长久以来，初中学生对物理的兴趣在于做实验，实验不仅能锻炼学生的实践能力，更能激发学生的探索兴趣和创新精神，是学生获得物理知识的重要途径.而课改前大部分实验形式老套，学生大多被教师牵着鼻子做实验，失去了自主性和探究好奇性，不利于创新，更易形成学生心理疲劳.新教材将实验作为探究活动来设计，让学生通过自主探究，得出结论，获得相关知识的理解.而且探究活动的形式多样，探究过程和方法由学生一手掌握，充满挑战性.这种改变有利于创新精神的培养，有利于形成实事求是的科学态度，更有利于克服学生的心理疲劳.
克服学生心理疲劳，就要使学生乐于探究.首先要激发起他们主动探究的欲望，强化学生的探究动机.因此在教学设计中，教师要尽可能地给学生创设自主空间，给学生更多的自和选择权，使学生的潜力得到充分发挥.学生在课题的研究中涌现出很多奇思妙想，用科学创新的精神去学习、探索成了学生最大的乐趣.
三、把生活引进课堂，让物理教学生活化
陶行知先生说过：“教育只有通过生活才能产生作用并真正成为教育”.但是现实的学校教育与学生的生活存在一定的距离，在许多教师和学生的心目中，知识都蕴涵在教材中，教和学的基本任务就是学习教材知识，这样就忽视学生的生活经验，忽视了学生观察世界的真实的感受，教与学都变成了游离于教师和学生真实生活之外的“虚拟世界”，学生感到厌烦甚至恐惧，造成学生严重的心理疲劳.而事实上学生在生活中面对着多种多样的物理现象，从幼年起，就怀有好奇心和神秘感，总想把它们解开，学习物理正是解开这些迷的途径.“回归生活”正体现了教育基本理念的变革，让教育回归生活，让教育成为生活，是教育自身发展的需要，也是生活对教育发出深切呼唤.
四、转变学习方式，尝试合作学习，做学习的主人
第9篇：生物信息学分析范文
[关键词]新生；适应大学；案例分析；学生工作
高校生活的适应过程是每一位刚刚迈入大学的大学生需要经历的重要环节，是大学生涯的起点。那些曾经父母眼中的宝贝们，高中同学眼中的佼佼者，在步入大学这座活力四射而又压力重重的象牙塔，由于种种原因，或迷失，或跌倒。作为高校的辅导员，帮助和引导学生们尽快正确的适应大学生活是义不容辞的任务。感触较深的是一名新生因独立性差和人际关系处理差等原因导致大学生活严重无法适应的案例。
一、案例简介
王某，男，17岁，某高校测绘工程专业大一新生，来自江西省抚州市城区，父母均为下岗工人，靠父亲打零工维持家用，家庭条件比较贫困。该生目前主要问题表现在以下三个方面：在生活中，他从入学后就经常独来独往，学生普遍认为他性格较为孤僻，他在与老师交谈中称无法与寝室同学、同班同学正常交流和生活，甚至有在寝室生活会呕吐的感觉；在学习上，他厌学，学习目的极不明确，对各类学习科目缺乏兴趣和求知欲，上课时总一个人坐最后一排，经常听课精力不集中，甚至上课有心慌的感觉；在思想方面，该生思想较为端正，但进入大学新环境后学习目的不明确，导致思想上缺乏进取心，对自己放任自流。种种迹象表明，他对大学生活失去了兴趣，无法适应大学生活，甚至产生了自暴自弃的消极心态。
二、案例分析
通过多方面、深入地了解该生的情况，结合心理学的专业知识来进行判定，该生目前是属于心理学中的人际关系障碍。导致他出现这一状况的主要原因有以下几个方面。
（一）自身内在因素：该生学习和接受教学的能力并不弱，但从高中到大学，学习方式的180度转变导致了其学习动力不足和态度不端，进取心缺乏，对学习也逐渐失去了兴趣，和其他同学之间的学习差距越来越大，进而产生了独来独往的习惯，无法与同学正常交流与生活。由于自身自卑等性格导致了心理弱势，他总爱把自己身上的弱点、缺点来对比其它同学的优点，这样心里更加失去了平衡和心态更加消极，在学习方面、为人处世方面也都不能放开自我。其学习成绩和个人行为也相应地得不到老师和同学的认可与重视，又导致他的学习积极性与学习兴趣都受到挫败，进而产生了恶性循环。
（二）外部环境因素：从未离开家庭住校，新进大学环境，学习方式由高中时期的灌输式转变为大学主导的自学形式，种种外部原因导致他孤僻、自卑、消极。通过与其父亲电话联系和当面交谈，了解到该生从小学到高中学习成绩一直不错，学习劲头足，但从未离开家庭住校或与同学同寝生活，基本上生活范围就在学校和家庭。他还与父母交流时透露，真正的大学生活与高中老师常说的大学生活是那么的不一样，现今的学习任务和其他压力很大，和自己心理预期有很大的落差。
（三）个人心理因素：该生由于本人性格特征及其家庭方面的原因，人际交往能力缺乏，不会与陌生人交往。当他遇到了人际交往方面的问题时，其表现为束手无策或想呕吐，根本不能较好地去化解人际矛盾。由于习惯不同，他感觉同寝甚至同班学生“懒散、不讲卫生”，进而心怀抱怨，当看到同学在玩时，就认为同学是不好好学习，让自身感觉到是身处被孤立的环境和氛围之中，久而久之自卑心理更为严重。进而，对自己的未来产生了迷茫和自暴自弃的感受，对老师的教育和管理也产生了一定的抵触情绪。
三、方法举措分析
在充分了解和分析了王某的情况后，笔者从以下三个方面进行教育引导工作：
（一）用尊重与信任来引导他。尊重与信任是引导此类问题学生的前提。在教育引导该生的过程中，笔者始终坚信“人是能够改变的”。与他耐心交谈，让他自己说出自己的困惑与想法，尊重他，用平等和关心的方式来对待他；忌当众揭丑、粗暴训斥、冷嘲热讽、变相体罚等手段。通过尊重与信任，用人格的魅力来启迪他，利用爱心与关心去融化他的“抵触心理”，架起了一条能够情感交流的纽带。通过不定期的“动之以情，晓之以理”谈心谈话、因势利导，让他充分感受到老师的尊重、信任、关爱，从而使他逐渐地恢复了一些自信心，也消除了部分自卑情绪，从内心深处接纳他人的帮助。进而引导他对自笔者价值的分析，建议他改进学习和为人处世的方法，让他自己去感受自身的进步带来的个人成就感，逐渐引导他由消极状态变为了主动状态。
（二）为其创造个人表现的契机，让他重塑信心。让学生树立起信心，是赏识教育此类问题的重要方式。首先要去挖掘他自身的潜能，来寻求他身上的“闪光点”，当他参加了一项活动、获得了一项奖励或在学习中有了点滴进步之时，都需要恰如其分的肯定他。为了及时了解、掌握他的内心世界和行为表现，进行有针对性的教育，笔者通过个别谈话、家长沟通、及时鼓励、正面引导等多方面、多方式来发现他的闪光点。积极鼓励他参加学院足球队、参加英语演讲比赛等，取得了一些荣誉，在班级群及时宣传他取得的荣誉，让他品尝到受赞许、表扬的欢乐，使其树立起自信心。这样逐渐激起他内心深处的潜在能量，也在教育引导中取得一定的效果。在他在努力后取得了一定的成绩时，先及时进行肯定，然后及时提出新的目标，循序渐进。逐渐使其看到了学习和生活的希望，进一步激发了自身内在潜力，从而确立起了一种不断进步的自信心。
（三）多方协调合作，持久持续引导教育。根据他的问题成因分析，实现引导和转化显然不是的朝夕之事，找到该生学习习惯、生活性格的转化过程中的反复点尤为重要，通过对其耐心地对待和引导，以及与该生家长、班委一起长期的、系统的打算和计划，不断地调整与其沟通交流方式、方法来进行教育和引导，与家长、班委、寝室室友密切配合，全方位地对他进行思想追踪；并加强该生日常生活与学习上的引导与督促，进一步使其在融入大学生活的同时养成良好的生活和学习的习惯。
经过近4个多月的沟通和引导教育，该生现在已经能与同学、老师正常交流，能够在寝室正常生活，与同寝同学也建立了一定的友谊。上课从倒数第一排，一步步往前挪，现在已经可以在前三排正常学习，且能主动找成绩好的同学补习和学习前三个月落下的科目，期末考试学习成绩无挂科现象。
四、案例启示
