巨噬细胞精选(九篇)

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第1篇：巨噬细胞范文

细胞感染模型制作参照预实验结果，按感染复数（multiplicityofinfection，MOI）为50∶1（细菌∶细胞）将培养至对数生长期的ST6、ST6－ΔpRST98、ST6－c－pRST98加入细胞，100g离心10min，继续在5％CO2、37℃条件下共培养1h。弃上清液（此时定为0点），加入含100mg／L的AMK培养液作用2h，以杀死胞外菌，在0h和2h收集细胞进行检测。1．2．5自噬蛋白LC3和p62的检测分别在0h和2h收集细胞，用于检测自噬相关蛋白LC3和p62。用预冷的磷酸缓冲液（phosphatebufferedsaline，PBS）洗1次，100g离心5min，小心吸除上清液。在细胞中加入裂解液，超声裂解细胞，4℃13200g离心20min，吸取上清液后用二羧基二喹啉酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒测蛋白浓度。取60μg样品上样，进行10％十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecylsulfate－polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS－PAGE）（浓缩胶70V，30min；分离胶90V，70min），将蛋白转移至硝酸纤维素膜（300mA，70min），5％脱脂奶粉室温封闭1h；加入鼠抗β－actin（1∶3000稀释）、兔抗LC3（1∶1000稀释）和兔抗p62（1∶1000稀释），4℃孵育过夜。次日室温孵育1h，用含Tween20的Tris缓冲液（Trisbuff－eredsalineandTween20，TBST）洗3次，每次5min；加入鼠二抗（1∶3000稀释）、兔二抗（1∶3000稀释），室温孵育90min，TBST洗3次，每次5min；化学发光法显影，检测LC3和p62蛋白的表达。mRFP－GFP－LC3质粒转染后荧光显微镜观察自噬体和自噬溶酶体变化应用脂质体转染法将与单体红色／绿色荧光蛋白（monomericredfluo－rescentprotein－greenfluorescentprotein，mRFP－GFP）偶联的自噬蛋白LC3真核细胞表达载体mRFP－GFP－LC3质粒导入巨噬细胞。取对数生长期的THP－1细胞，接种于铺有小圆玻片的24孔板，2×105个／孔，PMA诱导分化成熟。转染时，细胞融合度为80％～90％。弃去孔内含10％胎牛血清的RPMI1640，用无血清RPMI1640洗2次，每孔加500μl无血清RPMI1640，37℃、5％CO2培养1h。用50μl无血清RPMI1640稀释0．8μg质粒DNA，轻轻吹吸3～5次混匀。用50μl无血清RPMI1640稀释2μlLipofectamineTM2000，轻轻吹吸3～5次混匀，室温静置5min。混合转染试剂和质粒DNA稀释液，轻轻吹吸3～5次混匀，室温静置30min。将转染复合物缓慢滴加至24孔板中，100μl／孔，前后轻摇细胞板混匀。1．3统计学处理用SPSS17．0进行统计学数据处理，多个实验组均数间两两比较采用LSD－t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

CQ阻断THP－1细胞自噬的浓度确定用WB和MTT法确定CQ工作浓度。p62作为自噬的底物蛋白，主要在自噬溶酶体中降解。CQ可通过破坏溶酶体中酸性水解酶的活性，使p62无法正常降解而累积。WB结果显示，30μmol／LCQ作用细胞6h后，p62已明显累积；40μmol／LCQ作用细胞6h后，累积程度达饱和（图1A、1B）。结合MTT法检测CQ对细胞活性的影响，30μmol／LCQ作用24h后，细胞存活率为58．58％；而40μmol／LCQ作用24h后，细胞存活率仅为46．03％（图1C）。细菌OD值测定结果表明，30μmol／LCQ对ST6、ST6－ΔpRST98和ST6－c－pRST98菌量无明显影响，因此将30μmol／L作为CQ的工作浓度。伤寒沙门菌质粒对THP－1自噬蛋白LC3Ⅱ与p62表达的影响WB结果显示，细菌与THP－1作用0h，CQ处理组LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值明显高于对照组，其中突变株ST6－ΔpRST98LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值的增加量均高于野生株ST6（图2A、2B、2D）。细菌与THP－1作用2h，CQ处理组LC3Ⅱ／β－actin值及p62／β－actin值较对照组明显上升，但突变株ST6－ΔpRST98的上升量仍显著高于野生株ST6（图2A、2C、2E）。mRFP－GFP－LC3质粒转染后荧光显微镜观察自噬体和自噬溶酶体的变化转染mRFP－GFP－LC3质粒的细胞，自噬体为红绿叠加后形成的黄色点状聚集物，因溶酶体的酸性环境会淬灭绿色荧光而对红色荧光无影响，使自噬溶酶体表现为红色点状聚集物。若自噬活性上升，可观察到黄色自噬体和红色自噬溶酶体的点状聚集物均增多；若自噬体与溶酶体的融合被阻断、自噬溶酶体的生成减少，仅表现为黄色自噬体点状聚集物增多。结果显示，0hCQ干预组突变株ST6－ΔpRST98感染细胞的点状聚集物数量高于对照组，而野生株ST6和回补株ST6－c－pRST98感染细胞的点状聚集物数量无差异。2hCQ干预组3株菌感染细胞的点状聚集物数量均高于对照组，其中突变株ST6－ΔpRST98上升量显著高于野生株ST6及回补株ST6－c－pRST98（图3）。

自噬是不同于凋亡的一种细胞死亡方式，自1962年提出后已成为当前研究热点。自噬主要是通过细胞内的双层膜结构包裹需降解的细胞器、蛋白质或外来异物形成自噬体，然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，在自噬体内利用溶酶体水解酶降解其所包裹的内容物，以实现细胞内的稳态和细胞器的更新［8］。在细胞自噬与感染性疾病关系的研究中，自噬被视为机体对抗病原体入侵的一种方式，不仅可通过自噬溶酶体途径清除细菌发挥天然免疫应答效应，还参与病原菌的抗原呈递过程，对细胞的生存起至关重要的保护作用［9，10］。目前，在酵母和其他真核生物中已发现许多自噬相关基因（autophagy－relatedgene，ATG），其中微管相关蛋白1轻链3（microtubule－associatedprotein1lightchain3，MAP1－LC3）是酵母Atg8在哺乳动物细胞中的同源物。在自噬过程中，LC3Ⅰ经类泛素化酶催化其C端并与磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）偶联后转变为LC3Ⅱ［8］。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3Ⅱ即被溶酶体中的水解酶降解。LC3Ⅱ是目前发现的唯一定位于自噬体膜上的自噬相关蛋白，其含量多少与自噬泡数量成正比［11］。因此，WB检测细胞内LC3Ⅱ含量变化或激光共聚焦法检测细胞质内LC3点状结构，即可实现对自噬体形成的检测［12］。p62能结合泛素化的蛋白与LC3偶联，参与自噬体形成［13］。自噬发生时，随着蛋白质不断降解，p62水平逐渐降低；而在自噬缺陷细胞中，可观察到p62累积［14，15］。因此，p62也被作为检测自噬活性的一个标记蛋白，其表达水平与自噬活性呈负相关。CQ作为一种自噬阻断剂，通过提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶失活，导致自噬溶酶体无法分解底物［16］，造成位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3Ⅱ和p62不能及时降解，致使蛋白累积。

第2篇：巨噬细胞范文

目的：建立用流式细胞术检测小鼠腹腔诱导的巨噬细胞吞噬功能的方法。方法：用贴壁法筛选有活性的巨噬细胞，再与用碳酸盐缓冲液制备的荧光素(FITC)标记的大肠埃希菌混合，37℃孵育，每10min取少量固定后加EB染巨噬细胞核，用流式细胞仪检测，计算巨噬细胞对大肠埃希菌的吞噬率。结果：FITC能够有效标记大肠埃希菌；小鼠腹腔诱导的巨噬细胞能够吞噬大肠埃希菌，并且在30min时达到最大峰值。结论：用流式细胞术检测小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌是测定巨噬细胞吞噬功能简便、快速和重复性好的定量方法。

【关键词】 巨噬细胞 吞噬作用 大肠埃希菌 流式细胞仪

Establish a New Method of Detecting Phagocytosis of Macrophage by Flow Cytometry

Abstract Objective: To use a new method of detecting phagocytosis of macrophage induced from the Belly of mouse by flow cytometry. Methods: Firstly， the living macrophages were collect by cultivating and adherencing， and bacterium coli(E. coli) was labeled FITC. Secondly， E. coli was mixed with macrophages， every 10 minute to take out of small amounts of mixed liquor，and add a little of EB dye. Finally， the fluorescent intensity was measured by flow cytometry. Results: The E. coli was labeled well by FITC in carbonate buffer. Macrophage can phagocytize E. coli and the efficient rat of phagocytosis was highest about at 30 minute. Conclusion: The method that detecting phagocytosis of macrophage phagocytizs E. coli is convenient、fast、good repeatability.

Key words macrophage; phagocytosis; bacterium coli; flow cytometry

巨噬细胞(macrophage，MP)是机体天然免疫的主要免疫细胞，吞噬率则直接反映巨噬细胞的吞噬功能。通常测定吞噬率的方法是对吞噬细菌的MP染色后在显微镜下观察、计数的方法，也有研究者用流式细胞仪(Flow Cytometry，FCM)检测MP的吞噬功能［1，2］。我们在检测小鼠MP吞噬细菌的实验中发现，小鼠MP的形态较小，染色后在显微镜下观察计算吞噬率较为困难。本研究试建立用流式细胞术FITCEB法检测MP的吞噬功能，以求找到一种简便、客观和重复性好的方法。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 主要试剂

FITC；EB；2%淀粉肉汤；大肠埃希菌DH5A；2%琼脂LB固体培养基；含血清培养基；流式细胞仪四色校准微球(CaliBRITEBeads，美国BD公司)。

1.1.2 实验动物

BALB/C小鼠，25只，体重(19±2)g，由本院免疫学教研室保存提供。

1.1.3 主要仪器和软件

隔水恒温培养箱，型号：GNP9270 (上海精宏实验设备有限公司)；自控式CO2细胞孵育箱，型号：2300（美国Shellab公司）；分光光度计，型号：Jenway 6305 (Barloworld公司)；蔡司荧光显微镜，型号：ZEISS AXIO Imager.A1 (蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司)；流式细胞仪，型号：FACSCalibur (美国BD公司)；CellQuest软件。

1.2 实验方法

1.2.1 大肠杆菌培养及标记荧光素(FITC)

接种大肠杆菌于2%琼脂LB固体培养基表面皿上，在37℃隔水恒温培养箱中孵育48h，取少量菌落用PBS洗，革兰氏（图1）和GW染色观察（图3），并调节浓度(OD≈0.40在620nm处）。荧光素标记大肠杆菌［3］：离心去上清，加入250ul 1%Triton X100 和1ml FITC（0.01mg FITC/500ul 碳酸盐缓冲液）37℃避光孵育15min，离心去上清，少量PBS重悬细菌待用，并用荧光显微镜观察（图2）。

1.2.2 巨噬细胞吞噬大肠杆菌

诱导、筛选腹腔巨噬细胞：腹股沟注入1ml2%淀粉肉汤液，48h后开腹腔收集渗出液，培养基洗一次，转入培养瓶中37℃ CO2孵育箱孵育2h，收集贴壁细胞（1×107event）于离心管中4ml培养基重悬待用，并GW染色观察（图3）。检测巨噬细胞吞噬大肠杆菌：加FITC标记大肠杆菌于巨噬细胞培养液中，置于37℃水平摇床上（慢速摇动），每10min取摇匀液0.5ml，PBS洗一次，70%乙醇固定10min，离心后加入1ml EB(0.5μg/ml)，37℃避光孵育15min待测。首先使用BD CaliBRITE Beads试剂调整仪器，设定仪器基本参数，上样后先用FSCH/SSCH圈定MP，再采集红色荧光强度，并计算实际吞噬率（某时刻实际吞噬率=某时刻吞噬率-0min时的吞噬率），同时取少量GW染色观察（图3）。

1.3 统计分析

采用SPSS11.0软件进行统计分析，数据以±s表示，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌的定量观察

由大肠埃希菌的革兰氏染色图像（图1）可以看出：大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，并没有其他细菌污染，可以应用于吞噬实验；由大肠埃希菌的荧光显微镜观察（图2）可以看出：用碳酸盐缓冲液(pH=9) 制备的荧光素(FITC)能够有效标记大肠埃希菌；在不同时间段GW染色观察巨噬细胞吞噬大肠埃希菌过程的图像（图3）中可以看出：在0～20min内巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的量逐渐增加（巨噬细胞吞噬泡中大肠埃希菌的量增加），30min左右时巨噬细胞吞噬量最高，40min后巨噬细胞吞噬量有减少趋势（吞噬泡中有明显的溶菌现象，泡内大肠杆菌形态逐渐模糊）。

2.2 小鼠巨噬细胞吞噬FITC标记大肠埃希菌的动力学特点

小鼠巨噬细胞与FITC标记大肠埃希菌在37℃作用不同时间后， 巨噬细胞的实际吞噬率在0、10、20、30、40、50min时分别为0%、11.20±2.0%、21.57±2.1%、62.22±5.0%、54.58±3.5%、37.22±4.1%，在30min左右即达到峰值（表1，图4）。表1 巨噬细胞吞噬大肠埃希菌的动力学数据(略)

3 讨论

人类细胞免疫功能一般认为应包括白细胞、红细胞及巨噬细胞等三大系统，其相应的检测指标分别为：以CD4和CD8为主的T细胞亚群检测，以RBCC3bRR和RBCICR为主的红细胞免疫功能检测和以巨噬细胞吞噬率为主的巨噬细胞吞噬功能检测。但是，在临床上由于细胞免疫功能检测方法较繁琐，往往作前两项检测，对于某些免疫性疾病以及与免疫功能损伤有关疾病的诊断与治疗中，全面地评估机体的免疫状态极为重要。

检测MP功能最常用的方法之一就是检测其对细菌的吞噬率，传统方法是取外周血与细菌混合作用后涂片染色，在显微镜下观察MP对细菌的吞噬率。该方法一般要寻找200个以上MP中吞噬细菌MP数量，操作较烦琐，且形态较小，显微镜下观察其对细菌的吞噬率更为困难。因此，已有研究者报道用流式细胞术测定中性粒细胞对荧光素标记细菌的吞噬功能［4，5］，但目前有关巨噬细胞吞噬功能的检测报道不多。

本研究在前人研究基础上［6］，选择FITC和EB双荧光性物质标记法检测MP对大肠埃希菌的吞噬功能。其检测原理是：首先利用FITC在碳酸盐缓冲液中标记大肠埃希菌，再用MP吞噬标记后的大肠埃希菌，吞噬完成后，加入EB染料标记MP，在488nm的激光下MP内大肠埃希菌上的FITC首先发出绿色荧光，其荧光又可以激发MP上的EB染料，使其产生红色荧光，通过计算红色荧光的表达率反映MP对大肠埃希菌的吞噬功能。实验结果显示：0～20min内吞噬率逐渐增加；30min左右吞噬率达到平台，与有关资料一致；40min以后吞噬率反而减少，有可能通过MP内溶菌酶作用把MP内细菌消化、分解，释放到细胞外，导致MP内细菌减少，荧光能力减弱。其中，在流式细胞仪荧光强度直方图中CV平均值为3.9%，由此可见，自动流式细胞仪用于检测巨噬细胞吞噬功能，不但测量数据准确性高、重复性好、操作简便、快速，而且保持MP细胞膜的完整性，能够直接体现MP对细菌的吞噬能力，同时弥补了FITC荧光性弱难以区分、检测的弱点。

本实验结果充分证明通过流式细胞术的FITCEB法能够简便、快速和重复性好地定量检测巨噬细胞对大肠埃希菌的吞噬功能。

参考文献

1 张盈华，殷缨，张莉，等.流式细胞仪测定巨噬细胞吞噬率方法的建立及其应用.第四军医大学学报.2002，23(17):1559～1561.

2 WhiteOwen C，Alexander JW，Sramkoski RM，et al.Rapid whole blood microassay using flow cytometry for measuring neutrophil phagocytosis. J Clin Microbiol， 1992，30(8):2071～2076.

3 赵修春，姚春艳，李柏青，等.流式细胞术检测小鼠中性粒细胞吞噬功能的方法学探讨.基础医学.2004，29(5):388～390.

4 Vander Top EA， Perry GA， GentryNielsen MJ. A novel flow cytometric assay for measurement of in vivo pulmonary neutrophil phagocytosis. BMC Microbiology. 2006，6:61.

第3篇：巨噬细胞范文

    【关键词】  辛伐他汀; 巨噬细胞; 基质金属蛋白酶-9; 金属蛋白酶组织抑制因子-1

    Abstract:【Objective】 To investigate the effects of simvastatin drug-serum on the expression and secretion of matrix metalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in U937 monocyte-derived macrophages. 【Methods】 Fifteen New Zealand rabbits were randomized to 3 groups, normal control group (NL, n=5), atherosclerotic model group (AS, n=5) and simvastatin drug-serum group (SIM, n =5). The rabbit atherosclerotic model was developed by high cholesterol feeding. Then they were medicated with simvastatin liquor by gavage to prepare simvastatin drug-serum. U937 monocyte-derived macrophages were incubated with different concentrations (5%, 10%, and 20%) of simvastatin drug-serum for 24 hours. The mRNA expression and protein secretion of MMP-9 and TIMP-1 were detected by RT-PCR and ELISA. 【Results】 Compared to same concentration AS group, 5%, 10%, and 20% SIM group significantly inhibited the expression of MMP-9 mRNA in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.005, 0.041, and 0.013), and the expression difference of TIMP-1 mRNA were not significant (all P >0.05). Compared to same concentration AS group, 10% and 20% SIM group not only significantly inhibited the secretion of MMP-9 in U937 monocyte-derived macrophages (P=0.009 and 0.001), but also significantly increased the secretion of TIMP-1 ( P = 0.017 and 0.001) . 【Conclusion】 Simvastatin inhibits the expression and secretion of MMP-9 and enhances the secretion of TIMP-1.

    Key words: simvastatin; macrophage; matrix metalloproteinase-9; tissue inhibitor of metalloproteinase-1

    冠状动脉粥样硬化斑块由稳定转为不稳定,继而破裂导致血栓形成是急性冠脉综合征最主要的发病机制[1, 2]。斑块脂质核心大、纤维帽薄、巨噬细胞多是结构性易损斑块[3]。斑块内单核巨噬细胞聚集,基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)增多,金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMP)减少,导致斑块内胶原降解,纤维帽变薄,是斑块稳定性下降的重要原因[4, 5]。临床研究显示他汀对急性冠脉综合征治疗有效,可能与改善内皮功能、抗炎及稳定斑块等调脂以外的作用有关[6],但其具体机制尚未完全明确。本研究拟观察辛伐他汀含药血清对U937单核细胞源巨噬细胞MMP-9及TIMP-1表达与分泌的影响,以探讨辛伐他汀稳定斑块、治疗急性冠脉综合征的机制。

    1   材料与方法

    1.1   材料准备

    雄性纯种新西兰大白兔,体质量2.0~2.5 kg,购自中山大学动物实验中心。人单核白血病细胞株U937细胞,购自中山大学动物实验中心细胞库。辛伐他汀药片,购自默沙东公司,实验时溶解于蒸馏水灌胃。

    RPMI 1640培养基,购自Gibco公司。新生牛血清,购自PAA公司。佛波酯(PMA),购自Sigma公司。Trizol reagent,购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒,购自Fermentas公司。Taq酶购自Takara公司。PCR反应引物,由上海生工生物技术有限公司合成。人MMP-9、TIMP-1细胞上清ELISA试剂盒,购自RapidBio公司。

    1.2   动脉粥样硬化模型建立及含药血清制备

    15只新西兰大白兔随机分为3组:正常对照组(normal, NL)、粥样硬化模型组(atherosclerosis group, AS)和辛伐他汀含药血清组(simvastatin group, SIM),每组5只。正常对照组予普通饲料喂养12周,其余各组予高脂饲料(1%胆固醇、10%猪油、89%普通饲料)喂养10周后,每组随机处死1只,证实有大动脉粥样硬化形成后,继续高脂喂养至12周,其中SIM组于第11周起给予辛伐他汀5 mg/kg,每天1次,灌胃14 d。末次给药前禁食12 h,给药后1 h颈动脉无菌取血,分离血清,同组动物血清混匀,0.22 ?滋m滤膜过滤灭菌,-80 ℃保存备用。

    1.3   细胞培养及干预

    U937细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基中,置于含5% CO2,37 ℃培养箱中,待细胞生长至接近融合时传代,2~3代后用于实验。调整细胞密度为5×106/mL,接种于6孔培养板,加入PMA使终浓度为50 ng/mL,培养48 h后见悬浮生长的U937细胞分化为巨噬细胞,伸出伪足,贴壁生长。弃去旧培养基,PBS液洗涤后,予不含血清的RPMI 1640培养基继续培养24 h,弃去培养基。分别加入各含5%、10%、20%正常兔血清,5%、10%、20%粥样硬化兔血清,以及5%、10%、20%辛伐他汀含药血清的RPMI 1640培养基,每组设3个平行组,培养24 h用于RT-PCR实验。

    1.4   总RNA提取

    吸净培养基,每孔加入1 mL的Trizol液,吹打裂解细胞,收集于无RNA酶离心管中,室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿,剧烈颠倒15 s,室温静置3 min,4 ℃,12 000 × g离心10 min。转移上层水相液500 ?滋L到新的离心管,加入500 ?滋L异丙醇,室温静置10 min,4 ℃,12 000 × g离心7 min。弃上清,加入1 mL无RNA酶水配制的75%酒精,振荡混匀,4 ℃,7 500 × g离心5 min。重复酒精洗涤沉淀一遍,弃去酒精,室温干燥5 min,融解RNA于30 ?滋L无RNA酶水中,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,紫外分光光度计测定RNA含量,计算出RT-PCR所需样品量。

    1.5   RT-PCR

    取总RNA1.5 ?滋g,按逆转录试剂盒进行逆转录合成cDNA。以β-actin为内参照,进行半定量逆转录聚合酶链式反应。聚合酶链式反应:95 ℃ 5 min预变性,94 ℃ 45 s变性,56 ℃ 30 s退火,72 ℃ 45 s延伸,共35个循环,最后一次循环在72 ℃延伸7 min。RT-PCR产物用含1.5%琼脂糖凝胶电泳,Labwork成像系统采集图像及分析。合成引物序列,MMP-9-上游引物:5′- AGGACGGCA ATGCTGAT-3′,下游引物:5′- CGCCACGA GGAACAAACT-3′,扩增产物为362 bp;TIMP-1-上游引物:5′- TTCCGACCTCGTCATCAG-3′,下游引物:5′- GCATTCCTCACAGCCAAC-3′,扩增产物为340 bp;β-actin-上游引物:5′- ATCGTGCGTGA CATTAAGG-3′,下游引物:5′-ACAGGACTCC ATGCCCAGG-3′,扩增产物为195 bp。

    1.6   ELISA测定

    收集细胞上清液,4 ℃,3 000 r/min离心10 min,取上清,-80 ℃保存待检。ELISA采用双抗体夹心法,按照说明书步骤进行,测定细胞上清MMP-9、TIMP-1浓度。

    1.7   统计学处理

    所有数据均以均数±标准差(x±s)表示,三组间比较用单因素方差分析,两组间比较用LSD-t 检验,应用SPSS 10.0统计分析软件进行统计分析,P< 0.05 为差异有显着性。

    2   结   果

    2.1   辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9 mRNA表达的影响

    与相同浓度NL组相比,5%、10%、20%AS组MMP-9 mRNA表达均显着性增高(P值均< 0.05)。与相同浓度AS组相比,5%、10%、20%SIM组MMP-9 mRNA表达均显着性降低(P值分别为0.005、0.041和0.013)。与相同浓度NL组相比,5%、10%SIM组MMP-9 mRNA表达均增高(P值分别为0.034和0.029,表1、图1)。

    不同浓度间SIM组MMP-9 mRNA表达差别无统计学意义(F=1.747,P=0.252)。

    2.2   辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1 mRNA表达的影响

    NL组、AS组和SIM组不同浓度之间TIMP-1 mRNA表达无显着差异(表2、图2)。5%、10%和20%SIM组之间TIMP-1 mRNA的表达有显着性差异(F= 6.498,P=0.032)。与5%SIM组相比,10%、20%SIM组TIMP-1 mRNA的表达显着性增加(P=0.039、0.014),而10%与20%SIM组之间无显着性差异(P=0.446)。

    2.3   辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞MMP-9蛋白分泌的影响

    与同浓度NL组比较,10%、20%AS组MMP-9分泌均显着性增加(P=0.007、0.002);5%、10%、20%SIM组MMP-9分泌无显着性差异(P=0.824、0.857、0.658)。与同浓度AS组比较,5%SIM组MMP-9分泌无显着性差异(P=0.427),10%、20%SIM组MMP-9分泌显着性减少(P=0.009、0.001,表3)。

    SIM组不同浓度之间MMP-9分泌无显着性差异(F=0.985,P=0.427)。

    2.4   辛伐他汀含药血清对U937单核源巨噬细胞TIMP-1蛋白分泌的影响

    与同浓度NL组比较,AS组TIMP-1分泌均显着性减少(P=0.004、0.044、0.003);与同浓度NL组比较,5%SIM组TIMP-1分泌减少(P=0.038)。与同浓度AS组比较,10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显着性增加(P=0.017、0.001,表4)。

    SIM组不同浓度之间TIMP-1分泌有显着性差异(F=6.555,P=0.031)。与5%SIM组相比,10%、20%SIM组 TIMP-1分泌均显着性增加(P=0.038和0.014)。而10%和20%含药血清之间差异无显着性(P=0.456)。

    3   讨   论

    3. 1   MMP/TIMP与动脉粥样斑块稳定性

    急性冠状动脉综合征患者是易损病人[1],通常指在冠状动脉粥样硬化的基础上,斑块破裂,继而血小板粘附聚集和血栓形成,引起完全或不完全的血管阻塞,导致不稳定型心绞痛、非ST段抬高心肌梗死、ST段抬高心肌梗死及猝死。有报道[7-9]冠脉“罪犯”病变处多是软斑块、以正性重构为主,常伴血栓形成。斑块内细胞外基质过度降解,导致斑块中胶原含量减少,纤维帽变薄,是影响斑块稳定的重要因素。斑块破裂常发生在富含单核巨噬细胞的斑块肩部,此处巨噬细胞可分泌大量MMP,促进纤维帽降解[10]。MMP-9,又称明胶酶B,是巨噬细胞分泌的主要基质金属蛋白酶。TIMP是MMP的抑制物,目前已发现有4种:TIMP-1~TIMP-4,它们均可与激活的MMP 呈1 ∶ 1结合,从而使MMP失活。用免疫组化方法检测动脉粥样硬化斑块显示TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3显着性增多,且多存在于斑块肩部的巨噬细胞、纤维帽和脂核内,与MMP分布部位一致,部分抑制MMP的活性[11]。急性冠脉综合征患者存在着由炎症反应导致的以MMP-9升高为主的MMP-9/ TIMP-1失衡状态[2]。因此MMP与TIMP之间的平衡,对斑块稳定性的调节具有重要意义。研究还表明[12],MMP-9在转录水平上受多种细胞因子、生长因子及活性物质的调节,而TIMP的表达很少受细胞因子和生长因子的影响。本实验采用血清药理学方法观察到,与同浓度NL组相比较,5%、10%和20%AS组U937单核源巨噬细胞MMP-9表达均显着性增高(P值均< 0.05)。这可能是因为粥样硬化血清中含有较高的低密度脂蛋白胆固醇,以及大量激活的炎性细胞因子、生长因子以及其他活性物质,促进MMP -9的表达。与相同浓度NL组比较,AS组TIMP-1 mRNA表达无显着性差异,但TIMP-1的分泌均显着性减少(P< 0.05),提示动脉粥样硬化血清不但可使巨噬细胞MMP-9增加,同时还可使TIMP-1分泌增加(翻译后水平)而表达(mRNA水平)并未增加,具体机制尚不清楚。

    3. 2   他汀药与MMP/TIMP

    PROVE IT(TIMI-22)研究[13]显示强化他汀治疗可使ACS患者30 d的临件减少,在稳定的患者,使临件长期降低,但其具体机制尚未完全明确。Luan等[14]报道,西立伐他汀呈剂量依赖性抑制兔平滑肌细胞和巨噬细胞MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9,但对TIMP-1和TIMP-2无影响。本研究显示,与相同浓度AS组相比,5%、10%和20%SIM组MMP-9 mRNA表达均显着性降低(P值< 0.05);10%、20%SIM组MMP-9蛋白的分泌显着性减少(P值均< 0.01)。与相同浓度AS组相比,SIM组TIMP-1 mRNA表达无显着性差异(P >0.05);但10%、20%SIM组TIMP-1分泌均显着性增加(P值均< 0.01)。与Luan等[14]的报道有所不同,本研究显示辛伐他汀不但在一定剂量范围内可抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌,而且增加TIMP-1的分泌。这可能是辛伐他汀稳定斑块、减少临件的机制之一。他汀具有多效作用(Pleiotropic effects)[15],除了调脂作用外,还有抗炎、改善内皮功能等作用。辛伐他汀可能通过抑制巨噬细胞MMP-9的转录与分泌,同时还增加TIMP-1的分泌,从而调节MMP与TIMP之间的平衡,起到稳定斑块的作用。

    【参考文献】

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第4篇：巨噬细胞范文

[关键词] 重组人粒巨噬细胞刺激因子；肿瘤化疗；白细胞减少症；血小板减少症

[中图分类号] R577+.1 [文献标识码]C[文章编号]1674-4721（2011）07（b）-191-02

化疗是恶性肿瘤综合治疗的主要手段之一，但化疗往往会引起很多毒副反应、并发症及后遗症，其中最常见的毒副反应是骨髓抑制，由于红细胞寿命较长，受影响相对较小，因而对白细胞和血小板的影响表现显著，而当白细胞减少或者血小板减少时，不得不推迟化疗时间或者减少化疗药物剂量，以致中断治疗，影响疗效，长时间粒细胞缺乏易并发感染，严重者可导致患者死亡，而血小板的减少则可能导致出血性疾病的发生。为了防止化疗后白细胞及血小板降低，笔者对本院2009年5月~2010年12月收治的86例恶性肿瘤化疗患者进行研究，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

本院2009年5月～2010年12月收治的86例恶性肿瘤患者，其中，男39例，女47例，年龄26~73岁，平均52岁，胃癌25例，结直肠癌53例，乳腺癌8例。将86例恶性肿瘤患者随机分为两组，治疗组44例，其中胃癌14例，结直肠癌26例，乳腺癌4例，对照组42例，其中胃癌11例，结直肠癌27例，乳腺癌4例。两组患者的年龄、性别、所患疾病等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 治疗方法

治疗组在化疗结束后24 h给予皮下注射重组人粒巨噬细胞刺激因子100 μg/d，以3 d为1个疗程。对照组化疗前1 d开始口服鲨肝醇，50 mg/次，3次/d，7 d为1个疗程。两组相同的疾病所给予的化疗方案、药物剂量及给药时间完全相同，主要化疗方案为：胃癌结直肠癌采用folfox4方案，乳腺癌采用TAC（多西他赛、表阿霉素、环磷酰胺）。化疗结束后7 d查血常规，比较两组的白细胞及血小板降低情况。

1.3 疗效评定标准

白细胞低于4.0×109/L为白细胞减少、血小板低于100×109/L为血小板减少，比较两组白细胞及血小板减少有无差异。

1.4 统计学分析

统计分析采用SPSS 14.0统计软件包进行处理，对结果进行χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

治疗组白细胞下降5例、血小板减少3例，对照组白细胞下降18例、血小板减少11例，两组比较，差异有统计学意义，说明重组人粒巨噬细胞刺激因子能有效的防治化疗后白细胞及血小板减少症。见表1。

3 讨论

化疗药物引起的毒副反应对化疗的应用有一定的影响，常见的毒副反应是骨髓抑制，骨髓抑制的发生主要是由于化疗药物对骨髓干细胞的直接损伤和对骨髓基质细胞、微循环结构或功能损伤所致，造成骨髓抑制的程度及持续时间与药物种类和剂量有关[1]。而骨髓抑制不但影响治疗的继续进行，而且易导致细菌、真菌等微生物的感染，或者出血性疾病的发生，加重病情。虽然输注血小板可以缓解血小板减少，但这种作用是暂时的，同时还可能带来感染、输血反应和抗体产生等其他问题[2]。因此，在临床上对促进白细胞及血小板生长因子的需要十分迫切。在寻找血小板因子的过程中，陆续发现了促血小板生长素（TPO）、干细胞因子、白介素1、3、6、11和粒细胞集落刺激因子（GM）以及巨噬细胞集落刺激因子等。rhGM-CSF作为生长因子作用于造血干细胞，促进其增殖和分化，刺激粒、单核巨噬细胞成熟，促进成熟细胞向外周血释放，并能促进巨噬细胞及噬酸性细胞的多种功能，还作用于目前已知体内功能最强的抗原提呈细胞-树突状细胞，以促进免疫应答，调节免疫反应[3-4]。在临床实践中，rhGM-CSF已经成功的用于治疗对恶性肿瘤放、化疗所致黏膜糜烂、溃疡[5]。另外，GM-CSF在治疗真菌感染中也能够发挥良好的作用[6]，Peter BG等[7]对145例进行自体干细胞移植患者的真菌感染情况进行了回顾性分析，发现采用rhGM-CSF治疗的70例患者中有2例存在真菌感染，发生率为2.9%；而在对照组，75例患者中有9例发生真菌感染，发生率为12%，两者之间存在明显差异，另外还发现有10例死亡患者，其中5例的死亡原因是真菌感染，且这5例中有4例是未用rhGM-CSF治疗的。最近研究发现rhGM-CSF用于治疗烧伤创面也有着很好的疗效[8]。

本文通过对44例恶性肿瘤患者化疗后应用rhGM-CSF制剂进行对照研究，结果治疗组中白细胞下降5例、血小板减少3例，而在对照组，42例患者中有18例白细胞下降、11例血小板减少，经过统计学处理，P＜0.05，两者之间存在明显差异。因此笔者研究证实rhGM-CSF能有效的防治化疗后白细胞及血小板减少症，使得化疗能顺利进行。

[参考文献]

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第5篇：巨噬细胞范文

【摘要】 目的 研究穿心莲内酯对小鼠巨噬细胞氧化亚氮(NO)、肿瘤坏死因子(TNFα)和白细胞介素6(IL6)生成的影响。方法 培养小鼠巨噬细胞RAW264.7，分别加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，终质量浓度1 μg/mL)和不同浓度的穿心莲内酯(终浓度1、10、50 μmol/L)进行干预，并设空白组和穿心莲内酯单独作用组作为对照。取培养24 h细胞上清，用Griess法检测NO产量;用Elisa法检测TNFα、IL6浓度。结果 与空白组比较，LPS明显促进了RAW264.7细胞NO、TNFα、IL6等炎症因子的生成;穿心莲内酯单独作用不影响炎症因子的表达，但穿心莲内酯能显著下调LPS诱导的炎症因子表达，与LPS组差异有显著性。结论 穿心莲内酯可明显降低LPS诱导的巨噬细胞炎症因子表达，抑制炎症反应。

【关键词】 穿心莲内酯;巨噬细胞;炎症因子;内毒素

)Abstract:Objective To investigate the inhibitive effects of andrographolide on lipopolysaccharideinduced inflammation factors secretion in macrophage cells.Methods A macrophage cell line RAW264.7 cells were cultured in vitro，and treated with different concentration of andrpgrapholide in the presence or absence of lipopolysaccharide (LPS). The production of inflammatory factor nitric oxide (NO)，tumor necrosis factorα(TNFα) and interleukin6 (IL6) in the supernatant was measured by Griess reagent and Elisa，respectively.Results After stimulated with LPS，the content of NO，TNFα and IL6 were markedly upregulated. Pretreated with andrographolide significantly inhibited LPSinduced inflammation factors expression levels，which was statistically significant compared with LPS group(P

Key words:andrographolide;macrophage cells; inflammation factor; lipopolysaccharide

目前，炎症在心血管疾病、肿瘤中的促进作用日渐受到重视，抑制炎症反应防治心血管疾病及肿瘤成为研究的重点[1-2]。穿心莲为爵床科植物穿心莲属植物穿心莲干燥地上部分，作为常用中药，具有清热解毒、凉血消肿等功效。穿心莲内酯是穿心莲的主要药效成分，有研究表明，穿心莲内酯有显著的抗炎活性，能抑制二甲苯和醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增加，还对大鼠蛋清蛋白、角叉菜胶足趾注射致炎模型有明显的抗炎作用[3]。炎症反应时，巨噬细胞在细菌及其内毒素的刺激下，分泌大量的炎症因子，如氧化亚氮(NO)、TNFα和IL1β等，这些炎症因子又可以进一步活化巨噬细胞，形成恶性循环，加重炎症反应。本研究通过观察穿心莲内酯对NO、TNFα和IL1β等炎症因子表达的影响，探讨其抗炎活性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

穿心莲内酯(四川广汉市维康植化有限公司);细菌内毒素(LPS，E coli Serotype 055:B5，美国Sigma公司);NO检测试剂盒(南京建成生物公司);TNFα、IL6 Elisa检测试剂盒(美国R&D公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培养基(美国Gibco公司);酶标仪(美国BioRad公司)。

1.2 细胞培养及干预实验

小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞由本室保存。用完全DMEM培养基(含体积分数10%胎牛血清、质量浓度100 U/mL 青霉素和100 μg/mL链霉素)，体积分数5%CO2，37 ℃条件下传代培养。取生长状态良好的RAW264.7细胞，质量分数0.25%胰酶消化，用DMEM培养基调整细胞浓度为1×106/mL，接种到24 孔培养板内，待细胞生长至80%融合后，加入不同浓度的穿心莲内酯(终浓度分别为1、10、50 μmol/L)孵育1 h，然后加入LPS(终质量浓度1 μg/mL)进行刺激。实验分组：正常对照组、穿心莲内酯单独作用组、LPS组和穿心莲内酯加LPS组。

1.3 NO浓度测定

细胞加入刺激物后培养24 h，收集各处理组细胞培养上清液，用硝酸还原酶法检测炎性介质NO的浓度。操作步骤按试剂盒说明书完成。

1.4 细胞因子浓度测定

细胞加入刺激物后继续培养24 h，收集各处理组细胞培养上清液，用TNFα和IL6 Elisa试剂盒检测上清液中细胞因子的含量。操作步骤按试剂盒说明书完成。

1.5 统计分析

所有数据以±s表示，采用SPSS 11.0统计软件对实验结果进行Student’s t检验，P

2 结果

2.1 穿心莲内酯对LPS诱导巨噬细胞NO生成的影响

收集24 h细胞培养上清，用Griess法测定细胞上清中NO 的含量。结果见表1。结果显示，50 μmol/L穿心莲内酯单独作用并不影响巨噬细胞NO的表达(与正常对照组比较，P>0.05);1 μg/mL LPS刺激可以显著诱导巨噬细胞RAW 264.7产生NO，而穿心莲内酯预干预能明显抑制LPS引起的NO的释放，并在1～50 μmol/L浓度范围内呈剂量依赖性。表1 穿心莲内酯对NO分泌的影响

2.2 穿心莲内酯对LPS诱导巨噬细胞TNFα、IL6生成的影响

结果见表2。Elisa检测结果显示，在正常情况下巨噬细胞RAW264.7培养上清中TNFα、IL6含量极低，50 μmol/L浓度的穿心莲内酯单独作用对其表达也无明显影响(与正常对照组比较，P>0.05)。当用1 μg/mL LPS刺激后，巨噬细胞TNFα和IL6的表达均明显增高，与正常对照组比较，P

3 讨论

近年来，炎症在多种疾病中，尤其是心血管疾病和肿瘤中的作用引起了广泛的关注。根据在动脉粥样硬化斑块有多种炎性细胞和炎症因子存在等证据，Ross明确提出了动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)的“炎症学说”，指出慢性炎症反应是AS的主要发病机制[4]。随后的研究证实，进入血管壁的巨噬细胞可被氧化型低密度脂蛋白、革兰阴性菌及其LPS活化，通过NFκB、iNOS和COX等途径产生TNFα、IL6、NO、PGs等多种炎症介质，促进AS斑块的形成和发展，而抑制炎症反应可改善AS病变程度，进一步说明了炎症在AS中的关键性作用[5]。炎症与肿瘤的关系很早就引起了人们的关注。现代研究认为，炎症细胞主要通过分泌IL1、IL6、TNFα、NO、PGs及活性氧等炎症因子，参与组成肿瘤微环境，影响肿瘤的进程。这些炎症因子不仅能诱导正常细胞的恶性病变，还可以促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，诱导肿瘤血管形成，在肿瘤发生发展中有重要作用[6]。2009年，Mantovani在Nature杂志上提出，与无限制性生长、转移等特征一样，炎症性微环境与肿瘤关系密切，并认为炎症是肿瘤的7大重要标志之一[2]。　表2 穿心莲内酯对TNFα和IL6表达的影响

与正常对照组比较：**P

参考文献

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第6篇：巨噬细胞范文

【关键词】 白藜芦醇；微小RNA-146a；肺泡巨噬细胞；肿瘤坏死因子-α

Effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide-induced micRoRNA-146a in alveolaR macRophages Zeng Zhenguo，Shao Qiang，Li Yong，Ding Chengzhi， Qing Cheng， Liu Fen， Zhan Yian， Nie Cheng， Jie Kemin， Gong Honghan， Qian Kejian. DepaRtment of CRitical CaRe Medicine， FiRst Affiliated Hospital， Medical College of Nanchang UniveRsity， Nanchang 330006， China

CoRResponding authoR： Qian Kejian，Email：qkj0607@sohu，com

【AbstRact】Objective To obseRve the effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide （LPS） -induced micRoRNA-146a （miR-146a） in alveolaR macRophages. Methods Rat alveolaR macRophages（NR8383）weRe seeded at 2×106cell/poRe in 6 well plates in vitRo and incubated foR 90 min. NR8383 weRe Randomly divided into fouR gRoups： contRol gRoup， NR8383 stimulated with phosphate buffeR solution （PBS）； LPS-stimulated gRoup， NR8383 stimulated with 1μg/mL of LPS； ResveRatRol-tReated gRoup， NR8383 tReated with diffeRent concentRations of ResveRatRol （1 μg/mL oR 10 μg/mL） foR 30 min， then stimulated with 1 μg/mL of LPS. AfteR incubation foR 6 h， the cells weRe haRvested and the supeRnatant of cell cultuRe medium was collected. The expRession of miR-146a of cells was detected by using fluoRoilluminance Real-time quantitative PCR device， and the levels of TNF-α pRotein in the supeRnatant weRe assayed by using enzyme-linked immunosoRbent assay （ELISA）.Results CompaRed with contRol gRoup， the expRession of miR-146a and the level of TNF-α weRe significantly incReased in LPS stimulated gRoup （miR-146a’ s expRession folds： 5，92±1，57 vs 1，03±0，58，P

【Key woRds】ResveRatRol； MicRoRNA-146a； AlveolaR macRophages； TumoR necRosis factoR-α

大量临床及实验研究表明，白藜芦醇对脓毒症肺损伤具有保护作用[1-5]。微小RNA-146a（miR-146a）是TLRs/NF-κB炎症通路中重要的负反馈调控介质，能够抑制炎症反应[6]。本课题组前期研究发现，miR-146a参与了肺泡巨噬细胞炎症反应，有望成为抑制肺泡巨噬细胞炎症反应的新途径[7-8]。研究发现，白藜芦醇与miRNA关系密切，有可能通过miRNA发挥其抗炎作用[9-11]。然而，在肺泡巨噬细胞炎症反应模型中，白藜芦醇是否影响miR-146a的表达以及是否通过上调miR-146a的表达来抑制炎症介质释放均未见报道。

1 材料与方法

1，1 实验材料

大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383（中国科学院细胞库），胎牛血清（美国HyClone），Ham’ s F-12K培养基（美国Sigma-AldRich），LPS（E，coli 0111∶ B4，美国Sigma-AldRich），白藜芦醇（美国Enzo life sciences），TRIzol Reagent（美国InvitRogen），四甲基偶氮唑盐（MTT，北京索来宝科技有限公司），TaqMan UniveRsal 聚合酶链反应（PCR）检测试剂盒、TaqMan MicRoRNA 逆转录试剂盒、TaqMan MicRoRNA 检测试剂盒（美国ABI），十二烷基硫酸钠（SDS，美国Sigma-AldRich），大鼠TNF-α ELISA试剂盒（上海明睿生物），氯仿、异丙醇、无水乙醇等均为国产分析纯。

1，2 细胞培养

R8383细胞培养于含15%FBS、1，5 g/L碳酸氢钠、2 mmol L-谷氨酰胺的Ham’ s F-12K完全培养基中，置于大气压下37 ℃、含5%体积分数CO2的温湿培养箱中培养，2～3 d更换培养液，3～4 d传代1次。

1，3 MTT比色法检测白藜芦醇对细胞活性的影响

取指数生长期NR8383细胞，按每孔细胞0，5×104个接种至96孔板。细胞贴壁90 min后，分别加入0，1、1、10、50、100 μg/mL终质量浓度的白藜芦醇，每组设5个复孔，同时设阴性对照组（等体积PBS替代白藜芦醇）和阳性对照组（等体积10%二甲亚砜替代白藜芦醇）。加药后细胞再培养48 h，加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，继续培养4 h，加入三联溶解液100 μL/孔，于培养箱内继续孵育8 h，用酶标仪（波长570 nm）测定各孔的吸光度（OD 570 nm）值。

1，4 细胞处理及分组

取指数生长期NR8383细胞，按每孔细胞2×106个接种至6孔板。细胞培养90 min后，分为以下四组：（1） LPS处理组：培养板中加入LPS溶液（终质量浓度1 μg/mL）；（2） PBS对照组：培养板中加入等体积PBS溶液；（3） 白藜芦醇+LPS组：培养板中加入不同浓度白藜芦醇溶液（终质量浓度1 μg/mL、10 μg/mL）预处理30 min后，加入LPS溶液（终质量浓度1 μg/mL）。细胞培养6 h后，离心收集细胞上清液和细胞团块，保存于-80 ℃冰箱，分别用于ELISA检测和细胞总RNA提取。

1，5 检测指标及方法

1，5，1 TNF-α蛋白测定 收集各组细胞培养上清液，检测按照ELISA试剂盒使用说明书进行检测。

1，5，2 miR-146a表达测定 采用TRIzol法提取细胞中的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测总RNA完整性及纯度，紫外分光光度计测定总RNA浓度。采用TaqMan MicRoRNA逆转录试剂盒进行反转录，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用TaqMan UniveRsal 聚合酶链反应（PCR）检测试剂盒进行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 10 Rain；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个扩增循环，在ABI 7500定量PCR仪上扩增和检测。操作均按说明书进行，所有操作均在冰上完成。选取U6 snRNA作为内参照，miR-146a的相对表达量采用2-Ct计算。

1，6 统计学方法

采用SPSS 13，0统计软件进行分析，数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P

2 结果

2，1 MTT比色法检测白藜芦醇对NR8383

细胞活性的影响

白藜芦醇在0，1～100 μg/mL的质量浓度范围内对NR8383细胞无毒性作用。见图1。

2，2 TNF-α蛋白含量及细胞内miR-146a的表达变化

表1显示，与PBS对照组相比，LPS处理组TNF-α蛋白含量及miR-146a表达均明显升高（P

3 讨论

脓毒症并发急性肺损伤是脓毒症高病死率的主要原因[12，13]，如果发生脓毒症时避免或减轻肺损伤的发生，将有助于提高脓毒症患者的成功救治率。肺组织中最多的非实质性细胞是肺泡巨噬细胞[14]，脓毒症发生时，肺泡巨噬细胞内TLRs/NF-κB炎症通路活化，导致大量炎症基因的转录活化，失控性释放大量炎症因子，形成肺内炎症“瀑布”反应，导致ALI的发生。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要致病成分，是导致TLRs/NF-κB活化的常见因子。本研究结果显示，LPS刺激肺泡巨噬细胞后，导致TNF-α分泌显著增加。

白藜芦醇是一种多酚类化合物，是天然的植物抗菌素。它能够抑制肺泡巨噬细胞的活化，减少细胞内炎症因子的释放，避免或减轻脓毒症时肺损伤，提高脓毒症时肺损伤的治疗效果[1-5，15]。本实验研究也证实，白藜芦醇预处理大鼠肺泡巨噬细胞后，能明显抑制LPS诱导的炎症因子TNF-α 的产生，并且其抑制作用呈剂量依赖性。

miRNAs是一类小的内源性非编码RNA，通过识别靶基因mRNA的3’ 端非编码区来抑制靶蛋白的翻译或促进靶基因的降解[16-17]。miRNAs通过抑制炎症相关靶基因的转录表达，在炎症反应调控中具有重要作用。miR-146a在TLRs/NF-κB通路中具有重要调控作用。它的靶基因是TLRs/NF-κB通路中的两个重要接头蛋白编码基因IRAK-1和TRAF-6。miR-146a上调后将负性调控TLRs/NF-κB通路，能够抑制炎症介质的升高[6，18]。并且已证实miR-146a参与调节了LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应[7-8]。在本实验中，用LPS刺激肺泡巨噬细胞后，也诱导了miR-146a的表达上调，与前者报道结果相似。

研究发现，白藜芦醇通过影响miRNA前体的转录和miRNA的加工成熟，能特异性地引起一些miRNAs改变，包括miR-21、miR-146a、miR-663等，这些miRNAs都参与炎症反应的调控[9-11]。本研究发现，白藜芦醇预处理大鼠肺泡巨噬细胞后，能明显促进miR-146a的表达上调，并且相比于较低质量浓度白藜芦醇组（1 μg/mL组），较高质量浓度白藜芦醇组（10 μg/mL）更能诱导miR-146a的表达。

综上所述，在LPS诱导的肺泡巨噬细胞炎症反应中，白藜芦醇能够抑制炎症因子TNF-α的产生，并上调miR-146a的表达，由此笔者可以推测，白藜芦醇调控炎症的机制之一可能是通过升高细胞内miR-146a的表达水平来发挥其抗炎作用。

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（收稿日期：2013-05-07）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，009

基金项目：国家自然科学基金（81060152）；江西省自然科学基金（2009GZY0215）

作者单位：330006 南昌，南昌大学第一附属医院重症医学科（曾振国、邵强、丁成志、卿城、刘芬、詹以安、聂成、钱克俭），肿瘤科（李勇），影像科（龚洪翰）；南昌大学医学院生物化学与分子生物学教研室（揭克敏）

第7篇：巨噬细胞范文

［摘要］目的:观察亚硒酸钠与硫酸镁单独及联合应用对染尘肺泡巨噬细胞丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）及过氧化氢酶（CAT）水平变化的影响，寻找二者的最佳剂量组合。方法:采用大鼠肺灌洗法纯化获得肺泡巨噬细胞（1×109 L-1），同时加入SiO2及不同浓度的亚硒酸钠溶液、硫酸镁溶液、亚硒酸钠+硫酸镁溶液，于37℃、5%CO2培养条件下培养18 h后，检测MDA、H2O2含量及CAT活性。结果:亚硒酸钠与硫酸镁单独以及两者联合应用都可以使SiO2染毒的肺泡巨噬细胞MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高，且以10μmol・L-1亚硒酸钠与10μmol・L-1硫酸镁联合作用效果最好。结论:亚硒酸钠与硫酸镁在体外可有效拮抗SiO2粉尘的细胞毒性作用，二者合用效果更佳。

［关键词］二氧化硅;亚硒酸钠;硫酸镁;肺泡巨噬细胞;氧化损伤;大鼠

硒与镁是人体必需的元素，具有许多极为重要的生理生化作用，参与机体多种酶的构成，在体内抗氧化过程中发挥重要作用。已有研究证明，硒在体外有一定拮抗粉尘细胞毒性的作用［12］。硫酸镁在拮抗SiO2细胞毒性的作用与及硒、镁两种物质联合应用的研究尚未见报道。本研究主要探讨硒、镁两种元素单独及联合应用对染尘巨噬细胞丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）含量及过氧化氢酶（CAT）活性的影响，以期为矿物元素应用于矽肺的防治提供实验依据。

1 材料与方法

11 材料

111 实验动物 健康雄性Wistar大鼠，体质量180～220g，由本校实验动物中心提供。

112 石英粉尘 采用标准的SiO2粉尘，由中国预防医学科学院提供，游离SiO2的含量大于97％，粒径小于5μm的占95％以上，临用前新鲜研磨后用生理盐水配成10g・L-1的悬液待用。

113 RPMI 1640培养液 日本产RPMI 1640培养基干粉，每袋104g，溶于1 000ml去离子水，抽滤除菌并分装，4℃冰箱保存备用。内含2mmol・L-1的L谷氨酰胺、100U・ml-1青霉素、100μg・ml-1链霉素。临用前加入10%小牛血清。

114 亚硒酸钠（Na2SeO3） 由上海金山县兴塔化工厂生产，分析纯，批号：940802，临用前用生理盐水配成1.0mmol・ml-1的溶液待用。

115 硫酸镁（MgSO4） 由上海试四赫维化工有限公司生产，分析纯，批号：041107，临用前用生理盐水配成05mmol・ml-1的溶液待用。

116 MDA、H2O2、CAT试剂盒 由南京建成生物工程研究所提供。

12 方法

121 肺泡巨噬细胞（AM）的获取与培养 大鼠股动脉放血处死，在无菌条件下进行肺灌洗，收集灌洗液，细胞纯化后调整浓度为1×109 L-1。按实验设计分成：（1）阴性对照组（生理盐水）。（2）SiO2组，含SiO2200μg・ml-1。（3）Na2SeO3组，内含SiO2200μg・ml-1外，Na2SeO3设05、10、20μmol・L-1 3个浓度。（4）MgSO4组，内含SiO2200μg・ml-1外，MgSO4设05、10、20μmol・L-1 3个浓度。 （5）Na2SeO3与MgSO4联合应用组，内含SiO2200μg・ml-1外，Na2SeO3与MgSO4各按上述3种剂量采用正交表L9(34)的设计，共9个剂量组。均于37℃、5%CO2培养箱培养18 h后检测各指标。

122 检测指标 MDA、H2O2、CAT均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，操作方法严格按照说明书进行。

13 统计学处理实验数据应用SAS82软件进行完全随机设计资料方差分析及正交实验设计方差分析。

2 结果

21 Na2SeO3单独作用对染尘AM MDA、H2O2和CAT水平的影响

SiO2粉尘组AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，与阴性对照组比较，具有统计学意义(P< 005)。不同剂量Na2SeO3单独作用后MDA及H2O2含量下降，CAT活性有所增高，其中以加入的20μmol・L-1 Na2SeO3组的效果最明显。见表1。

表1 Na2SeO3单独作用18 h后染尘AM中MDA、H2O2含量和CAT活性的变化（略）

注：A组为200mg・L-1 SiO2;B组为200mg・L-1 SiO2+05μmol・L-1 Na2SeO3;C组为200mg・L-1 SiO2+10μmol・L-1 Na2SeO3;D组为200mg・L-1 SiO2+20μmol・L-1 Na2SeO3

1)与A组比较，P

22 MgSO4单独作用对染尘AM MDA、H2O2和CAT水平的影响SiO2粉尘组AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，与阴性对照组比较，具有统计学意义(P

表2 MgSO4单独作用18 h后染尘AM中MDA、H2O2含量和CAT活性的变化（略）

注：A组为200mg・L-1 SiO2;B组为200mg・L-1 SiO2+ 05μmol・L-1 MgSO4;C组为200mg・L-1 SiO2+ 10μmol・L-1 MgSO4;D组为200mg・L-1 SiO2+ 20μmol・L-1 MgSO4。A组为200mg・L-1 SiO2;B组为200mg・L-1 SiO2+05μmol・L-1 Na2SeO3;C组为200mg・L-1 SiO2+10μmol・L-1 Na2SeO3;D组为200mg・L-1 SiO2+20μmol・L-1 Na2SeO3

1)与A组比较，P

23 Na2SeO3与MgSO4联合作用对染尘AM MDA、H2O2和CAT水平的影响SiO2组AM中MDA及H2O2含量增加，CAT的活性降低，与阴性对照组比较，具有统计学意义(P

表3 Na2SeO3与MgSO4联合作用18 h后染尘AM中MDA、H2O2、CAT的变化（略）

1)与200mg・L-1 SiO2组比较，P

3 讨论

SiO2致肺泡AM损伤是矽肺发病的重要环节之一，SiO2粉尘进入机体后可引发肺泡巨噬细胞的自由基和脂质过氧化自由基反应。硒、镁是人体必需的元素， 参与机体多种酶的组成，涉及生物体内的细胞代谢，具有重要的生理功能。研究证实，硒、镁和矽肺之间有密切相关的联系［34］。MDA作为脂质过氧化作用的主要产物之一，可通过共价烷化赖氨酸、组氨酸和半胱氨酸对蛋白质加以修饰，引起蛋白变性［5］。MDA可以与蛋白质游离氨基作用，引起蛋白质分子内和分子间交联［6］。Hartley等［7］用四氯化碳、铁/抗坏血酸诱发肝细胞脂质过氧化，采用兔多克隆抗体测定MDA加合物，发现了13种丙二醛修饰蛋白。MDA 与蛋白结合后可导致蛋白对酶解作用的敏感性下降［8］。过多的H2O2和超氧化物反应可形成活性更强的・OH，后者参与脂质氧化的链式反应，还可直接结合到DNA上形成羟化反应；H2O2可被髓过氧化物酶代谢，产生的衍生物次卤酸，也有很强的活性［5］。自由基的清除依赖于非酶类抗氧化剂和酶类抗氧化剂。CAT是重要的酶类抗氧化剂，广泛分布于各种组织细胞中，在H2O2浓度较高时，可催化H2O2转变成H2O与O2。硒与硒的化合物在消除自由基、抗脂质过氧化方面发挥重要作用，可清除脂质过氧化自由基中间产物，分解脂质氢过氧化物，修复自由基引起的硫化物的分子损伤，在自由基破坏生命物质前将其清除或转变为稳定化合物，还能催化巯基化合物作为保护剂的反应。有研究表明，镁可减少缺血后再灌注心肌乳酸脱氢酶的漏出， 维持谷胱甘肽过氧化物酶的活性，降低心肌组织中的丙二醛含量，从而减少氧自由基的产生，起到抗脂质过氧化而保护心肌细胞的作用［911］，Mg 2+对内皮细胞及培养乳鼠心肌细胞羟自由基诱导的脂质损伤有保护作用［1213］，镁还作为钙的拮抗剂减少自由基的生成，减轻膜脂质过氧化反应［14］。

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第8篇：巨噬细胞范文

学意义; 甘露糖不能诱导Mφ分泌TNFα与IL4。结论: RTP引起的Mφ分泌TNFα作用是通过甘露糖受体介导， 而APS的作用不仅仅与甘露糖受体有关。两种多糖与甘露糖受体的作用差异可能与其单糖组成密切相关。

【关键词】 巨噬细胞 甘露糖受体 大黄多糖 当归多糖 肿瘤坏死因子 白细胞介素4

许多中药多糖能够刺激巨噬细胞（Macrophage， Mφ）释放前炎症因子或者某些细胞因子， 推测其可能机制与Mφ膜上的模式识别受体（pathogen recognition， PRR）结合引起细胞内某些信号通路的活化有关。前期研究发现， 当归多糖（Angelica sinensis Diel polysaccharide， APS）能够促进树突状细胞的成熟， 增强抗原提呈能力［1， 2］; 促进脾细胞IL2、 IFNγ的分泌［3］; 而RTP（Rheum tanguticum polysaccharide， RTP）能够对抗结肠炎大鼠CD4+T细胞的扩增， 降低克隆氏病大鼠IFNγ的升高， 升高结肠炎小鼠降低的IL4水平［4， 5］。但是RTP和APS的免疫反应作用机制， 尚不清楚。

Mφ是体内特定的吞噬细胞和抗原提呈细胞， 是连接先天免疫系统及后天免疫系统的桥梁。其表面众多膜受体参与完成这些功能， Mφ甘露糖受体(Macrophage Mannose receptor， MMR)为其中之一。研究表明， MR是一种PRR， 可特异性地识别以甘露糖、 N乙酰葡糖胺或岩藻糖为末

端的配体并与之结合［6］， 这些配体可来源于内源性或外源性分子。推测MR在病原体的识别、 吞噬与清除， 在结核、 肿瘤、 感染等许多疾病过程中都发挥着重要的作用。我们的研究表明， RTP含有近50%的甘露糖［7］， 组分RTP1， RTP2所含单糖比例不同; APS则含有N乙酰

葡糖胺残基［1］， 组分APS1， APS2， APS3所含单糖比例也不同。这两种多糖的免疫调节作用可能是通过MMR而起效的。本研究将探讨APS混合组分、 RTP混合组分对Mφ吞噬及分泌细胞因子的影响， 以揭示两种中药多糖的免疫调节作用。

1 材料和方法

1.1 材料

SD大鼠（200～220 g， 雌雄各半）， 由第四军医大学动物实验中心提供， 动物分笼饲养于空调温室内， 温度22±2℃， 相对湿度50%～60%， 自动调控昼夜各12 h， 颗粒饲料喂养， 自由饮水。RPMI1640培养基购自Gibco公司， 胎牛血清购自杭州四季青公司生物制品厂， PBS缓冲液购自博士德生物工程公司， 甘露糖购自上海试剂二厂; 半乳糖购自国药集团化学试剂有限公司; APS及RTP由我实验室提供， EDTA以及异硫氰酸荧光素标记的甘露糖化牛血清白蛋白(ManFITCBSA) 购自Sigma公司; GENios pro多功能酶标仪为瑞士TENCN公司产品; Nikon H600L荧光显微镜为日本Nikon公司产品。

1.2 方法

1.2.1 腹腔Mφ的分离、 纯化及培养

取6只雌性SD大鼠， 乙醚麻醉， 750 mL/L乙醇浸泡1 min， 取出， 消毒腹部皮肤， 打开腹壁， 但勿伤及腹膜。用注射器向腹腔内注入PBS 10 mL， 轻揉腹腔5 min， 剪开腹膜， 用吸管吸取腹腔内液体， 注入离心管， 1 000 r/min 离心5 min。弃上清， 分别加入6 mL含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 吹打混匀后计数， 调整细胞密度为1×109个/L， 分别接种腹腔Mφ于对应的培养板中， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中培养。3 h后轻轻吸弃培养液后， 再用PBS洗去未贴壁细胞， 重复3次， 每孔加入含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液， 用姬姆萨瑞氏染色法染色， 观察Mφ占 95％以上［8］。纯化后的单层大鼠腹腔Mφ用含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液置于37℃ 50

mL/L CO2孵箱中培养。

1.2.2 荧光显微镜观察MFITCBSA与Mφ的结合能力

取纯化腹腔Mφ， 以每孔1×106个腹腔Mφ接种于底部覆盖玻片的6孔培养板， 纯化后分为3组: 空白对照组（2 mL 500 mL/L RPMI1640/PBS缓冲液）; ManFITCBSA阳性对照组（2 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）; 甘露糖加MFITCBSA实验组（1 mL 1 g/L Man+1 mL 0.01 g/L ManFITCBSA）。用锡铂纸包严培养板， 置37℃ 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min; 用PBS冲洗接种有Mφ的盖玻片3遍， 40 g/L多聚甲醛固定30 min， PBS洗片， 晾干后滴上500 mL/L的甘油PBS 10 μL， 石蜡封片， 4℃短时储存留待观察。荧光显微镜激发光谱495 nm， BA520阻挡滤光片， DM505二向分色滤光片。

1.2.3 多糖对Mφ吞噬ManFITCBSA的影响

取纯化腹腔Mφ， 以每孔1×104个接种于Costar96孔底部透明板， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中孵育4 h， PBS冲洗3遍， 分别加入不同浓度的甘露糖（Man）、 半乳糖(GaL)、 APS混合组分、 RTP混合组分以及ManFITCBSA， 每组3个孔各加100 μL， 置37℃及4℃， 50 mL/L CO2孵箱中避光孵育60 min后， 弃上清， PBS冲洗3遍， 重复3次［9］。

1.2.4 多糖对Mφ分泌细胞因子的影响

取纯化Mφ， 以每孔1×104个腹腔Mφ接种于Costar96孔培养板， 分别与APS、 RTP、 Man、 APS+ Man

、 RTP+ Man在37℃， 50 mL/L CO2孵箱中培养36 h， 取细胞上清按照试剂盒说明（Rat IL4 ELISA Kit， Rat TNFα ELISA Kit， BOSTER）测定细胞因子水平。简述如下: 在酶标板加入100 μL不同浓度的标准品， 绘制标准曲线， 在反应孔中加入待测样品的Mφ培养液上清各100

μL， 然后加入100 μL生物素标记抗体， 37℃反应1 h， 0.01 mol/L PBS洗板3次， 然后每孔加入100 μL亲和素过氧化物酶复合物（ABC）， 37℃反应30 min， 洗板5次， 加入TMB显色液， 避光反应10～25 min， 加入TMB中止液， 450 nm测定光吸收值。

1.2.5 统计学处理

数据以x±s表示， 利用SPSS11.0软件进行分析， 显著性检验采用t检验及SNKq检验， P

2 结果

2.1 甘露糖抑制Mφ吞噬ManFITCBSA 采用荧光显微镜观察腹腔Mφ吞噬ManFITCBSA的情况(图1A)， 通过竞争抑制试验观察到: D甘露糖可以抑制该现象(图1B)。

2.2 多糖对Mφ吞噬功能的影响

采用多功能酶标仪检测Mφ吞噬ManFITCBSA的能力， 实验结果表明: 在37℃时， Mφ吞噬活性与ManFITCBSA浓度呈正相关， 在4℃时， ManFITCBSA与Mφ为非特异性吸附， 荧光强度不随ManFITCBSA浓度改变而发生变化（图2）; ManFITCBSA与MMR的结合为Ca2+依赖性， EDTA可阻断该过程（图3）， 其阻断能力与EDTA浓度呈正

相关; 甘露糖作为MR的阻断剂， 也阻断该过程， 其拮抗能力与甘露糖浓度相关， 半乳糖则不能阻断MR介导的Mφ对ManFITCBSA的吞噬作用（图4）; APS、 RTP均可阻滞Mφ吞噬ManFITCBSA的作用， 且呈剂量依赖性(图5、 6)。

2.3 多糖刺激Mφ释放TNFα， IL4的测定

采用ELISA法检测细胞培养液中TNFα和IL4水平， 体外将APS和RTP与Mφ共孵育36 h， 可以促进正常腹腔Mφ分泌TNFα(图6)， 与正常对照组相比有统计学意义（P

3 讨论

我们已发现， RTP与APS均具有免疫调节作用， 但它的免疫调节机制目前尚不清楚。本实验证明RTP、 APS均可抑制Mφ吞噬ManFITCBSA，提示RTP、 APS的免疫调节作用可能通过MR介导。

许多中药多糖富含甘露糖或葡萄糖， 且以反复串联的结构存在， 与MR具有比MRmAb更高的结合特性［10］。如壳寡糖可通过Mφ表面的MR， 产生白介素1β和TNFα［11］; 海带多糖能激活小鼠腹腔Mφ， 对S180肿瘤细胞有较好的杀伤作用［12］。我们的研究表明RTP含有近50%的甘露糖， 而APS则含有N乙酰葡糖胺残基， 因此， RTP、 APS具有潜在的MR结合特性。我们的实验结果表明， RTP与APS均可以阻断MR介导的Mφ吞噬作用， 且这种作用呈现剂量依赖关系， 为两种多糖作用于MR提供了依据。

为了进一步研究两种多糖与MR的作用， 我们发现RTP和APS均可以促进Mφ分泌细胞因子TNFα， 而MR的拮抗剂甘露糖可完全阻断RTP刺激Mφ分泌TNFα的作用， 说明RTP是通过MR而起作用; 甘露糖则没有该作用; RTP和APS对Mφ分泌细胞因子IL4无明显影响， 揭示RTP和APS影响Mφ的免疫功能主要通过Th1型细胞免疫发挥作用， 同时提示我们以前实验中RTP和APS影响T细胞极化可能通过MR起作用。

参考文献

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［10］Schepetkin IA， Quinn MT. Botanical polysaccharides: macrophage immunomodulation and therapeutic potential［J］. Int Immunopharmacol， 2006， 6(3): 317-333.

第9篇：巨噬细胞范文

【摘要】

目的: 分析连翘(FS )对小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬和体外NO释放的影响。方法: 无菌收集小鼠腹腔巨噬细胞和羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDASE)标记大肠杆菌DH5α， 短期培养3 h后流式细胞术(FCM)分析FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬的影响。用LPS体外刺激活化腹腔巨噬细胞， Griess Reagent试剂盒检测并分析FS对巨噬细胞体外释放NO的影响。结果: FCM分析显示， 终浓度为40、 80、 160 mg/L的FS对小鼠腹腔巨噬细胞体外吞噬具有明显的促进作用(P

【关键词】 连翘提取物 腹腔巨噬细胞 吞噬 NO释放

［Abstract］ AIM: To investigate the effect of forsythia suspensa (FS) extract on phagocytosis of peritoneal macrophages and NO production in vitro. METHODS: The peritoneal macrophagess were isolated from BALB/c mice. After stained with CFDASE， the DH5α were cocultured with peritoneal macrophagess for 3 h. The effect of FS extract on cytophagocytesis in vitro was analyzed by flow cytometry. The peritoneal macrophages were stimulated and activated by LPS in vitro. The effect of FS extract on NO production of the peritoneal macrophages in vitro was measured by NO assay kit. RESULTS: FCM analysis showed that FS extract significantly promoted the phagocytosis of peritoneal macrophages at the final concentration of 40， 80， 160 mg/L， respectively (P

［Keywords］forsythia suspensa extract;peritoneal macrophages;phagocytosis; NO production

连翘(forsythia suspensa， FS)又名旱莲子、 大翘子、 落翘等， 为木犀科植物连翘的果实。它作为传统中药广泛应用于对炎症、

发热和溃疡等方面的治疗［1］。同时， FS的主要活性成分连翘苷在抗氧化、 抗菌、 抗病毒和解热抗炎等方面［2］也起着重要的作用。本研究我们通过检测FS对小鼠腹腔内巨噬细胞体外吞噬和NO释放的影响， 进一步研究其免疫学效应。

1 材料和方法

1.1 材料 清洁级BALB/c近交系小鼠(雄性， 8～10周龄， 体质量20～22 g)购自广东省实验动物中心。FS购自四川广汗市维康植化有限公司。L谷氨酰胺、 β巯基乙醇、 刀豆蛋白A(concanavalin A， ConA)购自Sigma公司。羧基荧光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFDASE)购自美国Molecular Probes 公司。RPMI1640、 胎牛血清(fetal bovine serum， FBS)为美国GibcoBRL公司产品。Griess Reagent试剂盒为美国Promega公司产品。流式细胞仪(FACSCalibur)为美国Becton Dickinson公司产品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬细胞的制备和细胞培养 断颈处死小鼠， 用750 mL/L乙醇消毒， 腹腔注射RPMI1640完全培养液约5 mL。用棉球轻揉腹壁1～2 min后， 收集腹腔液， 1500 r/min离心10 min， 弃上清， 用RPMI1640完全培养液(含100 mL/L的FBS)调整细胞密度为2×109/L。根据需要接种于24孔(1mL/孔) 或96孔(0.2mL/孔)细胞培养板中， 37℃、 50mL/L CO2培养箱培养3 h 。轻轻吸弃培养液后， 再用RPMI1640完全培养液洗去未贴壁细胞， 继续培养［3］。

1.2.2 对大肠杆菌DH5α的染色标记 采用CFDASE染色标记大肠杆菌DH5α。CFDASE用二甲基亚砜(DMSO)溶解成10 mmol/L的储存液， -20℃ 保存。临用前， 取适量用PBS稀释成1 mmol/L的工作液， 备用。新鲜大肠杆菌DH5α离心弃去LB培养基(4 000 g， 6 min)， 冷PBS洗涤1次， 调整细菌密度为1×1010/L， 加入CFDASE工作液(终浓度为8 μmol/L)， 充分混匀后在37℃摇床振荡(220 r/min， 15 min)。RPMI1640培养基静置10 min终止染色后离心， 经RPMI1640洗涤2次(4000 g， 6 min)后， 重悬。流式细胞术(FCM)检测DH5α的CFDASE染色标记率为90%。

1.2.3 巨噬细胞体外吞噬 将CFDASE标记好的大肠杆菌DH5α(1×107/孔)与小鼠腹腔巨噬细胞(细胞密度为2×109/L)一同接种到24孔板内。实验分组及处理: 设2组空白对照(RPMI1640完全培养液组和PBS组)和不同终质量浓度FS组: (RPMI1640+FS 40)、 (RPMI1640+FS 80)、 (RPMI1640+FS 160)、 (PBS+FS 40)、 (PBS+FS 80)、 (PBS+FS 160)接种于24孔培养板。每组各设6个重复孔。37℃、 50 mL/L CO2培养箱中温育3 h后， 用细胞刮轻轻刮下贴壁的巨噬细胞， 各组分别经由70 μm滤器过滤， 立即以FCM检测。

1.2.4 巨噬细胞体外NO释放 实验分组及处理， 设阴性对照组(单独RPMI1640完全培养液组)、 阳性对照组(单独LPS组)、 不同终质量浓度的单纯FS组和(FS+LPS)组， 每组设6个复孔， 接种于96孔培养板。给药组细胞与药物FS共孵育4 h后， 再加入LPS(终浓度为10 mg/L)刺激继续培养24 h。收集相应培养上清-20℃保存。采用Griess Reagent试剂盒(Promega)以检测小鼠巨噬细胞培养上清中的NO稳定氧化代谢产物亚硝酸盐(NO-2)水平， 间接反映NO的释放量。50 mL小鼠巨噬细胞培养上清加入96孔平底酶标板中， 按试剂盒操作说明加入试剂， 室温避光孵育10 min， 检测A540值。

1.2.5 FCM检测及分析 所有样品经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取。先在前散射(FSC)对侧散射(SSC)二维散点图中， 划出巨噬细胞细胞区R1。CFDASE为荧光1(FL1)。M1表示腹腔巨噬细胞吞噬经CFDASE标记后DH5α百分率。全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CellQuest软件获取， 每管样品检测10000个细胞， 获得的数据用CellQuest软件分析。统计学分析用统计软件包SPSS10.0进行处理， 数据以x±s表示， 多组间比较采用方差分析， 两两间比较用LSDt检验。

2 结果

2.1 FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬的影响 表1结果显示， 仅对照组RPMI1640完全培养液和PBS组之间比较， 发现RPMI1640 悬浮的巨噬细胞吞噬率比对照组PBS表现较高。对照组RPMI1640 完全培养液和(RPMI1640+FS)组比较， 各浓度FS组均可促进巨噬细胞吞噬率的增加， 具有统计学意义。对照组PBS和(PBS+FS)组比较， 相同浓度FS组也可促进巨噬细胞吞噬率的增加， 具有统计学意义。不同浓度FS间比较有一定的浓度梯度依赖性。巨噬细胞体外吞噬的一次代表性实验结果(图1)。

表1 FS对腹腔巨噬细胞体外吞噬影响（略）

Tab 1 Influence of FS on the phagocytosis of peritoneal macrophage in vitro

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图1 腹腔巨噬细胞体外吞噬DH5α（略）

Fig 1 Phagocytosis of peritoneal macrophage on DH5α in vitro

2.2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放的影响 表2结果显示， 单纯RPMI1640完全培养液组为阴性对照组。不同终质量浓度的单纯FS组均可抑制巨噬细胞体外NO释放， 且随着药物浓度的升高其抑制NO释放的程度越高， 具有统计学意义。LPS组为阳性对照组， 它的NO释放结果为(0.36±0.01) μmol/L。在(LPS+FS)组中， FS也可抑制LPS诱导刺激巨噬细胞体外NO释放， 不同浓度间也随着药物浓度的升高其抑制NO释放的程度越高， 具有统计学意义。与单纯FS组作用趋势呈一致性。巨噬细胞体外吞噬的统计学实验结果见图2。

图2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放影响（略）

Fig 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro

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表2 FS对腹腔巨噬细胞体外NO释放影响（略）

Tab 2 Influence of FS on NO production of peritoneal macrophage in vitro

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3 讨论

腹腔中的巨噬细胞主要是通过引起和调节局部细胞介导的免疫反应来调节和维持腹腔环境的稳定， 是一种十分重要的免疫辅助细胞。它在细胞膜上表达MHCI/II类分子和多种黏附分子以及IgG Fc受体(FcγR)、 C3b受体(CRI)和多种细胞因子受体。在与多种病原微生物识别与结合过程中， 可以高表达IA抗原和分泌较高水平L10， 通过受体与病原体等抗原异物结合经吞噬或吞饮作用， 主动吞噬、 杀伤和消化病原微生物等抗原性物质。

本实验我们采用新的方法， 用CFDASE标记DH5α在体外被小鼠腹腔巨噬细胞吞噬， 间接证实了FS可促进小鼠腹腔巨噬细胞的体外吞噬。不同浓度的FS对其吞噬影响呈一定的梯度表现， 与对照相比均有统计学意义。我们推测FS可能通过与腹腔巨噬细胞表面的受体间的特异性结合而促进了巨噬细胞的吞噬功能; 或者也可能对作为抗原的大肠杆菌DH5α的受体Fc段存在一定的调理作用， 从而协同促进了腹腔巨噬细胞识别、 结合并吞噬的过程。

腹腔巨噬细胞的NO释放是由LPS协同INFγ、 TNFα等细胞因子作用刺激诱导诱导型一氧化氮合酶(iNOS)所达成的［4］。我们已知NO作为体内重要的生物活性物质， 可以兼具细胞间、 细胞内信使以及神经递质作用的信号分子。它是由血管及机体许多其他组织类型的细胞合成， 以自分泌或旁分泌作用参与正常生理过程和某些疾病的发生发展， 如血管扩张、 血管通透性、 血小板黏附和聚集、 神经信号转导、 宿主防御反应等等。此外， 在免疫学上NO也具有重要的意义。它作为机体非特异性免疫系统的组成部分之一， 起着免疫效应分子和免疫调节剂的作用， 可以杀伤细菌、 病毒和肿瘤细胞。但是， NO过量可对宿主细胞产生细胞毒性作用， 损害宿主细胞活性和导致基因突变， 如NO过量可诱发肿瘤， 有研究发现肿瘤的发生和发展与血液NO的浓度可呈正相关［5］。此外， 临床上NO过量还常表现在的休克和哮喘等［6］。

已知LPS诱导激活巨噬细胞一般是沿2条道路进行启动信号转导途径: 一是LPS与靶细胞膜相应受体作用并启动胞内信号转导途径; 二是LPS作用细胞后， 核内基因表达的变化及其上游信号分子的确定［6］。研究表明LPS的刺激可激活或增强通路MAPK家族(ERK1/2， JNK1/2以及p38MAPK)的磷酸化， 同时还可促进巨噬细胞分泌释放PGE2使之与其细胞表面G蛋白偶联的受体结合激活腺苷酸环化酶， 导致cAMP 释放增加及PKA的活化［7］。本试验结果表明FS对LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞体外NO释放有抑制作用。低浓度FS(40 mg/L)即可抑制腹腔巨噬细胞NO的体外释放， 且各浓度梯度FS与对照组比较均有统计学意义。由此我们推测FS抑制小鼠腹腔巨噬细胞体外释放NO的原因在于FS可能参与和影响了LPS诱导的某些通路的表达。文献表明FS可以抑制cAMP磷酸二酯酶的活性并在一定程度上能够降低胞内cAMP的含量［8］; 它还可以抑制p38MAPK的活化、 阻断NFκB途径作用以及抑制iNOS蛋白和mRNA的表达［9］， 这些均为FS抑制腹腔巨噬细胞体外释放NO提供了理论依据。

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