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8月27日,来自北京中关村生物医药园的孵化企业――北京弘润天源生物技术股份有限公司(下称“弘天生物”,832979.OC)正式登陆新三板,也使其成为国内细胞生物研究领域为数不多的上市公司之一。
在此前的8月21日,国家卫计委、国家食药监总局联合了我国首个《干细胞临床研究管理办法(试行)》,旨在规范干细胞临床研究行为,以期借此保障受试者权益并促进干细胞研究健康发展。此政策也被视作细胞研究大发展的“信号弹”。
4000 亿美元市场的吸引力
“细胞生物研究与储存在医学研究及治疗、医疗美容、转化医学方面都极为重要,这也是公司多年来投身该行业的原因。上市后,公司将在北京两大研发中心的基础上进一步在全国设立样本分库。” 弘天生物董事长王安祥接受《中国经济周刊》记者采访时表示。
王安祥介绍说,干细胞主要有两个特征:一是自我复制能力,即“一个变成两个完全一样的细胞”;另一个是多向分化,干细胞应用最常见的是细胞替换,比如说白血病患者做造血干细胞移植,等于换了正常的干细胞。干细胞还有特殊的营养因子,可以修复各个器官的损伤。
根据《2010年干细胞年鉴》,干细胞市场规模每年平均以34%复合增长率增长,未来 20 年内,干细胞全球市场规模有望达到 4000 亿美元。因此,干细胞市场被各路资本所青睐,“钱”景广阔,世界医药巨头纷纷布局干细胞产业。
业内人士认为,在医药行业中,干细胞作为新兴前沿领域,市场空间广阔,同时有望迎来政策激励。而细胞存储又被誉为“细胞银行”,是细胞治疗行业最基础、最前端的业务,前景广阔,谁先布局谁就将抢占行业资源先机。在细胞行业内也有不少企业都在向细胞存储业务延伸。
据不完全统计,目前国内共有200余家企业从事细胞治疗技术研发,这其中也包括上市公司如香雪制药(300147.SZ)、开能环保(300272.SZ)等,但布局都还停留在初期。
2004年开始,弘天生物与美国密歇根大学、北京大学的一些顶尖科学家搭建专业技术团队,2009年成立专业公司开始启用GMP(药品生产质量管理规范)研发实验室并做市场运作。在2013年获批国家高新技术企业后不久,弘天生物完成了增资扩股。
“细胞存储之所以被称为‘细胞银行’,是因为它是细胞治疗行业的最基础、最前端的业务,普通消费者将健康的细胞提取储存后,可至少保存20年的有效性,一旦未来有重大疾病治疗、预防性医学干预和抗衰老使用的需求,就能再度以细胞基因工程改造等先进技术进行使用。使用自己的健康细胞几乎不存在排异的情况,具有较高安全性。” 王安祥对《中国经济周刊》记者表示。
目前,弘天生物斥资5亿元在北京大兴建立细胞存储基地,一期已经完成并投入使用,库容可达32万份。
试水者或将大打市场战?
事实上,我国对干细胞技术的研究工作早有所部署,比如973、863等国家科技计划涉及了干细胞项目,在科技部“十二五”专项规划中,以干细胞技术为核心的再生医学还被称为“继药物治疗和手术治疗之后的一个医疗革命”,其被认可和重视的程度可见一斑。
“弘天生物所在的细胞生物领域对于技术研发非常倚重,而这类企业往往需要在资金投入、技术储备和市场推广方面三管齐下。在大型竞争对手纷纷登陆资本市场之后,获得资金补充的弘天生物可能将大打市场战。”银河证券一位内部人士对《中国经济周刊》记者表示。
事实上,干细胞研究需要大量资金且研究时间很长,即使取得成果,也并不一定能获得巨额利润。例如世界上首个干细胞治疗药物美国哥伦比亚奥西里斯诊疗公司(Osiris)的干细胞产品Prochymal,该产品上市后销售情况一般,公司于2013年10月将该产品以1亿美元出售给Mesoblast公司。
再加上干细胞产业极其“个体化”,不管是做基因检测、基因治疗,还是细胞治疗、免疫治疗或组织工程,都需要以自己的细胞、组织为原料,与传统医药工业的批量化模式有很大的区别,需要全新的基础设施和商业模式。
很多企业巨资投入后最终输出的产品分别面向两块完全不同的市场,在生物科技行业极为火热的CRO(向药企提供新药临床研究服务)与转化医学领域。包括无锡药明康德、博济医药等一众本土企业均以上述两项作为业务核心,弘天生物也不例外。
乳腺癌是一种全身性疾病,导致死亡的主要原因是远处转移,尤以脑、肺、骨转移多见。传统乳腺癌的治疗以手术为主,配合放化疗及内分泌治疗等。手术只能切除看得见的病灶,对于残存在血液和淋巴系统中的癌细胞却无能为力,因此存在复发和转移的风险。放化疗在杀伤肿瘤细胞的同时也可杀死正常细胞,造成患者骨髓抑制、免疫力低下,同时肿瘤细胞对放化疗耐受。尤其是老年患者身体比较虚弱,常常不能承受放化疗所带来的痛苦。内分泌治疗仅对部分激素受体阳性的病人有一定效果,限制了其在临床中的应用。
目前,针对乳腺癌患者的生物免疫治疗联合手术及放化疗,已成为标准的综合治疗模式。生物免疫疗法是运用生物技术从病人体内采集免疫细胞,进行体外培养和扩增,然后回输到病人体内,以此来调动人体的免疫系统或扩增人体自身的抗肿瘤因子,从而实现控制肿瘤细胞生长、浸润转移的目的。该方法已成为继手术、放疗、化疗之后的第四大肿瘤治疗模式,并因其安全、有效、毒副作用小等优点,被认为是目前肿瘤综合治疗模式中最活跃、最有前途的手段。肿瘤生物治疗主要包括细胞因子治疗、自体免疫细胞治疗、单克隆抗体治疗、癌疫苗治疗、基因治疗、抗血管生成治疗等。目前临床应用最多的是自体免疫细胞治疗技术,如“DC+CIK生物治疗”技术:通过采集患者外周血中单个核细胞进行体外增殖培养,以获取成熟的具有肿瘤细胞识别能力的DC细胞和数量更多、更具活性和杀伤力的CIK细胞,并将这两种细胞分两次回输到患者体内,用它们来对肿瘤细胞进行特异性杀伤,就像导弹精确打击一样击中肿瘤细胞。
生物免疫治疗安全且毒副作用小,对乳腺癌患者具有明显的优势。
对于没有机会手术和复发转移的晚期乳腺癌病人,通过大量的自体免疫细胞移植,不但能迅速缓解肿瘤晚期的“恶液质”,而且还能提高生活质量(增加食欲、改善睡眠、增强体质等),延长生存期。
有效清除术后残余的癌细胞及微小病灶,预防乳腺癌复发转移。
与放化疗联合使用,能降低放化疗的毒副作用和感染率,提高放化疗的疗效。
安全,无痛苦且毒副作用小。其副作用主要表现是发热,往往出现在注射后4~6小时,患者体温38~39度,持续约两个小时后可自行消退。一般情况下患者均能耐受,不需要特殊处理,对体质虚弱、无法进行放化疗的晚期患者依然适用。
可有效提高乳腺癌患者对放化疗的耐受能力,消除放化疗带来的毒副作用,恢复机体免疫功能,提高生存率,延长生存期。
由于生物免疫疗法的目的是提高患者自身的抗癌能力,因此,从根本上控制了肿瘤的生长,使肿瘤与机体处于一个平衡的状态,可使患者带瘤生存。
急性肝衰竭因肝功能严重受损,导致毒性物质堆积、生理功能紊乱,预后凶险。虽然内科综合治疗近年来取得了不少进展,但病死率仍高达60%~80%。肝移植是目前治疗肝衰竭惟一有效手段。但是由于个体病情和供体缺乏限制了临床使用。人工肝支持系统的研究基于肝细胞强大的再生能力,通过体外机械、理化装置清除体内各种有害物质,代偿肝脏代谢功能,使肝细胞得以再生直至自体肝脏恢复或等待机会进行肝移植,是目前治疗肝衰竭的重要方法之一。由于人工肝以体外支持和功能替代为主,只能取代肝脏的部分功能,因此又被称为人工肝支持系统(ALSS),简称人工肝。近年来人工肝支持系统,基本形成非生物型人工肝(NBAL)、生物型人工肝(BAL)、混合型生物人工肝(HBALSS)等三大类十几种方法。文章着重对各型人工肝的应用简要综述,并对其发展前景和存在问题进行探讨。
非生物型人工肝
非生物型人工肝以血液透析、血液滤过、血液灌流、血浆置换、连续性血液净化等血液净化技术清除体内毒性物质,维持人体内环境稳定的技术方法。早期非生物型人工肝装置的设计以小分子毒物血液解毒功能为主。到20世纪70年代,随着膜材料与膜技术的发展,血液净化治疗肝病的疗效有所提高。
血浆置换是国内应用最多最广泛的非生物人工肝治疗方法,它依靠血浆交换、交换输血技术,祛除毒性物质、补充生物活性物质。传统的血浆分离器的孔径为0.2~0.6μm,基本上所有的血浆物质都可以透过,在清除毒物的同时丢弃了大量对人体有益的生物活性物质[1]。浙江大学医学院附属第一医院应用小孔径血浆置换器EC-4A治疗重型肝炎患者,和传统的血浆分离器PS-06比较,能保留一部分大分子物质,减少了血浆的用量(EC-4A为2500ml,传统的血浆分离器PS-06为3000ml)。初步结果显示小孔径血浆分离器比传统的血浆分离器更适合应用于血浆置换,维持血流动力稳定,提高疗效[2]。
近年来连续性血液净化技术,以缓慢的血流速度持续稳定进行溶质交换和水分清除,具有血流动力学稳定、有效地祛除细胞因子及炎性介质,可提供充分的营养支持、改善组织氧代谢、持续维持内环境稳定等优点。对于重症肝病患者,尤其是血流动力学不稳定和严重高分解代谢的患者,提供了有效地治疗手段。基于上述原理近年国外研制了一些系统治疗肝衰竭。①分子吸附再循环系统(MARs):该系统是1993年德国研制的非生物型人工肝系统,基于双面嵌入白蛋白的特殊膜对血液进行透析,血液中分子量<50000D的中、小分子能够跨膜弥散,膜上的白蛋白的游离位点通过与血浆白蛋白竞争结合亲脂性毒素将白蛋白结合毒素吸附摄取到膜的另一侧,然后依浓度梯度与白蛋白透析液中的白蛋白重新配位结合,同时将毒素转运。白蛋白透析液净化后可循环利用[3]。MARS是非常高效的解毒系统,可部分清除芳香族氨基酸和大量清除白蛋白结合毒素,而机体需要的重要蛋白及激素又得以保留。Heemann等[4]研究指出MARS可以改善多项血清学指标,如降低血清胆红素水平、改善肾功能指标、肝性脑病、瘙痒症状和血流动力学,但同时也指出MARS可以降低患者的短期(30天)病死率,而对60天后的病死率没有影响[5]。由于MARS能有效替代肝脏的解毒功能,纠正血流动力学紊乱,对肝衰竭的并发症和MODS有治疗作用,因此目前临床应用较广泛。②普罗米修斯系统:该系统为费森尤斯公司和多瑙河大学联合研制,使用的Albu-Flow滤器能透过白蛋白,而血细胞和大分子蛋白不能透过,两个吸附装置吸附白蛋白结合毒素,游离的白蛋白能重新进入血液循环。普罗米修斯系统是一个基于血浆分离和吸附以及高通量透析的强大的体外肝脏解毒系统[6]。多项非对照研究均指出,普罗米修斯系统在治疗肝衰竭时,可以显著改善血清结合胆红素、胆汁酸、氨、胆碱酯酶、肌酐、尿素氮以及血pH值水平[7,8]。普罗米修斯系统的机制和疗效与MARS类似,同样可以同时清除蛋白结合毒素和水溶性毒素。但对胆红素和尿素氮的清除,普罗米修斯系统优于MARS系统,两者对胆汁酸的清除能力相当,而MARS系统可以改善患者的循环状态[9,10]。非生物型侧重于代偿肝脏的解毒作用,其不能完全替代肝脏的合成、代谢功能。
生物型人工肝
那么,“生物免疫治疗”到底是何方神圣?对肿瘤治疗能起什么作用?哪些病人才适合这样的治疗方式呢?
生物治疗:
对付肿瘤的未来方向
据广州医学院附属肿瘤医院肿瘤内科主任医师金川介绍,手术、放疗和化疗是目前公认的肿瘤治疗“指定动作”。但一个不可回避的事实却是,光靠这些传统的方法,已经难以杀灭患者体内残存的肿瘤细胞。正因如此,随着科技进步,目前肿瘤治疗已进入生物治疗时代,而且生物治疗将成为日后肿瘤治疗的主导。
而“免疫细胞治疗”其实就是生物治疗的一种。“说起‘生物治疗’,大家可能觉得很陌生,但如果提及靶向治疗,相信大家都不陌生,其实靶向治疗就是生物治疗的一种。”金川说。目前临床上比较常见的生物治疗方法,一种是靶向药物,另一种则是免疫细胞治疗。
作用机理:
激发自身抵抗力杀灭癌细胞
金川指出,其实“免疫细胞治疗”并不是什么新鲜事物,它在国内外开展的时间已有三四十年。
金川说,免疫细胞治疗等生物治疗与传统化学药物最大的区别在于,前者主要是利用人体自身的免疫细胞而不是传统的化学药品来杀伤肿瘤细胞的。而且与传统方法相比,生物治疗的针对性更精确,“它瞄准的是肿瘤细胞本身,不会‘伤及无辜’。”
而具体到免疫细胞治疗,其方法就是从患者的外周血中采集单个核细胞,然后送到专业的实验室内进行培养、扩增、诱导,刺激细胞中的肿瘤抗原,从而获得能识别癌细胞的DC细胞和具有高杀瘤活性的CIK细胞,然后如同打点滴一样分次回输到患者体内。这样一来,这些携带了“秘密武器”的免疫细胞就能有效抑制肿瘤细胞生长、消除转移病灶,达到预防和控制肿瘤复发和转移,实现延长患者生存期、提高患者生活质量的多重目标。“值得一提的是,免疫细胞治疗目前已经纳入了广州的医保。”
适应症:
晚期癌症患者获益不大
纳米技术的定义是指一些设备,本身或其关键部分是人工的,至少在某个方向上是1~100nm范围。与癌症相关的纳米技术设备可以是携带靶向性治疗药物的纳米载体;生物靶向性的纳米造影剂;也可以是高度特异检测DNA和蛋白质的纳米粒子和纳米设备,将在肿瘤的诊断、治疗领域产生巨大突破。
【关键词】 纳米技术 肿瘤 诊断 治疗
1 癌症纳米技术
纳米技术的正式定义是指一些设备,本身或其关键部分是人工的,至少在某个方向上是1~100nm范围。与癌症相关的纳米技术设备可以是注射的纳米载体;生物靶向性的纳米造影剂,用于手术中显像以区别神经—肿瘤的相互关系;也可以是高度特异检测DNA和蛋白质的磁性纳米粒子。Whitesides[3]在其纳米技术的定义中,对确切的大小没有过分限制,从生物学需要考虑,更强调生物纳米尺寸在实际操作中的合适性。
2 常用的纳米技术工具
2.1 用于药物投递和显像的纳米载体
癌症治疗中的纳米载体是一大类纳米技术装置,可以非侵袭性地发现早期肿瘤分子标志;同时靶向性投给药物。纳米载体一般至少由3部分组成[2]:核心的组成部分;治疗作用和(或)影像功能的有效负荷;生物表面调节分子,以增加纳米粒子在播散时的肿瘤靶向性。
脂质体是原始而简单的纳米载体,可以穿透癌症新生血管增加肿瘤位点的药物浓度。脂质体包埋的阿霉素现在用于乳腺癌或难治性卵巢癌[4]。几种类型的纳米粒子可以增加MRI的对比度,如含钆或氧化铁的纳米粒子;以及多结构纳米造影剂,可以将MRI与生物靶向性和可见光检测相结合。低密度脂性纳米粒子已用于提高超声影像的质量。
注射用的多孔硅纳米载体可以生物降解,比其他可生物降解的聚合体速度更快(几分钟~几小时vs几天~几个月),因此具有以前不可达到的时间特征。金纳米壳(Nanoshell)[5],由黄金在硅核心上涂布组成,可以通过组织的近红外线被选择性的激活,导致局部治疗性热消融。
2.2 含纳米材料的宏观设备
目前有能力在纳米范围内进行分子沉淀,使信息密度成百万倍的增加,微阵列进步为纳米阵列,直接用于核酸或蛋白组的测定。用于癌症领域的另一个纳米级装置是表面增强的激光解吸附—电离飞行时间(surface?鄄enhanced laser desorption/ionization time?鄄of?鄄flight,SELDI?鄄TOF)质谱技术,应用于癌症的早期诊断[6]。
多通路生物分子传感器,可以同时间对大量不同的分子标志(组织或血清蛋白组)进行检测,目前最有希望的有微悬臂和纳米悬臂阵列。
硅纳米导线或导管已用于小分子分离,控释药物的投给[7]。也可以作为纳米级的场效应生物晶体管,当其表面发生分子结合事件时,变化的导电率可以被检测。将尺寸控制在5~100纳米的通路和小孔已在硅芯片上制成,使体积移动精确到纳米范围。
3 癌症纳米技术的应用
纳米技术的应用包括:早期诊断,如对血标本进行蛋白组分析;其次,在体内对肿瘤的演化过程进行分析或分子显像;提高药物治疗的靶向性,避开体内的生物或生理学屏障;对治疗效果进行实时监测,替代治疗后的随访评估。
3.1 体内癌症生物标志的检测和监测
新的影像学技术使用的造影剂上结合有分子识别物质或靶向性药物(抗体),具有信号增强作用,可以检测更微小更早期的癌细胞。
近来证实,亲淋巴的顺磁性纳米粒子,可对前列腺癌的隐性淋巴结转移进行MRI显像,这为非侵袭性方法难以发现。Meta分析显示[8],使用纳米粒子造影的MRI对多种癌症的淋巴结转移的诊断具有很高的特异性(96%)和敏感性(88%)。Kobayashi等[9]在乳腺癌小鼠中使用钆纳米载体——聚合状的树状体(dendrimers)可以清晰显示淋巴结和淋巴管的排泄,提示在临床上可以替代前哨淋巴结活检。双峰纳米粒子,携带有近红外的肉眼可见的荧光基团,与MRI造影剂(交联氧化铁)共价结合,可以用于手术前脑肿瘤轮廓的描绘和手术中的病变显示。交联氧化铁纳米粒子与annexin?鄄Y共价结合,用于MRI可识别喜树碱诱导T细胞的凋亡。使用生物精确纳米粒子,端粒酶活性(增殖潜能的标志)也可以在细胞水平由MRI检测。
持续血管生成发生于癌前病变中,是早期诊断中的重要标志。在动物模型中使用改良纳米粒子,以ανβ3?鄄integrin为靶点,可以对血管形成进行了MRI显像。另一个体内分子检测的是植入性传感器,体外设备进行信号接收,但植入性材料存在非特异性吸附血清蛋白——生物污垢,导致传感器对蛋白检测能力迅速下降。
3.2 体外癌症生物标志分子的早期精确检测
临床使用的一些癌症分子标志,如CEA、PSA,由于特异性不是很好,限制其应用于早期诊断。有几个纳米技术是很合适的侯选者,如纳米悬臂,检测蛋白组的SELDI?鄄TOF质谱分析。
生物分子的结合会产生压力和形变[10],使用合适的选择性纳米结构传感器可以进行检测和识别。主要的例子是微米和纳米悬臂,当其表面发生核酸杂交、分子结合事件,其共振频率会发生偏斜和改变。此偏斜或者直接被激光束探测,或者偏斜转换成可以测量的物理特征,如共振频率发生改变,见图1。值得提出的是,将成千上万个纳米悬臂阵列集成在厘米大小的芯片上,这样可以同时读码蛋白组信息,甚至整个蛋白组。此技术与微电子制作技术存在相同之处,因此提示可以大规模的,低成本可靠的生产。
纳米悬臂、纳米导线和纳米管的阵列是可以将癌症的诊断、预后和治疗的选择从单个生物标志向多个生物标志转化的工具。
此外,携带荧光基团的硅珠已经用于白血病细胞的检测;在人类SY5Y成神经细胞瘤和C6胶质细胞瘤中,荧光纳米粒子可以检测细胞内的钙浓度——细胞死亡的有效标志,因此可定量测量细胞对药物的反应。
纳米粒子比传统的细胞染色方法具有稳定性和可调性的优势。如量子点不会随时间丢失其信号强度,即不存在光漂白作用;而且,偶联不同抗体的纳米粒子与对应的分子靶向性结合后,可以显示不同的颜色 [11]。即使进行单波长光照射,单个细胞或细胞群中的分子标志分布地图将准确而清晰的显示。
纳米粒子已经用于血清蛋白组的检测,重点是痕量的低分子量蛋白水解片段,应用于卵巢癌和其他肿瘤。SELDI?鄄TOF蛋白组分析使用纳米粒子后,可增加单位面积的蛋白吸附能力,进行更多不同样本的分离和检测。
目前已经开始联合使用多个纳米诊断技术。如改良的寡聚核苷酸—金纳米磁性粒子具有500个zepto摩尔(zepto=10-21)的敏感性,用于核酸的检测。因不需要酶扩增,具有超过PCR的优势,而且也用于蛋白质分析[12]。更进一步的方法是改良金纳米粒子探针,与微悬臂结合,可以分析DNA的单个碱基错配。
3.3 药物的靶向性治疗
将具有识别功能的物质(如抗体)与纳米载体结合,使含有活性药物的纳米载体具有分子靶向性功能。与传统的抗体引导的治疗相比,分子靶向性纳米载体至少具有4大优势:在每个靶向性生物识别过程中,可以携带更多有效治疗负荷;能携带多个不同的靶向性药物,增强选择性;能够以整体的方法通过生物屏障;局部可以投给多种药物,导致靶向性的联合治疗。
通过叶酸介导的靶向性纳米粒子已经在移植鼻咽癌的裸鼠的治疗中得到证实。多功能纳米材料——树状多聚体在胞内与叶酸靶向性结合后,选择性的在细胞内投递抗癌药物甲氨蝶呤[13];若将荧光素结合到纳米载体则可提供可视的影像信号。多种抗原已用于引导纳米粒子识别血管内皮细胞。如将存在于内皮细胞的ανβ3?鄄integrin与全碳氟纳米乳液结合,用于小鼠模型中结肠腺癌和黑色素瘤的抗血管治疗。目前,已将靶向性溶解血管内皮细胞和化疗药物相结合的纳米粒子开发出来,并可以明显提高治疗效果,减少副作用[14]。
另一类靶向性方法由外部能量驱动,激活局部毒性反应。如使用聚焦超声爆破的脂质包裹微囊进行光动力学治疗;通过联合使用金纳米壳和近红外线光学激活,对深层的癌细胞进行局部热消融。其次,非特异的物理化学相互作用也会提高纳米载体的靶向性,如100nm的粒子更趋向于达到内皮细胞的末梢;比此尺寸更大或更小均导致靠边,因此使治疗的药物更容易到达内皮或组织部位。对pH敏感的多聚纳米载体可以生物分解而释放出抗癌药物紫杉醇,所以肿瘤部位特殊的pH水平使治疗作用优先得到靶向性激活[15]。将来的希望是将上述靶向性方法联合起来,使之在治疗上取得最大成功。
获得和维持药物理想的生物分布,需要精确的给药剂量和时间。植入体内的纳米胶囊,没有多次注射和医院使用的不方便,还可以预先编程,使投递具有时间变化规律,或者通过传感器对植入点的微环境刺激作出自调节的反应。目前,从植入渗透泵恒速的投给激素药物醋酸亮丙瑞林已经在临床上用于治疗前列腺癌[16]。
3.4 工程纳米粒子避开生物、生理学屏障
药物和造影剂从投给部位向理想靶点的缓慢移动,充满磨难,纳米载体和传统的方法均如此。生物物理屏障包括上皮细胞之间的紧密联接(血脑屏障)或血管内皮细胞的保护性排出,网状内皮组织系统(reticulo?鄄endothelail system,RES)的捕获,以及供应癌症的脉管系统解剖结构的紊乱和癌症细胞中的高渗透压;延迟药物微粒进入或促进渗出。纳米技术基础的药物投递系统具有穿过屏障的优势,因为其组成的核心材料的独特特征,如使用缓激肽拮抗剂可以增加血管的通透性[1]。
通透性增强剂的局部给药,能可逆性地开启细胞间的联接,使生物分子药物更容易穿透肠道的上皮细胞屏障,进入血液循环。纳米技术具有多功能性,可以同时携带治疗药物、通透性增强剂和肠壁靶向性材料,因此也使药物避免被酶降解,延迟释放时间[17]。同样,尺寸更微小的多功能粒子被静脉注射,可以增加药物从癌症血管透出,或更容易通过血脑屏障。
细胞的RES可以隔离注射的纳米粒子,对纳米粒子包埋的药物是有效的免疫屏障。通过表面覆盖聚乙烯乙二醇,脂质体可以有效避免被RES的吸收,因此药物的半衰从几分钟提高到几小时或几天,增加了脂质体靶向治疗肿瘤的效果。
癌症病变内的高渗透压,导致治疗药物渗透和在肿瘤内扩散相当困难,即使药物直接注射到病变也容易再排除,尤其是晚期癌症。将来解决此麻烦问题的创造性方法是,多阶段、多负荷的投递系统,但目前这仅仅是一个理论上的构思。2005年1月Abraxane被美国FDA批准[18]为治疗转移性乳腺癌,此药物由紫杉醇纳米粒子组成,可以结合到白蛋白分子上。这种纳米粒子不需要治疗前使用甾体类抗炎药物(传统的紫杉类必须使用),白蛋白可以帮助纳米粒子从内皮细胞上穿过,此联合可以将紫杉醇的临床剂量提高50%。
4 纳米技术的安全性和展望
纳米技术对癌症治疗可能是最有希望的手段之一,然而,应该放在安全性考虑之后。这不仅是严格的审批管理的观点,当然也是健康工作者最关注的问题。纳米载体也会触发过敏反应。碳纳米管可以产生抗体,早期的纳米树状体也可导致较弱的抗体反应,但蛋白结合的树状体是很强的免疫原。因此,纳米技术的治疗不可能不导致过敏反应,需要设计合适对抗手段。
纳米粒子主要的优势是其多功能性,能够将多方法,如治疗、诊断和屏障避开制剂进行联合,与药物反应的生物副作用也会增加。Cristini等[19]发现,将靶向性细胞毒药物治疗肿瘤,尤其是抗血管治疗,将癌症病变分割成多个卫星灶,即治疗产生的重新排列(氧和营养支持的来源),使后序治疗的难度增加。
展望将来,对治疗的疗效进行实时评估方法,将替代直接对肿瘤大小、分子表达和靶向性信号通路进行的观察,甚至替代一些传统的终点分析方法,如缓解时间和生存时间。体内分子显像剂的开发,双重的治疗—显像纳米载体技术的建立,体内显微镜技术(通过荧光光子技术对单个细胞进行显像)的出现,将对最优的诊断治疗提供确实的依据[20,21]。
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1 分子生物技术概述
分子生物技术也称之为生物工程,是现代生物技术的主要标志,它是以基因重组技术和细胞融合技术为基础,利用生物体(或者生物组织、细胞及其组分)的特性和功能,设计构建具有预期性状的新物种或新品系,以及与工程原理相结合进行生产加工,为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系,其内容包括基因工程技术、细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、酶工程技术等。现代分子生物技术的诞生以70年代DNA重组技术和淋巴细胞杂交瘤技术的发明和应用为标志,迄今已走过了30多年的发展历程。实践证明在解决人类面临的粮食、健康、环境和能源等重大问题方面开辟了无限广阔的前景,受到了各国政府和企业界的广泛关注,是21世纪高新技术产业的先导。医学领域是分子生物技术最先登上的舞台,也是目前现代分子生物技术应用最广泛、成效最显著、发展最迅速、潜力也最大的一个领域。据统计,国际上分子生物技术领域所取得研究成果的60%以上集中在医学领域。
2 分子生物技术在医学领域的重要应用
2.1 分子生物传感器在医学中的应用
分子生物传感器是利用一定的生物或化学固定技术,将生物识别元件(如酶、抗体、抗原、蛋白、核酸、受体、细胞、微生物、动植物组织)固定在换能器上,当待测物与生物识别元件发生特异性反应后,通过换能器将所产生的反应结果转变为可以输出、检测的电信号和光信号等,以此对待测物质进行定性和定量分析,从而达到检测分析的目的。分子生物传感器可以广泛地应用于对体液中的微量蛋白、小分子有机物、核酸等多种物质的检测。在现代医学检验中,这些项目是临床诊断和病情分析的重要依据。能够在体内实时监控的生物传感器对于手术中或重症监护的病人都很有帮助。
2.2 分子生物纳米技术在基因诊断中的应用
基因诊断是利用分子杂交及荧光技术检测DN段,已经为基因诊断在临床上的应用带来了巨大的发展前景。研究表明,利用纳米技术,如利用金纳米微粒结合杂交DN段,很容易进入机体细胞核,并与核内染色体组合,具有较高的特异性,可以克服目前基因诊断所面临的一些困难和问题,进一步提高了基因诊断在实验室中的地位。科学家通过超顺磁性氧化铁纳米粒脂质体对肝癌的研究,提高了直径3 mm以下的肿瘤检测率。结论表明,纳米微粒对肿
瘤早期发现、早期诊断具有重要意义。
2.3 分子生物技术在医学制药中的应用
分子生物技术发展的一个重要方向是医学制药的研究与开发。与传统的化学合成制药相比,它不仅具有针对性强、疗效好、副作用较小的优点,同时对蛋白质药物改造、提高疗效、降低毒性、提高稳定性具有重要作用,并且能够利用生物系统,将自然界中存在的含量极低的有效生物活性物质进行大规模生产以及建立起高效、快速、准确、简便的分子诊断技术和开发出新药,更重要的是可以预防和治疗一些应用传统治疗方法无法克服的疾病。目前这一领域的应用主要包括以下几个方面:生产基因工程药物;生产发酵工程药物;生产核酸类药物;利用生物系统加工天然药物;从海洋生物中纯化提取药物。
2.4 分子纳米技术在基因疗法中的应用
基因治疗是临床治疗学上的重大发展,其基本原理是:质粒DNA进入目的细胞后,可以修复遗传错误,或可产生治疗因子,如多肽、蛋白质、抗原等,纳米技术能使DNA通过主动靶向作用定位于细胞。将质粒DNA缩小到50~200nm,带上负电荷进入到细胞核,插入到细胞核DNA的确切部位,起到对症治疗效果。同时分子纳米技术能够快速有效地确定基因序列、基因和药物的体内走向、传送和定位传递,使临床诊断和治疗过程效率得以提高。同时无机纳米颗粒体积小,可在血管中随血液循环,透过血管壁进入各个脏器的细胞中,作为新型非病毒型基因载体能有效介导DNA的转导,并使其在细胞内高水平的表达,从而为基因表达、功能研究及基因治疗提供了新的技术和手段。
2.5 分子生物芯片技术在医学检验中的应用
1.1细胞分离与染色
纳米细胞分离技术的出现有助于解决生物医学中快速获取细胞标本的难题。将15~20nm的SiO2包覆粒子均匀分散到含有多种细胞的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液中,利用梯度原理,通过离心技术快速分离所需要的细胞[1]。用这种方法很容易将怀孕仅8周左右的孕妇血样中极少量的胎儿细胞分离出来,通过对其染色体的分析,判断胎儿是否有遗传缺陷。应用纳米免疫磁珠检测早期肺癌患者循环血液中的肿瘤细胞,可以监测肺癌的转移情况[2]。
纳米颗粒也为建立新的细胞染色技术提供了新的途径。段箐华等[3]用联吡啶钌配合物[Ru(Ⅱ)(bpy)3]2+、异硫氰酸罗丹明B(TRITC)、异硫氰酸荧光素等荧光分子标记SiO2纳米颗粒,实现了体外对B淋巴细胞、肝癌细胞、早期凋亡乳腺癌细胞、系统性红斑狼疮细胞的特异性识别。异硫氰酸荧光素标记的SiO2纳米颗粒表面接特异抗体,可用于免疫学检测[4]。
1.2纳米造影剂
无机纳米粒子因其形状、尺寸和组成的不同而具有独特的物化性能,可用作新型生物造影材料,能提供良好的检测信号对比度和生物分布度,提高诊断效率,并有望将现有的解剖学层面的造影技术推向分子水平,即“分子造影”[5-7]。纳米造影剂一般需要3个组成部分:(1)无机纳米粒子核,如金、氧化铁等,用以实现造影增强效果;(2)水可分散的壳层,如聚乙二醇等,用以提高无机纳米粒子核的溶液稳定性;(3)赋予靶向功能的生物活性分子,如蛋白、多肽和抗体等。
高分子修饰的氧化铁纳米粒子,如葡聚糖包裹的超顺磁性氧化铁纳米粒子已被用于临床以提高解剖学层面的磁共振造影[8],也被用于分子造影[9]。传统的检测方法对Ⅰ、Ⅱ期癌症检出率小于15%,使用高磁共振对比度的造影剂能够提高早期癌症的检出率。例如,乳腺癌细胞过度表达人上皮增长因子受体2基因(HER2/neu)[10],将磁性纳米粒子(MNPs)偶联上HER2的抗体赫赛汀,就可以将SK-BR-3乳腺癌细胞检测出来[11]。用MNPs偶联赫赛汀探针还可以测出不同细胞的HER2表达量[12]。同样,可以用偶联了rch24抗体的Fe3O4靶向癌胚抗原来诊断结肠癌[13];用偶联了HmenB1抗体的FePt-Au来靶向成神经细胞瘤细胞(CHP134)过度表达的聚唾液酸(PSA)[14]。合金MNPs,如FePt@CoS2等兼具造影和治疗功能。
FeP@tCoS2纳米粒子被HeLa细胞摄入以后,在癌细胞的酸性环境中释放出的Pt+能导致癌细胞凋亡[15]。SiO2@Fe3O4@Au纳米粒子可以用于磁共振造影和治疗,当其与抗HER2基因抗体偶联后有明显的T2加权造影效果,再加上持续的光照,由金壳产生的能量能将癌细胞杀死,起到治疗作用[16]。
金纳米粒子因为其独特的表面等离子共振效应被用作光学造影剂和传感器[17-19]。利用金纳米粒子的表面易于功能化的特性,El-Sayed等[20]在金纳米粒子表面偶联表皮生长因子抗体(anti-EGFR),使金纳米粒子靶向富集在表皮生长因子高表达的口腔上皮癌HOC313细胞上。与普通上皮细胞HaCaT相比,经表面改性的金纳米粒子在HOC313细胞中表现出了更清晰的造影效果。以壳聚糖为纳米载体的复合微球成功地将包覆的金纳米粒子与药物一同送入细胞核,起到了细胞核给药和细胞核造影的双重功能,实现了金纳米粒子的多功能化[21-22]。
半导体纳米粒子(又称量子点)已经被用作荧光探针,用于细胞标记和光学探针[23-24]。美国华盛顿大学的研究人员用蛋白将一个量子点内核包裹在一个直径为3nm的超薄金壳中,使两部分的光电特性不受彼此的干扰,从而首次实现了将半导体和金属纳米粒子结合在一起而仍能保留各自的功能,量子点可用于荧光成像,金球则可用于散射成像。
1.3纳米传感器和新型纳米诊断技术
虽然对纳米传感器的研究时间较短,但其优点是不容置疑的。由生物大分子构成,利用化学能进行机械做功的分子马达纳米传感器,使其尖端插入活细胞内而又不干扰细胞的正常生理过程,来获取活细胞内多种反应的动态化学信息、电化学信息。如利用ATP酶作为分子马达的纳米传感器能进入人体细胞,完成在人体细胞内监测和药物释放等任务,可以连续监测体内代谢变化,对肺部小血管内NO和CO的监测结果对于高血压和心血管疾病的诊断和治疗具有重要意义[25]。其他的分子马达还包括RNA聚合酶、肌球蛋白和驱动蛋白等[26]。在糖尿病治疗中可将纳米生物传感器置于真皮层检测葡萄糖水平,从而指导给药。斯坦福大学的科学家最近利用纳米科技及电磁效应发明了一种生化传感器,这种传感器可以及早发现癌症的早期症状,利于对患者及时进行治疗。
随着隧道扫描显微镜和原子力显微镜的问世,人们能够在纳米尺度上了解生物大分子的精细结构及其与功能的关系,并动态获取生命信息[27]。利用原子力显微镜可以在纳米水平揭示肿瘤细胞的形态特点,通过寻找特异性的纳米结构改变实现对肿瘤的早期诊断,从而解决肿瘤诊断的难题[28]。
2纳米药物载体和纳米药物
纳米药物与传统的分子药物(molecularmedicine)的根本区别在于它是颗粒药物(particulatemedicine)。广义的纳米药物可分为两类:一类是纳米药物载体,即指溶解或分散有分子药物的各种纳米颗粒,如纳米球、纳米囊、纳米脂质体等。二是纳米药物,即指直接将原料药物加工成的纳米颗粒,或利用崭新的纳米结构或纳米特性,发现基于新型纳米颗粒的高效低毒的治疗或诊断药物。前者是对传统药物的改良,而后者强调的是把纳米材料本身作为药物[29]。
2.1纳米药物载体
实现细胞和亚细胞层次上药物的靶向传递和智能控制释放,是降低药物毒副作用、提高治疗效果的共性问题。纳米粒子介导的药物输送是纳米医学领域的一个关键技术,在药物输送方面具有许多优越性。目前,用作药物载体的材料有金属纳米颗粒、生物降解性高分子纳米颗粒及生物活性纳米颗粒等[30]。理想的纳米药物载体应具备以下性质:毒性较低或没有毒性;具有适宜的制备及提纯方法;具有合适的粒径与形状;具有较高的载药量;具有较高的包封率;对药物具有良好的释放特性;具有良好的生物相容性,可生物降解或可被机体排出;具有较长的体内循环时间,并能在疗效相关部位持久存在等。
2.1.1抗肿瘤药物载体肿瘤的纳米靶向治疗以纳米粒为载体,将药物或制剂定向于肿瘤部位,可以大幅度提高药物的生物利用率,提高疗效,降低用药量,减少毒副作用,已成为国际肿瘤药物研制中的热点和前沿。
恶性肿瘤周围及其实质有大量的新生毛细血管形成,这些血管通透性高,400~600nm以下的纳米颗粒可穿过血管到达肿瘤组织。Alexiou等[31]在动物模型上用磁性纳米粒负载抗癌药物进行区域动脉灌注,外加磁场定位浓集,发现纳米粒子随血液流入肿瘤部位并渗透到肿瘤组织内,提高了药物的治疗指数。Mu等[32]将生物可降解聚合物PLGA纳米粒、VitaminE、TPGS和抗肿瘤药物紫杉醇混合在一起,药物可较容易地到达肿瘤部位而发挥靶向效应作用。杨凯等[33]在治疗口腔癌颈淋巴结转移灶时,将抗癌药物葫芦素BE装载到聚乳酸纳米微粒上,发现药物可靶向到达病变部位,毒副作用和局部刺激作用显著减小。
恶性肿瘤的纳米粒磁导靶向热疗也是有效的方法,热疗本身可以破坏肿瘤细胞。将磁性纳米粒子经包裹或修饰后选择性地注射到肿瘤部位,然后施加交变磁场,纳米粒子受到交变作用而产热,可提高放疗和化疗的效果。口腔颌面部肿瘤位置相对表浅,是最适合作磁导靶向化疗和磁导靶向热疗的部位。此外,由于纳米脂质体载体具有较好的药物、基因和成影剂包封率,在肿瘤造影成像等方面显示出较好的优势[34]。
2.1.2中枢神经系统(CNS)药物载体血脑屏障对于维持CNS的相对稳定起着重要作用,但其毛细血管连接紧密,大多数药物很难通过血脑屏障进入CNS。因此,如何使CNS药物跨越血脑屏障从血液进入脑内且发挥药效是药物传递系统需要解决的一个难题。纳米粒子作为药物载体,为不能透过血脑屏障的CNS药物入脑提供了新途径。Sun等[35]以聚乳酸为基质,制备了装载异硫氰酸荧光素-右旋糖酐的纳米粒,并将纳米粒用聚山梨酯-80包衣,给小鼠尾静脉注射后发现纳米粒可主动靶向脑组织。Kepan等[36]同时给小鼠注射采用聚山梨酯-80包衣的甲氨蝶呤聚氰丙稀酸丁酯纳米粒子(PBCA-NP),未包衣NP及甲氨蝶呤溶液,通过检测脑脊液及脑组织内药物浓度显示,采用聚山梨酯-80包衣的甲氨蝶呤PBCA-NP能显著提高脑内甲氨蝶呤药物浓度。Petri等[37]研究显示,泊洛沙姆-188包衣的PBCA-NP与聚山梨酯-80包衣的PBCA-NP均能显著提高阿霉素的抗脑肿瘤活性。
Oliver[38]发现,用聚山梨酯-80修饰的PBCA-NP通过血脑屏障的机理,部分是由于载体降解产生的毒性打开了脑血管内皮的紧密连接。Ulbrich等[39]发现,用人血清白蛋白纳米粒子包无跨血脑屏障能力的药物洛哌丁胺(loperamide),并与转铁蛋白或转铁蛋白受体的单克隆抗体OX26共价结合后,能够借助血脑屏障上转铁蛋白受体介导的胞吞作用进入脑组织,产生强烈的抗伤害性药效。将神经生长因子载入表面经聚山梨酯-80修饰的PBCA-NP,注射帕金森病小鼠模型后可在21d内持续发挥抗帕金森病的疗效[40]。抗菌药物环丙沙星(ciprofloxacin)装载入表面修饰了HIV-1反式激活蛋白(TAT)的聚乙二醇纳米粒子,利用TAT能将异源蛋白导入细胞内或穿过血脑屏障的特点,通过检测发现该抗菌药物能被人类星型胶质细胞摄取,此法还可用于使其他抗生素跨越血脑屏障,从而治疗脑部感染[41]。
2.1.3其他胰岛素(insulin,INS)的降糖疗效明显,但普通制剂的INS口服给药不易吸收,且容易被胃蛋白酶、胰蛋白酶和肠激酶等降解,因此目前临床上INS的常规给药途径为注射给药。大量的研究工作证实,口服纳米囊可保护INS不被酶破坏,提高INS的生物利用度,减少用药次数。Mesiha等[42]制备的聚氰基异丁酯丙烯酸纳米粒可将药物作用时间从6h延长至72h,生物利用度更好。Merisko等[43]制得INS纳米粒,通过体外实验证明其有良好的缓释能力。Christiane等[44]用生物聚合物和非生物聚合物复配制得纳米粒子,可将INS包裹在纳米粒子的内核,对INS的包封率可达到约96%,并且实验证明有很好的缓控释效果。纳米药物控释系统还被用来防治血管再狭窄[45]。
再狭窄是冠状动脉经皮腔内成形术(PTCA)后常见而严重的并发症,运用微孔球囊介入导管将纳米粒子自由分散形成的乳状悬浮液置于PTCA部位,可以达到防治再狭窄的效果。另外,载药纳米粒子进入动脉壁后,随着可降解材料的逐渐水解,其内含的药物便缓慢持续释放出来,从而实现药物在动脉内局部定位。用纳米颗粒,包括纳米胶束、纳米脂质体等作为基因转移载体,已引起医学界广泛重视。其原理是纳米颗粒作为载体将DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)、dsRNA(双链RNA)等基因治疗分子包裹其中,或者通过静电引力或吸附将治疗分子固定在其表面形成复合物,在胞吞作用下纳米颗粒进入细胞,释放基因治疗分子,发挥治疗效能[46]。
2.2纳米药物
直接以纳米颗粒作为药物的应用之一是抗菌药物。纳米抗菌药物具有广谱、亲水、环保、遇水后杀菌力更强、不会诱导细菌耐药性等多种性能。以这种抗菌颗粒为原料,成功地开发出了创伤贴、溃疡贴等纳米医药类产品。例如,纳米二氧化钛树脂基托材料具有一定的抗变形链球菌和抗白色念珠菌的效果,当树脂基托中抗菌剂的浓度达到3%时,即可达到满意的抗菌效果[47]。郭春兰[48]用纳米银医用抗菌敷料对142例患者的手术切口进行护理,所有切口均无感染并Ⅰ期愈合,同常规使用普通无菌敷贴覆盖切口的方法相比,平均每例的愈合时间提前1.69d。
无机纳米颗粒作为新型的抗癌药物为肿瘤治疗提供了新的思路。Liu等[49]用Gd@C82(OH)22处理荷肝癌的小鼠,在10-7mol·kg-1的注射剂量下能有效地抑制肿瘤生长,同时对机体不产生任何毒性。其抑瘤效应不是通过纳米颗粒对肿瘤的直接杀伤起作用,而是可能通过激活机体免疫来实现对肿瘤的抑制作用。纳米羟基磷灰石在体外对恶性肿瘤细胞产生明显的抑制作用,而对正常细胞作用甚微,可望通过进一步的研究获得一种区别于传统的化疗药物的纳米无机抗癌药物[50-51]。此外,有的物质纳米化后出现新的治疗作用,如二氧化钛纳米粒子可抑制癌细胞增殖[52];二氧化铈纳米颗粒可以清除眼中的电抗性分子并防治一些由于视网膜老化而带来的疾病[53]。
3组织修复和再生医学中的纳米材料
将纳米技术与组织工程技术相结合,构建具有纳米拓扑结构的细胞生长支架正在形成一个崭新的研究方向。相对于微米尺度,纳米尺度的拓扑结构与机体内细胞生长的自然环境更为相似。纳米拓扑结构的构建有可能从分子和细胞水平上控制生物材料与细胞间的相互作用,引发特异性细胞反应,对于组织再生与修复具有潜在的应用前景和重要意义[54]。将纳米纤维水凝胶作为神经组织的支架,在其中生长的鼠神经前体细胞的生长速度明显快于对照材料[55]。向高分子材料中加入碳纳米管可以显著改善原有聚合物的传导性、强度、弹性、韧性和耐久性,同时还可以改进基体材料的生物相容性。研究发现,随着复合物中碳纳米管含量的增加,神经元细胞和成骨细胞在复合材料上的黏附与生长也越来越活跃,而星形细胞和成纤维细胞的活性则呈现同等程度的下降[56-57]。Freites[58]设计的人造红细胞输送氧的能力是同等体积天然红细胞的236倍,可应用于贫血症的局部治疗、人工呼吸、肺功能丧失和体育运动需要的额外耗氧等。Murphy等[59]成功合成了模拟骨骼亚结构的纳米物质,该物质可取代目前骨科常用的合金材料,其物理特性符合理想的骨骼替代物的模数匹配,不易骨折,且与正常骨组织连接紧密,显示出明显的正畸应用优势。
纳米自组装短肽材料RADA16-I与细胞外基质具有很高相似性,RADA16-I纳米支架可以作为一种临时性的细胞培养人工支架,它能很好地支持功能型细胞在受损位置附近生长、迁移和分化,因而有利于细胞抵达伤口缝隙,使组织得以再生。有研究人员[60]利用RADA16-I纳米支架修复了仓鼠脑部的急性创伤,并且恢复了仓鼠的视觉功能。RADA16-I形成的水凝胶可用作新型的简易止血剂,用于多种组织和多种不同类型伤口的止血。
4纳米中药
“纳米中药”是运用纳米技术制造的粒径小于100nm的中药有效成分、有效部位、原药及其复方制剂[61]。纳米中药不是简单地将中药材粉碎至纳米数量级,而是针对组成中药方剂的某味药的有效部位甚至是有效成分,进行纳米技术加工处理,赋予传统中药以新的功能。
中药纳米化可以使细胞破壁,大大提高中药有效成分的渗透性或溶解度,提高生物利用度;利用纳米化的中药所具有的缓释功能和靶向给药功能,在提高药效的同时降低毒副作用;利用中药的纳米包覆技术能改变一些中药制剂的亲水、亲油性,提高临床疗效。例如,用纳米粉碎技术将中药黄芩、黄连、黄柏、地榆超微粒化,添加纳米锌、硒等微量元素,加广谱强效纳米银系(AT)抗菌剂、麦饭石纳米粉、远红外二氧化钛、电气石在传统中药配方基础上制成的纳米中药,用于烧烫伤的治疗,提高了药物疗效[62]。将超临界二氧化碳萃取技术用于中药挥发油提取和中药有效成分的提取,通过包覆技术把中药挥发油和中药有效成分制备成纳米药物。超临界二氧化碳萃取技术已广泛用于对菖蒲根、金丝桃叶、月桂叶、肉豆蔻、苍术、高良姜等的有效成分进行提取和对紫苏、香薷、防风、辛夷、苍术、厚朴、细辛、木香等挥发油的提取[63]。
对中药挥发油采用包合技术制备包合物,用纳米尺度的分子材料(主要是环糊精类)作为载体材料,形成不到2nm的药物超微粒,其内径为0.7~0.8nm,可容纳几个药物分子,这样的包合物又称为分子型包囊[64]。由于载体是种多羟基物质,且羟基排列于筒状结构的外壁,极易分散于水中,筒内侧可包裹水难溶性的药物分子,从而大大提高水难溶性药物在水中的溶出和体内的吸收,提高生物利用度,还可降低药物的刺激性,增加药物的稳定性。药物脂质体制剂在纳米中药的研制中也得到了日益广泛的关注。如纳米雄黄脂质体[65]、辛夷挥发油纳米脂质体[66]、马钱子碱脂质体的研究[67];鱼腥草挥发油纳米脂质体的制备及其肺靶向效果[68]等。
纳米中药的研究和应用仍处于起步阶段,存在许多亟待解决的问题,如纳米中药的药效不确定性及可能的毒副作用、纳米中药的有效成分和稳定性难以控制等。但目前已经取得的一些成果表明,纳米中药的研究极大地丰富了中药的剂型,对中药的研究和开发产生了巨大的推动作用。这方面研究的深入能在纳米中药的制药技术、药效等诸方面建立更多具有自主知识产权的专利技术和创新方法,促进中药制剂的标准化和国际化,提升中药的市场竞争力。
5纳米医学材料的安全性
纳米材料在医学领域已应用于药物载体、癌症治疗、基因治疗、抗菌材料、组织工程、医学诊断等方面,给人类带来了许多好处。然而,有关纳米材料毒理学的报道也很多[69-70]。由于纳米材料具有小尺寸效应、表面和界面效应以及量子尺寸效应等特性,可能引发特殊的生物学效应,给人类健康和环境带来负面影响。例如,Yeo等[71]指出具有抗菌效果的纳米银可在水生环境中蓄积,对斑马鱼胚胎发育有毒性作用。
从纳米医学材料大小与DNA、蛋白质、病毒等生物分子的尺寸相当这一事实很容易想到,即使化学组成相同,纳米物质的生物毒性也可能不同于微米尺寸以上的常规物质[72]。根据常规物质研究所得到的毒理学数据库与安全性评价结果,可能不适用于纳米物质;现有的安全评价方法、技术又都不太适用于纳米医学材料对人体风险评价[73]。这些问题正是目前纳米医学材料安全性评价的困难所在。
纳米材料的安全性评估是一个全球性关注的问题,美国、欧盟、日本纷纷斥巨资展开纳米材料的安全性研究,我国也已将其列入国家“973”重点基础研究规划项目。纳米技术涉及很多学科,如电子、生物、物理、化学等等。因此,对医用纳米材料安全性的评估不是单一的某个学科可以完成的,而是需要临床医学、基础医学、毒理学、物理学、分子生物学、化学和环境科学等多学科的融合,充分利用各种先进的分析技术,开展多学科的综合研究。
6展望
虽然纳米医学刚刚问世,但其发展的巨大潜力已经展示在我们面前。21世纪是纳米科技的世纪,人们将以全新的角度和视野看待生物医学问题,在纳米水平上可以更加深入地研究各种组织的结构和功能,并充分发挥其优势。纳米医学技术的发展必将为基础与临床研究带来新的机遇,为现阶段尚不能解决的问题带来新的思路和方法。
1、导 言
近年来,人工肝的研究有了很大的进展。目前分为四型:(Ⅰ)非生物型;(Ⅱ)中间型;(Ⅲ)生物型;(Ⅳ)组合型[1]。研究最多的是组合型人工肝装置(Hybrid artificial Liver Device ,HALD),亦称组合型人工
肝支持系统(Hybrid Artificial Liver Support System,HALSs),是由Ⅲ型加Ⅰ型或Ⅲ型加Ⅱ型组成。这是因为过去40多年里,人们先后尝试了血液透析、血液透析滤过、血或血浆灌流、血浆置换、活性炭灌注、交叉循环、交换输血及整体洗涤等多种形式的人工肝辅助装置,用这些方法虽然改善病人的神经状况,但不能改善其生率[2]。因此,人们认识到用肝细胞的生物肝才是较理想的人工肝。而生物肝虽然能较好地替代肝脏的解毒与生物合成功能,但急性肝衰竭患者体内积累的大量代谢产物及毒性物质,难以在有限的交换中由肝细胞来解毒,反过来还可能对培养肝细胞的存活及生物学功能产生不利影响,如将生物人工肝与偏重于解毒作用的人工肝结合起来,可使人工肝辅助装置的作用更完善。目前报道最多的是生物人工肝加上血或血浆灌流装置,后者内置活性碳或树脂等吸附剂[3]。
2、组合型人工肝的适应证意义
就目前所知,肝脏至少有600多种酶。在医学领域里有很少情况比急性肝功能衰竭更具有破坏性,这是因为会细胞的坏死破坏了肝脏的合成,代谢、解毒和排泄功能与途径,导致高达80%的死亡率[1,4]。在未来人工肝有可能成为治疗急性肝功能衰竭的主要手段之一,通过下列途径得以治疗,并包括治疗一些相关的疾病:(1)肝组织再生,如果肝脏以前的结构与功能是正常的,暴发性肝衰幸存者的肝组织可以完全再生,同时人工肝的肝细胞可分泌一些促再生的物质如肝细胞生长因子返回到病人肝脏中,促进肝细胞的再生,因此人工肝有可能维持肝衰病人存活,一直到肝细胞再生与功能恢复。(2)肝移植的桥梁:尽管肝移植术是目前治疗肝功能衰竭的唯一有效办法,但受严重的器官短缺所限制。一个理想的人工肝有可能通过支持肝功能来解决移植前的重在难题,直到有一个合适的供肝被移植。(3)治疗肝移植后的最初无功能(PNF)。(4)提高再移植的存活率:如果人工肝能使肝的急症再移植手术变成择期手术的话,可提高再移植肝的存活率[5]。(5)有助于行肝叶吸量切除术,肝叶极量切除术后用人工肝支持其功能,使病人渡过危险期一直到肝组织再生。(6)人工肝可减少肝癌化疗的毒性作用。(7)有可能治疗和预防慢性肝功能衰竭的失代偿[5]。
3、组合型人工肝研究的现况
目前大多数组合型人工肝包括生物成分、生物反应器和血或血浆灌流三个部分[3,6]。
3.1 生物成分
为了替代肝脏的功能,曾试用了肝脏的切片、细片、冻干粉沫、肝细胞酶等,但因其机能短且质量低,现很少应用。目前所用的多为动物或人的肝细胞。
3.1.1 细胞来源
动物肝细胞中猪肝细胞为首选。虽然分离后的肝细胞在体外很少增生,但来源是无限的。尽管动物试验与临床有可喜的报告。但问题是动物肝细胞所合成的物质能否完全取代人的相应物质,并且异基因蛋白和酶进入到血循环中也能出现副作用[4,7]。用人的肝细胞似乎是理想的,然而体外分化的肝细胞很少增值,因而其来源成了问题。现常用的人肝细胞系是肝细胞瘤或肝胚细胞瘤,它们具有肿瘤的基因特征,虽然能表达一些特殊的酶且能合成一些蛋白和尿素,但这些细胞提供葡萄糖和代谢乳酸以及合成尿素的能力是很低的,同时对这些细胞引起的危险和副作用知甚少[8]。可行的事实是可以改变它们的基因型和表现型以及形成亚克隆,而仍具有分化功能。另一种希望是将来弄清肝细胞增生和分化的机制,在此基础上通过基因工程在体外产生理想的稳定肝细胞系并贮存起来,当需要 时用分化因子刺激;这种技术在其它高度分化的细胞中已经应用。用胎儿肝细胞在试管内增生并很可能被刺激而分化,这需要一些关于肝细胞分化的基础研究,也涉及到伦理问题。
3.1.2 细胞培养
在肝细胞单层培养中,尽管维持了几种重要的代谢功能。但细胞在24小时内失去了连接,在5天内失去特殊功能,于1-2周内死亡。以后由于认识到了肝细胞与肝细胞之间、肝细胞与基质间的相互作用对于肝细胞保持分化功能与活性非常重要,使培养了的肝细胞经长时间的也能保持其功能[2,10]。这是肝细胞培养技术的一个重要突破,因而使动物试验与临床有初步的效果。新改进的技术在培养基质中加有生长因子、激素和细胞外的基质成分以及与肝非实质细胞共同培养。培养技术由最初的单层培养发展到不同的方法如多层平板型、胶原三明治状、球型聚集肝细胞、微囊肝细胞、微载体肝细胞培养、聚乙酰内酯培养等[2,11]。分离后的肝细胞需要固定在载体基质上如微载体、或多孔材料如树脂、或多孔微载体、微型海棉等,其它固定化技术包括将肝细胞置于水凝胶中。目前多用的是将细胞固定后粘附到中空细纤维壁外或腔内培养[6]。
3.2 生物反应器
3.2.1 生物反应器的设计要求:
一个理想的生物反应器应包括以下基本内容:(1)细胞培养技术:生物反应器不仅能满足细胞量的需求,并且应提供足够的膜面积以供肝细胞固定和培养。(2)膜的特性:应保护植入的肝细胞不被宿主排斥,阻止病人血中的抗体和免疫成分进入。现已证实膜截留物质的分子量在5-10万间能有效地阻止免疫成份。期待一种多孔的,海棉状的和相当亲水性的膜,以使细胞更易粘附和发挥更大的功能。(3)生物物应器的生物相容性:如同血液透析器一样,膜的选择和内装的物质不应引起病人的生化和免疫反应。(4)膜的弥散:生物反应器应保证成功地去除血中的毒素并使肝的特殊因子返回到病人的血中[12]。
3.2.2 生物反应器的类型
目前应用最多的生物反应器仍为中空纤维,所用半透膜多是醋酸盐纤维素膜和纤维蛋白修饰的多聚砜膜。根据培养形式分为两大类:一类是细胞培养在中空纤维或毛细管内腔,另一类是细胞培养在膜外腔。临床治疗效果至少取决于三种因素,即细胞培养技术膜的特性和生物反应器的构型。
常见的生物反应器构型包括:(1)细胞培养在中空纤维腔内凝胶床中:Nyberg等于1992年提出将原代肝细胞和胶原凝胶混合后植入中空纤维管内,当凝胶收缩时在腔内形成一通道,利用此管道来增加细胞的营养,血液或血浆通过膜外循环,并产生第二个层流以减少血膜的界面与浓缩界面之间的阻力,也减少血凝块的形成;缺点是流动液体中的浓度级差可使凝胶深部的细胞营养不足和代谢产物累积。(2)细胞培养在中空纤维膜外:1972年Gullino等报告了分离的哺乳细胞能够成功地培养在中空纤维壁外,这些管排列在一个壳内,即壳一管构形,血液于管腔内循环灌注,血液中的毒性物质可通过半透膜而代谢,肝细胞分泌的营养成分进入血中。优点是细胞容易且很快地种植,细胞的植入量不受管内径的限制,因此细胞群和微载体附的肝细胞已培养在这型的生物反应器上,并且已商业化[12]。(3)细胞在毛细管膜编织的网间培养:这一生物反应器的概念于1993年由Gerlch等提出,其主要组成是用毛细管编织成垫,形成三个平面,每个平面呈90度角形成三维结构,三个平面分别运输氧、营养物质和血浆,肝细胞培养在管膜外,且可与细胞外基质或其它哺乳细胞共同培养[13]。已有报道,此种反应器的细胞密度可高达2.5×109/ml,细胞的功能达到5周之久[14]。优点是运输的氧将供给血浆,同时随着浓度差也可营养肝细胞。同样,营养物质亦能供给血浆中相当数量的细胞而不依赖于溶质的浓度。不同的膜垫组合,甚至在同一组中不同的膜垫,在不同的压力下可以促使通过细胞弥散对流来运输高分子量的溶质和迅速补给所消耗的溶质。溶质也随着单纯的弥散使其弥散能力极大地增强。然而这一现代化的装置至今没有得到临床应用,并且关于动物试验的效果知之甚少[12]。
3.3 血或血浆灌流
为了辅助生物肝的解毒功能,目前临床上试用的组合型人工肝多是用血浆分离后通过活性炭或树脂来吸附毒性物质再灌注到中空 纤维中。血浆通过灌流去除中、大分子物质。活性炭在早期的研究中易出现肺梗塞和出血倾向,以后出现了活性炭微囊以及将此微囊固定在氨基甲酸乙脂膜上等形式,使其发展较快。树脂对于有毒物质的清除有专一性能,因此是有前途的吸附材料。
4、组合型人工肝的动物试验与临床应用
尽管组合型人工肝有不同的类型,但基本结构是相似的,即血或血浆进入到含有肝细胞的生物反应器中,再返回到病人血中,其循环上再加上一个辅助解毒的装置。第一个临床试用组合型人工肝的是Matsumura,他于1987年报道了用血液透析装置内置兔的肝细胞,治疗了一例没有手术的胆管癌患者,使其胆红素下降并使肝性脑病得到了改善。次年Uchino等报道了用组合型人工肝治疗无肝犬,他用犬的肝细胞培养在胶原覆盖的硼盐玻璃器皿中,然后置入丙烯酸的容器中,证实了合成尿素,糖原和白蛋白的功能达两周,并维持凝血酶原时间、氨的代谢在正常水平,使无肝犬存活65小时[15]。而最近研究最多的是Rozga他于1994年报道了组合型人工肝的临床应用,1995年报道了用人工肝治疗8例急性肝细胞衰竭患者,其中前3例用的是生物人工肝,后5例用的是组合型人工肝,皆取得了好的临床效果。1997年Watanabe与Rozga等报告了用组合型人工肝治疗31例严重肝衰的病人,所用的装置是将5×10/ml猪肝细胞粘附在胶原覆盖的葡萄糖微载体上,再接种到由醋酸纤维素制成的中空纤维壁外间隙;当病人血浆分离后先经过纤维素包裹的活性炭吸附,再灌注到中空纤维管内循环。另外在装置中配有温度调节和氧合装置以便为细胞提供生理环境。所有病人分为三组:第一组为暴了性肝功能衰竭患者,共18人,经治疗后16例成功地用人工肝作为桥梁而行肝移植术,一例病情恢复后没有行肝移植,另一例死于伴发严重的胰腺炎;第二组有3人,为肝移植后的最初无功能患者,皆成功地用人工肝作为桥梁而实行了肝的再移植术;第三组有10人,为慢性肝脏疾病的急性恶性化,治疗后有2例病人肝功能恢复后成功地行肝移植术,其它8人虽用人工肝得以支持,但因不适合行肝移植而死亡。这是互到目前为止临床应用组合型人工肝最令人鼓舞的结果。
5、组合型人工肝的问题与展望
5.1 问题
尽管组合型人工肝可以提供体外解毒、代谢、合成和调节功能,但仍有以下问题:(1)仍然不知道用何种来源的细胞为佳;(2)分离后的肝细胞怎样才能维持分离前的高度分化形式和活性;(3)对异种肝细胞的排斥反应未完全解决;(4)由于人工肝需培养大量的肝细胞,而生物反应器未按比例地发展;(5)目前生物反应器的膜设计是为其它方面的用途,而不是专为满足肝功能辅助装置的需求[12];(6)生物反应器的设计迄今为止不太注意流体力学、几何学以及细胞量在生物反应器上分布;(7)对急性肝功能衰竭的病生理了解不够,如不了解某些因子的特性,很难推测限定这些因子运输的因素,也不可能制造出理想的膜[17]。
5.2 展望
今后,理想的组合型人工肝是最有希望的人工肝辅助装置[4.10.18]。下列几个方面需加以发展:(1)发展具有分化功能的正常人类肝细胞系,有能力扩增胎干或成人肝细胞以诱导它们的分化功能,以使用于人工肝装置中,在这方面基因工程是有希望的;(2)在细胞培养中通过用新型的基质、生长因子以及与其它类型的细胞共同培养,将肝细胞聚集成球形或细胞簇来增强肝细胞的分化功能[19];(3)改进肝细胞的冷冻保存技术,以便容易运输这一装置;(4)新型的生物反应器应相当准确地按比例发展,并应注意流体力学;(5)生物反应器的膜设计应满足人工肝辅助装置的需求,且应有专一性;(6)加强对肝功能衰竭的病生理研究,以能设计出更合理的人工肝辅助装置;(7)发展灵敏的测定肝功能方法,并用严格的临床随机对照,以便更好地评价人工肝辅助装置[20]。
总之,人工肝辅助装置是一个综合性复杂的研究课题,需多学科的密切合作。我们相信未来的人工肝极有可能像人工肾曾给肾功能衰竭的治疗带来革命性变化一样,为急性肝功能衰竭的现代化治疗提供最大的希望。
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二十一世纪的生命科学将是基因科学,随着人类基因组图谱的全部破译,基因治疗肿瘤将使医学科学进入一个崭新的时代。基因治疗技术研究的迅速发展,IL-24在肿瘤治疗方面将会是一座新的里程碑。
基因治疗恶性实体肿瘤是临床医生面临的挑战性课题,由于肿瘤易转移的特性,使手术、化疗和放疗等传统治疗方法对晚期肿瘤的治疗有限。研究表明,肿瘤生长的关键因素是血管形成,实体瘤表达,如血管生长因子、碱性成纤细胞生长因子和血小板源性生长因子等血管形成介导肿瘤产生新血管,利用原发肿瘤的血管的形成而转移。因此,寻找抑制肿瘤生长和血管形成进而阻止肿瘤转移的方法尤为重要,基因疗法为恶性实体肿瘤的治疗提供了这种可能性。理想的功能基因表达产物应能诱导肿瘤细胞调亡、抑制肿瘤生长和肿瘤血管形成,对正常组织细胞无明显毒副作用。白细胞介素-24(IL-24)具有上述功能。目前,利用白细胞介素-24(IL-24)对恶性肿瘤的基因治疗,是发达国家的研究热点之一。
白细胞介素-24(IL-24)是1995年JiangH等人首先克隆并分离出该细胞因子,原名称黑色瘤分化相关抗原(mda-7),2002年,mda-7因其分子结构、基因定位和细胞因子样特性而被正式命名为白细胞介素-24(IL-24)。
研究表明,借助腺病毒表达载体,将人白细胞介素-24基因转染肿瘤细胞,可特异性抑制肿瘤细胞生长,诱导其调亡,但不会影响正常细胞。IL-24的这种作用在至少50余种人类恶性肿瘤细胞实验中得到证实,包括黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、前列腺癌、胰腺癌等。可以认为IL-24是目前发现的唯一能即抑制肿瘤细胞生长又表达刺激免疫系统的蛋白基因。目前,P53、P10、Rb等抑癌基因正在用于基因治疗的临床试验(其中重组人P53腺病毒注射液已在我国生产上市,也是世界上第一个上市的基因治疗药物),但均不具有通过刺激免疫应答来杀伤肿瘤细胞的特性。所以,通过比较可以证明IL-24的研究有着重要的临床意义。
通过腺病毒介导人IL-24基因进行治疗肿瘤的基因治疗的技术,具有非常重要的社会、理论和临床意义。基因治疗产品使细胞产生内源性的目的蛋白质或多肽,产生特异的生物治疗。基因治疗使给药更加特异、高效和安全,达到医学科学所期望达到的最高目标。基因治疗药物将对基因工程蛋白质或者肽类药物也形成严重的挑战,用基因治疗方法可代替反复使用、费用极高的蛋白质药物,一次注射,可带来长久的疗效或根治。
据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年有500多万人死于各种癌症,每年各种癌症患者多达2200万人。我国每年约有600万肿瘤患者,假如有百分之一的患者使用“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”,治疗一个疗程,用药20支,其用量为120万支,按每支2000元人民币计算,国内市场为24亿元人民币,国内外市场的百分之一为44亿元人民币。所以,基因治疗肿瘤是关系到广大患者生命安全和生活质量的高科技项目。
该项目是我单位独立研究的基因治疗项目,现已独立完成了人白细胞介素-24基因的克隆。从中国人外周血中分离的单核细胞中克隆出人白细胞介素-24的基因,经测序与国外公布的人IL-24的基因序列一致,说明我们已得到人IL-24的基因。正进行重组腺病毒载体的构建。
本单位是生物医药研究、开发、生产、经营的专业化企业,是山东省高新技术企业,十余年来承担了多个项目的研究。独立研究的IL-2(125ser)是山东省火炬计划项目、IL-18是2002年山东省重大科技攻关项目、G-CSF是济南市星火计划项目、α-2b干扰素抗病毒口含片是2003年山东省SARS综合防治技术研究药物开发中标项目、重组人新型溶栓酶是2003年济南市科技发展计划项目,其中IL-2(125ser)获省、市、区科技进步奖,并获国家科技部等五部委联合颁发的《国家重点新产品证书》。有较强的生物技术药物研究开发能力。
该项目的成功开发及产业化,势必将带动我国整个生物高新技术的发展,并构成一个生物高技术平台,一个巨大的产业,一个新的经济增长点。同时,不仅能够在临床上有着重要的治疗意义,而且能够对广大肿瘤患者提供一条崭新的治疗途径,也将会对生命科学的发展和山东省经济的发展起到一定的作用。
二、国内外现状和发展趋势:
经检索,在国内,只检索到军事医学科学院和苏州大学细胞和分子生物学教研室对IL-24基因的克隆及在大肠杆菌中的表达文献,未发现利用腺病毒介导人IL-24基因来治疗肿瘤的报道。也未发现利用Admax腺病毒表达系统来介导人白细胞介素-24基因治疗肿瘤的专利。所以,我单位研制的重组人白细胞介素-24腺病毒注射液可形成自己的知识产权。
在国外,只有美国等少数发达国家对携带IL-24基因的重组腺病毒进行研究,尚未有对其开发成药物的报道。
目前国内未发现有对IL-24进行药物研究的单位和个人。
我单位从上世纪八十年代中期开始对生物技术进行研究,基本与国外同行业同步。已独立研制成功了IL-2(125ser)、IL-18、G-CSF、α-2b干扰素抗病毒口含片、重组人新型溶栓酶等生物技术高科技成果产品。拥有一支素质较高、经验丰富的科研队伍。已对该项目进行了一年多的研究,已完成人白细胞介素-24基因的克隆。从中国人外周血中分离的单核细胞中克隆出人白细胞介素-24的基因,经测序与国外公布的人IL-24的基因序列一致,证明我们已得到人IL-24的基因。正进行重组腺病毒载体的构建。基因治疗的关键技术是表达系统,腺病毒表达系统被广泛用于基因治疗、基因功能性研究、反义治疗、疫苗开发等领域。我单位利用Admax腺病毒表达系统来介导人白细胞介素-24基因治疗肿瘤,Admax腺病毒载体系统比现有的其它腺病毒载体系统更有优势,具有构建简单、出毒快、单细胞病毒产量高等优点。
三、现有研究基础、特色和优势
1、现阶段已达到的主要技术指标和经济指标
(1)现阶段已完成人白细胞介素-24基因的克隆。
(2)从中国人外周血中分离的单核细胞中克隆出人白细胞介素-24的基因,经测序与国外公布的人IL-24的基因序列一致,说明我们已得到人IL-24的基因。
(3)正进行重组腺病毒载体的构建。
2、项目的创新点及在人才、资源和产业方面的特色优势
重组人白细胞介素-24腺病毒主要创新点:
(1)、白细胞介素-24是新发现的抗肿瘤细胞因子,国内外均未上市。
(2)、利用Admax腺病毒作载体将IL-24基因介导到人体,对肿瘤细胞进行基因治疗的方法。
腺病毒载体系统一般应用人类病毒作为载体,以人类细胞作为宿主,因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。
腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞,因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。特别需要指出的是:腺病毒具有嗜上皮细胞性,而人类的大多数的肿瘤就是上皮细胞来源的。因此,腺病毒载体系统具有靶向性,使其可以靶向特定的组织或细胞内复制增殖,表达目的基因,直接作用于病灶,抑制肿瘤细胞生长,诱导其调亡。
(3)、Admax腺病毒表达载体具有构建简单,出毒快,单细胞病毒产量高等特点。
Admax腺病毒系统是由腺病毒载体鼻祖Dr.FrankGraham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统,该系统基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶,使共转染到293细胞中的腺病毒载体穿梭质粒和辅助质粒(腺病毒基因组质粒)在重组酶的作用下产生重组腺病毒。得到的重组病毒是E1/E3缺失的复制缺型腺病毒。与目前使用最普及的AdEasy系统相比,有一定的优势:AdMax系统只需要2~4周就能完成从质粒构建到重组出毒,成功率大于98%(其中95%的克隆含有目的基因),因在真核细胞内重组出毒,保持了对腺病毒的生存压力,有助于重组腺病毒的基因组的完整性;而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34%(Stratagene公司新版的AdEasyXL系统成功率在94%左右),且在原核细胞(BJ5183)中完成病毒基因组重组,理论上,失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变,病毒遗传背景及活性可能会受到影响。
人才、资源和产业方面的特色优势:
本单位是山东省科技厅认定的高新技术企业及重点联系单位。在人才、资源和产业化方面具备如下优势:
1、有研究开发基因药物的专业机构--生物技术研究所。配备有较完善的科研生产检测仪器和设备(DNA合成仪、PCR扩增仪、70L贝克曼的发酵罐、发玛西亚的蛋白层析系统、Waters的高效液相、万级净化级别的实验室等)。
2、拥有一支经验丰富、老中青相结合的科研队伍。已开发出的国家级新药“重组人白细胞介素-2(125ser)”和“重组人粒细胞集落刺激因子”,并已获得国家药品监督管理局颁发的新药证书和批准文号,现已投放市场。
3、有一座4000m2的GMP标准的生物药品生产车间(GMP证书编号:C1064),年生产药品能力可达千万支。
4、有完善的科研协作网络。我单位与“美国俄亥俄州立大学分子生物学中心”、“中国协和医科大学”、“山东大学药学院”等国内外大专院校和科研院所有紧密合作关系。本项目是与中国协和医科大学共同合作研究的科研项目。
5、我单位科研工作经验丰富,承担过省、市、区级科研项目多项。
上述条件,为“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”的研制奠定了基础。
四、应用或产业化前景、市场需求
人白细胞介素-24(IL-24)是目前发现的唯一能即抑制肿瘤细胞生长又表达刺激免疫系统的具有双重功效的蛋白基因。研究表明,借助腺病毒表达载体,将人白细胞介素-24基因转染肿瘤细胞,可特异性抑制肿瘤细胞生长,诱导其调亡,但不会影响正常细胞。IL-24的这种作用在至少50余种人类恶性肿瘤细胞实验中得到证实,包括黑色素瘤、神经胶质细胞瘤、骨肉瘤、乳腺癌、子宫颈癌、肺癌、结肠癌、鼻咽癌、前列腺癌、胰腺癌等。
全世界每年有500多万人死于各种癌症,每年各种癌症患者多达2200万人。我国每年约有600万肿瘤患者,假如有百分之一的患者使用“重组人白细胞介素-24腺病毒注射液”,治疗一个疗程,用药20支,其用量为120万支,按每支2000元人民币计算,国内市场为24亿元人民币,国内外市场的百分之一为44亿元人民币。
该项目产业化后,可年产100万支,实现产值20亿元人民币,年销售收入可达12亿元人民币,年利税6亿元人民币,年创汇2000万美元。
所以,基因治疗肿瘤是关系到广大患者生命安全和生活质量的高科技项目。同时,对包装、印刷、玻璃制品等行业起到带动作用。
五、研究内容与预期目标
研究内容:
1、人白细胞介素-24基因的克隆
2、重组人白细胞介素-24腺病毒的建立
3、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法的建立
4、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的抗肿瘤实验
总体目标
本项目预计投入800万元人民币。可完成基础性研究,获得重组人白细胞介素-24腺病毒注射液样品,整理出科研文献。
本单位现有资产1.6亿元人民币,员工116人。
经济目标
项目完成时,预计年新增产品销售额3000万元、年新增交税总额200万元、年新增净利润1000万元、年新增创(节)汇200万美元、年新增产值4000万元。
技术、质量指标:
参照国家«人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则»、«中国生物制品规程»、«中国药典»(2000年版)等要求建立重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法。着重对重组人白细胞介素-24腺病毒制品的病毒纯度、病毒滴度的测定和复制型病毒(RCA)、腺相关病毒检测的方法学进行研究。
1、比活性:病毒比滴度=病毒感染滴度/病毒颗粒数测定,>3.3%。
2、复制型病毒(RCA)的检测:A549细胞检测法,每3.0×1010VP中应
不高于1RCA(即≤1RCA/3.0×1010VP)。
3、腺相关病毒的检测:采用PCR法,应无腺相关病毒(AAV)的污染。
4、病毒纯度检测:采用高效液相色谱法或A260/A280法纯度大于95%。
本项目属科技攻关项目,主要是完成技术性研究,取得该技术领域的科研成果。产业化达产后,预计可实现产值10亿元人民币,年销售收入6亿元人民币,年利税3亿元人民币,年创汇1000万美元。用腺病毒携带IL-24基因治疗肿瘤的方法可形成专利。
六、研究方案、技术路线、组织方式与课题分解
1、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的技术方案
1.1重组人白细胞介素-24腺病毒的建立
(1)人白介素-24基因的克隆
从人外周血单个核细胞中提取mRNA,设计并合成特异引物,应用PCR的方法扩增得到人白细胞介素-24的基因片段。
(2)人白介素-24基因序列的确证
将用PCR扩增出的人白介素-24基因,进行测序,并与GeneBank报道的结果比较,以确定扩增的白介素-24基因序列的正确性。
(3)携带人白细胞介素-24基因腺病毒穿梭质粒载体的构建与鉴定
采用基因工程的方法,将人白细胞介素-24基因克隆至腺病毒穿梭质粒载体中,通过限制性内切酶图谱法鉴定人白细胞介素-24基因是否重组到腺病毒穿梭质粒载体中。
(4)重组人白细胞介素-24腺病毒的构建
通过脂质体转染技术,将携带人白细胞介素-24基因腺病毒穿梭质粒载体转染293细胞(人胚肾细胞),提取重组腺病毒DNA进行PCR鉴定。
(5)扩增前重组人白细胞介素-24腺病毒的空斑筛选
利用噬斑纯化方法,将感染重组腺病毒的293细胞进行培养,挑选出单个重组腺病毒,以保证扩增的纯度和稳定性。
(6)重组人白细胞介素-24腺病毒的扩增、纯化
将经噬斑纯化获得重组腺病毒大量感染293细胞,以大量生产重组腺病毒。待感染病毒的293细胞成熟后收获细胞,经反复冻融及离心等方法,除去细胞碎片,收集上清,获得重组腺病毒。并通过超滤和离子交换的方法来纯化和浓缩重组腺病毒,从而获得大量、高滴度、高纯度的重组人白细胞介素-24腺病毒样品。
1.2、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法的建立
参照国家«人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则»、«中国生物制品规程»、«中国药典»(2000年版)等要求建立重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法。着重对重组人白细胞介素-24腺病毒制品的病毒的纯度、病毒滴度的测定和复制型病毒(RCA)、腺相关病毒检测的方法学研究。
(1)比活性:病毒比滴度=病毒感染滴度/病毒颗粒数测定
(2)复制型病毒(RCA)的检测:A549细胞检测法,每3.0×1010VP中应不高于1RCA(即≤1RCA/3.0×1010VP)
(3)腺相关病毒的检测
采用PCR法,应无腺相关病毒(AAV)的污染。
(4)病毒纯度检测
采用高效液相色谱法或A260/A280法纯度大于95%。
1.3重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的抗肿瘤实验
将重组人白细胞介素-24腺病毒注射到肿瘤细胞,观察重组人白细胞介素-24腺病毒抗肿瘤效果。
2、本企业在生产场地、公用工程、辅助设施等方面已具备的条件和需新增加的基本建设内容。
我单位有研究开发基因药物的专业性生物技术研究所,有着从事多年生物技术药物研究和开发经验,曾研制出“注射用重组人白介素-2(125Ser)、注射用重组人白介素-18、α-2b干扰素口含片、新型溶栓酶”等高科技生物药品,具有良好的科研基础。配备有较完善的科研生产检测仪器和设备:DNA合成仪、PCR扩增仪、70L贝克曼的发酵罐、发玛西亚的蛋白层析系统、Waters的高效液相、万级净化级别的实验室等。现有生物药品GMP生产车间和两条生物药品生产线,具备良好的生产条件。
3、述生产过程中“三废”排放、“三废”处理的措施和生产过程中职业危害因素分析及采取的保护措施方案。
重组人白细胞介素-24腺病毒注射液研制和生产过程,无三废排放。
4、特殊行业许可证报批情况
我单位企业法人营业执照(执照号:3700001806768)、药品生产企业许可证(证号:鲁01Sz20010020)和药品GMP证书(证书编号:C1064)等证照齐全。
5、说明本项目推广应用计划和保障措施
(1)本项目研制成功后,我单位自行生产。
(2)本单位有一座4000m2GMP标准的生物药品生产车间,具有完备的生产仪器、设备,年生产能力可达上千万支生物制剂。
(3)本单位有专业销售公司,销售网络遍布全国30多个省市自治区,本项目产业化后即可上市推广。
(4)该项目有着巨大的社会意义和经济效益,公司对该项目极为重视,不但组织了科研能力较强的专职研究队伍,加大资金的投入,而且组织了由5位国内著名院士、6名知名专家组成的专家组,对“重组人白细胞介素-24注射液”基因治疗项目进行了论证指导,保证了本项目的可行性。
七、年度计划内容:
本项目计划为三年
2006年1月-2006年6月载体的构建经费投入预计300万元
2006年7月-2006年12月载体的鉴定经费投入预计100万元
2007年1月-2007年6月重组腺病毒的扩增纯化经费投入预计100万元
2007年7月-2007年12月重组腺病毒的质量研究经费投入预计100万元
2008年1月-2008年12月重组腺病毒的抗肿瘤细胞实验经费投入预计200万元
八、主要研究人员和单位简况及具备的条件
1、主要参加人员情况
邹立家,研究生导师,药理、药学专业教授,在药理、药学学科方面有着很深的造诣和贡献,有著作5部,科研成果8项。曾参加研制开发IL-2(125Ser)、IL-18的工作;现参加白介素-24(IL-24)的研制开发工作,并任课题组负责人。
韩代书,博士、教授,中国协和医科大学博士生导师,细胞生物学专业教授,在细胞生物学学科方面有着很深的造诣和贡献,有数十篇论在国际刊物上发表。是本单位科研课题组主要成员。
王加旺,博士,微生物专业,有6篇论文在国家级刊物上发表,曾参加IL-2(125Ser)、IL-18的工作、α-2b干扰素抗病毒口含片、新型溶栓酶等项目的研究开发,是本单位研究所课体组主要成员。
苑波,博士后、教授,长期在美国从事基因组学科技研究,是美国著名的基因组学科学家,2003年被美国政府评为“十大科技青年”,近年来一直与我单位合作。
课题组其他成员均在生物技术研究所长期工作,是“注射用重组人白介素-2(125Ser)”课题组原班人马,他们在“白介素-2(125Ser)”、“rhG-CSF”和“IL-18”等高科技产品的研制开发过程中做了大量的工作,取得了优异的成绩,被济南市科技局评为“科技先进集体”、被济南市药监局评为“科技进步先进集体”。
2、单位法人近几年来研究开发业绩
我单位法人长期从事科研工作,带领企业承担了国家级、省级、市级星火计划、火炬计划、科技攻关、技术改造、重点工业项目等十几项科研开发及产业化项目,被广泛应用于社会各重要领域,多项成果填补了国家空白,取得了令人瞩目的成绩,受到各级政府和社会各界的充分肯定和高度评价。
主要科技成果3项,科技著作2部。并领导本单位全体科研人员研制出了“注射用重组人白介素-2(125Ser)”、“重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)”、“注射用重组人白细胞介素-18(IL-18)”、“新型重组溶栓酶”、“α-2b干扰素口含片”等多项生物技术药物。“注射用重组人白介素-2(125Ser)”和“重组人粒细胞集落刺激因子注射液(rhG-CSF)”两项新药分别被列为《国家星火计划项目》和《山东省火炬计划》,《山东省技术改造导向计划》,《济南市三十项重点技术改造项目》。其中“注射用重组人白介素-2(125Ser)”的各项主要技术指标,均达到国际领先水平,填补了国内空白。被国家五部委(中华人民共和国科学技术部、国家税务总局、中华人民共和国商务部、中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、国家环境保护总局)认定为“国家重点新产品”,获山东省科技进步一等奖。
在抗癌科研方面也做了长期大量的工作,正式发表的文章已被国外学术杂志引用,被聘为“山东省抗癌协会”常务理事,2002年被“国际儿童癌症治疗联合会”聘为高级顾问。
企业投资上亿元建起了生物工程药品生产基地。建有GMP生物制药生产车间、科研综合楼、办公楼等16000多平方米的基础设施,并从发达国家引进了先进的科研、生产设备仪器,建立了产学研一体化的产业基础。
3、单位技术装备水平、实验仪器状况。
(1)我单位现已具备4000m2的GMP生产车间(GMP证书编号:C1064)
(2)研究开发基因药物的生物技术研究所,多年从事生物技术药物的研究和开发,具有良好的科研基础。
(3)研究所配备有较完善的科研生产检测仪器和设备:DNA合成仪、PCR扩增仪、70L贝克曼的发酵罐、发玛西亚的蛋白层析系统、Waters的高效液相和万级净化级别的实验室等。
九、经费预算
项目总投资800万元,申请科技三项经费100万元,自筹440万元,银行贷款250万元,省科技经费拨款10万元。其中已完成投资100万元。
划项目可行性研究报告
编制提纲
一、立项的背景和意义
主要说明:
1、技术来源,包括国外技术、国内技术、自有技术及合作开发、引进消化吸收。
2、研发形式,包括与本市、本省、国内外院校及研发机构合作。
3、曾列入国家哪类科技计划项目、获奖及专利情况。
4、对国家或我市经济和社会发展的意义作用。
二、国内外现状和发展趋势〔包括知识产权现状〕
主要说明:
1、国内外基本情况及发展趋势。
2、申请承担单位目前研发应用情况。
三、现有研究基础、特色和优势
主要说明:
1、现阶段已达到的主要技术指标和经济指标。
2、项目创新点及在人才、资源和产业方面的特色优势。
四、应用或产业化前景、市场需求。
主要说明:
1、结合发展趋势和基础优势说明,主要应用领域及对相关产业的带动作用及国内外市场需求。
2、具体说明已有和有待开发的市场情况。
五、研究内容与预期目标(此栏目各项指标是项目立项后,签定合同的主要内容,也是项目验收的主要依据)
1、总体目标,包括项目执行期间预计投资总额、项目完成时实现年生产能力、单位资产规模和单位人员规模等。
2、经济目标,包括项目实施期间实际达到的年度指标、完成时预计可实现的年销售收入、年交税总额、年净利润、年创汇额等。
3、技术、质量指标,包括项目完成时,项目达到的主要技术性能指标、单位通过的质量认证体系、产品执行的质量标准、产品通过的国家相关行业许可认证以及获得专利等知识产权情况。
六、研究方案、技术路线、组织方式与课题分解
主要说明:
1、技术方案,指技术路线、关键技术、工艺流程,主要技术参数等。
2、本企业在生产场地、公用工程、辅助设施等方面已具备的条件和需新增加的基本建设内容。
3、简述生产过程中“三废”排放、“三废”处理的措施和生产过程中职业危害因素分析及采取的保护措施方案。
4、特殊行业许可证报批情况,包括国家专卖、专控产品、医药产品、交通、安全产品、压力容器产品、电信产品等许可报批情况说明。
5、说明本项目推广应用计划和保障措施。
6、组织方式与课题分解,如果是两家以上单位联合承担,须说明具体分工及联合优势。
七、年度计划内容
分年度说明项目执行过程中的年度目标;年度工作内容及经费投入。
八、主要研究人员和单位简况及具备的条件
(注:可行性研究报告中单位名称和研究人员的姓名不得出现,单位名称均以“本单位”代替,否则视为无效)
主要说明:
1、主要研究人员情况,需说明所学专业、现从事专业、学历、学位、技术职称、职务及取得的主要科技成果或论文、专利等。
2、简述单位法人及近几年来研究开发业绩。
3、简述单位技术装备水平、试验仪器状况。
九、经费预算