细胞凋亡精选(九篇)

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第1篇：细胞凋亡范文

细胞凋亡是普遍存在于多细胞生物体内的一种自发、主动的细胞死亡过程，是生物体维持细胞数量相对稳定的固有机制。这一机制若有障碍或发生异常，就有可能引发肿瘤或其他病变。而肿瘤是一种细胞凋亡过少而增殖过多的疾病，若能抑制肿瘤细胞的增殖并诱导其凋亡，肿瘤细胞就有可能停止生长，因而中药诱导肿瘤细胞凋亡已成为一条很有希望的治疗肿瘤的新途径。目前常用的诱导肿瘤细胞凋亡的中药有：

1.中药单方制剂

全蝎水浸液提取物可诱导HL――60细胞凋亡，凋亡比例随药物浓度增高而上升，土贝母对体外培养的人肾颗粒细胞癌细胞RLC―310的生长具有明显抑制作用，并能诱导癌细胞凋亡。

2.中药复方制剂

国内外医学界先后报道十全大补汤、六君子汤、人参养荣汤、小柴胡汤、当归补血汤等具有诱导不同肿瘤细胞凋亡的作用，并认为诱导肿瘤细胞凋亡是其抗癌机制之

日本学者对小柴胡汤的研究最为细致。他们用小柴胡汤的几种水溶性成分柴胡皂甙、人参皂甙、甘草甜素、黄芩皂甙和小柴胡汤的水溶性全部成分；分别处理体外培养的肝癌细胞株、胆管癌细胞株、正常大鼠肝细胞和正常人外周淋巴细胞。结果发现，各药效成分单独使用对两种癌细胞株的凋亡诱导率很低，而小柴胡汤全成分作用最为明显，且有浓度依赖性，所有试验药对所培养的两种正常细胞都没有影响。该实验表明中药复方在诱导肿瘤细胞凋亡方面较中药提取成分更有效。

3.中药有效提取成分

第2篇：细胞凋亡范文

    1 ROS和凋亡细胞的线粒体功能变化的关系

    细胞游离系统(cell-freesystem)为认识细胞凋亡机制提供了良好的模型。该系统通过分离细胞核和细胞浆,制备去核细胞(cytoplast)和无浆细胞,可以独立分析细胞浆和细胞核在细胞凋亡中的作用。以此为基础的两大发现强力地揭示线粒体在细胞凋亡中的重要性:①细胞自发的受Bcl-2抑制的核固缩和DNA裂解依赖线粒体的存在;②caspase的活化依赖细胞色素C自线粒体释放。随后的研究显示各种因素诱导的细胞凋亡均出现线粒体功能紊乱,尤其是线粒体跨膜电位(ψm)的破坏。业已清楚,造成ψm下降的主要原因是线粒体膜通透性转运孔(MPT)的开放。MPT位于线粒体内、外膜之间,由一组蛋白复合体构成。许多因素可影响MPT的开关。其中,定位于线粒体内膜的腺嘌呤核苷酸转位蛋白(ANT)发挥重要作用。ANT分子的构象改变,尤其是其相邻巯基的氧化还原状态明显影响MPT的开关。当相邻巯基氧化为二硫键或类似于二硫键的交联复合物时,MPT开放。反之,MPT关闭〔1〕。因此,MPT的开放及ψm的破坏与细胞的氧化还原状态,如巯基氧化、细胞GSH缺少和ROS的堆积密切相关。Macho等〔2〕在研究胸腺细胞凋亡机制中发现,早期凋亡细胞胞内GSH下降和ROS含量轻度升高。后者进一步引起NADH和NADPH下降,产生大量超氧阴离子自由基。因此,在凋亡过程中,ROS既是促发和加速MPT开放重要效应分子,又是MPT开放的产物。这种正反馈机制使MPT开放具有自我放大效应和“全”或“无”的特点,使线粒体ψm的下降进入不可逆过程,细胞发生凋亡。

    2 ROS和凋亡信号传导分子Ca2+的关系

    自从Kaiser等发现糖皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡与Ca2+离子内流增加有关以来,越来越多的直接或间接证据表明胞浆Ca2+浓度上升是细胞凋亡的一个重要事件。Ca2+作为第二信使或死亡信号传导分子,通过参与某些和细胞凋亡相关的蛋白激酶和核酸酶的活化介导细胞凋亡。实际上,在细胞凋亡过程中胞内Ca2+浓度上升和ROS的产生、堆积之间也存在密切联系,而且后者往往先于胞内Ca2+浓度的上升。例如,Tan等〔3〕发现神经细胞系HT22凋亡过程中,ROS的大量产生先于胞内Ca2+浓度的持续上升。进一步地,ROS的产生被FCCP(一种能够抑制线粒体呼吸链产生ROS的芳香族化合物)阻断后,胞内Ca2+水平升高不明显。反之,当Ca2+的内流被钴阻断时,胞内ROS的产生和堆积也受到抑制。因此,他们认为在凋亡早期贮存于内质网或线粒体的Ca2+释放引起胞内Ca2+水平轻度升高,并协同其它因素(如GSH的下降等)引发线粒体大量产生ROS,而ROS进一步促进胞内Ca2+浓度持续升高。David〔4〕等发现抗氧化剂和MPT抑制剂能够抑制糖皮质激素诱导的胸腺细胞内Ca2+水平的升高,进而抑制凋亡。他们认为凋亡中产生的ROS可能引起细胞内贮存Ca2+的细胞器如内质网、线粒体膜和胞膜的破坏,导致胞内Ca2+重分布和胞外Ca2+的内流,从而引起细胞内持续的Ca2+水平升高。总之,ROS的产生堆积和Ca2+水平的升高都是细胞凋亡中的重要事件,且两者相互促进,在细胞凋亡中发挥重要作用。

第3篇：细胞凋亡范文

【论文摘要】细胞凋亡是通过正常的方式在多细胞生物中消除不需要的、衰老的和受损的细胞，使机体细胞有丝分裂的速度与凋亡的速度相平衡。认识肝病发生、发展中细胞的异常凋亡有重要作用。

细胞凋亡是一个主动过程，是机体在生理或病理条件下受到刺激后，导致细胞产生一系列形态和生化方面的改变而引起的程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）。

一、细胞凋亡机制与检测方法

1.凋亡机制

细胞凋亡的生化特点包括质膜磷脂排列方向改变、细胞内离子环境自稳改变、蛋白酶和核酸内切酶激活分别致细胞蛋白质裂解和DNA断裂、细胞内产生神经酰胺、线粒体功能障碍、谷胱甘肽耗竭以及转谷氨酰胺酶激活。参与引发细胞凋亡的蛋白酶有多种，包括半胱氨酰天门冬氨酸特异蛋白酶家族成员和组织蛋白酶等。特别是caspase家族成员与细胞凋亡关系最为密切，至少有14种哺乳动物caspase已获克隆，但仅对caspase-3和caspase-8的功能有所了解。caspase-8在细胞凋亡中发挥启动作用；caspase-3在细胞凋亡中发挥效应作用。由于各caspase可相互激活，所以caspase蛋白酶级联反应是导致细胞凋亡结构改变的主要环节。线粒体功能障碍在细胞凋亡发生机制中起关键作用，能促进线粒体功能障碍的因素很多，包括各种有害刺激和信号传递过程，其中某些配体/受体相互作用最为重要。配体与靶细胞表面受体相结合，就导致复杂的多蛋白复合物形成，即将凋亡信号传递给效应蛋白酶FLICE，FLICE与caspase-8相互反应可激活caspase-8，caspase-8激活后就通过某些不明的机制引发线粒体功能障碍。线粒体功能障碍导致细胞色素C释放，细胞色素C与凋亡激活因子-2相结合，使caspase-3激活。caspase-3又激活DNA断裂因子，导致静息状态的核酸内切酶激活，最终引起DNA断裂。从线粒体功能障碍到DNA断裂，是细胞凋亡生化途径的共同途径。在肝细胞凋亡发生机制中，以Fas配体/Fas受体引发凋亡信号级联反应研究得最多。此外，转化生长因子β1及其受体、肿瘤坏死因子及其受体在肝细胞凋亡发生机制中均起重要作用。细胞凋亡的主要调节因子是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白家族的成员。Bcl-2，通过抑制凋亡以延长细胞存活时间，是哺乳类动物细胞凋亡的一种强大抑制因子。与Bcl-2关系密切的同源物是Bcl-x，有两个RNA拼接变种，长Bcl-X是较大的拼接变种，短Bcl-X是短拼接变种。

2.检查方法

（1）对细胞凋亡形态学的观察有HE染色光镜观察以及电子显微镜、相差显微镜、共聚焦激光扫描显微镜检查。

（2）对DNA降解片段的分析有琼脂糖凝胶电泳检测DNA以及Southern Blotting方法。

（3）荧光标记膜蛋白V的检测。

（4）流式细胞技术（FCM）可以对活体或已固定的凋亡细胞进行定量分析。（5）末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记术（TUNEL）。（6）免疫组化。

二、肝中的细胞凋亡

近年来研究表明：肝细胞的死亡方式包括坏死和凋亡两种。凋亡在肝脏疾病发展过程中的重要作用得到了人们的重视，现将有代表性的几种肝脏疾病中的凋亡现象分述如下。

1.病毒性肝炎。Fas系统介导的细胞凋亡在肝炎发生发展过程中起着重要作用，在不同条件下，穿孔素、颗粒酶、TNF-α、TGF-β等也参与了肝细胞的凋亡。1998年Galle等报道乙型肝炎时肝细胞Fas表达增强，致敏的细胞毒性T细胞（CTL）表达Fas配基（FasL），CTL经过免疫途径介导肝细胞凋亡，参与病毒的清理和肝炎的病理生理过程。若该反应过强，则可能诱发暴发性肝功能衰竭。

2.肝纤维化。肝纤维化是慢性肝病共有的病理改变，有研究表明各种类型的肝纤维化中都存在凋亡。肝星状细胞（HSC）的激活是肝纤维化发生的中心环节。1998年Gong等报道HSC向肌成纤维细胞（MFB）的转变与sFasL介导的凋亡增强相平行，Bcl-2和Bcl-XL在早期HSC上的表达高于晚期HSC和MFB，Bax则相反。这说明调节HSC的凋亡易感性在肝纤维化发生机制中起重要作用。

3.肝硬变。凋亡现象在肝硬变病例的肝细胞、胆管细胞、单核细胞中普遍存在。1999年Frommel等对照研究了正常肝组织、丙型肝炎和肝硬变标本，发现对Bcl-2的表达逐渐增强，肝硬变患者中表达最强，提出了一种解释肝硬变患者中肝癌高发生率的新机制。

4.肝癌。肝细胞癌形成过程中，不仅癌细胞异常增生，而且突变的细胞凋亡减少，肝癌细胞对凋亡诱导反应明显缺陷，1998年Jodo等报道肝癌血清中sFas水平升高，切除肿瘤后，sFas水平即下降。一些抑癌剂如:硒、类维生素A、化疗药物等可促进鼠肝的潜在恶性细胞的凋亡，从而降低肝癌的发病率，这从一个侧面反映了凋亡在肝癌发病机制中的地位。1997年Cras L等报道在非基因毒性致癌物nafenopin所致的原发性肝癌中，正常肝细胞和肝肿瘤细胞都会受到抑制。当nafenopin的作用消失后，二者的凋亡都增加。后者的增殖率和凋亡率都高于前者。

第4篇：细胞凋亡范文

细胞凋亡(apoptosis)又称为程序性死亡，是由基因控制的细胞自我消亡过程。其特征是质膜保持完整性，而核染色质固缩，内源性内切酶激活，将染色质DNA降解成寡聚小体，电泳带谱表现为特征性梯状带，无整个组织的破坏和炎性反应。1992年英国科学家Hickman等首次提出可以将诱导肿瘤细胞凋亡作为以后肿瘤治疗研究的主要目标和手段，诱导肿瘤细胞凋亡治疗逐渐成为国际肿瘤研究的一个热点。近年研究表明，许多中药的有效成分或其提取液具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，中药诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制主要有以下几个方面。

1 阻滞肿瘤细胞增殖周期

一般而言，每一代肿瘤细胞的增殖周期都需要依次经历G1期、S期、G2期、M期四个阶段。许多中药的有效成份能够作用于细胞周期的某一环节，从而使细胞增殖周期受阻，诱导其发生凋亡。用藤梨根氯仿提取液处理人肺腺癌A549细胞，可以对细胞周期产生影响，表现为G0/G1期细胞增多，S期和G2/M期细胞减少，出现G0/G1期阻滞，并呈现一定的剂量依赖关系，伴PI染色检测的细胞凋亡率增加，提示藤梨根氯仿提取液可抑制A549细胞的有丝分裂，诱导肿瘤细胞凋亡[1]。Li等[2]报道黄连提取物及其主要成分小檗碱都可以在不影响CyclinB1 mRNA表达情况下，抑制CyclinB1蛋白活性，但不抑制Cyclin A～Cyclin E蛋白活性，使cdc2激酶活性降低，细胞进入有丝分裂受阻滞，被阻滞在G2期。某些药物可以阻滞肿瘤细胞由S期进入G2/M期而诱发其凋亡。左云飞等[3]研究发现，榄香烯对肝癌腹水瘤细胞系Hca2F25/CL216A3的G0/G1期细胞无明显作用，主要作用在S期，阻止细胞由S期进入G2/M期，从而抑制肿瘤生长。并观察到在G0/G1期前出现一个凋亡特异的AP峰。黄志煜等[4]报道小檗胺可抑制人白血病Jurkat细胞的增殖，使细胞阻滞在S期，G0/G1期细胞比例也有减少，同时并也观察到肿瘤细胞凋亡明显增加。

较多的中药通过阻滞肿瘤细胞于G2/M期而发挥诱导细胞凋亡的作用。马东礼等[5]在研究榄香烯对HeLa细胞的作用时发现，HeLa细胞增殖受到明显的抑制，细胞的分裂能力降低，绝大多数细胞阻滞在G2/M期。张曼颖等[6]研究发现，刺五加叶皂苷能诱导肺癌细胞SpcA1凋亡，细胞周期分析发现，G0/G1和S期细胞比例明显降低，G2/M期细胞明显升高，提示刺五加叶皂苷作用也是使SPCA1细胞阻滞于G2/M期。毛兰素是从鼓槌石斛中分离得到的，也可以阻滞人早幼粒细胞白血病HL60细胞于G2/M期，并伴Bcl2表达下调，Bax表达上调，诱导肿瘤细胞凋亡[7]。

2 影响癌基因和抑癌基因的表达

在肿瘤的发生发展过程中，肿瘤细胞表达的凋亡相关基因起重要的调控作用，其中的某些基因发生缺失，突变或过度表达，可导致细胞增殖失控或凋亡受阻。因此，如何调控凋亡相关基因或其相应产物，提高肿瘤细胞对药物的敏感性，并诱导细胞进入凋亡是肿瘤治疗取得成功的关键。目前bcl2、cmyc、p53是几个了解较为深入的、与凋亡调控有关的基因。

野生型p53(wtp53)基因的主要生物学功能为引起细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡和促进分化，对细胞生长起负调控作用，而因基因缺失或突变产生的突变型P53(mtp53)蛋白则对细胞的增殖和转化起促进作用，抑制细胞凋亡，导致肿瘤的发生[8]。p53基因发生突变是许多人类恶性肿瘤中常见的基因改变之一。实验证明[9]，大蒜素通过促进抑癌基因p53和p21的表达诱导人早幼粒细胞白血病HL60细胞和胃癌BGC823细胞凋亡。Wilson等[10]发现金雀异黄素(genistein)能诱导大肠癌HCT2116细胞的抑癌基因非甾体抗炎药活化基因NAG21和p53、p21的表达，并通过诱导p53基因来调节NAG21的表达。而在大肠癌HCT215细胞(p53基因缺失)中NAG21不能被诱导表达，提示金雀异黄素通过调节p53基因而诱导肿瘤细胞凋亡。

郭伟剑等[11]采用血清药理学方法研究健脾理气药(党参、白术、茯苓、八月札等)的体外诱导凋亡效应。结果显示，含中药血清作用2天后，诱导肝癌细胞凋亡，使细胞周期阻滞于S期，并上调p53蛋白的表达，提示上调p53蛋白的表达可能为健脾理气药诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡的分子机制之一。抗癌口服液(由人参、灵芝和白花蛇舌草组成的复方水煎汤剂)作用于人胃癌MGC803细胞株，发现其具有明显抑制增殖和诱导凋亡作用，用药前后凋亡相关基因p53蛋白、Bcl2蛋白表达均减少，而Fas抗原表达明显增高，差别均有显著性改变[12]。

原癌基因bcl2、cmyc是主要的凋亡调控基因。bcl2能抑制细胞凋亡，bcl2受抑制被认为可能是细胞凋亡的共同通道[13]。而bax基因则倾向于分布在终末分化细胞、退化细胞，在凋亡旺盛的细胞中表达更强，在功能上与bcl2相反，其过度表达则触发凋亡。袁怀波等[14]用RTPCR和蛋白质免疫印迹技术，发现葛根黄酮提取物、葛根素和大豆苷元处理HL60细胞后能够上调bax mRNA表达水平，下调Bcl2蛋白表达和上调bax蛋白表达。姚保泰等[15]研究，发现盐酸小檗碱可通过下调bcl2的表达而达到防治胃癌及癌前病变的目的。左小东等[16]研究华蟾素诱导肿瘤细胞凋亡与细胞周期阻断和抗凋亡基因bcl2表达之间的关系。结果华蟾素能将肿瘤细胞阻断在S期，并能抑制bcl2基因的表达。马靖等[17]研究表明，cmyc、cjun和cfos上调参与甘草诱导肿瘤细胞凋亡的调控。何承伟等[18]研究半边旗提取物6F对HL60细胞内cmyc、bcl2及增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响，发现给予6F 8～231nmol/L，作用HL60细胞12小时，流式细胞分析示cmyc、bcl2及PCNA蛋白表达水平明显下降，并呈剂量效应关系。

因此，中药诱导肿瘤细胞凋亡的机制可能与一些癌基因和抑癌基因的表达改变有关，但其中可能的具体机制仍需进一步研究。

3 抑制端粒酶活性

端粒酶可能是目前已知的最广谱的恶性肿瘤分子标记物，并且与细胞周期和肿瘤凋亡基因表达关系密切。因此，鉴于端粒酶在肿瘤发生和发展中所扮演的重要角色，端粒酶活性的抑制可能是某些抗癌药物发挥作用的机制。

陈伟忠等[19]利用TRAPELISA法半定量检测了不同浓度的苦参碱对肝癌细胞HepG2端粒酶活性的影响。结果显示，苦参碱对HepG2的端粒酶活性有一定的抑制作用。同时认为苦参碱抗肿瘤的机制可能与抑制hTERT表达、降低端粒酶活性有关。曾建新等[20]实验发现，肝癌HCC9204细胞中端粒酶活性较高，而当用AS2O3处理48小时后，测得端粒酶活性显著降低，提示抑制端粒酶活性是AS2O3诱导肝癌细胞凋亡的机制之一。黎丹戎等[21]实验表明，茶多酚具有诱导BEL7402细胞分化的作用，并能降低端粒酶活性的表达。同时并没有发现发生分化的细胞端粒酶活性不下降的情况。说明端粒酶的活性抑制是细胞分化过程所伴有的，提示茶多酚的抗癌机制可能是通过抑制端粒酶的活性而实现。李伏娥等[22]用PCRELISA法对胃癌细胞端粒酶活性进行检测，苦参碱在诱导细胞凋亡的同时伴随端粒酶活性下调，且随苦参碱浓度增大和时间延长，抑制作用逐渐增强。提示苦参碱诱导细胞凋亡的调控可能与端粒酶表达调控之间存在密切联系。

韩国槲寄生中的凝集素能抑制肝癌细胞端粒酶活性[23]，桔梗属grandiflorum的水提取物能抑制肺癌细胞株A549端粒酶活性[24]。姜黄素能诱导白血病细胞株HL60细胞[25]和卵巢癌K562[26]细胞凋亡，伴有端粒酶活性抑制，且表现为浓度依赖性[25，26]。柴胡属中的scorzonerifolium也能诱导肺癌细胞株A549细胞凋亡并能抑制其端粒酶活性[27]。

目前，多数研究认为，这些药物抑制肿瘤细胞端粒酶活性可能是诱导肿瘤细胞凋亡的机制之一。

4 影响细胞凋亡信号传导

caspase是一个半胱氨酸蛋白酶家族， 是细胞凋亡的主要执行者。 已发现的14种caspase均以酶原(procaspase)形式存在并定位于细胞内不同的亚细胞部位。 caspase8基因位于染色体2q3334。 caspase8也称MACH、FLICE、Mch5，1996年被克隆成功， 以无活性的酶原(procaspase8)形式存在于成人及除胎儿脑组织外的各种组织中， 在外周血白细胞中分布较高。 procaspase8有479个氨基酸， 分子量为55kD， 其8种异构体中2种有完整的酶活性， 能启动死亡受体介导的凋亡。 在死亡受体(Fas、DR4和HDR5等)介导的细胞凋亡途径中， caspase8是关键的启动型caspase。 caspase3是CE/CED3家族的重要成员， 是细胞凋亡调控的重要因子之一。 一般以23000相对分子质量的无活性前体存在于细胞质中， 当细胞进入凋亡时被激活， 并可促进ICE家族其他成员一起促进细胞凋亡， 被认为是多种凋亡途径的共同作用因子。

Moragoda[28]报道，姜黄素能抑制胃癌KAT0III和结肠癌HCT116细胞增殖并诱导凋亡，使HCT2116细胞的细胞周期停止于G2/M期，免疫印迹结果显示两种细胞cyclinD、E水平下降，其诱导凋亡的机理是导致PARP断裂，激括caspase8活性，启动Fas凋亡途径。

Pan等[29]研究乌龙茶多酚诱导人组织淋巴瘤U937细胞凋亡时发现，乌龙茶多酚可通过释放细胞色素C，活化caspase9、caspase3来诱导细胞凋亡。

韩国槲寄生中凝集素[23]、桔梗属grandiflorum[24]、姜黄素[25，26]、柴胡属中的scorzonerifolium[27]已经被发现能诱导肿瘤细胞凋亡且能抑制端粒酶活性，具有毒副作用小的优点。他们的研究均提示诱导肿瘤细胞凋亡是通过触发细胞色素C从线粒体向胞质的释放，伴有一些caspase激活而实现的，并可见上调bax表达和下调bcl2蛋白表达。推测线粒体途径是主要的通路。

尽管caspase3是多种凋亡途径共同作用的因子，但并非是所有细胞凋亡途径的共同通路。有报道证实，冬凌草素甲可以诱导人乳腺癌MCF7细胞凋亡，表现为caspase9依赖性，而非caspase3依赖性[30]。最近，还有报道白藜芦醇MCF7细胞凋亡与caspase8和casDase3的激活无关，但与bcl2、NFkappaB下调有关[31]。曲古抑菌素A也能诱导胃癌细胞凋亡，可能与P53和bax蛋白表达增加，bcl2蛋白和SurViVin蛋白表达减少有关，并独立于caspase途径[32]，这也说明细胞凋亡可在没有caspase参与的条件下发生，存在不依赖caspase的凋亡通路。

另外，某些中药诱导肝癌细胞凋亡的机理还与蛋白激酶(PKC)、cAMP等信息分子有关。PKC可拮抗皮质激素诱导的胸腺细胞凋亡，槲皮素作为PKC的拮抗剂，可逆转这种作用，增强机体对肿瘤细胞的吞噬能力，诱导细胞凋亡。槲皮素能降低PTK活性，抑制cAMP和cGMP的磷酸二酯酶，增加cAMP水平，降低cGMP水平，调节细胞内二者的比值，控制细胞凋亡的蛋白磷酸化，导致肿瘤细胞凋亡[33]。

5 展 望

随着研究工作的不断深入，细胞凋亡的研究为肿瘤治疗提供了新的思路和靶点。人们已经认识到诱导肿瘤细胞凋亡很可能是肿瘤治疗的一个新策略。但是，在中医药与细胞凋亡关系研究领域，相关中医基础理论研究明显滞后于中药作用机制研究，目前主要限于运用现代医学手段检测某些中药或方剂对肿瘤细胞的诱导凋亡作用，而缺乏对相应中医理论的探讨。因此，将传统中医基础理论与现代分子生物学有机地结合，开展“中医分子生物学”的研究，对中医药现代化研究具有十分重要的意义。

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第5篇：细胞凋亡范文

【摘要】HSS具有促进肝癌细胞增生和抑制其分裂增生、引起肝癌细胞凋亡的双向作用。HSS可能与多种化疗药物诱导肝癌细胞凋亡有协同作用，并且明显减轻化疗药物的毒副作用，对化疗性肝损伤具有保护作用，有可能开创一种细胞因子与化疗药物相结合治疗肝癌的极具潜力的新疗法。

【关键词】肝细胞刺激因子；肝癌；凋亡

【中图分类号】R735.7【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)02-0016-02

肝脏是生物体内一种具有很强再生能力的器官，从中分离纯化出具有再生刺激功能的物质一直是国内外研究人员关注的重点。特异性的肝细胞生长刺激因子，HGF（血源性）、HSS（肝源性）、ALR（胞源性）在功能机制方面有许多共同和相似之处，又具有各自独特的功能。在临床上，它们既能启动肝损伤后的再生与修复，又能抑制某些肝癌细胞的生长，在肝病治疗药物中占有极其重要的地位。由于HSS特异性地促肝细胞生长的活性，参与肝细胞再生的调控等，一直是肝炎治疗、肝细胞调控的研究热点。而HSS对肝癌细胞株的作用各家报道不一，限制了HSS临床应用。本文就HSS诱导肝癌细胞凋亡的研究进展作一综述。

1HSS研究概况

1975年LaBrecque从初断乳大鼠和肝部分切除后的再生肝中提取出一种生物活性物质，称为肝细胞刺激因子(HSS)。它能刺激肝细胞有丝分裂，促进肝细胞再生和肝细胞DNA的合成，加速肝脏修复，保护肝细胞的作用。其机制仍不清楚。国内目前临床用的促肝细胞生长素即属于HSS类。HSS至今尚未得到纯化单一的活性物质，其分子结构和DNA序列仍不清楚，但有研究显示是一类分子量约为12～18kD，带强负电荷、微弱疏水的多肽类物质的总和。HSS没有种属特异性，但有器官特异性：HSS在体内对骨髓、脾脏、肾等器官均不作任何反应；在体外，对8种正常的或恶变的非肝脏起源细胞株也没有作用，然而无论体内、外，正常或恶变的肝脏起源的细胞均能对HSS产生较强的反应。HSS可由胎肝、再生肝中提取得到，但成年鼠肝脏提取物则无此物质。体外翻译实验表明，人胎肝细胞的多聚A-mRNA可以引导人HSS的生物合成，表明HSS是人胎肝组织的基因表达产物，而不是酶催化加工的结果。HSS存在乳肝组织或再生肝组织的肝细胞胞浆中，肝细胞膜上有相应的受体，在非肝细胞中未发现HSS。HSS与其他肝再生调控因子的主要不同之处在于具有耐热性并仅存在于生长状态的肝脏中。

2HSS诱导肝癌细胞凋亡的研究进展

HSS具有较强的抗损伤能力，可能减轻多种因素(病毒、细菌、化学毒物、缺血再灌注等)引起的肝细胞凋亡的发生[1]，它能刺激肝细胞DNA合成及肝细胞再生，并对肝细胞具有保护作用。HSS对肝癌细胞的作用各家报道不一。由于体外实验证明HSS对肝癌细胞株DNA合成也有促进作用[2]，因而HSS能否致癌变及能否应用于肝癌治疗，一直是人们关心的问题。李茹冰等研究表明，HSS的某些组份在体外尚可抑制肝癌细胞的增殖活性。大多数研究认为低浓度时，对肝癌细胞生长无明显刺激作用，较高浓度则有明显抑制肝癌细胞生长作用[3]。吴国庆等实验发现[4]HSS对正常大鼠肝脏细胞和人肝癌细胞呈促进增生和抑制其分裂增生、引起自溶和死亡的双向作用。研究表明[5]，HSS对肝细胞生长起双重调控作用，不但能促进肝细胞DNA合成，同时还能抑制肝癌细胞生长，预防黄曲霉素导致的大鼠肝癌前病变。在体外实验，细胞水平证实[6]，HSS能抑制肝癌细胞活力，但无明显形态学损害的表现。有学者通过琼脂糖凝胶电泳及流式细胞检测证实[7]，肝癌细胞活性的降低系HSS和ADR的作用下发生细胞凋亡所致。其他学者通过实验亦得出 HSS对肝癌细胞生长具有抑制作用，且对肝癌细胞的凋亡具有促进作用[8]。但类似的动物实验尚需进一步证实。可见HSS具有诱导肝癌细胞凋亡的作用是肯定的。当然，肝的再生增殖、凋亡等的调控并不是由单一因素决定的，HSS作为一种促肝生长物质是不可能完全独立发挥作用的。HSS单独对肝癌细胞系的凋亡诱导作用很弱，很可能与多种化学药物作为促进剂共同发挥作用。

3HSS诱导肝癌细胞凋亡的作用机制

自发现HSS以来，虽然受到一些学者的关注，但HSS对相同起源的正常和恶性肿瘤细胞为何表现出相反的作用，其机制仍不清楚。首都医科大学生物学实验室报道[9]，HSS刺激肝细胞生长的机理可能是诱导细胞EGF受体(EGFR)mRNA的转录水平，上调EGFR的数量，提高EGFR的亲和力和磷酸化程度，促使其内向化。EGFR具有酪氨酸激酶活性，其活化后可诱导形成包括Ras在内的细胞信号传导通路，最终导致细胞增殖[10]。HSS促肝癌细胞生长亦可能通过调节EGFR介导的信号传导通路所为。戴杰等[2]报道，HSS系通过调节EGFR介导的细胞信号传导通路促肝癌细胞生长。HSS与肝细胞或肝癌细胞膜表面的EGFR结合，促使EGF与受体内向化，继而活化EGFR，后者则作用于膜内面的p21ras，引发胞内信号传导的瀑布效应。因此，在基因水平HSS刺激EGF受体表达，可能是HSS启动肝细胞再生的关键。

有学者通过实验发现HSS作用后的肝癌细胞突变型P53蛋白表达明显降低，可能是HSS促进肝癌细胞凋亡的原因之一[8]。HSS对肝癌细胞的生长调节作用与肝癌细胞EGFR/DNA表达密切相关[11]。HSS诱导肝癌细胞凋亡亦可能是通过作用于细胞膜上的EGFR而发挥其生物效应的。实际上EGF于不同细胞系可分别诱导凋亡及减轻凋亡。HSS与EGFR结合后引起EGFR构象的改变[12]。HSS进入细胞，产生一系列理化反应，最终在核内启动一些基因的表达，如p53基因的表达，进一步表现出其效应。也有学者认为HSS在促进肝细胞再生的同时，可能同时具有促进细胞分化的作用，而肝癌细胞凋亡的发生可能与这种尚未证实的促分化作用有关[7]。

4HSS抗化疗性肝损伤的作用

HSS通过增强肝细胞抗氧化能力，抑制脂质过氧化反应，在一定程度上拮抗CTX、CCl4的肝毒性[13]。HSS能够阻止化学毒物或药物导致的肝细胞膜流动性的降低，能够有效地维持急性肝损伤后线粒体的通透性[5]，线粒体膜通透性改变可能是细胞死亡的关键性机制，改善肝脏线粒体的呼吸功能，因而阻止细胞死亡。据报道，HSS能促进肝细胞膜的稳定性，增强肝细胞对化疗药物的耐受性，减轻肝细胞的损伤，提高化疗效果，明显缩小肿瘤病灶，延长生存期，并能减轻化疗引起的呕吐等消化道反应。可见HSS作为一种有效的天然的肝细胞特异性保护剂应用于临床，可望成为化疗性肝损伤有效治疗方法之一。

5小结

肝癌的化疗敏感性较差，全身化疗反应率在20%左右，且肝癌的联合化疗方案并未显示出比单一药物化疗更明显的优势，相反，联合化疗不可避免的具有更高的毒性。研究结果证实多种化疗药物均有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，诱导细胞凋亡成为肿瘤治疗的一个方向。HSS可能与多种化疗药物诱导肝癌细胞凋亡有协同作用，并且明显减轻化疗药物的毒副作用，对化疗性肝损伤具有保护作用，应用于人体可能发挥显著的抗肝癌作用，有可能开创一种细胞因子与化疗药物相结合治疗肝癌的极具潜力的新疗法。

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第6篇：细胞凋亡范文

一、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的实验依据

虽然目前有多项研究显示缺血再灌注可诱发心肌细胞凋亡，但是关于凋亡是由心肌缺血性损伤所诱发还是由再灌注损伤所诱发的问题仍然存在有争议。Kajstura 等[2]发现，在体大鼠心肌缺血2～3h 后即可出现凋亡细胞，缺血4.5h 后凋亡细胞的数量达到高峰，然后逐渐降低。采用在体大鼠心肌缺血再灌注模型发现，持续缺血 2.25h或缺血45min后再灌注1h均有凋亡细胞的产生，并且随着再灌注时间的延长，凋亡细胞的数目增加[3]。与上述研究结果不同，采用在体家兔心肌缺血再灌注模型发现，单纯缺血30min、4.5h 和缺血5min 再灌注4h 的心肌细胞均未出现凋亡现象，而缺血30min再灌注4h的心肌细胞则出现了凋亡，因此认为凋亡是心肌对缺血再灌注损伤的一个特殊反应[4]。Zhao等[5]采用犬冠状动脉完全性梗阻7h或梗阻1h后再灌注6h模型进行研究发现，尽管长时间缺血后可出现明显的心肌坏死，但是原位TUNEL 染色显示坏死区的凋亡细胞极少，而且缺乏特征性“DNA 梯状条纹”。相比之下，缺血1h 再灌注6h 则可诱发凋亡细胞数目明显增加和出现典型的特征性“DNA 梯状条纹”，而且凋亡细胞大多是出现在坏死心肌的周围区域，即缺血后血管再通的相关部位和梗死灶的收缩带区域。该研究结果提示，缺血再灌注后的心肌细胞凋亡主要是由再灌注过程诱发的。综合上述文献，目前认为长时间持续性缺血和再灌注均可诱发心肌细胞发生凋亡，尤其是再灌注后细胞内ATP 水平迅速恢复、胞浆和线粒体内钙超载以及自由基大量生成，更是加速了不可逆性细胞凋亡的发生[1]。

二、心肌缺血和再灌注过程中细胞凋亡及坏死的时程变化关系

在缺血后再灌注期间，心肌细胞的凋亡过程可分为几个阶段：①再灌注早期的起始阶段；②中性粒细胞浸润的中间阶段；③数天、数周或数月之后的延迟阶段，该阶段可能与心室重塑和心功能衰竭的发生有关[6]。

对于心肌缺血和再灌注过程中细胞凋亡及坏死的演变规律，目前同样存在着较大的争议。Kajstura等[2]采用在体大鼠心肌缺血模型研究发现，心肌缺血2h后，凋亡细胞和坏死细胞同时出现；随着缺血时间延长，在凋亡细胞增多的同时亦演变为坏死细胞。Zhao 等[7]采用犬心肌局部缺血1h 再灌注 6h、24h、48h 或72h 模型研究发现，心肌坏死的程度在再灌注24h时最为严重，此后一直保持着相对恒定的状态。相比之下，随着再灌注时间延长，凋亡细胞在坏死组织周围区进行性增多，至再灌注72h 时达到高峰。这提示细胞坏死和细胞凋亡在再灌注期间可同时发生，并且在再灌注早期坏死的发生率相对较高，而在再灌注后期凋亡的发生率较高。

三、细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤中的作用

由于再灌注期间凋亡细胞主要是出现在坏死心肌的周围区域，所以提示凋亡可能在缺血再灌注后心肌梗死范围的扩大中发挥着一定的作用[5]。为此，有人采用核酸内切酶抑制剂—金精三羧酸（ATA）分析了凋亡在缺血再灌注后心肌梗死中的作用[7]。结果显示，在犬冠状动脉梗阻1h 再灌注24h 模型上，再灌注开始时采用ATA处理可明显减少坏死组织周围区凋亡心肌细胞的数目，同时伴有特征性“DNA梯状条纹”的缺失。这种凋亡程度的降低主要是与Bcl-2 上调以及Bax 和细胞凋亡蛋白酶（Caspase-3）活性降低有关。更为重要的是，ATA 所致的心肌凋亡抑制可明显缩小心肌梗死的面积。采用小鼠心脏特异性细胞凋亡蛋白酶过度表达模型的研究发现，在缺血后心肌细胞凋亡加重的同时，亦出现了心肌梗死面积的扩大和心功能的恶化 [1]。这说明细胞凋亡和细胞坏死之间存在着一定的交叉和联系，因此抑制心肌细胞凋亡可能是临床上有效防治心肌缺血再灌注损伤的一条重要途径。

四、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的信号转导通路

目前认为，各种促凋亡的损伤因素一般是通过激活死亡受体（death receptor， DR）依赖性信号转导通路和线粒体依赖性信号转导通路诱发细胞凋亡[8]。死亡受体被其相应的促凋亡配体激活后，可导致凋亡调控基因（主要是Bcl-2 家族）表达失衡和胞浆蛋白酶（即Caspase 家族）活化。而线粒体依赖性途径被激活后，可诱发线粒体释放细胞色素C（cyto C）和凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1），并与半胱天冬酶9 的前体形成复合物，激活下游的半胱天冬酶。半胱天冬酶是细胞凋亡过程的执行器，通过上述两条途径激发半胱天冬酶家族的级联反应是细胞发生凋亡的一个中心环节[9]。

（一）由死亡受体介导的细胞凋亡

肿瘤坏死因子（TNFα）、Fas配体（FasL）和TNF-相关性凋亡诱导配体（TRAIL）均可诱导细胞发生凋亡，因此被称为死亡因子（death factor）。介导它们诱导凋亡作用的受体被称之为死亡受体。位于细胞膜表面的死亡受体主要包括TNFR1（亦称为 p55 或CD120a）、Fas（亦称为CD95 或Apo1）、DR3、DR4 和DR5，它们的共同特征是胞内部分有一大约80 个氨基酸残基构成的死亡功能域（death domain，DD）。死亡因子可分别激活相应的受体，启动导致凋亡的信号转导通路。激活的死亡受体可与细胞内的多种亦具有死亡功能域的受体接头蛋白相结合。其中，激活的Fas 和DR3 可与Fas相关性死亡功能域（FADD）相结合，而激活的TNFR1和DR4可与TNFR相关性死亡功能域（TRADD）相结合。此外，通过TRADD 和FADD 之间的相互作用，来自 TNFR1的激活信号亦可与Fas 信号转导通路发生联系[10]。

死亡受体激活后，可通过一系列反应激活胞浆内的胱门蛋白酶。一般认为，胱门蛋白酶的活化是凋亡执行过程中的最后通路。胱门蛋白酶家族属于白介素-1β转化酶（ICE）类蛋白，因可在天冬氨酸残基之后将底物裂解，故目前被称之为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶。根据胱门蛋白酶在细胞凋亡中的作用及其N 端的长度，可将其分为启动子胱门蛋白酶（包括胱门蛋白酶-8、9 和10）和效应子胱门蛋白酶（包括胱门蛋白酶-3、6 和7，能被启动子胱门蛋白酶所激活）。在正常情况下，胱门蛋白酶是以无活性的酶原形式存在。在心肌缺血性损伤和再灌注损伤的刺激下， Fas-FADD 和TNFα-TRADD 可诱导启动子胱门蛋白酶-8 和10 的激活，然后酶解激活下游的效应子胱门蛋白酶-3、6和7而导致细胞凋亡。效应子胱门蛋白酶（尤其是胱门蛋白酶-3）是细胞凋亡的执行器，活化后可裂解破坏细胞的必需成分（例如细胞骨架和核蛋白）和抑制受损伤DNA 的修复，从而诱发细胞凋亡。研究显示，促凋亡配体与死亡受体结合后诱发细胞凋亡的反应可在数小时内迅速发生，无须RNA 或蛋白质合成，而且亦不依赖于线粒体[11]。也有研究发现，死亡受体TNFR1 被激活后还可进一步激活核转录因子κB（NF-κB）和丝裂素活化蛋白激酶（MAPK）/c-jun氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）信号转导通路来调控心肌细胞凋亡，但是激活后的信号转导通路目前尚未被完全阐明[9]。

（二）由线粒体损伤启动的细胞凋亡

在死亡信号到达线粒体之后，首先引起线粒体膜通透性转运孔开放，然后线粒体内外膜间的凋亡诱导蛋白被释放进入胞浆，主要包括cyto C、凋亡诱导因子（AIF）和半胱天冬酶-2、3、9的前体。在dATP的存在下，线粒体释放的cyto C 可与Apaf-1 形成三聚体。该复合体可将半胱天冬酶-9 的前体直接裂解为线粒体依赖性凋亡信号转导通路中最上游的半胱天冬酶[11]。随后，活化的半胱天冬酶-9 可将半胱天冬酶-3 的前体裂解为半胱天冬酶-3。而AIF可通过直接激活半胱天冬酶-3而诱发细胞凋亡。一般认为，凋亡的整个过程通常分为3 个阶段：①决定死亡阶段：细胞表面的促凋亡信号与细胞内的抗凋亡信号发生联合，促使细胞作出生与死的决策；②执行死亡阶段：如果细胞内的平衡状态倾向于凋亡，则可激活半胱天冬酶家族酶级联反应或AIF 核转位而诱发DNA 降解。③残体清除阶段：包括邻近细胞对凋亡细胞的包围和吞噬消化。由于细胞发展成为不可逆性凋亡的时间需数分钟至数小时或更长，所以在凋亡过程执行前可通过操纵有关因素而影响结局。这就为损伤后治疗干预提供了一个“机会窗”，在这个机会窗内采用一定的措施挽救走向凋亡的心肌细胞，可起到心肌保护作用[12]。

（三）线粒体与半胱天冬酶在诱导细胞凋亡中的相互关系

线粒体与半胱天冬酶在诱导细胞凋亡的过程中均具有重要作用，而且它们之间可互相独立又可互相促进。总体来讲包括下列三种情况：①C半胱天冬酶直接诱导细胞凋亡，没有线粒体的参与，例如Fas 诱导的凋亡；②线粒体直接诱导细胞凋亡，半胱天冬酶不参与。这种情况主要见于Bax 或Bax 类似蛋白大量表达而抑制半胱天冬酶，使DNA 发生凝集（而半胱天冬酶可使DNA 发生降解）和线粒体膜通透性转运孔开放；③线粒体和半胱天冬酶共同参与细胞凋亡，以实现死亡信号的级联放大，加快凋亡的发生[11]。

目前，线粒体损伤和半胱天冬酶活化在缺血再灌注过程中诱发心肌细胞凋亡的作用已经得到了证实。采用培养的心肌细胞缺氧/复氧模型、在体大鼠局部心肌缺血再灌注模型以及氧化应激介导的犬心室功能障碍模型进行的研究均发现，cyto C 释放以及半胱天冬酶-3 和半胱天冬酶-9 活化可诱发心肌细胞凋亡。能够阻断cyto C 释放和半胱天冬酶活化的药物和处理措施均可明显减轻心肌细胞凋亡的程度，而加入外源性细胞色素C 和dATP 则可激活足以诱发心肌细胞凋亡的半胱天冬酶[6，11]。而且，在原发性心肌病患者心肌中检测到的心肌凋亡细胞亦可能是由线粒体cyto C 释放所致的半胱天冬酶-3 活化引起的。在犬心肌缺血再灌注损伤模型的研究显示，缺血心肌内存在活化型半胱天冬酶-3 的高度表达[7]，并且抑制半胱天冬酶的活性可明显减轻心肌细胞凋亡的程度和缩小心肌梗死的面积[13]。

五、心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生机制

（一）心肌细胞凋亡的基因调控

细胞凋亡的调控基因分为诱导基因（死亡基因）和抑制基因（生存基因）。在生理条件下，心肌细胞有序而协调地激活凋亡诱导基因（Bax、Fas、p53 等）和/或凋亡抑制基因（Bcl-2 等），共同调控细胞代谢而维持细胞内环境稳定。但是在缺血再灌注过程中，凋亡相关基因及其表达产物发生了变化，从而导致心肌细胞凋亡的发生。在调控凋亡的基因中，目前研究较多的是Bcl-2基因家族。

Bcl-2家族包括一组抗凋亡基因（Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Bag-1和BI-1）和一组促凋亡基因（Bax、Bak、Bad、Bid和Bim）。Bcl-2是最主要的抗凋亡基因，而Bax 的作用则正好相反，Bcl-2/Bax的比值将决定细胞是否发生凋亡。研究发现，长时间缺血诱发心肌细胞发生凋亡之后，心肌内Bcl-2 表达减少而Bax 表达增多[14]。据报道，在梗死区周围的存活心肌中有Bcl-2 的阳性表达，而在心肌梗死区内则有Bax 的过度表达。在Bcl-2过度表达的转基因小鼠，缺血和再灌注所致的心肌细胞凋亡、心肌梗死和心功能均明显减轻。

通常认为Bcl-2 具有抗氧化自由基的作用，可通过减轻脂质过氧化和增强细胞对活性氧的耐受而预防凋亡的发生。另外，Bcl-2还可防止细胞内酸中毒、抑制细胞内钙超载、抑制TNFα的合成和释放、减轻促凋亡基因Bax的细胞毒性作用以及稳定线粒体膜电位和抑制线粒体释放cyto C 和AIF 等。这些作用均有助于减轻缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的发生[14]。

（二）心肌细胞凋亡的外部诱发因素

1．中性粒细胞浸润 研究发现，中性粒细胞在再灌注心肌中聚集增加可加重心肌细胞凋亡的程度，并且危险区中性粒细胞聚集与凋亡细胞数目的增加呈线性关系，提示中性粒细胞与心肌细胞凋亡的发生密切相关[5，15]。关于中性粒细胞如何介导心肌细胞凋亡的发生目前尚不十分清楚，可能是由于中性粒细胞聚集堵塞微血管而导致无复流现象，亦可能与中性粒细胞活化后释放大量的炎性介质（例如自由基和细胞因子）有关[16]。

2．巨噬细胞活化 采用离体和在体心肌缺血再灌注损伤模型的多项研究显示，巨噬细胞诱发的炎症反应可能是促发心肌细胞凋亡的重要因素[16，17]。离体实验研究显示，巨噬细胞可通过释放细胞因子和细胞毒性介质（例如TNFα和NO）而诱发细胞凋亡。在大鼠离体心肌细胞进行的研究发现，巨噬细胞释放的细胞因子可呈时间依赖性诱导心肌细胞凋亡。近年来也还有研究发现，缺血再灌注心肌内的大部分巨噬细胞在再灌注6～24h内一直维持着较为完整的形态，直到48h后才发生明显的脱颗粒。再灌注48h 和72h 后聚积在危险区内的巨噬细胞数和凋亡细胞数呈明显的线性关系，提示活化的巨噬细胞可能参与了再灌注诱发的延迟性心肌细胞凋亡[5，17]。

3．非炎症细胞激活 在心肌缺血再灌注过程中，除了上述炎症细胞之外，被激活的血管内皮细胞和心肌细胞亦可合成和释放大量的炎症介质，然后通过死亡受体依赖性信号转导通路而诱发心肌细胞凋亡[15]。

4．氧化应激增强 多项研究显示，氧自由基是启动凋亡的重要因子，采用抗氧化剂和自由基清除剂可有效抑制细胞凋亡的发生。氧自由基诱发凋亡的机制可能为：①氧化破坏内质网和线粒体膜的完整性而导致细胞内钙超载；②促使线粒体膜通透性转运孔开放而释放cyto C；③激活转录因子AP-1 和NF-κB，后者可通过上调TNFα和白介素-6而诱导心肌细胞凋亡的发生[18]。

5．细胞因子与黏附分子大量表达 在心肌缺血再灌注期间，活化的巨嗜细胞、肥大细胞、中性粒细胞以及心肌细胞本身可产生大量的细胞因子和黏附分子。细胞因子不仅可促进心肌炎症，而且还可与黏附分子相互作用而加重心肌细胞凋亡[15]。在缺血和再灌注期间，心肌细胞内的TNFα表达明显上调，TNFα可通过下列机制诱发心肌细胞凋亡：①与其受体TNFR1 结合后，直接激活心肌细胞凋亡的信号转导通路；②激活酸性鞘磷脂酶，通过产生脂质信使神经酰胺而介导细胞凋亡的发生； ③诱导内皮细胞和部分心肌细胞表达IL-1、IL-2、IL-6、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）和血小板活化因子，促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附和脱颗粒，并激活NADPH 氧化酶而释放氧自由基，从而间接地调控凋亡过程[19]。

6．细胞内钙超载 细胞内钙超载是各种损伤因素的最后共同通路。在缺氧诱导的心肌细胞凋亡中，无论是阻断细胞外Ca2+内流还是减少细胞内Ca2+释放，均能有效减少心肌细胞凋亡的发生[20]。细胞内Ca2+浓度升高后可激活内源性Ca2+-Mg2+依赖性核酸内切酶，使细胞核内染色体DNA降解成寡核苷酸片段。此外，Ca2+还可激活Ⅱ型转谷酰胺酶，使大量蛋白质发生交联，在脂质膜下形成蛋白质网，防止胞浆内成分外漏，避免了像坏死所致的炎症反应。而且，转谷酰胺酶还参与了胞浆膜的修饰，从而有利于吞噬细胞识别形成的凋亡小体而将其吞噬。

7．细胞内酸中毒 在心肌缺血再灌注时，无氧代谢可导致细胞内、外H+浓度增加而引起酸中毒。细胞内酸化可使细胞趋向凋亡，可能与凋亡过程中的一些酶例如核酸内切酶的最佳pH

8．一氧化氮与细胞凋亡 一氧化氮（nitric oxide，NO）是体内一种重要的生物信号分子，在心血管生理学和病理学过程中发挥着重要调节作用。研究发现， NO具有细胞毒性作用，可增强氧化应激（尤其是iNOS的激活和过氧亚硝基阴离子的大量生成）、干扰能量代谢、直接损害DNA、激活多聚ADP 核糖聚合酶[PARP]或扰乱细胞内Ca2+稳态，从而诱导包括心肌细胞在内的多种细胞发生凋亡；但是亦有研究报道，NO是一种细胞保护因子，可通过抑制中性粒细胞的黏附和聚集、上调cGMP、抑制Bcl-2降解和线粒体释放cyto C以及降低半胱天冬酶的活性而抑制细胞凋亡的发生[21，22]。至于NO 在心肌缺血再灌注过程中是发挥促进细胞凋亡还是抑制细胞凋亡的作用，可能取决于NO在心脏内发挥作用的浓度和心脏的氧化还原状态。

六、缺血再灌注过程中心肌细胞凋亡的防治

目前，防治心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡发生的措施包括：消除诱发细胞凋亡的因素、切断细胞凋亡信号转导途径、提高心肌细胞内源性保护机制和瓦解细胞凋亡信号。由于心肌缺血再灌注过程中细胞凋亡的发生是多因素和多途径的，所以阻断细胞凋亡级联反应中的关键环节和抑制参与多信号途径的介质是防治细胞凋亡的最有效方法[15]。

研究发现，β受体阻断剂可抑制高浓度儿茶酚胺促发的细胞凋亡[23]，血管紧张素转换酶抑制剂亦可抑制血管紧张素Ⅱ引起的心肌细胞凋亡。针对氧化应激[18]、细胞内钙超载[24]和改善心肌血流灌注[15]的方法亦具有同样的效应。采用可溶性死亡受体或受体拮抗剂清除死亡因子，可减轻死亡受体介导的心肌细胞凋亡[1]。

采用抗凋亡基因Bcl-2产物和可溶性存活因子例如胰岛素样生长因子1（IGF1）能够抑制缺血所致的细胞凋亡[25]。IGF1 过度表达可减少非梗死区细胞凋亡和促进梗死后有利的心肌重构。细胞凋亡的执行包括线粒体扩大和半胱天冬酶激活在内的一系列信号途径的活化。内源性半胱天冬酶抑制剂能抑制缺血再灌注刺激所致的细胞凋亡。抑制半胱天冬酶的药物亦可短期抑制心肌细胞凋亡的发生。研究发现，L-肉碱可抑制半胱天冬酶和降低TNFα，从而防止心肌细胞凋亡的发生[19]。

第7篇：细胞凋亡范文

关键词：凋亡；中药；综述 

细胞凋亡(apoptosis)是一种细胞生理性死亡的形式，是多细胞有机体为保持身体组织稳定、调控自身细胞增殖和死亡之间的平衡、由基因控制的细胞自动性死亡过程，在机体的生长发育、衰老、免疫调节、内环境稳定以及肿瘤、感染、自身免疫性疾病等生理病理过程中均有重要意义。机体通过凋亡过程来清除体内不需要或有害细胞，或通过抗凋亡过程维持细胞功能。抑制凋亡在维护生命个体的稳定、抗衰老等过程中有很重要的作用。近年来有关中药抑制细胞凋亡的研究日渐增多，研究涉及缺氧、缺血等因素导致的神经系统、心脑血管、胃肠功能损伤的保护、肿瘤治疗(放、化疗)后骨髓、免疫功能损伤的防治等方面。中医药可对细胞凋亡过程的不同环节进行调节，进而抑制细胞凋亡，维持机体内平衡，阻止组织病理过程的恶化。 

 

1 通过调控细胞凋亡途径抑制凋亡 

机体内存在多条细胞凋亡的信号转导途径，其中内源性的线粒体细胞色素C途径和外源性的死亡受体途径所介导细胞凋亡是目前研究较多的途径。 

1．1 通过调控线粒体细胞色素C途径抑制凋亡 许多研究结果均表明，线粒体在细胞凋亡过程中起着“主开关”作用，是最重要的途径之一，其通过Cyt－C途径诱导细胞凋亡。在细胞凋亡信号的刺激下，会使caspases激活，胞质Ca2+水平升高，产生ceramide，诸如此类的改变会直接或间接地引发线粒体通透性转变孔道(PTP)开放，使能量产生中断，线粒体内膜跨膜电位(ψm)的下降，并导致外膜破裂，释放出Cyt－C等各种活性蛋白，Cyt－C从线粒体内释放是关键的一步。胞浆内的Cyt－C在dA7P存在下，与凋亡蛋白酶活化因子－1(Apaf－1)结合，诱导caspase－9前体的寡聚化，并形成凋亡体。凋亡体的形成可激活caspase－9，继而活化Caspase－3，启动Caspase的级联反应，引起细胞凋亡。 

有研究以缺氧／缺糖再给氧为模型，观察清开灵注射液对神经细胞线粒体膜电位的保护作用。结果发现清开灵注射液能显著降低细胞内Ca2+浓度，抑制细胞凋亡，提高线粒体膜电位和活性，认为清开灵注射液可抑制缺氧一缺糖再给氧损伤所致的线粒体膜电位的降低、抑制神经细胞内钙超载与抑制细胞凋亡有关。 

1．2 通过调控死亡受体途径抑制凋亡 凋亡还可以通过死亡受体通路介导，现知死亡受体途径主要包括Fas／FasL途径和TNFa／TNFR途径。死亡受体家族成员包括7NFRl、TNFR2、Fas／CD95、TRAlL－Rs等，当死亡受体与其相应的配基(死亡配体)特异性结合后，将凋亡信号由胞外传人胞内，在连接分子的媒介下，激活Caspase，导致细胞凋亡。

    1．2．1 通过调控Fas／FasL途径抑制凋亡 中药可以通过调控Fas／FasL的表达，抑制受损细胞的凋亡。参附注射液对培养的乳鼠心肌细胞缺氧及缺氧／复氧时凋亡相关基因Fas／FasL蛋白表达影响研究发现，结果缺氧4.5h及10.5h后，心肌细胞Fas／FasL蛋白的阳性表达指数(positive expressionindex，PEI)参附注射液组明显低于缺氧组；参附注射液可通过下调Fas／FasL蛋白表达，参附注射液组还见到caspase-3活性下降，提示参附注射液抑制乳鼠心肌细胞凋亡是通过Fas／FasL-caspase-3途径实现的。

1．2．2 通过调控TNFa／TNFR途径抑制凋亡 研究还发现中药通过调控7NFa／TNFR途径抑制细胞凋亡。枸杞多糖对老年大鼠T细胞过度凋亡及相关基因表达研究发现，枸杞多糖可以下调促凋亡的TNFRl基因mRNA表达并上调抗凋亡的Bcl-2基因mRNA表达，降低老年大鼠T细胞的过度凋亡，从而改善老年大鼠T细胞过度凋亡的状态。 

 

2 通过影响凋亡信号传导抑制凋亡 

细胞抗凋亡的信号转导是在内外生存因子的刺激下，激活多种信号偶联途径的信号转导过程。常见的凋亡信号传导途径有磷脂酰肌醇－3－激酶(P13K)／蛋白激酶B(PKB或称为AKT)途径，RAS－MAPK途径，NF－κB途径，N()途径等。

    2．1 P13K／PKB途径 P13K是一种胞内磷脂酰肌醇激酶，PKB是P13K的靶蛋白之一，P13K与PKB是促进凋亡作用的重要调节因子；其过量表达可抑制细胞的凋亡。黄芪多糖(APS)对2型糖尿病大鼠肾组织胰岛素信号分子表达的研究发现，认为黄芪多糖降低2型糖尿病大鼠血糖水平的机制可能与提高糖尿病大鼠肾组织中胰岛素受体(InsR)、胰岛素受体底物－1(IRS－1)、P13K水平，增加组织对胰岛素的敏感性，改善胰岛素信号转导有关。 

第8篇：细胞凋亡范文

【关键词】 短发夹RNA；干预治疗；磷酸二酯酶5；心肌细胞

doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.06.035 文章编号：1004-7484（2013）-06-2893-02

病理性细胞凋亡是心肌细胞丧失的形式之一，是心血管疾病发生和发展的基础[1]。心肌细胞凋亡既是心肌细胞损伤的一种反应，同时又是心功能受损的一个重要参与因素。因此，减少心肌细胞凋亡，可能会减轻心室重构，减轻心肌纤维化，改善心脏功能，抗细胞凋亡成为心力衰竭生物治疗的一个新方向。越来越多的证据表明PDE5与心血管系统疾病有密切的关系。最近研究表明PDE5在晚期心力衰竭患者心肌中表达增加，并且会加重心衰患者的心室重构，可能是由于cGMP/PKG信号的下降，加剧心功能恶化[2]。RNA干扰是近年发现的一种由双链RNA引发的转录后基因沉默机制，能特异性地抑制靶基因的表达，具有快速、高效、容易操作、序列特异性强等优点[3-4]。本实验通过构建磷酸二酯酶5的短发夹RNA重组腺病毒载体（PDE5 shRNA），研究其对缺氧缺糖条件下乳鼠心肌细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物新生C57BL/6J小鼠购自大连医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK（辽）2008-0002），用于乳鼠心肌细胞的培养。

药品与试剂DMEM培养基、FBS购自美国Sigma公司，TUNEL试剂盒购自Promega公司，cGMP、PKG试剂盒购自美国SantaCruz公司。

1.2 方法 shRNA重组腺病毒载体构建我们根据鼠的PDE5A序列设计PDE5短发卡RNA，两个互补PDE5的寡核苷酸序列是：SENSE 5`-GATCCGGAGC AGCAGTCATT GGAAGTCGAA ACTTCCAATG ACTGCTGCTC CTTTTTTG-3` and ANTISENSE 5`-AATTCAAAAA AGGAGCAGCA GTCATTGGAA GTTTCGACTT CCAATGACTG CTGCTCCG-3`.根据鼠PDE5序列设计并合成shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆进入载体pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector，获得鼠PDE5的shRNA表达载体质粒（pSIREN-DNR-PDE5-shRNA-DsRed）。然后将供体注入到骨架腺病毒pLP-Adeno-X LP CMV，获得pLP-Adeno-PDE5 shRNA，没有插入shRNA的普通腺病毒载体作为对照组（Null），然后将携带有PDE5 shRNA的腺病毒载体（shPDE5）和普通的腺病毒载体（Null）分别转染HEK 293细胞，放在DMEM和10% FBS混合培养液中培养，通过HEK293细胞扩增病毒，并经离心、提取、纯化制备高滴度重组腺病毒载体。

准备和培养转导的心肌细胞按照文献[6]从一日龄C57BL/6J小鼠提取心肌细胞，在含有10%FBS的DMEM培养液中37°C培养24小时，进行心肌细胞的鉴定。

分组及给药分为实验组和对照组，实验组（shPDE5）用浓度1X106个/ml的PDE5shRNA腺病毒转染心肌细胞，对照组（Null）转染等量未携带PDE5shRNA的腺病毒载体（Null），在正常条件下培养，培养16小时候在激光共聚焦显微镜下观察鉴定。

1.3 原位末端标记分析（TUNEL） 正常培养的心肌细胞，用缺糖Hanks液代替正常培养基，放在37°C饱含95%N2/5%CO2密闭容器中培养，细胞培养8小时之后，利用原位末端标记分析对各组心肌细胞进行细胞凋亡检测。

1.4 统计分析 用SPSSl7.0进行统计分析。计数资料以均数±标准差表示，均数比较用单因素方差分析（one―wayANOVA），P

2 结 果

2.1 PDE5shRNA转导鉴定 经PDE5 shRNA转导16小时以后，实验组大多数细胞在荧光显微镜下呈现红色，证明PDE5 shRNA腺病毒载体转到心肌细胞是成功的（图1）。

2.2 TUNEL阳性检测 细胞在缺氧缺糖条件下培养8小时后进行TUNEL分析显示，实验组的心肌细胞在缺氧缺糖条件下能够耐受细胞损伤，而对照组细胞对细胞损伤很敏感，细胞在缺氧缺糖条件下培养8小时之后，与实验组比较，对照组TUNEL阳性心肌细胞明显增加（图2）。

3 讨 论

RNA干扰是指当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）时，通过dsRNA介导特异性的使内源性mRNA发生降解而导致基因表达沉默的现象，这种现象发生在转录后水平，又称为转录后基因沉默[6-7]。由RNAi现象产生的RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

本研究发现，利用靶目标PDE5的短发夹RNA（PDE5 shRNA）对缺氧缺糖条件下心肌细胞干预治疗，通过抑制PDE5的表达明显拮抗缺氧缺糖诱导的心肌细胞凋亡。这些观察结果与早先的报道一致，即PDE5抑制剂西地那非可以拮抗心肌局部缺血引起的心肌细胞凋亡[8]，有研究者提出，cGMP/PKG信号通路在PDE5抑制剂抗心肌细胞凋亡方面起到非常重要的作用[9-10]，本实验结果证明，经过PDE5 shRNA 干预，细胞凋亡明显减轻，这些都高度提示cGMP/PKG信号通路在减少细胞凋亡方面起到核心作用。

总之，PDE5 shRNA明显拮抗缺氧缺糖诱导的心肌细胞凋亡，通过持续抑制心肌细胞PDE5基因表达对缺氧缺糖条件下心肌细胞发挥显著的保护作用。

参考文献

[1] Lockshin RA.Programmed cell death：history and future of a Concept[J].J Soc Biol，2005，199（3）：169-173.

[2] Pokreisz P，Vandenwijngaert S，Bito V，et al.Ventricular phosphodiesterase-5 expression is increased in patients with advanced heart failure and contributes to adverse ventricular remodeling after myocardial infarction in mice[J].Circulation，2009，（119）：408-416.

[3] Bernstein E，Caudy AA，Hammond SM，et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature，2001，409（6818）：363-366.

[4] Nishikura K.A short primer on RNAi：RNA-directed RNA polymerase acts as a key catalyst[J].Cell，2001，107（4）：415-418.

[5] Wang L，Feng ZP，Kondo CS，et al.Developmental changes in the delayed rectifier K+ channels in mouse heart[J].Circ Res，1996，（79）：79-85.

[6] Hannon GJ.RNA interference[J].Nature，2002，（418）：244251.

[7] Grimm D，Streetz KL，Jopling CL，et al.Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways[J].Nature，2006，（441）：537541.

[8] Das A，Xi L，Kukreja RC.Phosphodiesterase-5 inhibitor sildenafil preconditionscardiac myocytes against necrosis and apoptosis.Essential role of nitric oxide signaling[J].J Biol Chem，2005，（280）：12944-12955.

第9篇：细胞凋亡范文

【关键词】 舒林酸；胃癌细胞；细胞凋亡；环氧化酶2；凋亡相关基因

0 引言

流行病学研究发现，经常服用非甾体类抗炎药（NSAIDs）者，其结、直肠肿瘤的发病率下降将近50% [1]。动物实验研究表明NSAIDs对许多动物诱发性肿瘤如结肠癌、膀胱癌有明显的化学预防作用 [2，3]，临床上非甾体类抗炎药舒林酸可使家族性腺瘤肉病患者的肠道息肉消退 [1]。对于胃癌，这方面的研究较少，其作用机制也不清楚。本实验将舒林酸设置不同的作用浓度和作用时间，于人胃癌细胞株BGC-823共培养，观察舒林酸对胃癌细胞凋亡的调控作用，探讨其作用机制。

1 材料与方法

将舒林酸作用于人胃癌BGC823细胞（购自中国科学院上海细胞生物学研究所；舒林酸购自Sigma公司）。设置3个实验组，舒林酸浓度分别为0.6mmol/L、0.9mmol/L和1.2mmol/L，以不加药为对照组，作用时间分别为24、48、72h。应用流式细胞术、TUNE法检测胃癌细胞的凋亡率（200倍光镜下每张爬片随机计数1 000个细胞，每组4张涂片共计数4 000个细胞，计数其中的阳性细胞数，计算阳性率。阳性率＝阳性细胞数/4 000×100％）；透射电镜观察胃癌细胞超微结构改变；免疫组化SP法检测凋亡相关基因蛋白bcl2、survivin的表达以及环氧化酶2（COX2）蛋白的表达（鼠抗人COX2、bcl2、survivin单克隆抗体、免疫组织化学SP试剂盒、TUNEL试剂盒，均购自福州迈新生物技术开发有限公司）。

2 结果

2.1 流式细胞仪检出了凋亡峰（图略），该峰随着舒林酸作用浓度的增大而升高；随作用时间的延长而升高。经0.6mmol/L、0.9mmol/L、1.2mmol/L浓度舒林酸作用24h后，凋亡细胞分别占8.7%、20.1%和36.7%，而对照组仅为1.9%；作用48h后，凋亡细胞分别上升至19.8%、35.6%和54.9%，对照组为2.8%。各药物组与对照组比较有显著性差异（P

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2.2 TUNEL法检测细胞凋亡率

随着舒林酸浓度增大，细胞凋亡率增加。各实验组与对照组比较以及实验组之间比较均有显著性差异（P

2.3 透射电镜下，对照组BGC-823细胞体积较大，结构完整，核形规整、核膜清晰，染色质分布均匀。舒林酸作用组可见细胞皱缩、核质比例减小，核仁不清晰，染色质聚集于核膜下呈块状或新月状（图略），并见到细胞质膜包被的凋亡小体（图略）。

2.4 免疫组化检测凋亡相关基因蛋白bcl2、survivin表达和COX2蛋白表达，结果显示胃癌细胞的bcl2蛋白和survivin蛋白表达下降，COX2蛋白的表达阳性率也低于对照组，以上结果均呈时间和剂量依赖性(P

3 讨论

本实验应用FCM，在不同浓度舒林酸作用24、48h后，各实验组均检测到凋亡峰，且细胞凋亡率显著高于对照组（P

【参考文献】

［1］Sandler RS， Glanko JC， Murray SC， et al. Aspirin and non steroidal antiinflammatory agents and risk for colorectal adenomas [J]. Castroenerology， 1998，114(30)：441447.