代写情书精选(九篇)
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第1篇：代写情书范文
摘要：总体看来，研究者对浪漫抒情小说在20－40年代流变的梳理显得相对较少，其中有许多的问题需要继续探讨，比如浪漫主义小说为何在20年代走上全盛，在不同的年代各自有什么特点，这些问题都亟待解决。本文试图从横纵坐标图中梳理出浪漫抒情小说的特点，窥视其创作流变过程。一方面，从横向看，浪漫抒情小说的共同的特点，使其成为独立的存在。纵向看，在不同时展也显现出与其他流派的不同特点；另一方面，横向轴上不同题材的浪漫抒情小说之间也存在着异同，这也需要在时间的纵轴上仔细分析，以便把握它们的发展脉络。
关键词：浪漫抒情小说；自我；田园
一方面，从横向看，浪漫抒情小说有许多独特的创作方法及其他共同的特点，这使我们将它们归结为浪漫抒情小说这一派别，从而区别于其他流派，成为独立的存在。最明显的是区别于现实主义小说的提出社会问题激发思考，客观叙述、典型塑造及布局严谨，浪漫主义的风格特征是“自我小说”(1)、感伤抒情、体式的散文化及诗化，尤其“在我国小说的体式发展上具有极大的新鲜性”(2)。纵向看，浪漫抒情小说在不同时展中显现出与其他流派的不同特点；另一方面，横向轴上不同题材的浪漫抒情小说之间也存在着异同，这些不同则反映了浪漫抒情小说自身的复杂多变性，这些不同，同样需要我们在时间的纵轴上仔细分析，以便把握它们的发展脉络。本文以浪漫抒情小说题材中比较具有代表性的自我和田园浪漫抒情小说为例，时间上划分为20年代前中期上延至清末民初、20年代末至30年、40年代三个阶段，尝试着从横纵坐标图中梳理出浪漫抒情小说的特点，窥视其创作流变过程。
一、自我的浪漫抒情小说在20－40年代的新陈代谢
20年代前中期上延至清末民初的感伤的浪漫抒情小说，要求个性解放尊崇自我价值而又遭到社会压抑的年轻一代，在本国文学承传和外国抒情文学的双重影响下，用写作表达内心激情，形成了独特风格。1、20世纪初西方世纪末文学思潮影响下自我的浪漫抒情小说形成了感伤、忧郁、颓废的特点。比如郁达夫的《沉沦》；2、俄国多余人形象，这是俄国世纪末情绪的体现，在其影响下我国浪漫抒情小说也带有零余者的特点。比如郁达夫、郭沫若笔下的主人公，多是多余人；3、日本私小说的自然主义式的自我袒露结合世纪末情绪和多余人气质，在此风笼罩下的中国自我浪漫抒情小说演化为感伤的自叙心理倾诉，常用日记体、书信体。这在郁达夫、郭沫若和其他创造社作家中有明显都体现；4、中国古代文学感伤传统和中国文人固有的抒情气质影响此时的中国自我浪漫抒情小说，表现为常从古代文学中取材与意境。比如倪贻德《花影》、郭沫若《行路难》分别取意境于李后主的词和李白的诗；5、加之封建王朝濒临末世使得20年代前中期上延至清末民初的自我浪漫抒情小说有着悲凉感伤情调。比如苏曼殊《断鸿零雁记》。(3)种种因素最终促成20年代个人浪漫抒情小说走向全盛。创造社的、浅草一沉钟社的陈翔鹤、林如稷等“艺术派”作家为浪漫主义抒情小说创作的主干；甚至少数文学研究会的作家也不乏浪漫抒情小说的创作，如庐隐《海滨故人》王以仁的《孤雁》；还有新潮社时期的罗家伦。
20年代末至30年代坚守自我的作家也不少，浪漫抒情小说仍然绵延不绝。这一时期的自我的浪漫抒情小说与前一个时期相比有许多异同。相同之处在于1、即使在30年代革命文学和普罗文学创作中，走向左翼，走向健康热烈积极向上时，作家的自我情感也还是无法彻底回避的因素，感伤色调依然时隐时现。并在一定意义上反映着世纪末的某种病态。2、这一时代的感伤较之20年代的来自于作家对时代社会极不适应的过敏反应，仍旧比较明显的反应在30年代，这体现了20到30年代的传承关系。这在丁玲的《沙菲女士的日记》和柔石的《二月》上有明显的体现。3、30年代作家笔下具有20年代浪漫抒情气质的形象不胜枚举；主要的不同：20年代末至30年代初，由于时代风云的变幻，许多作家逐步转向，纷纷从小我走向社会这个大我，浪漫抒情小说面临被检讨、批判、否定的命运。20年代感伤的集中、典型，在30年代自我浪漫抒情小说在时代因素影响下走向淡化，形成逐步敛缩的局面。20年代末至30年代的自我的浪漫抒情小说更有自己的特色，作家像悖时的文人发出的病态。
30年代至40年代经过战火的磨炼，文学史上坚守自我的作家仍占相当的比重。他们中的不少人对于浪漫抒情依然持有浓厚的兴趣，40年代的自我的浪漫抒情小说虽然敛缩，但注定不断延续。总特点是理性主义的发达。如在中国的现代派作家的笔下，虽主要反映现代性，但倒是充满浪漫抒情情调。如无名氏《塔里的女人》、《北极风情画》，这些小说中有些情节场景也写得很感伤，有五四式感伤气质，有浪漫抒情的情调。
二、田园的浪漫抒情小说在20－40年代的新陈代谢
田园浪漫抒情小说(包括乡野浪漫抒情小说)，这一类型的小说与乡土文学有着明显的相似及不同之处。两者联系密切，纠缠发展，因而乡土写实常常与田园浪漫抒情小说相混淆，这需要我们认真的理清它们之间的区别之处。
20年代前中期鲁迅的作品《故乡》传达出的实际上就是浪漫的自然和自然人的观念。许钦文前期的写作实际上是他开手写乡土文学前，在寻找一种精神家园，他们都为田园浪漫抒情小说奠定了基础。他们的作品类似于乡土文学，注重真，而其中美和善却缺失。正式开启田园浪漫抒情小说的是处在20年代的废名，他的田园浪漫抒情小说明显突出特征是忧伤与玄。另外的如郁达夫的《沉沦》，也有对自然的溢美之词。
30年代乡土文学中因传达这种流行着的、感伤的怀乡病而体现浪漫抒情风格，但同时显示出异色。20年代的乡土文学基本上是现实主义风格，30年代所写的田园抒情小说以现代文明的弊端为参照来反观心目中遥远的乡村，常带有一种主观的理想的色彩，比如废名、沈从文，他们是对田园浪漫抒情继续与开拓。带着优美、健康而理想的人生设计特点的田园浪漫抒情小说。人们误把“他们笔下的风情画面都被当成了乡土写实的缘故。”(4)所以把他们当做乡土写实的作家来看待，他们实际是浪漫抒情小说发展的新的阶段。在30年代中期达到顶峰，但同时也意味着走向衰退。20年代没有家园，逃离家园，出去流浪，30年代回到家乡，寻找失落的家园。小说家们找回了过去的梦，但发现这时的家园已经不是自己心目中的理想的家园。梦想已经破灭，这是更进一步的精神家园的失落。这两个时代共同之处是作家所刻画的人物一般都经历着漂泊、寻找、失落三部曲。
40年代的汪曾祺继承接续、丰富和扩展田园浪漫抒情小说。后来他又创了寻根小说的先声。
第2篇：代写情书范文
l材料与方法
1．1实验场地选择
2010年7月一2010年11月，在广东省汕尾市红海湾鸿泰养殖场，从10口凡纳滨对虾高位精养池塘中随机抽取6口池塘进行采样。各池塘面积约为(0．45土0．1)hm2。池底铺设土工膜，无泥沙层，水深1．8～2．2m，养殖用海水经沙滤井过滤所得。每口池塘配备12～15kw／hm2的增氧设备(增氧机和底部增氧曝气管)。放养凡纳滨对虾∞f^妒e刀口P螂1，口刀，z口mef)虾苗体长(1．0士0．1)cm，放苗量为270万尾／h“。
1．2材料及方法
1．2．1样品采集采样时间和频率按照养殖时间划分。在第一批放苗的五口池塘中随机选取卜3号3口池塘。从放苗日起，跟踪其养殖全程，时间从2010年7月31日到同年11月24日，约14d取一次样，跟踪时长116d。根据第一批的调查结果，在第二批放苗的5口池塘中随机选取4—6号3口池塘从放苗后的第10天起，进行养殖密集采样跟踪，时间从2010年9月18日到同年11月20日，采样时间为7天1次，跟踪时长63d。第二批采样池塘均因wSS暴发而中断养殖。所取虾样均为活虾，每次每塘随机采集对虾不少于15尾，分别采集对虾的鳃和肌肉组织，用浓度为75％的酒精固定。
1．2．2DNA的提取将每次采集的15尾对虾随机分成3组，每组5尾。任选一组，并分别取5尾虾的鳃或者肌肉组织混合成一个样品，鳃组织样品总质量为(15士2)mg，肌肉组织样品总克数为(20土3)mg。各组织样品DNA采用“天根海洋动物组织DNA提取试剂盒”(天根生物技术有限公司制造)提取。所提取的DNA样于一20℃保存待测。
1．2．3Real．timePCR引物和探针引物和探针的选择。根据DurandandLi曲tner【6J设计，由Invitrogen公司合成(表1)
1．2．4Real．timePcR反应参照Li曲tIler等旧1建立的实时荧光定量PcR法检测wSsV使用Eppendorf荧光定量PCR仪(EppendorfMastercy-clerRealplex)进行定量PcR检测。选取20“LPcR反应体系：1O灿2xTaqManUniversalPCRMasterMix(TAKARA公司，代号DRR039A)，上下游引物各0．5灿(终浓度为10“m01／L)，探针0．5皿(终浓度为5“mol／L)，模板DNA2此，补充水至20此。PCR反应参数：95℃30s；95℃5s，55℃15s，72℃30s，40个循环，每个样品重复4次，每批样品设置空白对照和阳性对照。空白对照用灭菌超纯水作模板，阳性对照用已知病原虾提取的DNA调整浓度后作模板。
1．2．5标准品的制备和标准曲线的建立阳性质粒标准品制备根据Lightner[6]利用插入外源目的基因的方法得到纯化阳性质粒DNA，其浓度为1．618×108copy／此。用10倍稀释阳性质粒至7个梯度作模板并对其进行扩增，其平均CT值依次为34．90、31．04、27．65、24．57、20．24、17．11、13．66，标准曲线如图l所示，R2=0．9991。
2结果与分析
2．1第一批放苗1～4池塘养殖全程对虾携带wSSv检测结果
2．1．114—34池塘对虾鳃组织中WSSV携带量在养殖全程中，14—3”池塘对虾鳃组织中wsSV携带量的动态变化如图2所示。从图中可以看出，3口池塘的对虾苗种均携带wssv，且其携带量均达到了103copy幢以上。随着养殖的进行，对虾鳃组织中wssV的携带量整体呈现波动上升的趋势。养殖前期上升幅度较小，最高携带量为1．o×105copy幢；到养殖60d左右，24、34池塘出现第一个波动高峰，此时鳃中wssV携带量最高可达到3．O×107c叩y／g。随后其病毒携带量有所下降；到养殖后期，1”一3“池塘的wssv携带量均有较大幅度的上升，均在养殖末期达到最大峰值。养殖全程中，14池对虾鳃组织wssv携带量的波动范围为1．6×103—8．6×106c叩y恒，平均值1．1×106cdpy／g；2”池对虾鳃组织wssV携带量的波动范围为1．9×10’~2．1×107c叩y儋，平均值4．4×106copy悖；34池对虾鳃组织wssv携带量的波动范围为6．2×103～9．7×108copy／g，平均值1．1×108copy／g。
2．1．21L3”池塘对虾肌肉组织中wsSv携带量在养殖全程中，1群一3j!j}池塘对虾肌肉组织中wssV携带量如图1所示，其动态变化情况与鳃组织中的趋势相似，均呈现波动上升的趋势，但整体低于鳃组织。结果显示，14养殖池对虾肌肉组织wssV携带量的波动范围为1．3×103～4．4×105copy／g，平均值3．2×105copy／g；24养殖池对虾肌肉组织wssV携带量的波动范围为2．1×103～6．1×105copy／g，平均值2．8×105copy／g；34养殖池对虾肌肉组织WssV携带量的波动范围为6．5x103～1．1×106copy／g，平均值3．3×105copy／g。1虻38池塘病毒含量(取对虾鳃和肌肉组织带毒量的平均值)，环境指标及养殖环境状况见表2。
2．2第二批放苗4L64池塘加密采样对虾携带WSSv的检测结果
2．2．14牝矿池塘对虾鳃组织wSSV携带量44—6“池塘对虾鳃组织WSSv携带量在养殖过程中的动态变化如图2所示。从图中可以看出，前期病毒携带量均较低，随着养殖的进行，3个池塘对虾鳃组织中wssv携带量逐渐升高，30d左右各池出现第一个波动高峰，wssV最高携带量为1．21×106copy／g，随后有所稳定和下降，但11月6日即养殖53d后，携带量快速增长。其中58池塘携带量在5天之内从2．3×105copy儋升高至8．2×1010copy／g，最终暴发wss，导致中断养殖，最后一次采样缺失：44、64池对虾wSSV携带量在后两次采样中迅速增加，最后一次采样11月20日(即养殖63d)时均达到各池检测的最大值(分别为6×106copy／g和5×107c叩y／g)，虽未达到发病阈值但两池最终也因暴发wsS而于11月27—30日停止养殖。调查结果显示，在整个养殖过程中，48池对虾鳃组织wssv携带量的波动范围为8．1×103～6×106copy／g，平均值8．6×105copy／g；5“养殖池对虾鳃组织wSsV携带量的波动范围为1．7×104～8．2×1010copy／g，平均值7．0×109copy／g；6”养殖池对虾鳃组织wSsv携带量的波动范围为5．7×103～5．0×107copy／g，平均值4．3×106copy／g。
2．2．24L6”池塘对虾肌肉组织中WSSV携带量44—64池塘对虾肌肉组织wSSv携带量在养殖过程中的动态变化如图2所示，其变化情况与鳃组织的趋势相似，均随养殖时间的进行逐渐波动上升，且无显著性差异。调查结果显示，4”池对虾肌肉组织WSSV携带量的波动范围为8．1×103～9．4×107copy／g，平均值1．1×1017copy／g；5“池对虾肌肉组织wSsV携带量的波动范围为1．7×104～1．2×1010copy／g，平均值1．1×109copy／g；6”池对虾肌肉组织wSSv携带量的波动范围为5．7×103～5．5×105copy／g，平均值1．1×10’copy／g。4牝64池塘病毒含量(取对虾鳃与肌肉组织带毒量的平均值)，环境指标及养殖环境状况见表3。3讨论TaqMan探针法荧光定量PcR是实时荧光定量PCR(Real．timePCR)的一种，可以针对微量的病毒进行检测并实时监测病毒的复制情况，其特异性更强，准确度更高，被广泛用于微量病毒复制的定量研究[7]。本研究采取实时定量PcR—TaqMan探针法，对高密度精养池塘对虾wssV携带量进行跟踪调查，以期能够更加准确的了解对虾养殖过程中体内wssv携带量的变化。本次检测结果表明，被测对虾苗种携带微量wSSV范围在1．3×103～1．7×104copy儋。虾苗携带病原体，说明了苗种生产过程中的病害控制还需加强，对育苗场销售的苗种病害监控还需严格【8J。整个检测结果表明，对虾鳃组织中的wssV携带量整体多于肌肉组织，且两者变动趋势一致，但没有显著性差异(尸>0．05)。在对14—3“池塘整个养殖过程的调查中，wssV携带量在养殖前期(47d前)都有不同程度的增加，但均处于一个较稳定的水平，wsSV拷贝数总体保持在104copy／g左右，个别值高于105copy／g；养殖中后期(60～116d)携带量呈现波动上升的趋势，并在最后一次采样中达到相对最大值。根据1“一34池塘中对虾体内wssv前期携带情况的调查，对第二批采样的4虻64号3口池塘进行密集采样，缩短了采样时间，增加了采样次数，以期更好的反应wssv的变化规律及其受各种环境因素影响所表现出的动态变化。在对4牝64池塘养殖的调查中发现，这3口池塘对虾携带wssV的情况与1L38池塘较为相似，前期病毒含量有一定程度的上升，但均处于一个较稳定的水平，除个别池塘外，wssv拷贝数多保持在105copy／g以下。然而53d后急剧上升，其中5”池塘升高至109copy／g以上，导致wSS暴发。44和64池塘也紧急收获，致使养殖中断。
第3篇：代写情书范文
关键词：常熟市；代谢综合征；调查
随着经济高速发展，生活方式的巨大改变，人群中肥胖、血脂异常、高血压病、糖尿病的患病率明显升高[1]。代谢综合征（MS）是多种代谢成分异常聚集的病理状态，发病率快速增长，其后果为冠心病、动脉粥样硬化、糖尿病，成为我国重要的公共卫生问题[2]。许多大城市相继开展流行病调查工作，为了了解我市农村社区的发病情况，于2013年对昆承湖社区进行调查分析，结果如下。
1 资料与方法
1.1一般资料 昆承湖社区有两个行政村合并而成，常住居民1830人，其中40以上居民有1209人，针对上述居民采取结合65岁以上老年人健康体检、50岁以上社保退休职工体检，及抽样体检的方法，实际检查1148人，其中男性591人，女性617人。
1.2方法
1.2.1问卷调查 采用自行设计的调查问卷，对1148例抽检人员的基本情况进行调查分析，内容主要包括人口学信息、代谢异常病史、慢性病家族史、饮食习惯、有无吸烟、饮酒习惯、体力情况等资料。由经过专业培训的相关成员担任本次研究的调查员，将问卷于社区卫生服务中心发放，对抽检人员的相关情况进行询问，并详细填写问卷，并由调查员当场收回。
1.2.2人体学指标测量 由经过专业培训的医务人员对1148例抽检人员的人体学指标进行测量，主要指标包括身高、体重、腰围、臀围、舒张压、收缩压、握力、视力、脉搏、听力、眼底检查、牙齿脱落情况以及5s起坐时间等。
1.2.3生化指标测量 集中分次，统一标准，对1148例抽检人员的生化指标进行测量，采集空腹静脉血，并低温保存，当日送至医院，并用日立全自动生化仪采取葡萄糖氧化酶法对其FPG（空腹血糖）、2hPG（餐后2h血糖）、TG（甘油三酯）与TC（总胆固醇）进行检测，同时对其LDL-C（低密度脂蛋白胆固醇，采取Friedewald等式计算）、HDL-C（高密度脂蛋白胆固醇，采取直接法）以及UA（尿酸，采取尿酸酶-POD法）等各项指标进行检测。
1.3诊断标准 中心性肥胖：男性腰围≥90cm，女性腰围≥80cm，另加下列4因素中任意两项：①甘油三酯水平升高：>150mg/dl（1.7mmol/L），或已接受针对此脂质异常的特殊治疗；②高密度脂蛋白胆固醇水平降低：男性
1.4统计学方法 应用SPSS16.0系统软件进行统计学分析，其中计量资料采用（x±s）表示，并应用t检验；计数资料应用χ2检验；且P
2 结果
2.1社区居民各年龄段发病情况 社区40岁以上人群中高血压、超重/肥胖、高血糖及血脂异常的发病率分别为20.3%、14.1%、6.0%、35.6%。其中40-50岁的患病率为9.7%，51～60岁的患病率为19.0%，60岁以上的患病率为22.9%。经χ2检验，40～50岁年龄段的发病率明显低于50～60岁、60岁以上年龄段人群的发病率，差异显著（P
2.2农村社区与通州城区MS发病率对比 农村社区MS发病例，发病率为17.0%；通州城区MS发病例，发病率为32.6%。在MS发病率上，农村社区明显低于通州市城区，差异明显（P
3 讨论
代谢综合征是多种代谢异常情形集结存在，包括糖尿病，或糖调节受损、高血压、血脂异常、肥胖、高胰岛素血症伴胰岛素抵抗，是引起心脑血管疾病的高危因素和导致人类致死、致残的主要原因之一[4-5]。随着社会的发展，社区居民的生活方式发生了明显改变，代谢综合征患病率日趋上升，初步统计我国MS患病率已达14%～18%。在人群中早期筛查并发现代谢综合征的高危人群，及时早期干预和预防，有重要意义。另外，对代谢综合征的防治应采取以改善胰岛素抵抗为基础的全面防治心脑血管危险因素的综合干预措施，大力宣传"合理膳食、适量运动、戒烟限酒、心里平衡"十六字健康方式，在社区积极开展以老年人（50、60岁以上）的文化体育活动，以减少静坐和活动减少带来的代谢性疾病，从而减少相应的并发症[6]。
本研究就常熟市社区1148例40岁以上居民进行调查研究显示，我市农村社区患病率达17.0%，明显低于城区（32.6%），两者比较差异显著（P
参考文献：
[1]徐成斌.代谢综合征[J].国外医学内分泌学分册，2005，25（1）：36.
[2]祝之明，徐成斌.应加强代谢综合征的研究和防治[J].中华心血管杂志，2005，33（2）：105-106.
[3]Zimmet P，Magliano D，Matsuzawa Y，et al.The metabolic syndrome：aglobal public healtproblem and a new definition[J].J Atheroscler Thromb，2005，12（8）：295-300.
[4]ISONAA B.A major health：metabolic syndromc[J].Life Sci，2003，73：2395-2411.
[5]青岛市糖尿病流行病学调查组，青岛市湛山社区20-74岁人群代谢综合症的流行病学调查[J].中华糖尿病杂志，2004，12（3）：177-181.
第4篇：代写情书范文
【关键词】 低聚原花青素;1型糖尿病;血脂;胰岛素
心血管并发症是糖尿病(diabetes mellitus，dm)的主要并发症和致死原因，而脂代谢异常是糖尿病患者发生心血管并发症的重要危险因素[1]。wWw.133229.Com天然抗氧化剂低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidin，opc) 由于具有降血糖、降血脂及免疫调节等作用和高效、低毒、高生物利用率等特点而受到医药界的广泛重视[2，3]，本文研究opc对1型糖尿病(type1 diabetes mellitus，t1dm)小鼠血脂代谢以及胰岛素表达水平的影响，为opc药物开发和应用于糖尿病及其并发症的防治提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂与仪器 opc:由葡萄籽和松树皮经红酒萃取，美国greensboro公司产品;链脲佐菌素(streptozotocin，stz)：美国sigma公司;accuchek active型血糖仪及血糖测试条：德国roche诊断有限公司;modular pp全自动生化分析仪及酶法检测配套试剂盒，包括总胆固醇(tc)检测试剂盒(chodpap法)、甘油三酯(tg)检测试剂盒(gpopap法)、高密度脂蛋白胆固醇(hdlc)及低密度脂蛋白胆固醇(ldlc)检测试剂盒(酶直接法)：德国roche公司;兔抗小鼠胰岛素多克隆抗体(antiinsulin)、过氧化物酶标记的链霉卵白素(streptavidin peroxidase，sp)试剂盒：北京博奥森生物技术有限公司;组织切片机、显微照相装置：德国莱卡公司。
1.1.2 动物 健康雄性昆明小鼠60只，体质量26～30g，由长江大学医学院实验动物中心提供。1.2 方法
1.2.1 糖尿病模型制作[4，5] 用ph4.4的0.1mol/l枸橼酸钠缓冲液新鲜配制stz溶液，按45mg/kg每日给50只小鼠行腹腔注射，连续5d。注射后小鼠自由饮水、进食标准饲料;每周1次采尾静脉血测定小鼠全血血糖值，空腹血糖值在12mmol/l以上的小鼠为糖尿病模型。
1.2.2 动物分组与opc给药 stz末次注射后2周，取40只糖尿病小鼠分为4组，每组10只，每天上午禁食2h后灌胃给药：①opc低剂量组：opc粉剂溶于蒸馏水按50mg/kg体质量给药;②opc中剂量组：opc 100mg/kg体质量;③opc高剂量组：opc 150mg/kg体质量;④糖尿病模型对照组和作为⑤组的正常对照小鼠(10只)灌胃等容量蒸馏水。
1.2.3 主要观测指标 试验过程中注意观察动物饮水量、进食量、尿量和体质量的变化及糖尿病症状表现;4周末小鼠空腹摘眼球取血，3000rmp/min离心分离血清，按试剂盒要求操作，检测血清tc、tg、hdlc、ldlc含量;处死小鼠取胰腺标本，4%多聚甲醛固定、石蜡包埋切片、脱蜡水化、微波抗原修复后，按sp试剂盒要求进行免疫组织化学染色(抗小鼠胰岛素抗体工作浓度为1∶300)、dab显色、苏木素复染、脱水、透明，中性树脂封片，最后显微镜观察、拍照。
1.3 统计学处理 计量实验数据以±s表示，组间差异性检验用spss11.5统计软件进行单因素方差分析。p<0.05为有统计学差异。
2 结 果
2.1 opc对dm小鼠症状的影响 试验过程中观察到t1dm模型组多饮、多食、多尿、体质量减轻等糖尿病症状典型并在试验过程中加重，而opc各组以上症状明显较轻且体质量仍有缓慢增加，表明opc具有缓解和改善糖尿病症状的作用。
2.2 opc对实验动物血脂的影响 糖尿病模型组表现为高血脂症，与正常组相比，血清tc、tg、ldlc显著增高(p< 0.01，p <0.05)，hdlc降低但不具统计学差异(p>0.05);与dm组比，opc组血清tc、tg、ldlc降低(p< 0.01，p<0.05)，表明opc主要降低tc、tg、ldlc，并以中、高剂量作用较大，但对hdlc的影响不明显，见表1。 表1 opc对糖尿病小鼠血脂含量的影响注：与正常对照组比较，*p<0.05，**p<0.01;与模型对照组比较，p<0.01，p<0.01。
2.3 胰腺免疫组织化学染色结果 显微镜下可见正常小鼠胰腺组织胰岛数目多，呈圆形或椭圆型，结构完整;t1dm组胰岛数目明显减少，形态结构改变甚至被破坏， 有不同程度的淋巴细胞浸润。(第89页彩色图版ⅰ之)图1示正常对照组胰岛结构完整，胰岛细胞呈深棕色，着色部位在胞浆，胰岛素高表达;(第89页彩色图版ⅰ之)图2示模型组胰岛结构破坏，多量淋巴细胞浸润，仅少量胰岛细胞着色，胰岛素表达明显减少;(第89页彩色图版ⅰ之)图3示opc组，胰岛结构相对完整，胰岛细胞着色浅但着色细胞明显多见，淋巴细胞浸润较少，表明由stz诱导的自身免疫反应有所减轻，胰岛素分泌增加。
3 讨 论
stz小剂量多次注射stz选择性破坏动物胰岛细胞， 使之释放自身抗原成分刺激机体免疫系统产生自身抗体，胰岛b细胞进行性损害，胰岛素合成受阻、缺乏， 导致自身免疫性1型糖尿病的发生。而胰岛素不足，脂肪组织摄取葡萄糖及从血中移出甘油三酯减少，脂肪合成减少;脂蛋白酯酶活性低下，血游离脂肪酸和甘油三酯浓度升高则引起糖尿病的脂代谢紊乱[6] 。本试验表明，糖尿病小鼠脂代谢明显异常，tc、tg和ldlc显著升高，hdlc也有降低;opc早期用药能显著降低糖尿病小鼠血中甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇，改善糖尿病小鼠的脂代谢异常。其作用机理可能是通过对糖尿病小鼠胰岛β细胞的修复作用，促进胰岛素分泌功能，从而起到减轻小剂量多次注射stz所诱导的胰岛自身免疫反应、调节脂代谢和改善症状的作用。由于脂代谢紊乱是糖尿病肾病和心血管病等并发症的高危因素，纠正糖脂代谢紊乱是减少和治疗糖尿病并发症的关键[1] ，因此opc的以上作用在减少糖尿病并发症，尤其是心血管并发症方面可能具有重要意义。opc目前主要用于保健品，但其作为降糖[7]、降脂及免疫调节的抗氧化药物用途方面的研究应用正在引起关注。鉴于我国的opc资源丰富，而糖尿病及并发症发生率高，我们的研究对opc的进一步开发和应用于防治糖尿病及其并发症方面具有积极作用。
【参考文献】
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第5篇：代写情书范文
[关键词] 硫化氢；代谢综合征；血糖；胰岛素
[中图分类号] R589 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）12（b）-0000-02
1988年，Reaven首次提出X综合征又称为胰岛素抵抗综合征或代谢综合征（metabolic syndrome，MS），包括胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）、高胰岛素血症、脂质代谢紊乱以及高血压等综合的病理变化[1]。MS是多基因和多种环境因素综合作用所致的疾病，患病率逐年上升，已成为当前社会严重威胁人民健康的公共卫生问题。研究发现，机体可以内源性产生硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）并完成一定的生理功能。生理浓度的H2S与气体分子一氧化氮、一氧化碳在部分生物学功能方面相同或相似，因此，它被看作体内第三种的气体信号分子。H2S是以L-半胱氨酸为底物，在胱硫醚-β-合酶（cystathionine-β-synthase，CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine-γ-lyase，CSE）的作用下产生，广泛参与诸多的疾病的发病与转归[2]。研究表明，外源性H2S治疗可减轻高糖引起的ROS产物的级联反应，减轻DNA的损伤[3]，外源性H2S能抑制高浓度葡萄糖引起的心肌细胞损伤[4]，可以抑制胰岛素分泌和成熟脂肪细胞对葡萄糖的摄取[5]。笔者前期研究工作也发现，MS小鼠内源性H2S/CSE体系受到严重抑制，因此推断H2S参与了MS小鼠血糖和胰岛素水平的调节。
基于以上问题，本实验选用KK/Upj-Ay/J小鼠作为MS小鼠动物模型，观察H2S供体NaHS对血糖和血胰岛素水平的影响，以及NaHS对C2C12骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力的影响，并通过观察NaHS对小鼠胰岛瘤细胞（NIT-1细胞）胰岛素分泌的影响，对机制进行初步探讨。
1 材料与方法
1.1 实验动物和细胞
MS模型雄性KK/Upj-Ay/J小鼠（8～10周）由中科院动物所提供（动物质量合格证号：SCKK2004-0001）；正常对照雄性C57BL/6J小鼠（8～10周）由中科院动物所提供（动物质量合格证号：SCKK2005-0013）；小鼠胰岛瘤（NIT-1）细胞由首都医科大学病理生理教研室赠予；小鼠C2C12骨骼肌细胞株购自上海中科院细胞库。
1.2 试剂
硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）购自美国Sigma公司；2-脱氧荧光葡萄糖（2-NBDG，2-[N-（7-nitrobenz-2-oxa-1，3-diazo l- 4- yl）amino]-2-deoxy-D-glucose） 购自Invitrogen公司。
1.3 方法
1.3.1 实验分组 8～10周的雄性KK/Upj-Ay/J小鼠随机分为MS+NaHS组和MS组，每组各6只。MS+NaHS组每日每只腹腔注射0.25 mL H2S供体NaHS（78 μmol/kg）；MS组每日每只注射等量生理盐水。取同周龄健康雄性C57BL/6J小鼠10只作为正常对照组（CON组），注射等量生理盐水。连续给药4周。
1.3.2 空腹血糖和胰岛素的测定 小鼠尾尖取血，强生ONE TOUCH Ultra血糖仪测定血糖值。胰岛素测定由总医院科技开发中心放免所采用放射免疫分析法完成。
1.3.3 肥胖指标和血脂的测定 取材前腹腔注射4%水合氯醛麻醉（0.8 mL/100 g），测量体重、腹围和体长并计算Lee指数。体长即小鼠麻醉后仰卧，从鼻尖到的长度。Lee's指数=[体质量（g）]1/3/体长（cm）×1000。取肾周、肠系膜、附睾处脂肪称重并计算脂肪系数（VFC）。VFC（%）=内脏脂肪湿重（viceral fat mass，VFM）/体重（BW）。做颈总动脉插管取血，EDTA抗凝，1500 r/min离心10 min， 取上清液分装入冻存管中，-80℃保存，全自动生化分析仪测定血脂各项指标。
1.3.4 2-NBDG摄取实验[6] 将小鼠C2C12骨骼肌细胞株采用DMEM培养基培养，于细胞培养箱内95%空气5% CO2 37℃恒温培养，取同批单层培养细胞吸去原培养液后，用无血清培养基饥饿24 h，换用含5%新生牛血清的培养基，取同批单层培养细胞分为A、B、C、D、E 5组，分别加入不同浓度的NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培养1 h后，弃去培养液，0.01 mol/L PBS冲洗3遍，加入200 μmol/L 2-N BDG培养20 min 后，弃去2- NBDG液，0.01 mol/L PBS 冲洗3 遍，将玻片小心取出，放置在荧光显微镜下观察，激发光波长488 nm，发射光波长540 nm，可观察到细胞内有绿色荧光。各浓度NaHS组选3个皿，每皿随机选取6个视野拍照，实验重复3次，用Imagepro Plus 6.0软件对荧光积分光密度（IA）进行统计分析。
1.3.5 小鼠NIT-1细胞胰岛素分泌功能的测定[7] 采用DMEM培养基，于细胞培养箱内95%空气5% CO2 37℃恒温培养。取同批单层培养细胞分别加入不同浓度NaHS（0、50、100、200、400 mmol/L），培养1 h后弃去培养液，用含5.6 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基培养24 h留取培养液，-20℃贮存，待测胰岛素含量。然后行葡萄糖刺激的胰岛素释放试验，每个皿弃去培养液后加入含16.7 mmol/L 葡萄糖的KRBB 液刺激1 h后，留取培养液，待测胰岛素含量。
1.3.6 MS诊断标准 采用2005年4月国际糖尿病联盟（International Dabetes Federation，IDF）颁布的MS国际统一诊断标准，即在中心性肥胖基础上具备以下4项中的任何2项：三酰甘油水平升高，高密度脂蛋白胆固醇水平降低，血压升高，空腹血糖升高[8]。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 MS模型的评价
与CON组小鼠相比，KK/Upj-Ay/J小鼠的肥胖指标：腹围和Lee's指数显著增加；空腹血糖和胰岛素水平分别增高236.9%和310.3%（P < 0.01）；血脂指标中总胆固醇升高131%，三酰甘油升高141%，低密度脂蛋白胆固醇升高76%，高密度脂蛋白胆固醇水平升高160%（均P < 0.01）（表1），符合MS诊断标准，说明MS模型选择成功。
2.2 NaHS对血糖和血胰岛素水平的影响
给予NaHS 4周后，MS+NaHS组小鼠空腹血糖和胰岛素比MS组分别降低了24.2%和46.98%（P < 0.05），提示NaHS可以改善MS的的高糖高胰岛素水平。见表2。
2.3 NaHS对骨骼肌细胞摄取2-NBDG的影响
加入2-NBDG 20 min后，荧光显微镜下观察可见，不同浓度NaHS干预后，骨骼肌摄取2-NBDG增加，荧光IA值C、D组与A组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01），B、E组与A组比较差异有统计学意义（P < 0.05），其由大到小排序依次为C组>D组>B组>E组>A组。NaHS浓度为100 mmol/L时，骨骼肌摄取葡萄糖量达到最大值。见图1、2。
A、B、C、D、E即为A、B、C、D、E组，其NaHS浓度分别为0、50、100、200、400 mmol/L
图1 C2C12细胞对2-NBDG的摄取（×20）
A、B、C、D、E组的NaHS浓度分别为0、50、100、200、400 mmol/L；与A组比较，*P < 0.05，**P < 0.01
图2 各组2-NBDG摄取的IA值比较
2.4 NaHS对NIT-1细胞胰岛素分泌功能的影响
在低糖（5.6 mmol/L葡萄糖）刺激下，不同浓度NaHS对胰岛细胞胰岛素分泌水平无明显影响。在高糖（16.7 mmol/L葡萄糖）刺激下，不同浓度NaHS干预后，胰岛素分泌水平差异有统计学意义（P < 0.05），且随着NaHS水平的升高，胰岛素分泌水平下降越明显。见表3。
表3 不同浓度NaHS对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响（x±s）
注：与NaHS 0 mmol/L比较，*P < 0.05
3 讨论
与CON组相比，KK/Upj-Ay/J小鼠的肥胖指标体重、腹围、Lee's指数和空腹血糖、胰岛素以及三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇均显著升高（P < 0.01），这与MS诊断标准相符，说明本实验选用的MS模型是成功的。
近年来，H2S在胰岛素抵抗及糖尿病发生发展中的作用越来越受到人们关注。在本实验中MS组小鼠空腹血糖和胰岛素水平均比CON组显著升高（P < 0.05），而给予NaHS 4周后，MS+NaHS组小鼠血糖和胰岛素分别比MS组降低了24.2%和46.98%。推测H2S可能是通过增加胰岛素靶器官对葡萄糖的摄取和利用来达到降低血糖的作用。因此，本研究进一步观察了NaHS对骨骼肌细胞葡萄糖摄取量的影响，结果表明，不同浓度的NaHS干预后，骨骼肌摄取葡萄糖增加（均P < 0.05），NaHS浓度为100 mmol/L时，骨骼肌摄取葡萄糖量达到最大值。表明H2S可以通过提高胰岛素敏感性，促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取来降低血糖。
高胰岛素血症是在胰岛素抵抗的状态下，胰岛B细胞代偿性分泌胰岛素增加的结果，不仅会导致胰岛B细胞功能的下降，还会损伤血管内皮细胞，加速冠状动脉粥样硬化形成，导致左心室肥厚[9]，是冠心病、高血压、高血脂、Ⅱ型糖尿病、肥胖、脑卒中等共同的发病基础。研究表明，不同浓度的H2S对胰岛B细胞具有不同作用，低浓度的H2S可通过ATP敏感性K通道（KATP）和不依赖于KATP通道的其他机制抑制胰岛素释放，高浓度的H2S可通过内质网应激通路导致胰岛B细胞坏死[3，10]。本实验结果表明，外源性给予NaHS后，小鼠血清胰岛素水平均比MS组降低（P < 0.05），NIT-1细胞在加入NaHS后，胰岛素分泌水平下降（P < 0.05），且随着外源性NaHS浓度的增加，胰岛素分泌下降越明显，说明外源性NaHS还可以抑制MS的高胰岛素分泌。
综上所述，H2S可以通过提高胰岛素敏感性，促进骨骼肌细胞对葡萄糖的摄取来降低血糖，从而改善了高血糖刺激高胰岛素血症发展的恶性循环，抑制胰岛素分泌；同时，H2S在高糖条件下可以直接抑制胰岛素分泌，改善了MS小鼠的高胰岛素状态。另外，H2S还作为体内的“调停器”减轻高糖环境对胰岛细胞造成的损害[11]。因此，外源性H2S可能通过多个方面在MS小鼠中发挥血糖调节的重要作用。
[参考文献]
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第6篇：代写情书范文
[关键词] 肺炎支原体； 代谢组学； 超高效液相色谱飞行时g质谱； 模式识别
Serum metabonomics in mice infected with mycoplasma
pneumoniae by UPLCQTOFMS
WEI Wenfeng， CHU Yantao， LIU Ye， HUO Jinhai， WANG Weiming*
（Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences， Harbin 150036， China）
[Abstract] Ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole time of flight mass spectrometry（UPLCQTOFMS） was applied to metabonomics study in BALB/c mice infected with mycoplasma pneumoniae（MP） to analyze the changes in serum endogenous metabolites， identify potential biomarkers associated with mycoplasma pneumoniae pneumonia（MPP）， analyze the metabolic pathway and explore the pathogenic mechanism of MPP. The BALB/c mice were inoculated with MP by repeated intranasal infectious routes to establish MPP models， and the results of the lung tissue biopsy， IgM and mycoplasma nucleic acid content determination showed that the models of MP in BALB/c mice were successfully established. UPLCQTOFMS was used to analyze the serum metabolic profiling of BALB/c mice infected with MP， and then principal component analysis（PCA） was combined with orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLSDA） for data processing. The results showed that there were significant differences in serum metabolic profile between the MP infected mice and the normal mice. Fortyseven potential biomarkers such as ornithine， cortisol， vitamin A and tryptophan were screened out by database searching and MS information matching. These potential biomarkers related to 17 metabolic pathways including retinol metabolism， arginine and proline metabolism， steroid hormone synthesis and so on. The metabonomic research method for serum of mice infected with mycoplasma pneumoniae based on UPLCQTOFMS was established in this study. The metabolic changes of endogenous small molecules in mice infected with MP were reflected in the overall level， laying the foundation for the selection and evaluation of MPP drugs.
[Key words] mycoplasma pneumonia； metabolomics； ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry； pattern recognition
肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，MP）是引起呼吸道疾病和全身性病变的重要致病菌之一，可引起肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）。它是学龄前儿童和青少年时期最常见的肺炎之一，发病率为19.6%～21.9%，呈逐年增加趋势[1]。小儿肺结构发育不完善，经过反复感染后，极易受损。MP主要通过飞沫传播，引起上呼吸道和肺部感染，同时引起脑炎、 心肌炎、 肝炎、 关节炎等肺外组织或器官的病变。临床表现多种多样，严重时出现暴发型肺炎，发展迅速，最终因呼吸衰竭而死亡[2]。
MPP临床检测主要利用病原体培养法和血清学检测确证。病原学检测结果阳性率低，病原体培养结果明显滞后，并且每种诊断都有其局限性，临床上常采用多种检测手段联合应用的方式，但是仍有高达40%～50%的社区获得性肺炎不能确定相关病原体，严重影响早期的抗菌药物选择[3]。代谢组学从整体观出发，以机体代谢物组变化为载体，以时空动态性和全局性观点，试图全面解析疾病对机体的影响[4]。代谢组学技术已经在实验动物模型评价中展现了其特色和优势[56]，但目前关于支原体肺炎代谢组学的研究尚未见报道。
本研究利用代谢组学研究方法，以MP感染小鼠血清为研究对象，采用UPLCQTOF 液质分析，并通过化学计量学模式识别的方法，发现潜在的生物标志物（potential biomaker）并鉴定，解析代谢通路。从代谢组学角度阐明MPP的致病机制，为其有效防治提供新理论，促进治疗MPP药物的筛选和开发。
1 材料
ACQUITYTM UPLC液相色谱仪（美国Waters公司）；Sciex 5600+型质谱仪（美国AB Sciex公司）；IKA MS3 digital涡旋振荡器（广州仪科实验室技术有限公司）；DH5000型电热恒温培养箱（上海一恒仪器有限公司）；LDZX75KB型立式蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；DLCJ1N型超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；ST16R型高速低温离心机（美国赛默飞世尔科技有限公司）。
肺炎支原体国际标准菌株FH（ATCC15531，美国菌种保藏中心）；PPLO培养基（碧迪医疗器械有限公司）；乙醚（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）；核酸定量检测试剂盒（广州中山大学达安基因股份有限公司）；甲醇（色谱级，Merck公司）；乙腈（色谱级，Merck公司）；甲酸（色谱级，Thermo Scientific）；屈臣氏蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）。
BALB/c雄性小鼠20只，SPF级，体重（20±2）g，北京维通利华实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012001。饲养于黑龙江中医药科学院动物实验中心，环境温度 （20±2） ℃，相对湿度 （50±20）%。
2 方法
2.1 支原体培养与造模方法 支原体培养参见文献[7]。小鼠支原体肺炎模型采用支原体滴鼻感染方法，将20只BALB/c小鼠随机分为空白组和模型组，每组10只，乙醚麻醉，模型组取MP培养液20 μL缓慢滴入BALB/c小鼠鼻孔内，每日1次，连续感染3 d。空白组给予无MP的培养液。
2.2 样品采集与预处理 小鼠于造模结束后24 h采集颖荆采集前禁食12 h，各组由眼眶取血，血液静置1 h后于3 000 r・min-1离心10 min取血清，-80 ℃冻存。取血后处死小鼠，剪取左肺组织10%甲醛固定，用以病理切片观察；剪取右肺组织用于支原体核酸定量检测。
HE 染色实验：取甲醛固定的肺组织，用乙醇梯度脱水，二甲苯透明2 次，放入石蜡内进行包埋。蜡块修好后固定于石蜡切片机上切片，将完全展开的蜡片贴附于清洁载玻片上，常规HE 染色，在显微镜下进行MP 特异性病变间质性肺炎的病理组织学检查。
血清IgMMP测定：取各组血清样品，同时设定对照孔和标准样品孔，每孔加入50 μL样品，50 μL IgM结合物，室温孵育1 h，洗去孔内液体，加入100 μL底物，室温孵育30 min，加入100 μL终止液，于450 nm下读取吸光度值。
支原体核酸含量测定：取肺组织100 mg加入100 μL纯水，匀浆，吸取20 μL，加入等量DNA提取液，100 ℃保温10 min，8 000 r・min-1离心5 min，取上清液2 μL用于测定，同时设立标准曲线样本、质控样本，测试方法参照试剂盒说明书设定相关程序。
代谢组学样本测定：每个样本取100 μL血清，加400 μL甲醇，涡旋30 s，4 ℃条件下13 000 r・min-1离心10 min，取上清液用于代谢组学分析。
2.3 色谱条件 Waters Acquity UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸水（A）0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脱，0～3 min，95%～40%A，3～4 min，40%A，4～9 min，40%～0%A，流速0.3 mL・min-1； 柱温50 ℃；样品仓温度4 ℃；进样量3 μL；色谱仪流出液不分流直接注入质谱仪进行正负离子扫描检测。
2.4 质谱条件 采用ESI离子源，离子化模式为电喷雾正、负离子模式，正离子扫描模式参数：离子源电压5 500 V；离子源温度550 ℃；雾化气55 psi（1 psi=6.895 kPa）；辅助气55 psi；气帘气35 psi；去簇电压80 V；碰撞能量35 eV；碰撞能量扩展15 eV；TOFMS扫描范围80～1 500；Product Ion扫描范围50～1 500。扫描方式：IDA设置响应值超过100 cps的8个最高峰进行二级质谱扫描，并开启动态背景扣除（DBS）。Analyst TF 1.6 software采集工作站；采用AB Sciex公司的CDS质量校正系统在线校正。负离子扫描模式：离子源电压-4 500 V；去簇电压（DP）-80 V；碰撞能量（CE）-35 eV；其余参数同正离子扫描模式。
2.5 数据处理 将所有生物样本的UPLCMS数据导入MarKerview软件，进行峰匹配、峰对齐、峰提取和归一化处理，进而进行主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法判别分析（OPLSDA），并采用正交信号校正技术过滤变量信息，通过代谢轨迹变化趋势分析模型组与空白组的差异，确定主成分和潜在生物标志物（Marker）。利用QTOF测定各Marker的精确相对分子质量，对所筛查的具有显著性差异的代谢物进行分析，计算其可能的分子式。再通过分子式检索Human Metabolome Database（HMDB）数据库，结合文献和标准品确证的方式，鉴定潜在生物标志物的化学结构。通过检索代谢途径数据库KEGG和MetPA，结合相关文献、生物化学及分子生物学知识，探讨潜在生物标志物相关生物学意义。
3 结果
3.1 小鼠肺组织病理变化 小鼠肺组织病理切片评分系统由1 个0～26分的可数评分组成[8]，5 个分类评价系统由管腔周围浸润而致的细支气管和支气管数目、管腔周围浸润的程度、管腔内渗出的严重度、血管周围浸润的频度、实质性肺炎的严重度合并后记分，每张切片选择5 个视野评分。空白组支气管、肺泡、血管等无明显病变，上皮细胞状态良好，肺组织中未见炎性细胞浸润；模型组支气管中度改变，官腔有大量分泌物，肺泡上皮坏死，弥漫性细胞浸润，边缘模糊，病变面积较大，肺泡腔内伴以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润，严重者伴有红细胞渗入（表1，图1）。
3.2 血清IgM与MP核酸定量 与空白组相比，模型组血清IgM含量极显著升高（P
3.3 小鼠血清代谢组学分析 采用UPLCMS进行血清样本的分离与数据采集，将所得数据导入MarkerView软件进行PCA无监督分析（图4），在正离子2个主成分（PC1：82.2；PC2：4.6）和负离子2个主成分（PC1：56.1；PC2：11.2）构建的得分图可直观看出，空白组与模型组有显著分开趋势。为进一步区分不同组别差异，对2组血清代谢物进行有监督的OPLSDA分析（图5），正离子模式的模型参数为R2=0.959 5，Q2=0.880 9，负离子模型参数为R2=0.986 2，Q2=0.961 4，参数显示所构建模型有效，可用于后续组间差异成分的寻找及分析。结合MarkerView软件中t检验包筛选在2组中有显著性差异（P1.5倍，筛选出对分型贡献较大且具有显著性差异的离子作为潜在的生物标志物进行分析鉴定（图6）。
3.4 MPP潜在生物标志物鉴定 潜在标志物的鉴定方法为通过一级质谱信息确定相对分子量， 利用二级质谱信息获得其结构碎片信息。通过HMDB，KEGG，METLIN等多个数据库检索，共推断出47个生物标志物，并列举了各生物标志物在空白组和模型组中的表达水平。与空白组相比，模型组代谢物水平升高的有20种，降低的有27种（表2）。
3.5 代谢通路分析 应用MetPA网站构建分析代谢通路，并选择小鼠物种，将推断的47个代谢物的HMDB编号输入进行代谢通路分析（图7）。利用拓扑分析，代谢通路影响的临界值设置为0.01，大于这个值将选择作榍痹诘墓丶代谢通路（表3）。与支原体肺炎相关的代谢通路共涉及视黄醇代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、甾类激素合成、色氨酸代谢、嘌呤代谢等17个代谢途径。
3.6 生物标志物与生化病理指标的相关性分析 选取OPLSDA中Fold Change>2的差异变量化合物与IgM含量、MP含量及病理切片中病变面积总分进行相关性分析，找出代谢物与病理生化指标的相关性并列出相关系数（表4）。结果表明，5羟吲哚乙酸、2氨基辛酸、赖氨酸、L色氨酸与MP含量有极度相关性，D2羟谷氨酸、赖氨酸、L色氨酸、对甲酚与病理面积总分有极度相关性，D2羟谷氨酸、2氨基辛酸、赖氨酸与IgM含量极度相关。
4 讨论
经前期实验摸索，本研究从生化指标和肺组织病理指标判断，MPP模型动物造模成功，进一步利用代谢组学方法结合UPLCQTOFMS技术，研究MPP小鼠血清内源性代谢物的变化规律。本课题组已熟练掌握肺炎支原体培养、测定及滴鼻感染小鼠的造模方法[8]，经前期实验摸索确定了肺炎支原体感染小鼠的剂量。在UPLCQTOFMS测定中，每间隔5个样品进样1个QC样品，选取QC样品中不同保留时间段内响应值高的5个化合物质控分析，选取化合物的保留时间及峰面积的RSD均小于1.0%，保证此评价方法的可靠性。利用模式识别的数据处理方式初步判定47个生物标志物，发现其中对正常组和模型组区分贡献较大的代谢物涉及了17条代谢通路。
维生素A（VA）涉及到视黄醇代谢，对维持视觉并促进机体生长发育有重要作用，另外可以增强机体的免疫反应[9]。VA的缺乏可引起气管、支气管上皮细胞发育受阻，细胞脱落，气道上皮完整性遭到破坏。本研究中，模型组VA水平降低，提示MPP可引起VA水平下降，进而导致气道上皮完整性的破坏和机体免疫功能下降。
鸟氨酸和乙酰氨基丁酸涉及精氨酸和脯氨酸代谢，本研究中模型组小鼠的鸟氨酸水平降低，鸟氨酸转化作用增强，乙酰氨基丁酸水平降低，说明聚肽类进一步转化的作用下降，提示腐胺等聚肽类水平升高，直接或间接影响细胞的pH[10]。文献报道，在小鼠哮喘模型的肺组织中聚肽类水平有所增加。同时因为VA的缺乏，气道上皮的损伤和脱落，炎性细胞的浸润等，气道壁结构易发生改变，气道动力出现滞缓，在一定程度上导致了支原体肺炎患者的哮喘症状。
色氨酸涉及色氨酸代谢，体内氨基酸作为蛋白质合成原料及分解代谢产物，参与多种生理和病理过程，其水平的高低往往可以反映机体的代谢情况。色氨酸是人体必需氨基酸之一，在肝脏以外，色氨酸主要通过降解为犬尿氨酸进行代谢，该过程受吲哚胺2，3双加氧酶（IDO）影响，IDO是色氨酸犬尿氨酸转化途径的限速酶，炎症因子干扰素γ（IFNγ）是其诱导剂[11]。本研究中，模型组色氨酸水平降低，加速了色氨酸犬尿氨酸途径，提示机体炎症明显。
次黄嘌呤和尿酸涉及嘌呤代谢，嘌呤是动物基因结构的一部分，在机体中起着代谢调节、能量供应等重要作用。次黄嘌呤和尿酸是腺嘌呤和鸟嘌呤的代谢产物，其中，次黄嘌呤来自一磷酸腺苷的分解代谢，该过程受氧气含量影响较大，缺氧时，一磷酸腺苷会加速分解，导致次黄嘌呤含量在血中增加[12]。本研究中，模型组次黄嘌呤和尿酸含量升高，可能由于肺组织充血、水肿等，导致气管和支气管管壁增厚，管腔变得狭窄，进而影响通气，同时肺泡腔因为渗出阻碍气体交换，从而引起缺氧环境而致。
综上所述本研究采用UPLCQTOFMS技术结合模式识别数据分析手段，进行了小鼠支原体肺炎的血清代谢组学研究。共标识了47种生物标志物，并且呈现一定的上调或下调趋势，这些生物标志物涉及17条代谢通路，其中视黄醇代谢、精氨酸与脯氨酸代谢、甾类激素合成等代谢途径与肺组织损伤、炎症反应、免疫抑制有密切关联。本研究从整体水映了支原体肺炎内源性小分子的代谢变化，有助于MPP代谢网络的全面构建及疾病诊断，为抗MPP药物的选择与评价奠定了基础。
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