核酸检测方法精选(九篇)

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第1篇：核酸检测方法范文

作者简介：冯晔晨(1974－)，男(汉族)，浙江宁波人，工程师，主要从事建筑结构设计工作。

摘要：当仅需要了解框架结构的侧移时，可采用一种高层框架侧移简化计算方法－合并梁法。本文以4跨22层框架为例，分别采用两种不同等效框架简化计算，结果表明：简化计算框架结构侧移是可行的，且简化程度对计算精度影响不大，该法可为框架结构侧移的快速估算提供参考。

关键词：框架；简化方法；合并梁

中图分类号：TU311．4

文献标识码：B

文章编号：1008－0422(2007)02－0070－03

1　引言

水平荷载作用下，框架侧移的计算有三种手算方法：反弯点法、D值法。前者计算较为简单，但计算精度不够：后者较为精确，当工作量较大，碰到层数较多的高层框架结构时，计算工作量更大。初步设计阶段，往往需要工程设计人员能对结构的受力性能不仅有个定性的把握，最好能对一些受力指标有个定量的估算。因此，当仅需要了解框架结构的侧移时，可采用一种高层框架侧移简化计算方法一合并梁法。所谓合并梁法就是根据位移相同的原则，将若干小层梁合并为一大层，得到相应部位的等效梁柱的惯性距，得到较为简单的等效框架，能够大幅度减少计算的工作量。

2　合并梁法

2．1框架侧移计算

Smith＆Coull认为，水平荷载作用下的框架层间侧移由三部分组成：第一部分是由于梁的双曲率弯曲变形引起的节点转动产生的侧移δb；第二部分是由柱的双曲率弯曲变形引起的侧移δc；第三部分是由于柱子轴向变形使结构整体弯曲而引起的侧移δN，即层间总侧移δ=δc+δb+δN，当框架高宽比小于4时，可忽略最后一项，即δ=δc+δb。

除底层外的其余各层，假定反弯点在柱高的一半及梁的跨中，梁弯曲变形引起的层间位移

柱弯曲变形引起的层间位移

式中，Vi为第层的总剪力；E为混凝土弹性模量；lb、lc分别为框架梁、柱截面惯性距；l为框架梁、柱的跨度、hi，为第i层层高。

2．2合并梁计算

当各楼层相同时，可以将各层梁依次合并起来形成一个层数较少的模型。为表述方便，以图1框架结构为例，有三根各由三根梁合并成的单梁，首层和顶层梁不能合并，因为在顶部和基底附近框架的受力性能明显地与中间部分不同。在图1(b)中，第二层和顶层下面一层的梁保持原样，以便能够更接近于真实的边界条件。

对等效合并梁框架的要求是在水平荷载作用下节点的平移与原始结构相同。对于梁受弯引起的平移，式(1)表明只要每根等效梁的惯性矩等于原框架被合并的n根梁的惯性矩之和，该条件即能满足，即

等效合并梁框架的柱子特征值的确定可参考式(2)。对等效框架层高为nh处的层间柱由于双率弯曲引起的位移分量应等于原始框架中n层的相应水平位移。

根据上式可得出等效柱的惯性矩为

在图1(a)所示的结构中，三根等高柱Ic8,Ic9及c10可以由等效合并梁模型中一个三层高的等效柱取代，该等效的惯性矩为

在梁被合并的各区段内如果相继每层柱的惯性矩都相同。那么高度为3h的等效柱惯性矩将是原来单层柱的9倍(图1)，如果高度为2h的中间区段其等效柱的惯性矩为原来单层柱的4倍。

3　算例

某22层高层框架(如图2所示)，底层层高5．0m：其余层层高3．2m。混凝土强度C40。截面尺寸如下：框架柱b×h=0．8m×0．8m；框架梁：b×h=0．25m×0．6m。

将原框架结构(图1－a)简化等效框架1(图1－b)和等效框架2(图1－c)，以便探讨简化程度对计算精度的影响。

①等效框架1

等效梁惯性矩(3根小梁合为1根大梁)

等效柱惯性矩(3根短柱合为1根长柱)

②等效框架2

等效梁惯性矩(9根小梁合为1根大梁)

等效柱惯性矩(5根短柱合为1根长柱)

等效柱惯性矩(9根短柱合为1根长柱)

结构侧移比较如图3所示。

从图中可以看出：(1)等效后的结构侧移与原结构的侧移非常相近，说明采用简化计算框架结构侧移是可行的。(2)简化结构1与简化结构2的侧移相差也不大，说明框架结构的侧移计算误差不会因为简化程度加大而显著增加，因此实际工程中，为最大限度的简化，可将原来比较复杂的框架结构按合并梁法做最大程度的简化。

图2 结构计算简图

4　结论

第2篇：核酸检测方法范文

关键词：水环境 监测 计算机 水质

中图分类号：X830 文献标识码：A 文章编号：1007-9416（2014）05-0091-01

水是人类及各种生物的生命之源，随着水环境的逐渐恶化，国家对水环境的监测越来越重视。我们国家首次真正意义上的开展环境保护工作是从1973年第一次全国环境保护大会开始的，如今，我国的水环境监测经历了30多年的过程。水环境监测是国家水资源管理与保护的基础。我国水资源缺乏，水污染非常严重，水环境监测提供的水质数据非常重要。水环境监测的目的是判别断水环境的质量状况。水质的好坏直接影响我们的生存环境。为了对水资源实施有效的管控，合理的保护、开发和利用水资源，需要及时掌握水环境的现状。水质监测是对水环境中的污染物及污染因素进行监测，监测的目的是评价污物产生的原因及污染途径，为防治污染提供技术支持。水环境控制目标的确定及水环境质量状况改善的效果要依靠水质监测。

1 水环境监测数据的计算机处理

水质动态信息是政府控制水污染实施监督管理的依据。水质是水中含有各种杂质的共同表现出来的综合特性。反映水质状况的综合指标主要有总磷、总氮、氨氮、高锰酸盐等特性指标。

水环境监测的质量控制和质量保证是实验室水质分析的主要工作之一，是水环境监测工作中的关键技术和科学管理实验室的有效方法，是获得正确数据分析的一个非常重要环节。为了保证水质监测工作的科学性、公正性、合理性，使水环境监测的数据能够真实准确地反映水环境质量的现状及预测污染物的发展趋势。从水质评价的角度出发来分析水质监测数据的质量控制。

从水环境评价的方面考虑水质监测数据的质量控制，得出水质监测开始到结束的数据公布及解释的过程中有可能存在的误差来源及消除误差的方法，并对工作现场质量控制的主要原则、实验室测定分析的基本要求、数据处理和保存的控制等方面做详细的分析。

水环境监测但是有时过于简单，只是对照标准，对单个数据进行评价，判断其是否超标。本文采用计算机来处理水环境监测数据能够直观的反映当前水质的各种综合指标的变化情况，有利于察觉水环境的发展趋势。

现在水环境监测数据的处理方面还存在不少的问题，比如在水的样品采集、实验分析过程中的误差，使监测数据受到影响；在代表性的监测数据控制方面不完善；缺乏必备的监测数据综合分析能力。

随着信息时代的到来，计算机技术在各个领域广泛应用。但是目前对水环境监测方面的计算机分析软件还十分缺乏，主要还是靠人工操作。水环境监测数据的处理、汇总、分析及上报过程，还是要不断地重复简单枯燥的工作，整个汇总过程单调而繁琐。没有一种行之有效的计算方法对整个水环境监测过程加以处理。

本文采用计算机数学软件Matlab对石河监测数据编程及处理，用以消除水环境监测过程中的误差，然后再采用EXCEL对数据进行绘图，形成水环境长期的综合指标的曲线图，如图1、图2所示。然后对水环境质量动态特征及其成因进行分析，可实现敏捷、准确的水环境预警。

通过对图1分析得知，该水样的水质中总氮指标在第10天监测时有超标的发展趋势，有助于评价水体被污染和自净状况，微生物大量繁殖，浮游生物生长旺盛，出现富营养化状态。图2中综合指标相对比较稳定。

2 结语

本文研究了水环境监测数据的计算机处理方法，通过该方法能直接、有效的发现水质中重要综合指标的发展趋势，并应用到石河的水环境监测上，实践证明该方法是直观的、合理的。

参考文献

[1]王卫明，唐龙彪.浅谈环境影响评价中环境监测工作相关问题[J].现代经济信息，2009.19.

[2]奚旦立，孙裕生.环境监测[M].北京：高等教育出版社，2011.

[3]国家环保局.水和废水监测分析方法（第四版）[M].北京：中国环境科学出版社，2002.

[4]李贵宝，周怀东，郭翔云，陈海英.我国水环境监测存在的问题及对策[J].水利技术监督，2005.03.

[5]李怡庭.全国水质监测规划概述[J].中国水利，2003.14.

第3篇：核酸检测方法范文

笔者通过对丙氨酸氨基转移酶筛查的微量检测方法进行改进，不仅减小实验误差，降低试剂成本，方便操作，降低劳动强度，而且保证了检测结果判断的准确性，更加适合单采血浆和输血单位对供血浆者（献血者）丙氨酸氨基转移酶筛查。

1 原理

血清中丙氨酸氨基转移酶在一定的反应条件下，作用于丙氨酸及α-酮戊二酸，生成一定量的丙酮酸及谷氨酸。2，4-二硝基苯肼能与反应产生的丙酮酸及剩余的基质α-酮戊二酸生成相应的2，4-二硝基苯腙。后者在碱性条件下呈棕色，从而推算出酶的活力。

2 实验准备

2.1 仪器、设备 雷勃10μl可调移液器；雷勃50μl连续分配器；722型分光光度计；全自动酶标测试仪（北京普朗）；电子微量分析天平（分光度值为0.1mg以下）；电热恒温箱；带盖空白酶标板（江苏海门市博阳实验器材厂生产）。

2.2 试剂 四川迈克生产的丙氨酸氨基转移酶检测试剂。

2.3 操作 用电子微量分析天平精确称取丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒内2mmol/L丙酮酸钠标准液0.438g，加入0.562g蒸馏水配制成0.876mmol/L浓度混匀，密封保存，作为25单位丙氨酸氨基转移酶对照品使用。

2.4 样品测定 按表1顺序分别加入样品、标准试剂进行操作，为减少实验误差，标准孔加3孔，酶标仪取其平均值自动计算。表1 样品微量法测定操作过程

2、4-二硝基苯肼溶液

振荡1min左右混匀，室温静置5～10min，492nm测定波长，630nm参考波长下，空白孔调零进行酶标比色。读取各孔吸光度值A，大于标准孔读数的机器自动打印“+”，表示不合格；小于等于标准孔读数的机器自动打印“-”，表示合格［2］。

2.5 结果判定 被测样本 ：≤25单位为合格，>25单位为不合格。

3 讨论

本实验与已发表文献类似方法不同之处主要有以下几个方面：第一是先加基质，后加样品，目的是为了减少实验误差，因为经过实验证明对20份同样的样品进行检测，先加样品后加基质检测结果的变异系数达到13.2%，而先加基质，后加样品检测结果的变异系数仅有7.8%，原因可能是10μl的样品量太少，容易干燥导致检测结果不准确，基于本检测方法是终点法，作为采浆单位目的是为了筛查出不合格的供血浆者，保证原料血浆的安全性，所以采用先加基质，后加样品的实验步骤；第二是本方法不需要制作标准曲线，因为按照经典的赖氏法对28单位的定义：试管法为50μl 2mmol/L丙酮酸钠标准液，微量法所有试剂均为试管法加样量的1/10，5μl就相当于28单位，经过计算0.876mmol/L丙酮酸钠标准液10μl就相当于微量法的25单位。前提是在25单位到28单位成近似线形［1］。这样判断结果就变得非常简单：OD值比标准孔高的判断为不合格，反之合格。既保留原始打印资料方便今后查找，又节省90%的试剂成本，经过对1125样品用微量法和试管法同时检测，微量法检测结果为小于25单位（OD值为标准孔的0.8～1倍）但是经过试管法确定为大于25单位的有5例，不合格符合率达到99.6%，微量法检测结果为大于25单位（OD值为标准孔的1～1.2倍）但是经过试管法确定为小于25单位的有3例，合格符合率达到99.7%，解决办法是建立灰区范围（标准孔的0.8～1.2倍）用试管法确定。综上所述，该方法更加适合采集原料血浆前的样品筛查。

【参考文献】

第4篇：核酸检测方法范文

1材料和方法

1.1材料：选取我院临床初筛检测病例72例，其中男性40例，女性32例。年龄28-63岁，平均39岁。

1.2临床症状：初期的开始症状像伤风、流感、全身疲劳无力、食欲减退、发热、体重减少、随着病情的加重，症状日见增多，如皮肤、粘肤出现白色念球菌感染，单纯疱疹、带状疱疹、紫斑、血肿、血疱、滞血斑、皮肤容易损伤，伤后出血不止等。

1.3方法：目前作为诊断手段使用的检测主要包括抗HIV病毒抗体检测、核酸检测和抗原检测。其中对病毒抗体的检测是艾滋病初筛实验室常规使用的方法

1.3.1酶联免疫吸附试验（ELISA）：目前应用的ELISA法有8种之多。它们的特异性和敏感性超过99%。在一些特殊情况下，当抗体检测无法满足HIV感染诊断的需要时，病毒分离及测定、核酸检测、抗原检测可作为辅助手段使用，这包括对非典型血清学反应样品的诊断、HIV感染的窗口期诊断、新生儿早期诊断和对特殊样品的诊断。

1.3.2明胶颗粒凝集法（PA）：它是快速、简便的一种筛选方法。PA的基本过程是先将样品稀释，然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒，混匀后保温(一般为室温)。当血清中有HIV抗体存在时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。PA操作简便，无需特殊仪器设备，适合对少量标本的检测。是对大量人群初筛实验使用的方法，例公民义务献血的初筛检测。

1.3.3免疫荧光试验(IFA)：基本原理为应用H9或HUT78培养细胞作为载体，用HIV感染细胞，该细胞内就会含有HIV抗原，将HIV感染的淋巴细胞涂于玻片上固定，制备为抗原片，加入待检血清，待检血清中的抗 HIV抗体与抗原结合后，再与荧光素标记的抗人Ig结合，在荧光显微镜下可见到细胞内有黄绿色荧光。

1.3.4免疫印迹试验：主要用于确认试验，基本原理是HIV全病毒抗原经过SDSPAGE电泳，将分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状，每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。将待检血清样品用稀释液稀释成1/100，再把它直接加到硝酸纤维素膜上，恒温震荡，使其充分接触反应，血清中若含有抗HIV抗体，就会与膜条上的抗原带相结合并呈现紫褐色。此确认实验室是初筛阳性的标本送检省疾控的HIV确认实验室或市疾控的HIV中心实验室进行的。

1.3.5病毒核酸检测：是通过检测HIV RNA水平来反映病毒载量，具有很高的灵敏度，使用适时荧光聚合酶链反应(PCR)技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。病毒核酸检测方法可用于HIV的早期诊断，如窗口期辅助诊断、病程监控、指导治疗方案及疗效测定、预测疾病进程等。目前常用的测定方法有逆转录PCR实验(RT PCR)、核酸序列扩增实验(NASBA)、分支DNA杂交实验(bDNA)等。使用高灵敏度的适时荧光PCR技术，能够在HIV感染的前2周检测到病毒核酸。此种检测是在HIV感染确诊之后，判定使用抗病毒药物的检测指标，现在可有省疾控中心的艾滋病检测实验室完成。

2结果

经过我院的检测和分析后，14例送检经确认实验，未确诊艾滋病感染。

3讨论

近年来，HIV检测技术取得了很大进展，但是仍有不足的地方。例如ELISA法第四代试剂增加了P24抗原的检测， p24抗原检测能够在病毒开始复制后检测到血液中的可溶性p24抗原，但易出现假阳性。因此，阳性结果必须经中和试验确认，该结果才可作为HIV感染的辅助诊断依据。还有病毒核酸检测方法具有很高的灵敏度，对疾病进展的监测、抗病毒疗效观察和耐药性监测非常重要。但是，由于HIV基因的多样性，没有一套引物可以覆盖所有的HIV序列，使检测的敏感性又受到限制。

HIV感染的诊断是艾滋病预防控制工作的重要组成部分，建立敏感实用的检测方法对于监测、诊断或血液筛查，控制艾滋病的流行显得尤为重要。总结以上讨论的检测方法，我们得出的结论是，既要提高检测的敏感性、特异性，缩短窗口期，又要简便、快速和降低成本已成为HIV检测技术发展的要求和方向，很多的研究正致力于寻找病毒检测的替代技术。

参考文献

[1]曹韵贞

我国艾滋病的现状

中国抗感染化疗杂志 2002，2(2):65 66

[2]沈霞

第5篇：核酸检测方法范文

关键词：多色熔解曲线分析 Gene-Xpert 微孔板 肺结核 利福平 耐药

Study on the clinical application of different detection methods in the rapid diagnosis of tuberculosis resistance to rifampicin

BAO Xundi WANG Qing WANG Shu XU Dongfang LIANG Suo JIANG Yue

Department of Clinical Laboratory,Anhui Chest Hospital/Anhui Provincial Institute of Tuberculosis Prevention and Control;

Abstract：

Objective To evaluate the efficacy and application value of different tuberculosis laboratory testing methods in the rapid diagnosis of rifampicin(RFP) resistance in tuberculosis patients.Methods Sputum or alveolar lavage fluid samples from pulmonary tuberculosis patients treated in the hospital from January to July 2020 were collected.Different detection methods were used for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and RFP resistance, and the detection efficiency of different detection methods in rapid diagnosis of Mycobacterium tuberculosis and RFP resistance was evaluated.Results The results of RFP susceptibility test were obtained by multicolor melting curve analysis(MMCA),Gene-Xpert and microplate(MIC) in 77 cases.There was no significant difference in the drug resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to RFP(38.96%,33.77% and 35.06%) among the three detection methods(P>0.05).There was no significant difference in the drug resistance rate of Mycobacterium tuberculosis to RFP among patients with different gender, age and bacterial samples(P>0.05).Conclusion MMCA method, Gene-Xpert method and MIC method have no significant difference in the clinical detection of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis to RFP.They all have high sensitivity and specificity.The drug sensitivity detection technology can be selected according to the actual clinical needs.

Keyword：

multicolor melting curve analysis; Gene-Xpert; microplate; tuberculosis; rifampicin; drug resistance;

结核病是一种全球感染人数最多，经呼吸系统传播的疾病，已成为全球十大死亡原因之一。近年来，随着耐药结核病的日益增多，结核病的疫情防控工作从各方面都面临着巨大挑战[1-2]。根据我国第5次结核病流行病学抽样调查和第1次耐药结核病基线调查数据[3-4],我国每年大约新发结核病患者约93万人，估算耐多药结核病患者约5.2万人[5]。有研究指出，耐利福平(RFP)患者大部分为耐多药结核病患者，因此，世界卫生组织(WHO)在耐多药结核病患者中发现，近期耐RFP患者即可按照耐多药结核病患者进行治疗。耐药结核病的诊断主要依赖于结核分枝菌药物敏感(简称药敏)试验，传统的细菌学药敏试验是目前诊断耐药结核病的“金标准”,但传统药敏试验时间长，影响耐药结核病的防控、及时诊断和治疗工作。因此，结核病和耐药结核病的早期快速诊断对结核病疫情控制起着至关重要的作用。

进入21世纪，随着分子生物学检测技术的飞速发展，结核分枝杆菌和RFP耐药基因的快速检测均有成熟易用的技术在推广使用。多色熔解曲线分析(MMCA)法为我国自主研发技术，可同时进行结核分枝杆菌和多种抗结核药物的快速检测[6-7];Gene-Xpert法为WHO推广使用的快速检测技术，同样可同时进行结核分枝杆菌和RFP耐药基因的检测。这两种方法均为DNA扩增检测技术，具有操作相对简单、灵敏度高、特异度高等特点[8-9]。微孔板(MIC)法是近几年报道的一种细菌学药敏检测方法，利用MIC中加入抗结核药物进行药敏检测，可缩短耐药检测时间[10]。本研究采用这3种检测方法对肺结核患者进行结核分枝杆菌和RFP耐药的快速诊断，以评估这3种检测方法在结核分枝杆菌和RFP耐药快速诊断中的检测效能，进一步分析其在结核病和耐药结核病控制中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年1-7月在本院就诊的300例肺结核患者作为研究对象。300例患者中男214例，平均年龄(49.72±19.12)岁；女86例，平均年龄(43.77±20.06)岁。

1.2 仪器与试剂

Gene-Xpert法检测仪器GeneXpert及配套试剂盒购自美国Cepheid公司，MMCA法结核分枝杆菌耐药突变检测仪器SLAN-96S及配套试剂盒购自厦门致善生物科技有限公司，MIC法结核药敏检测仪器YK960及配套试剂盒购自珠海市银科医学工程股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

采集肺结核患者的痰或肺泡灌洗液标本，按照结核病实验室标准操作流程采用MMCA法、Gene-Xpert法检测RFP耐药性，同时进行结核分枝杆菌培养，培养阳性菌株再进行MIC法检测RFP耐药性。

1.3.2 结核分枝杆菌和RFP耐药检测方法

(1)MMCA法：取标本1～2 mL,加入1～2倍标本前处理液处理，以12 000×g离心15 min, 磷酸盐缓冲液(PBS)重悬后洗涤，12 000×g离心5 min, 弃上清液，加入核酸提取液，上核酸提取仪进行核酸提取，提取后的DNA按照试剂盒说明书进行检测，由仪器根据核酸解链温度自动判读结果。(2)Gene-Xpert法：取待检标本2 mL,加入1～2倍标本前处理液处理，消化处理15 min后，按照试剂盒操作说明书进行操作，由仪器自动判读结果，结核分枝杆菌半定量检测结果分为阴性、极低、低、中、高5个菌量级别，RFP耐药检测结果分为耐药、敏感。(3)MIC法检测：取患者1～2周内培养阳性菌株，根据操作说明书，将菌株进行比浊定量，加入MIC相应药敏检测位置，37 ℃培养10～14 d后，由仪器判读药敏试验结果。

1.4 统计学处理

将数据录入EXCEL2016,使用spss19.0软件对数据进行统计分析、处理。正态分布的计量资料以x¯±s表示。计数资料以频数、率表示，组间比较采用χ2检验，如理论数T≥5且总样本量n≥40,组间比较采用χ2检验；如理论数T<5但T≥1,且≥40,组间比较采用连续性校正的χ2检验；如理论数T<1或n<40,组间比较则用Fisher确切概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3种检测方法结核分枝杆菌RFP药敏试验结果

采用MMCA法、Gene-Xpert法、MIC法对300例肺结核患者标本进行检测，MMCA法获得132例药敏试验结果，Gene-Xpert法获得192例药敏试验结果，MIC法获得201例药敏试验结果。3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的患者有77例，其中有63例继发性肺结核、12例空洞型肺结核、2例浸润性肺结核；40例为复治结核病患者。3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 3种检测方法结核分枝杆菌RFP药敏试验结果

2.2 不同性别患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药情况比较

3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的77例患者中，男53例，女24例。不同性别患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 不同性别患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药情况比较[n(%)]

2.3 不同年龄组患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药情况比较

将3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的77例患者分为≤25岁、>25～50岁、>50岁3个年龄组。不同年龄组患者3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 不同年龄组患者3种检测方法结核分枝杆菌 对RFP的耐药情况比较[n(%)]

2.4 不同菌量标本3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药情况比较

将3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的77例患者标本按照菌量分为高、中、低、极低菌量4个级别，不同菌量标本3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率比较，差异均无统计学意义(P>0.05),见表4。

表4 不同菌量3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的 耐药情况比较[n(%)]

3 讨 论

自我国开始结核病的规范化管理治疗以来，结核患者一直能够得到国家规范化的免费抗结核治疗。虽然经过近20年的规范化管理治疗，但我国的结核病患者数量并没有明显下降，目前居全球第2位。随着实验室检测技术的发展，越来越多的耐药结核病患者被发现，结核分枝杆菌耐药株的传播也导致了我国耐药结核病患者数量居高不下[11],使我国成为全球耐药结核病高负担国家之一。RFP是目前结核病治疗中最常用，也是最重要的一种药物。根据WHO的推荐，耐RFP的结核病患者可按照耐多药结核病患者进行治疗，因此，RFP耐药情况检测在肺结核患者中至关重要。

本研究中，3种检测方法均获得结核分枝杆菌RFP药敏试验结果的患者有77例，其中有63例继发性肺结核、12例空洞型肺结核、2例浸润性肺结核；40例为复治结核病患者。由于本院是省级结核病定点医院，收治的多是复治、耐药结核病患者，故本研究中RFP耐药率高于全国平均水平，但与全国复治结核患者RFP耐药率基本一致[4]。

目前，常见的实验室结核分枝杆菌耐药株检测方法有传统的细菌学药敏检测技术、液体药敏检测技术、分子生物学耐药快速筛查等技术[12-15]。传统的细菌学药敏检测技术的缺点是耗时长，但液体药敏检测技术缩短了这一时间，MIC法仅需7～10 d即可报告药敏试验结果。而分子生物学方法1 d内即可获得药敏检测结果，常用的分子生物学检测技术有MMCA法、Gene-Xpert法、线性探针、基因芯片等，它们主要通过检测结核分枝杆菌的特异性靶基因是否存在基因突变来评估结核分枝杆菌对相应药物的耐药性，而且自动化程度高，检测结果与传统细菌学药敏试验结果基本一致，故在临床逐渐被接受和推广。

本研究结果显示，MMCA法检测结核分枝杆菌对RFP的耐药率最高，MIC法次之，Gene-Xpert法最低，但三者的差异均无统计学意义(P>0.05);而且在不同性别和年龄段患者中，结核分枝杆菌对RFP的耐药率差异也均无统计学意义(P>0.05)。对于分子生物学检测，菌量是不可忽视的一个问题，含菌量低的标本可能导致核酸提取的假阴性；而含菌量高的标本，因野生型模板背景较高时，易导致非特异性扩增，产生假阳性结果。这些原因都可能导致表型药敏试验和分子药敏试验结果不一致。基于核酸的碱基突变检测也不能完全覆盖所有的基因突变位点，也有可能导致假阴性结果的存在。因此，可以利用分子药敏试验和表型药敏试验互补的检测方法进行药敏试验筛查，提高检测灵敏度和特异度。本研究中结果显示，不同菌量标本3种检测方法结核分枝杆菌对RFP的耐药率差异无统计学意义(P>0.05),这可能与样本量较少有关，后期可以加大样本量进行研究，进而发现分子药敏试验和表型药敏试验之间的差异。

MMCA法和Gene-Xpert法均是通过检测RFP的rpoB基因上的507～533共81 bp耐药决定区的基因序列，通过检测碱基突变来确定RFP的耐药信息，与传统的细菌学药敏试验相比，有较好的一致性，且灵敏度和特异度均较高，能够在短时间内检测出RFP的耐药基因rpoB的突变信息。MIC法是通过抗结核药物技术处理后按照一定的药物浓度加入MIC中，再加入一定量的结核分枝杆菌，经过一定时间的培养，从而判断结核分枝杆菌是否对该药物耐药的一种新型细菌学耐药检测技术[16]。该方法受MIC加工工艺和药粉质量的影响，对药敏试验结果可能会存在一定的影响，因此，目前应加强MIC的质量控制工作。本研究在药敏试验检测过程中，参加了中国疾病预防控制中心国家结核病参比实验室的药敏试验室间质量控制，取得了优秀成绩，但此次质量控制覆盖的药物种类较少，主要是常见的抗结核药物，质量控制药物较少，这也是结核分枝杆菌药敏试验检测室间质量控制的发展方向。

此外，MMCA法、Gene-Xpert法、MIC法3种方法在检测时间、检测费用、人力成本方面也有区别，3种方法都是结核分枝杆菌的新检测技术，需要经过培训的专业技术人员进行操作。MMCA法和Gene-Xpert法是分子生物学检测技术，检测时间均短于细菌学检测技术MIC法；检测费用Gene-Xpert法最高，MIC法最低。这3种方法需要临床医生根据患者病情和其他多方面因素进行选择，并可在耐多药结核病防治领域中进行推广和应用[17]。

综上所述，MMCA法、Gene-Xpert法和MIC法在临床上检测结核分枝杆菌对RFP的耐药性结果无明显差异，均具有较高的灵敏度和特异度，可结合临床实际需求选择药敏检测技术。

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第6篇：核酸检测方法范文

[关键词]核酸检测；血液筛查；输血风险；血液安全；转录介导扩增技术

输血相关传染病的预防和控制是全社会关注的焦点之一。2010年，国家卫生与计划生育委员会（原卫生部）确定在全国15家采供血机构开展核酸检测（NAT）试点工作，以进一步保证血液检测质量，提升我国无偿献血者血液检测水平。到目前NAT技术已经广泛运用于全国各地血站的血液筛检。该技术的检测灵敏度较ELISA检测方法高，能显著缩短病原体检测的窗口期，从而降低输血传播病毒的残余风险50%以上。但NAT技术从理论上并不能完全消除“窗口期”，国外已有经核酸检测后仍发生输血后感染的病例报道，包括HIV和HBV。本中心2010年11月正式将NAT技术应用于血液筛查项目中，对全部无偿献血者血液标本进行HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA核酸检测。本研究通过对无偿献血者血液标本的常规血清学及核酸检测结果的分析，以评估核酸检测的检测功效，以及本地献血者人群的感染状况。现将检测结果报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

2011年1月～2014年12月，广州血液中心采集的无偿献血者血液标本1146740例。所有无偿献血者均符合现行的卫生部《献血者健康检查要求》（GB18467-2011）。血液采集后同时留取核酸检测标本和酶免检测标本管各一支。核酸检测标本采集、保存和处理等均严格按照卫生部核酸检测试点技术要求操作。

1.2主要仪器与试剂

核酸检测仪器：Grifols公司（原诺华诊断公司）PROCLEIX TIGRIS全自动核酸检测分析系统，试剂配置恒温箱（RPI）。试剂为PROCLEIXULTRIO Assay核酸联检试剂盒和核酸鉴别试剂盒（Discriminatory Assay）。核酸检测试剂批号：（593226，614952，624775，116153等）。血清学检测仪器：STAR全自动加样仪和全自动酶联免疫分析仪（FAME24/30）。ELISA检测主要试剂包括乙肝表面抗原试剂盒（法国梅里埃，批号B11FA，20110704；上海科华：批号201101031，201201011，201302011）、丙型肝炎抗体试剂盒（美国强生ORTHO：批号EXE187，EXE208；上海科华：批号201103011，201202031，201303011）及人类免疫缺陷病毒（HIVl/2）抗原抗体检测试剂盒（法国伯乐，批号1F0189，280213，3F0259；北京万泰，批号1201 10204，120121 120，12013 1022）。

1.3检测策略

血液标本采用血清学和NAT并行检测操作策略；对核酸检测单独反应性标本进行分项鉴别试验。

1.4检测方法

采用PROCLEIX TIGRIS 全自动核酸检测分析系统（TMA方法）对血液核酸标本进行单人份联合检测（HIV-1/HCV/HBV）；对核酸检测单独反应性标本进行分项鉴别试验；核酸检测结果反应性结果由检测系统软件自动判定，其判定标准为样本的S/CO值≥1。采用两种不同厂家的ELISA试剂对献血者标本进行血清学HBsAg、HCVAb、HIVAgAb检测，严格执行说明书进行相关操作，通过阴阳性对照及室内质控品来控制试剂盒的质量和检测的有效性；血清学检测结果阳性的判定：样本OD≥cut off值。

1.5检测原理

Grifols核酸检测试剂是以转录介导的扩增（transcription-mediated amplification，TMA）技术原理来检测病毒核酸的方法。其检测基本原理是：利用特异性的目标捕获试剂和磁微珠分离纯化被检测病毒核酸分子，再通过TMA技术来扩增HBVDNA、HCV RNA和HIV-1 RNA（1型）的核酸片断，最后通过杂交保护（HPA）方法检测扩增产物。试剂中含有内标分子，用以监测整个反应过程，避免出现假阴性结果。

1.6统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行处理和分析，对计数资料进行x2检验，P

2结果

2.1血清学与核酸检测结果的比较

对1 146 740例献血者血液标本，核酸检测的阳性检出率为0.97%，低于血清学（HBsAg，HCVAb，H1VAbAg三项之和）的检测阳性率1.66%，二者之间的差异具有统计学意义（x2=2128.4，P

2.2核酸检测

4年中Grifols单人份核酸检测系统的总阳性率为0.97%，并且阳性率呈现逐年缓慢增加的趋势。在对每年的检测阳性率进行比较时，各年度间检测阳性率未见统计学意义（x2=2.442，P

2.3血清学合格标本中核酸检测情况

在1114428例血清学检测合格标本中，单人份核酸检测共检出2457例核酸反应性样本，核酸单独反应性比率为0.22%；在对每年检测阳性率进行比较时，各年度间血清学检测合格标本其NAT检测阳性率之间的差异具有统计学意义（x2=16.506，P

2.4核酸鉴别结果

在2457例核酸单独反应性标本中，鉴别试验反应性的样本为718例，其中，HBV-DNA 711例，HCV-RNA 4例，HIV-RNA 3例，献血者中核酸单独阳性的样本大多属于HBV感染，HBV DNA鉴别阳性率与另外两者间的差异具有统计学意义（x2=2091.464，P

3讨论

目前，国内外应用于血液筛查的核酸检测技术主要有TMA及PCR两种。我中心使用的是Grills公司基于TMA技术的核酸检测试剂，对全部献血者样本进行单人份核酸检测。这种检测方法的灵敏度高，反应条件简单，扩增效率高，可以防止低拷贝的病毒阳性血液的漏检。其分析灵敏度为：HBVDNA 10.4IU/mL，HCV RNA 3.0IU/mL和HIV RNA45.0IU/mL。并且该方法的整个反应过程在1个试管中进行，因此也减少了污染发生的可能。本研究显示，广州地区无偿献血者血液标本的核酸阳性检出率明显低于酶免检测项目阳性检出率（P

在献血者血液筛查中引入核酸检测技术，其主要目的是检测出原有血清学检测可能漏掉的具有感染性的献血者样本。在本研究中的1114428份血清学检测合格标本中，单人份核酸检测共检测出反应性样本2475例，阳性检出率为0.22%（2457/1114428），结果明显高于大连和沈阳地区0.07%，这可能与各地区病毒流行率差异、检测样本数量、使用试剂差异，以及检测模式（单人份与多人份混样检测）不同有关。在对这些核酸单独阳性样本的鉴别检测中，共检出718例阳性结果，鉴别阳性检出率为29.22%。这个鉴别率与汪德海等报道的一致，而低于大连，杭州等地的数据。而出现核酸检测联检反应性，而鉴别试验全部为非反应性的原因可能有：（1）联检结果假阳性。这可能是由于酶免及核酸检测平行进行，检测人员若操作不规范，导致阳性标本的小范围污染，增加联检结果假阳性的可能；或由于检测试剂本身的非特异性反应。（2）鉴别试验的假阴性。如病毒浓度处于极低的浓度水平，由于病毒颗粒在血浆中的泊松分布，导致取样时未能吸取到带有病毒的样本；或可能是因不合适的储存条件，不良的运送，干扰物质的存在，导致样本中病毒的降解，也会造成鉴别试验假阴性的结果。由于我国乙肝的流行率相对较高，因此献血者中核酸单独阳性的样本大多属于HBV感染。而HBV感染，特别是隐匿性乙肝感染（OBI）的病毒浓度通常很低，因此出现上述低浓度样本的可能性很大。已有文章报道，对于不可鉴别的样本，采用其他核酸检测方法，或乙肝感染标志物（如乙肝核心抗体）进行检测时，部分样本仍然呈现阳性结果。提示这些不可鉴别的样本中存在一定比例的真阳性。

第7篇：核酸检测方法范文

禽流行性感冒病毒简称禽流感病毒(AIV)，属于正粘病毒科、流感病毒属。流感病毒根据可溶性抗原不同可分为A、B、C 3型，只有 A 型(AIV)易变异［1］，并可在禽、人、猪、马和海洋哺乳动物中暴发流行，出现轻度呼吸疾病到严重败血症等。1878 年 AIV 在意大利首次暴发，其后在英、法、德等欧洲国家和美国均有流行。高致病性 AIV H5N1 于 1997 年在香港致 6 人死亡，2003～2004 年在亚洲致 4 人死亡，2003 年 H7N7 在荷兰致 1 人死亡［2］。AIV 给人类健康已带来严重威胁，引起全球的极大关注，AIV 检测技术也随之成为人们研究的热点。现就近年来 AIV检测技术研究进展作一综述。

1 病原学检测

鸡胚分离培养是检测病禽组织中AIV的一种经典、准确、敏感的病原学诊断方法，可以作为金标准，特异性和敏感度均可以达到100%［2］。

2 血清学检测

21 病毒中和试验（NT） 作为经典方法，病毒中和实验操作繁琐、耗时、费料，临床几乎不用。

22 血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验AIV 能够与鸡红细胞发生凝集现象，这种红细胞凝集现象又可被特异性免疫血清所抑制，即红细胞凝集抑制试验。血凝和血凝抑制试验可以鉴定病毒、检测血清中的抗体水平。用抗不同血凝素的抗血清，由血凝抑制试验来确定HA亚型。

23 神经氨酸酶抑制（NI）试验微量神经氨酸酶（NA）抑制剂抑制NA的活性，并以半抑制浓度IC50鉴定NA亚型。Hurt等［3］用5mg的抗病毒药物zanamivir建立的荧光NI试验，检测阳性样本H1N1、H1N2，符合率分别为N1 955%，N2 897%，平均935%（187/200）。该方法成本低，适于大规模地应用。

24 琼脂凝胶扩散试验（AGP） 用于检测AIV共同抗原核蛋白或基质蛋白。由于所有的AIV 都具有型特异性共同抗原，用一种AIV的抗原或抗血清就可对所有AIV 的抗体或抗原进行鉴定。免疫双向扩散及免疫电泳中以沉淀线判定可以定性，免疫单辐射扩散试验可以定量。

25 免疫荧光技术(IFT) 将抗原或抗体标记上荧光素，再进行抗原抗体反应。最早用于流感病毒是鉴定和定位病毒感染细胞异性的抗原、核蛋白(NP)或基质蛋白(MP)抗原。用NP抗原的荧光抗体染色，主要出现核内荧光；用MP抗原的荧光抗体主要出现胞质荧光，核内也可出现部分荧光。

26 酶联免疫吸附试验(ELISA) 运用ELISA原理建立的AIV检测方法较多，如用单克隆抗体介导的、经生物素一亲和素系统放大的H5亚型禽流感病毒捕获ELISA检测方法，为进一步研究检测试剂盒提供基础［4］。AIV抗体胶体金检测试纸条则是胶体金免疫层析分析法，用纯化病毒与胶体金颗粒偶联，吸附在玻璃纤维上制作而成，不需要其他试剂，一步完成，反应时间只需要几分钟(5～10min)，是一种检测微量AIV抗体快速、简便的方法［5］。郑其升等［6］用基因工程重组HA蛋白作为抗原建立了检测AIV 抗体的间接ELISA方法，可以检测H3、H5、H7、H9亚型血清，特异性高，与传统HI方法比较，符合率为 971%（774/807）。基于重组HA蛋白的间接ELISA方法可望用于AIV的保护性抗体水平检测。

3 单链构型多态性(SSCP)

作为检测基因变异的手段已得到广泛应用，其原理是单个核苷酸的置换引起DNA单链构象改变，在非变性电泳中足以导致泳动率变化。Quinto等［7］用高通量 SSCP 与限制性片段长度多性（RFLP）分析法对照，检测了近50株流感病毒的400多个基因片段，符合率为98%。

4 核酸扩增方法

41 RTPCR基于MP、NP 基因的高度保守区的引物，RTPCR可以鉴定AIV［810］。Lee等［9］在此基础上针对H1～H15又分别设计了15对HA基因的特异性引物，同时进行15管RTPCR，可以检测H1H15的HA亚型，该法所测80株病毒样品，与血清学方法符合率为100%。但单管单测，操作繁琐。Phipps等［11］建立了相对简便的RTPCR的AIV检测法，仅用一对引物扩增出H1～H15的HA2基因，产物由双脱氧核酸链中止法测序分析，盲测12株标准病毒和30株样品病毒，并与HI对照，完全相符。为提高扩增的灵敏度和特异性，也可采用巢式或半巢式RTPCR［8］。

42 多重RTPCR(mRTPCR)mRTRCR是在RTPCR基础之上实现单管多检的相对快速和经济的检测方法。 Malik等［12］建立的mRTPCR方法，检测3种不同的鸟类呼吸道病毒，与单管单检RTPCR方法结果完全相符。Yamada等［13］ 建立了包括5对引物的mRTPCR体系，可鉴别5种亚型AIV。BellauPujol等［14］运用多重半巢式RTPCR可以检测包括AIV的12种呼吸道RNA病毒，使检测范围进一步扩展，其203个样本与培养方法及直接免疫荧光法对照，综合敏感度为98%。

43 Realtime RTPCR(RRTPCR)运用特异性的荧光水解探针的RRTPCR方法可使检测时间缩短为4 h ［10，15］。Lee等［10］建立的检测H5、H7亚型AIV的RRTPCR方法，与传统的培养方法比较，并以EID50（50%鸡胚致病指数）为评价指标，呈正相关（r = 0972），T 检验无显著差别（P >021）。其重复性试验呈正相关（r = 0902），灵敏度H5为1 fg或 102 RNA拷贝，H7为10-1 fg或10 RNA拷贝，所测病毒浓度均低于1010 EID50，该灵敏度高于培养方法。

44 依赖核酸序列的扩增（NASBA）NASBA是一种快速、等温的RNA 扩增技术，整个反应有赖于AMV逆转录酶、T7 RNA 多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，是以转录为基础，单链核苷酸的连续扩增，其反应产物是单链RNA。扩增产物与磁珠上的捕捉探针及钌标记的电化学发光寡核苷酸探针杂交后，形成复合物，经NucliSens阅读器直接检测电化学发光强度［1617］。Collins等［16］检测了亚欧地区H5亚型AIV，同时还鉴别出高致病及低致病H5亚型。Lau 等［17］建立的NASBA技术可以检测H1～H15亚型的AIV，并能区分出H5及H7亚型，整个过程从核酸分离、扩增、检测在6 h 以内，灵敏度与鸡胚培养相当。

45 环介导的等温扩增（loopmediated isothermal amplification， LAMP）

Poon等［18］介绍了一种新的更加简便的扩增方法，即环介导的等温扩增，特异性地针对6个独立的结合位点设计两对引物扩增，以看家基因或外源性RNA分子作为阳性对照。由于反应中产生大量焦磷酸镁，可以肉眼判断结果，无需凝胶电泳。作者用该方法检测了SARS病毒后，又检测了H1～H3的AIV，与常规方法比较符合率为100%。

5 基因芯片

将RTPCR获得的cDNA固化于芯片，利用核酸探针技术构建的检测流感病毒A、B及其亚型的芯片平台， Cy3、Cy5标记的核酸探针与靶DNA杂交，可以进一步鉴别混合体系中扩增产物。Li等［19］用cDNA芯片及mRTPCR对流感病毒进行检测及分型，结果显示cDNA芯片为基于PCR的诊断技术提供了补充，因为基于PCR的方法，直接从DNA扩增片段大小不足以证明是目的产物。王秀荣等［20］依据M蛋白进行基因型别鉴定和HA基因亚型鉴定，用Cy5荧光标记，在基因芯片平台上构建检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒(AIV)的实验技术模型，检测AIV的cDNA，杂交达到预期结果。Kessler等［21］考虑到三维芯片潜在的优势（因其增加了几何面积，使反应效率提高，同时动态的流质也使杂交时间缩短），将芯片技术进一步改进，建立了检测流感病毒A、B的三维芯片平台，通过比较实验，选择了特异性强的随机 RTPCR 扩增方法，和低背景的化学发光检测方法，检测了AIV （H1N1、H1N2、H3N2、H5N1）和流感病毒B，特异性好，全部检测过程不超过5 h。

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病毒分离培养和血凝抑制试验经常作为评价新的检测 AIV方法的对照，但病毒分离培养耗时长，至少需7 d，不利于快速诊断，病毒分离的实验条件要求较高，同时有高致病性的危险，对毒株的检测及管理上要严格考虑生物安全措施。AIV在鸡胚培养过程中还可能发生发生变异［22］。血凝及血凝抑制试验特异性好，但其操作相对繁琐，同时必须具备一定血凝效价的标准病毒和新鲜制备的红细胞。血清学检查对最后确诊有回顾性诊断价值，一般只能在发病23周甚至更长时间才能有抗体阳性出现［17］。由于 AIV 血清型众多，新的变异株不断出现，制备血清型特异性单克隆抗体相对困难，且在各种免疫接种的情况下，血凝抑制试验等血清学诊断方法也会失去作用。核酸扩增技术（NAT）检测 AIV，选择好靶基因和引物及优化反应参数，均可获得高灵敏度和特异性［23］。对于血清型众多的 AIV，不同亚型致病性不同，宿主分布不同，故快速、特异地分型在 AIV 诊断中显得尤为重要，而当前的核酸扩增技术尚不能高通量地鉴别出所有 HA 或 NA 的已知亚型。RTPCR 方法能够获得所有 AIV 的已知 HA 亚型，但最终结果尚需借助测序方法［10］，不能作为常规检测手段。要实现高通量、大规模的检测，有望借助生物芯片这项技术。生物芯片正逐步应用于细菌及病毒的检测，它不仅能克服 PCR 扩增技术中难题，对 PCR 扩增技术还能起到补充作用［19］。目前人们针对病毒，甚至 AIV 检测芯片不断优化杂交条件；将核酸扩增产物片段化，以减少核酸二、三级结构效应对杂交的影响；以及对芯片载体结构和检测方法进行改进，都为建立快速、灵敏、特异的 AIV 检测方法提供平台［21］。

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第8篇：核酸检测方法范文

【关键词】 高效液相色谱法；氨茶碱；盐酸麻黄碱

复方氨茶碱口服液是以氨茶碱和盐酸麻黄碱为主要成分的复方制剂，用于治疗小儿喘息性支气管炎。2005版药典用紫外分光光度法测定氨茶碱含量［1］，用非水滴定法和紫外分光光度法测定盐酸麻黄碱含量［2］。已有文献报道氨茶碱和盐酸麻黄碱的高效液相色谱含量测定方法［35］，但同时测定两者含量的方法还未见报道。本文采用高效液相色谱法同时测定氨茶碱和盐酸麻黄碱的含量，该法简单、灵敏、准确。

1 仪器与试剂

Agilent 1100系列高效液相色谱仪，包括手动进样器、单元泵、二极管阵列检测器。Jasco V500 UV/Vis分光光度计，MTTLER TOLEDO AL104电子天平，MTTLER TOLEDO 320 pH计。

氨茶碱和盐酸麻黄碱对照品（浙江省药品检验所），复方氨茶碱口服液（批准文号：浙药制20050201，浙江大学附属儿童医院制剂室自制，批号：20060330，20060807，20061123）。乙腈为色谱纯（TEDIA公司），磷酸二氢钾为分析纯（上海试剂二厂）。水为超纯水，电阻率≥18.2 MΩ·cm。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SBC18 (250 mm × 4.6 mm，

5 μm)；流动相：乙腈磷酸二氢钾缓冲液(pH 4.5)（10∶90，V/V）；检测波长：214 nm；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；柱温：室温。

2.2 对照品溶液的配制

精密称取氨茶碱对照品100 mg和盐酸麻黄碱对照品10 mg，分别置于100 mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀即得浓度为1 mg/mL和0.10 mg/mL的储备液，备用。

2.3 样品溶液的配制

精密量取复方氨茶碱口服液10 mL，置于50 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。用0.45 μm微孔滤膜过滤。精密量取续滤液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

3 结果

3.1 色谱图

氨茶碱和盐酸麻黄碱的检测限分别为10、30 ng/mL（S/N=3）， 定量限分别为30、100 ng/mL（S/N=10），保留时间为9.4 min、11.4 min，氨茶碱和盐酸麻黄碱分离度R=4.8，理论塔板数均大于8 000，符合测定要求，辅料对氨茶碱和盐酸麻黄碱均无干扰，色谱图见图1。

3.2 标准曲线制备

精密移取上述对照品储备液各0.2、0.5、1.0、2.0、

5.0 mL置于10 mL容量瓶中，混合、加水稀释至刻度，摇匀，即得氨茶碱和盐酸麻黄碱浓度分别为20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 μg/mL和2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的混合溶液，按上述色谱条件进样。以峰面积A对药物浓度C（μg/mL）进行线性回归，求得氨茶碱的标准曲线（n=5）为：A=76.85C104.530，r=0.9999， 氨茶碱在20.0～500.0 μg/mL浓度范围呈现良好的线性关系；盐酸麻黄碱的标准曲线（n=5）为：A=38.71C8.203，r=0.9999，盐酸麻黄碱在2.0～50.0 μg/mL浓度范围呈现良好的线性关系。

3.3 精密度试验

精密量取对照品储备液分别配制成含氨茶碱和盐酸麻黄碱浓度为20.0、100.0、500.0 μg/mL和2.0、10.0、50.0 μg/mL对照品溶液，一天内连续进样5次，计算日内精密度，氨茶碱和盐酸麻黄碱的RSD在高、中、低三个浓度分别为0.68%、0.71%、1.06%和0.70%、

1.28%、1.66%，符合精密度要求。

3.4 稳定性试验

按“2.3”项配制样品溶液，间隔24 h、48 h、72 h在相同的实验条件下进样，氨茶碱和盐酸麻黄碱的峰面积基本没有变化（氨茶碱RSD

3.5 回收率试验

按复方氨茶碱口服液处方配制不含主药的空白溶液，精密称取一定量的氨茶碱和盐酸麻黄碱对照品，制成高、中、低三种浓度溶液（分别相当于标示量的120%、100%、80%）。按“2.3”项下方法处理，按“2.1”项下方法分别测定，代入标准曲线，所得结果与加入量比较得氨茶碱和盐酸麻黄碱的平均回收率分别为99.7%、100.1%，RSD分别为0.58%（n=9）、1.31%(n=9)。

3.6 样品测定

按上述色谱条件进样20 μL，记录色谱峰面积，代入标准曲线，计算，结果见表1。表1 样品含量测定结果（略）

4 讨论

通过紫外扫描氨茶碱和盐酸麻黄碱的水溶液(见图2)发现，氨茶碱的最大吸收波长在275 nm附近，在214 nm处的吸收也很强，而盐酸麻黄碱在275 nm波长附近处吸收很弱，在214 nm附近吸收较强。因此，本文选用214 nm作为同时测定两者含量的检测波长，可以获得较高的灵敏度。流动相选用乙腈磷酸二氢钾缓冲液(pH 4.5)（10∶90， V/V）使两组分的分离效果更好，有利于含量测定。

本法快速、灵敏、准确，能同时测定氨茶碱和盐酸麻黄碱的含量，可用于复方氨茶碱口服液的质量控制。

【参考文献】

［1］中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 2005年版. 北京: 化学工业出版社， 2005: 617.

［2］中华人民共和国药典委员会. 中华人民共和国药典(二部)［S］. 2005年版. 北京: 化学工业出版社， 2005: 568.

［3］赵 丽， 王 卓， 杨樟卫， 等. HPLC法同时测定输液中加替沙星和氨茶碱的含量及其应用［J］. 药学服，务与研究. 2004， 4(2): 160162.

第9篇：核酸检测方法范文

[关键词] 沙眼衣原体；SAT； PCR；培养；尿液

[中图分类号] R374.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2011）22-124-02

Real-time Fluorescence Detection of Nucleic Acid Amplification Constant Urine Analysis of Chlamydia Trachomatis

SUN Yuhua CHEN Feng CAI Ruiyun

Guangji Hospital in Dongguan City of Guangdong Province，Dongguan 523690，China

[Abstract] Objective To evaluate the real-time isothermal nucleic acid amplification fluorescence（SAT） Chlamydia trachomatis in urine（CT） of the specificity and sensitivity. Methods 175 cases of suspected patients of genital swab line CT-SAT，PCR testing and Chlamydia trachomatis culture，while the corresponding urine specimens of 175 CT-SAT test. Results SAT on the same source swab specimens and urine samples consistent results：Case of SAT-positive and N.gonorrhoeae culture-negative，2 SAT-negative and PCR positive. Conclusion SAT swabs and urine detection of Chlamydia trachomatis with high sensitivity and specificity of laboratory diagnosis for the CT to provide a new detection method.

[Key words] Chlamydia trachomatis； SAT； PCR； Culture；Urine

实时荧光核酸恒温扩增检测技术（simultaneous amplification and testing，SAT）是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，该技术具有高灵敏度、高特异性、低污染、反应稳定等优点。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

CT-SAT试剂盒由上海仁度生物科技有限公司提供，PCR试剂盒由深圳匹基生物工程有限公司提供，沙眼衣原体培养使用Mc Coy培养皿，实时荧光核酸扩增仪为杭州博日科技有限公司生产。

1.2 标本来源

2009年9月～2010年7月来本院就诊的疑似患者175例，其中男62例，女113例，每份患者取3份分泌物拭子标本和1份尿液标本。

1.3 标本采集

准备3个无菌拭子，分别以A、B、C标示。B号拭子的管内加入1mL无菌生理盐水，C号拭子的管内加入1.5mL无菌生理盐水。患者采样前2h不排尿，取材方法按常规操作[1]。即男性患者由尿道口内3cm处、女性患者由宫颈口内1～1.5cm处取材。棉拭插至取材处后，转动并停留数秒种后取出。A拭子用于淋球菌培养，1h内尽快接种。B拭子取后-20℃冰箱保存，作PCR测定待用。C拭子取后取1mL混合液至专用尿液保存液（试剂盒提供）中，混匀，-20℃冰箱保存，作CT- SAT测定待用。另取1mL首段尿液至专用尿液保存液（试剂盒提供）中混匀，-20℃冰箱保存，用于CT-SAT测定待用。

1.4 检测方法

尿液标本和拭子标本从冰箱取出，平衡至室温同时行CT-SAT检测，按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 沙眼衣原体培养

见参考文献[1]。

1.6 统计学分析

应用SPSS10.0软件对数据进行χ2检验。

2 结果

2.1 SAT、PCR及沙眼衣原体培养的检测

SAT检测的阳性63例尿液标本其对应的63例拭子标本SAT检测也是阳性，符合率100%，1例沙眼衣原体培养阴性而SAT阳性，2例PCR阳性而SAT阴性。尿液标本不适用于PCR和沙眼衣原体培养，故均以拭子结果为参照[4]。见表1。

2.2 CT-SAT检测的敏感性及特异性

与沙眼衣原体培养结果作比较，CT-SAT尿液/拭子标本的检测灵敏度为98.41%（62/63），特异性为99.11%（112/113），经χ2检验，差异无显著性（χ2=0.01，P＞0.05）；与PCR结果作对比，CT-SAT尿液/拭子标本的检测灵敏度为100%（63/63），特异性为98.21%（110/112），经χ2检验，差异无显著性（χ2=0.05，P＞0.05）。见表1。

2.3 CT-SAT法对拭子标本和尿液标本检测结果的符合率分析

CT-SAT法对175例患者的拭子标本和尿液标本进行检测，两组标本检测结果的符合率为100%，差异无显著性（P＞0.05）。

3 讨论

目前CT检测都是以患者的泌尿生殖道分泌物进行沙眼衣原体抗原检测、沙眼衣原体培养和/或PCR检测。取生殖道分泌物容易增加患者的取样痛苦，同时几种检测方法在敏感性和特异性上都有不足。沙眼衣原体抗原检测多用胶体金试剂，阳性率都较低容易造成女性患者尿道感染的漏检。沙眼衣原体培养的敏感性和特异性都较好，但是耗时长。PCR检测的是DNA，患者治疗后病灶处残留的DNA包括杀死后还没排出的菌体DNA都会导致PCR阳性结果。病人经治疗后病菌死亡、症状消失即可判为治愈，如果要等PCR转阴，势必造成过度治疗[2]。本研究中有2例PCR阳性而CT-SAT及沙眼衣原体培养均阴性就是这种情况。CT-SAT检测病原菌体RNA，RNA在死亡的病原体中快速降解，活菌中才有完整的RN段，故能排除患者治疗后病灶处的残留物对检测结果的影响，有利于临床用药后的疗效监测及判愈。在175例标本中1例CT-SAT阳性，而沙眼衣原体培养阴性，可能是沙眼衣原体培养敏感性不足的原因，此例标本经PCR实验后得到验证，也证明了CT-SAT的高灵敏度。而且CT-SAT可以对尿液标本进行检测，尿液作为一种非侵入性的取样标本，取样方便，减少了患者采样的痛苦，也减少了医生的工作量[3]。RNA在环境中极不稳定，容易降解，大大降低了交叉污染概率及环境污染[4]。

本研究显示，利用SAT技术检测沙眼衣原体，不仅特异性好，灵敏度高，可用于临床用药后的疗效监测及判愈，而且尿液标本可以代替拭子标本。在临床应用中表现出采样方便、耗时短、低污染、结果准确可靠等优点，为沙眼衣原体的实验室诊断提供新的采样方式和检测方法[5]，是一种值得推广的检测方法。

[参考文献]

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[2]叶顺章，王千秋，王荷英，等. PCR检验技术在性病临床标本实验诊断中应用价值的研究[J].中国皮肤性病学杂志，2002，16（1）：6-8.

[3] 王彬.泌尿生殖道支原体感染的特征及药敏结果分析[J].中国当代医药，2010，17（4）：123-124.

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