核磁共振波谱法的基本原理精选(九篇)

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第1篇：核磁共振波谱法的基本原理范文

摘要：

本文对荚膜多糖进行了概述，综述近年来细菌荚膜多糖相关的研究进展，并从理化性质与生物学功能的角度出发，总结了近年来荚膜多糖提取、分离、纯化等方面的研究，重点介绍了与荚膜多糖结构相关的研究进展。本文为进一步研究细菌致病性、分型机制提供必要的方法，为疫苗的设计提供基础数据，对加强致病菌的防控具有重要意义。

关键词：

荚膜多糖；提取；分离；纯化；理化性质

荚膜多糖是细菌细胞壁外层的胶状物质，具有抗原性和特异性，可用于细菌鉴定［1］，是细菌重要的毒力因子［2］。荚膜多糖是一种分子量大、极性大的物质，对其进行分离纯化和结构解析要比单糖和寡糖更加复杂。很多细菌的表面都具有荚膜，例如肺炎链球菌，B群链球菌，猪链球菌等［3］。有报道认为荚膜的存在与细菌耐药性呈正相关，一旦感染则发病率和死亡率都很高［4］。为进一步了解细菌的致病机制，设计及研制更加有效的疫苗，研究细菌荚膜多糖的结构日益引起了国内外学者的重视。本文主要针对荚膜多糖的分离纯化和结构解析的最新研究进展进行综述。

1细菌荚膜多糖的概述

荚膜是某些细菌表面的特殊结构，是一层位于细胞壁表面的松散的粘液物质，荚膜的成分因菌种不同而异，主要是由糖与糖醛酸组成的聚合物，如猪链球菌的荚膜多糖。也有部分细菌的荚膜多糖含有多肽及脂质，如炭疽杆菌［5］。细菌荚膜具有抗原性，可用于细菌的鉴定［1］。细菌鉴定的前提是对细菌进行科学的分型，目前对于细菌分型主要有两大分型系统，即血清型分型系统和基因分型系统。血清型分型系统主要依据荚膜多糖和脂多糖不同的抗原性对细菌进行区分。基因分型系统主要依据毒力因子，与免疫相关的因子等因素为主，将具有相同致病机制的细菌分为一类［6］。荚膜多糖作为细菌的毒力因子，其与细菌的血清型有密切关系。不同血清型的细菌会产生不同的毒力因子，对宿主造成不同的影响，而不同的毒力因子是通过不同的基因进行编码的，因此，毒力因子与血清型之间存在着密不可分的关系。由于荚膜位于细菌最外部，是细菌感染宿主时最先接触的物质，所以多为细菌主要的毒力因子［2］。荚膜多糖作为毒力因子，在细菌抵抗免疫系统中吞噬细胞吞噬过程中担任着重要角色［7］。以猪链球菌为例，猪链球菌2型的荚膜多糖主要由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N2－乙酰半乳糖胺和唾液酸这5种单糖组成，其糖蛋白是由231个氨基酸残基组成，由位于基因组3846～4541bp之间的一段长696bp基因序列编码［8］。荚膜多糖的存在降低了猪链球菌被吞噬细胞吞噬的程度，而无荚膜的突变株容易被吞噬。荚膜的厚度越大越有利于抵抗猪多形核白细胞的吞噬［9］。实验表明，由于荚膜多糖的存在，使猪链球菌2型能够抵抗巨噬细胞的吞噬，并且使被吞噬的细菌可以在巨噬细胞中存活至少3h［10］。Gottschalk和Segura在2000年提出“特洛伊木马”模型，即猪链球菌黏附在免疫细胞上，特别是单核细胞，随着单核细胞通过血脑屏障［11］，这就是荚膜多糖发挥抗吞噬能力的机制。荚膜多糖作为毒力因子，致病机理就在于抗吞噬能力，黏附能力和维持细菌在细胞内部存活的能力。

2细菌荚膜多糖的理化特征

从化学组成上来说，大部分的细菌荚膜多糖是以2种或以上的单糖（如D－葡萄糖，D－半乳糖，L－鼠李糖等）及其他物质（如磷酸根，唾液酸等）为重复单元，聚合形成的大分子物质。大多数细菌的荚膜多糖为酸性黏多糖，属于杂多糖类。有文献报道b型流感嗜血杆菌荚膜多糖的主要成分是多聚核糖基核糖醇磷酸盐［12］。还有一部分细菌荚膜多糖是有乙酰化的多糖组成［13］。A群脑膜炎奈瑟菌荚膜多糖，其主要结构是多聚磷酸乙酰氨基吡喃型甘露糖，乙酰基结构是该菌最重要的免疫原性表位［14］。从化学结构上来说，荚膜多糖通过各种作用力，如分子间氢键或者其他非共价键，与细胞壁之间形成了比较强韧的外膜，黏附在细菌的表面。荚膜多糖是由重复的单糖通过糖苷键连接形成聚合物，由于单糖种类不同，连接方式不同，多糖结构中是否存在支链，有机或者无机分子等因素导致荚膜结构解析存在巨大的复杂性［15］。正是因为其分子组成复杂性和构型多样性，科研人员以此作为细菌血清学分型的基础，即根据细菌荚膜多糖的抗原性的异同对细菌进行分型。肺炎双球菌，根据其荚膜多糖的抗原性，迄今为止，可分为96种血清型，而其中有30多种血清型有致病性。大肠杆菌，据文献报道，已经发现超过90种血清型，其中有少数是具有侵袭感染能力的，而在可以引发新生儿脑膜炎的这类大肠杆菌具有相同的多糖链，只是多糖的不同修饰导致它们之间存在差异［16］。

3细菌荚膜多糖的功能

荚膜由于其具有耐干燥，黏附，储存养分等功能，成为致病性细菌的一种重要的毒力因子。细菌荚膜中水分占到95％以上，含有大量水分的荚膜在细菌的表面，可以避免细菌脱水死亡，这就使得有荚膜的细菌更容易在宿主间相互传播［17］。荚膜多糖还能够促进细菌与细菌或者细胞之间的黏附，从而促进生物膜的形成和在不同的生存环境中的定植［18］。例如，能够引起龋齿的唾液链球菌和变异链球菌会分泌己糖基转移酶，使口腔中的蔗糖转变成果聚糖，这种果聚糖能使细菌牢牢黏附于牙齿表面，而细菌发酵糖类产生的乳酸在局部积累后，会使牙齿表面的珐琅质层发生腐蚀而引起龋齿［19］。某些细菌的荚膜还是储存养分的场所，以备细菌处于营养缺乏时可以利用，如黄色杆菌的荚膜。而猪链球菌的荚膜除上述作用外，最重要的作用是抗吞噬作用，由于它的存在大大降低了猪链球菌被吞噬的程度，而荚膜厚度的增加也会使猪链球菌抗白细胞杀伤能力［20］。

4细菌荚膜多糖的分离纯化

荚膜多糖的提取分离一般分以下几个步骤：去菌体，粗提总糖，去除蛋白质和核酸，分级分离［21－22］。

4．1去除菌体和总糖粗提取在提取多糖之前，首先需要去除菌体。目前，去除菌体提取总糖的方法主要有离心法，酶解法，巴氏灭菌法［23］等。离心法，将灭菌过的培养液通过离心机离心，然后收集上层清液的方法除去菌体。但是该方法去除菌体的效果差，离心的效果依赖于高效能的离心设备。对于含有唾液酸等不稳定结构的荚膜多糖，最常用的方法是酶解法，即细菌培养液离心得到菌体，然后将菌体分散在缓冲液中，再加入不同的酶，酶解菌体，最后再次离心使菌体碎片和荚膜多糖分离，取上层清液［24］。用溶菌酶来裂解菌体，从而可以避免破坏荚膜多糖。酶解法的成本较高，但是专一性强，去除菌体的效果较好。中国海洋大学的赵峡课题组通过将菌体分散在甘氨酸缓冲液中，然后加入溶菌酶裂解消化的方法去除猪链球菌菌体，从而得到荚膜多糖［25］。巴氏灭菌法，通过对菌液进行加热灭菌，随着温度的提高，多糖的溶解度逐步提高，有利于后续的离心。巴氏灭菌法便于操作，去除菌体效果较好，过程中要注意温度，温度过高会导致多糖分解。在2013年Gottschalk课题组发表的文章中，通过此方法，在121℃加热菌液75min来达到去除菌体的目的，从而得到14型猪链球菌的荚膜多糖［26］。

4．2去除蛋白质和核酸由于一些细菌的荚膜多糖结构复杂且稳定性较差，所以在纯化过程中要注意方法的选择。有机溶剂多级沉淀法由于其操作简单并且对操作人员的良好性被广泛使用［27］。有机试剂引起多糖、蛋白等物质沉淀的原因是加入有机试剂使水溶液的介电常数降低，从而增加了具有相反电荷的基团之间的吸引力，促使分子聚集而沉淀，此类现象类似盐析。但是利用该法沉淀荚膜多糖的同时也会导致核酸和蛋白的沉淀，为避免多糖中混合核酸和蛋白，可以在溶液中加入阳离子，例如CaCl2，NaCl，利用阳离子和带负电的基团结合，降低多聚核苷酸链之间的排斥作用，从而去除核酸和蛋白，或者通过加入酶，将蛋白质去除，得到荚膜多糖的沉淀［28］。

4．3分级分离根据荚膜多糖的理化性质对其进行分级分离，荚膜多糖是一种极性很大，分子量之间存在较大差异的物质。所以可以通过体积排阻色谱技术进行分离纯化，其中凝胶层析技术运用最为成熟，且效果最佳［29］。荚膜多糖除了可以根据分子量差异进行分离纯化，在其组成中有磷酸基或者乙酰基，这些基团可以使荚膜多糖具有不同的电荷性质和pH值，根据此类理化性质可以采用离子交换技术对其进行分离纯化［30］。进一步的纯化还可以采用超滤法，这是一种用于分子分离的膜分离技术，操作简便，无需添加化学试剂［31］。可以根据待分离的物质的性质选择不同规格的超滤膜。

4．3．1凝胶色谱法凝胶色谱法是一种简单而快速的分离技术，对高分子物质有较好的分离能力。分离的基本原理是分子筛效应。根据凝胶的种类和性质不同，分为交联葡聚糖凝胶（sephadex），琼脂糖凝胶（sepharose）［32］，丙烯葡聚糖凝胶（sepharcryl）等。根据多糖的性质和分子量范围选择适合的凝胶种类和型号。CristinaDeCastro课题组于2008年发表的文章中，采用sepharcrylS－500HR凝胶柱成功地从Rhizobiumrubi分离纯化出一种新的荚膜多糖［33］。在2010年Gottschalk课题组通过乙醇沉淀法提取2型猪链球菌的荚膜多糖，然后通过使用sepharcrylS－400HR凝胶装柱，对粗多糖进行分离纯化，然后运用GC－MS技术得到2型猪链球菌荚膜多糖的单糖组成，结合质谱，核磁共振，以及相关化学反应，确定了2型猪链球菌荚膜多糖的结构［28］。该课题组在2013年又得到了14型猪链球菌荚膜多糖的结构［26］。

4．3．2离子交换色谱法离子交换色谱的基本原理是根据物质的酸碱性，极性的不同极性分离。运用离子交换色谱技术分离糖类，可以有效地去除酸碱成分和无机离子，从而得到糖和糖苷［30］。但是对于带有唾液酸的多糖样品，不宜使用强阴离子交换，唾液酸会发生严重脱离［34］。

5荚膜多糖的结构解析

荚膜多糖由于极性大，分子量高，结构复杂，多以复合物存在等原因，增加了结构解析的难度。分离纯化度高会增大结构解析的成功率和准确性。结构解析一般分为以下几个步骤，单糖组成分析，分子量确定［35］，糖残基连接位置和顺序、构型、分支点结构分析［36］。单糖组成分析方面，主要技术有高效液相色谱［37］，气相色谱质谱联用技术［38］，离子色谱技术［39］等。由于糖类物质没有紫外吸收，可以通过柱前衍生化使其结合上有光学活性的基团，1－苯基－3－甲基－5－吡唑啉酮（PMP）是目前最常用的衍生化试剂，该反应条件温和，操作简便，衍生化效率高，适合复杂样品的单糖组成［40］。中国海洋大学的赵峡课题组在2014年发表的文章中，使用PMP做柱前衍生化，成功得到猪链球菌4种血清型的单糖组成及其摩尔比例［25］。离子色谱技术在近些年逐渐被运用在糖化学研究中，2013年FionaL．Lin课题组通过运用离子色谱技术，准确的分析出肺炎链球菌33C和33D血清型的单糖组成［41］。糖残基连接位置和顺序方面，当前常见的分析手段有气相色谱质谱联用技术。通过对多糖依次进行甲基化反应，水解反应，还原反应和乙酰化反应，然后运用气相色谱质谱联用技术对糖残基连接位置和顺序进行确定。核磁共振技术为糖类物质的结构解析起推动作用，通过核磁共振图谱分析可以推测出糖类物质中碳链的连接位置，构型等信息［42］，还可以进行样品检定［43］。BentO．Petersen课题组在2013年通过核磁共振技术成功解析了肺炎链球菌47A血清型的结构［44］。在2010年Gottschalk课题组运用GC－MS技术得到2型猪链球菌荚膜多糖的单糖组成，结合质谱，核磁共振，以及相关化学反应，确定了2型猪链球菌荚膜多糖的结构［28］。该课题组在2013年又得到了14型猪链球菌荚膜多糖的结构［26］。荚膜多糖的结构解析需要诸多分析技术的结合，谱图解析工作难度仍然很大。

6多糖合成的相关基因和途径

荚膜多糖合成的相关基因主要包含3种，即荚膜多糖合成调节基因，糖基转移酶基因和转运基因。以肺炎链球菌为例，其90个血清型的荚膜多糖合成的相关基因簇已经被测序并分析。除去3型和37型以外，其余的血清型的荚膜多糖合成的相关基因簇均位于染色体上dexB和aliA之间的一个完整的转录单位，具有位于上游位置高度保守的4个合成调节基因（cpsABCD），基因簇内包含多种糖基转移酶，多糖合成酶，乙酰基转移酶和翻转酶等［15］。糖基转移酶（GT）作为多糖生物合成的主要酶之一。多糖结构的多样性取决于催化反应中的GT。GT催化转糖基反应，即催化一个糖基供体上的糖残基转移到另一个受体上。糖基供体为糖核苷酸，而糖基受体可以是单糖、寡糖、多糖、多肽、蛋白质等物质［45］。根据糖基供体和生成的糖苷键的立体构型，GT分为保留型和反转型［46］。由于GT的不同作用的结果，使多糖结构从组成到构型都存在巨大的多样性。从基因研究角度，表明细菌多糖的生物合成途径分为3种，wzy－依赖途径，ABC转运体－依赖途径和合酶－依赖途径［47］。以生物合成分为3个步骤，起始－延伸－连接终止。以上3种合成途径主要根据延伸步骤进行划分。基因调控酶进行多糖的生物合成。从多糖的多样性，到多糖的合成调控，现阶段仍暗含着尚不明确的步骤，有待进一步的研究。

7展望

荚膜多糖作为细菌的主要毒力因子，在研制疫苗方面有重要作用。肺炎链球菌23型多糖疫苗于1983年在美国批准并开始使用，在使用的过程中问题也随之发生，该疫苗对成年人的效果较好，但是对婴幼儿效果不好［48］。这使人们对荚膜多糖制备的疫苗有了新的思考。细菌荚膜多糖作为主要的毒力因子，研究人员对其结构组成，功能及基因已越来越重视［49］。高效地分离纯化荚膜多糖对其结构解析至关重要，不断改进原有分离技术和开发新型分离技术要齐头并进，从而得到纯化度更高的多糖样品，增加结构解析的准确性。随着对荚膜多糖研究的深入，进一步解析荚膜多糖结构以及合成基因与调节机制等方面［50］，会对荚膜多糖在疫苗研制和疾病治疗中的作用有更加清晰的认识。在此基础上，通过生物工程手段对细菌进行改造，使细菌的荚膜多糖向着有利于人类生存和应用的方向发展。

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