反向遗传学研究方法精选(九篇)

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第1篇：反向遗传学研究方法范文

关键词 病毒学 方法 分子细胞水平

中图分类号：G644 文献标识码：A

相对动物学或者植物学这些传统学科，病毒学是一门始创于20世纪40年代的新兴学科。虽然在此之前，就有发现能通过细菌过滤器的烟草花叶病致病因子的科学家D.Ivanofsky，以及发现具有滤过性的口蹄疫病原的科学家Loeffler和Frosch，但是基于历史条件和知识水平的限制，人们或许观察到了病毒引起的自然现象，却无法对其产出真正科学的认识。

病毒学的里程碑事件应属1935年美国科学家Stanley对于烟草花叶病毒的提纯，使人们不再空泛地想象病毒的存在，而是真切地观察和接触到病毒，为今后的研究开辟了广阔的道路。随后，观察手段，培养方法，以及相关的病理性研究手段的不断提升，也使得病毒学这样一门起步较晚的学科开始了飞速发展。

回顾病毒学研究的发展历程，不难发现，学科的发展很大程度上依赖于技术的进步与革新，以及与相关学科的借鉴与学习。故了解和掌握病毒学方法技术的发展历史以及技术要求，对于学科的研究，以及技术的创新，都有诸多裨益。

1 病毒鉴定检测的相关方法技术

对于病毒最直观的认识无疑是其生物学上特征，如病毒的理化性质（如病毒粒子的形态、大小、对理化因子的耐受性、特外存活期等）以及在寄主上的反应（如寄主范围、症状表现、传播方式等）。目前，病毒生物学特征的研究鉴定方法主要分为三大类：显微成像技术（或相关针对病毒形态结构观察的技术）、免疫-血清学检测和分子生物学检测。

1.1 病毒形态结构的观察技术

众所周知，病毒颗粒的大小远小于普通细菌，所以对病毒最直观的鉴定方法就是使用电镜观察，它可以直接地看到病毒的形态结构、存在与否。自第一台电子显微镜的诞生，这门技术已为病毒学在内的多种生物学科作出了重要的贡献，优点也十分明显，操作简便，快捷有效，所以，即使是在进入了分子研究水平的今天，电子显微镜仍然发挥着它不可替代的作用。

另外，在原始的技术基础之上加以改进也形成了一些针对特殊观察对象的电镜技术，如电镜负染技术和免疫电镜检测技术等。低温电镜技术，就是一种结合电镜技术和低温结晶观察病毒的三维结构的技术，其优点不仅在于其分辨率更高，而且对于病毒样品的损伤和失真的概率都大大减小，常用于极微量和高保真要求的病毒观察检测。

X-射线衍射技术是通过扫射病毒微晶得到的衍射图像来分析还原原始的病毒结构，但为了保证衍射图像的准确性，往往对样品的纯度和颗粒完整性要求较高，所以这种技术的使用范围相对受限。

核磁共振技术，相对于前面提到的技术，对于操作的要求更低，运用范围也更广，但是对于结构的准确性判断略低。此技术主要用于病毒短肽的分析以及蛋白小分子构象变化的研究。

1.2 免疫-血清检测方法

此类技术的原理主要根据病毒的侵染性以及其作为白的特性而设计的。运用最为广泛的还是血清学测试，即利用血清中可以和具有某种特定结构特征的病毒结合的抗体，从而进行病毒的定性定量分析。此法也广泛应用用于医学临床的诊断，操作简便，低廉有效。

酶联免疫吸附实验（ELISA）也是利用特异抗体吸附病毒颗粒的原理，只是在抗体上附带了酶标记，从而使反应可以有颜色强弱的变化，利于定时定量监测病毒浓度。此法灵敏度高，且不受浓度范围或其他抑制剂的干扰，也越来越多地应用于相关的生产实践中。

免疫组化技术也是将抗体带上特殊的显色基团，使其游离时不显色，而于抗原物质结合后显色。利用这个特点，可以检测特定组织中不同区域的病毒含量已经分布特点，利于进行组织性毒理分析。

1.3 分子生物学检测方法

病毒寄生在宿主细胞内，但它又有不同于宿主细胞的特异基因组序列，特异序列的存在就说明病毒的存在，这就是分子生物学检测病毒的原理。

聚合酶链式反应（PCR）是其中最为常用的一种检测手段，其原理即利用DNA半保留复制的特点，以原始DNA为模板合成两条一样的双链，从而达到扩增量指数增长，DNA总量可检测的目的。另外，由于病毒的核酸有的是DNA，有的是RNA，所以常规的PCR以及反转录PCR即可针对不同的病毒基因进行检测。

实时定量PCR与传统PCR基本相同，只是在体系中加入荧光基团，反应中利用CCD实时读取荧光信号，检测。不仅减少的污染和浪费，也使定量快速而方便，可以实现多样品和高通量的反应。

核酸原位杂交的原理是利用生物素编辑的cDNA探针来杂交组织中的样本，从而确定病毒在宿主中的分布和载毒量。该技术，往往与免疫组化一起使用。

dsRNA技术是利用dsRNA在一定条件下与纤维素特异结合的性质，从来快速简便的提取检测出病毒颗粒中的dsRNA等，高效准确，在普通实验室和生产工厂中都有所应用。

2 病毒的分离与培养的相关技术方法

2.1 病毒的提纯技术

作为病毒学研究的重要技术前提，病毒的提纯质量往往影响了后续一系列的步骤，所以其重要性不言而喻。由于病毒的生长特性、理化性质和宿主都差异颇大，提纯的方法也不尽一致。

在病毒研究初期，沉淀法最常被使用，其主要利用病毒的蛋白外壳，改变溶剂性质，从而分离病毒粒子。相对而言简便快速，但也常存在粗糙易变性的缺点。

色谱法源于化学中多组分的分离，由于生物成分的多样性，也常使用该技术。色谱法主要分为吸附法、柱层析法和电泳法，都是利用较为温和的环境，以及病毒的特异吸附或凝集等特质而设计的技术。种类繁多，应用广泛。

超速离心利用样品中不同成分拥有不同的沉降系数，在离心过程中，不同成分会在溶剂的特定位置形成区带，从而达到分离提纯的目的。此法常使用生物活性溶剂，且离心本身对病毒粒子损伤较小，故常用于理想的病毒快速分离技术。

2.2 病毒的获取

最初的植物病毒学和动物病毒学的诸多研究都是建立在活的宿主体系上的，并且至今仍在应用，如生产不能体外繁殖的病毒、研究病毒感染的病理作用、检测疫苗的安全性等。但动物宿主体系存在太多弊病，随着细胞培养技术和分子生物学的发展，有逐渐被淘汰的趋势。

现在，病毒的获取主要是三种途径：从宿主直接获取、感染宿主扩增病毒、直接合成，其中后两种途径使用更为广泛。

感染宿主扩增病毒即要使用到组织细胞培养，这项技术本来属于细胞学的范畴，后由于动物源性或者细菌源性的病毒研究需求，此技术也越来越多地应用于病毒学的研究中。如，空斑分析最初用于测定噬菌体含量，而今也逐渐普及为动物病毒的研究中去。

直接合成法则是利用动物转基因技术，将病毒的遗传信息整合进目标动物中，在动物体内完成基因的表达，蛋白的合成，以及病毒的组装等步骤。而动物转基因技术也是现今生物领域的热点内容，技术繁多，更新迅速，也为病毒的研究提供了良好的基础。

3 病毒的功能机制研究的相关技术方法

3.1 病毒的遗传学的研究

关于病毒遗传学的研究和细菌等微生物的遗传学研究技术相似，如PCR等。但是病毒的遗传物质除了可能是DNA还可能是RNA，而且现在对于RNA病毒的研究居多，所以针对性的技术也与细菌等微生物的遗传学研究技术有所区别。

对于RNA病毒使用最多的是反向遗传学技术，最初即使用反转录PCR得到病毒RNA的cDNA，从而完成病毒基因组的探索工作，以达到了解或有目的性改造病毒基因组实现生产应用的目的。此法对于类型多样的病毒研究提供的最为基础的遗传学数据，为疫苗开发筛选、新型病毒载体等多方面都给予有力的技术支持。

针对病毒易变异的特点，单链构想多态性检测技术（SSCP）则理想地解决了这一问题。近年来，对于多种模式生物的基因组测序的发展，越来越多的研究开始着重于探索基因变异的问题，而SSCP技术正是这样发展起来的。其主要用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入，为病毒的分子演化规律以及流行病学提供充分的证据。

基因芯片技术的概念来源于计算机芯片，即将大量寡聚核苷酸以阵列形式有序固定于载体表面，与待测样本的病毒分子杂交，然后利用化学发光或同位素等显色方法，用CCD等仪器对杂交信号进行高效检测分析。主要用于病毒基因表达谱和基因多态性等方面的研究。

3.2 病毒表达机制的研究

在病毒的表达机制研究中，主要是利用不同的检测手段，判断病毒表达的具体情况，并对于病毒表达的情况进行总结归纳，研究其时空上的机制和规律。

Northern Blots即针对病毒RNA样品的技术手段，原理与Southern Blots相似，利用探针与固相RNA杂交，再对探针分子的图像进行捕获和分析。此法特异性高，常用于分析已知基因的表达情况。

mRNA表达差异技术主要使用反转录PCR以及等量不同宿主的定量检测，来确定抗病种和感病种的差异表达基因，从而进一步确定造成品种差异的原因。

3.3 病毒蛋白质的研究

病毒蛋白决定了病毒的形态结构，常作为抗原来激发人体内的免疫反应，作用于宿主细胞信号转导途径，导致宿主细胞内信号转导发生紊乱；并且一些病毒蛋白具有酶的作用，可作为细胞毒素作用于宿主细胞。

大范围而言，病毒蛋白质研究的技术，都隶属于蛋白质组学的研究范畴之内，只不过针对不同特性的蛋白，往往会选取最为有效而简便的技术方法进行研究。而由于蛋白质分子结构、化学生物特性等多方面差异很大的特点，其针对性技术也是五花八门，在此仅列举较为常用的技术，以供研究者学习参考。

经典的方法有亲和层析、抗体受体法、抗细胞受体法、抗独特型抗体法、病毒覆盖蛋白法。大多还是利用病毒蛋白和抗体蛋白或者其他蛋白或大分子物质的作用，来检测病毒蛋白的特性。虽然这些方法快速简便，但是由于方法本身较为粗糙，样品用量较大，准确性存疑等问题，现在仅在低要求情况下使用。

现代的方法则更加丰富，也分别具有各自的特点，常被运用于现在的病毒蛋白的研究。

噬菌体表面呈现技术是利用噬菌体本身表达的两种结构蛋白会暴露在噬菌体表面，故将外源基因倒入两个结构蛋白基因间，使外源序列一起表达，然后让表达产物与大量配体结合，筛选特殊结合性配体。但此法表达出来的蛋白可能与天然状态不符，所以使用较为受限。

免疫共沉淀是一种成熟蛋白作用技术，其原理为在溶液或细胞中，用一种蛋白的抗体耦合可与此蛋白特异结合的另一蛋白，从而形成一抗体两蛋白的沉淀，从而获取具有结合饵蛋白能力的未知蛋白，探索细胞中蛋白作用机制。

酵母双杂交技术是利用真核基因的特殊表达机制，通过将两个蛋白的编码序列整合在同一酵母细胞内的特殊转录激活域附近，若两种蛋白可以发生相互作用，则会激活相应的报告基因，从而报告蛋白的相互作用。此法常用于筛选病毒蛋白的特异膜蛋白受体。

除了以上列举的技术之外，还有cDNA文库技术、质谱分析技术、GST Pull-down技术、串联亲和纯化、荧光能量共转移等多种技术应用于蛋白互作的研究。

参考文献

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第2篇：反向遗传学研究方法范文

【关键词】 基质金属蛋白酶9;RNA干扰;慢病毒载体

【Abstract】 Objective To explore the silencing effect of the constructed mice′s matrix metalloproteinase (MMP)9 RNA interference (RNAi) lentivirus vector in vitro. Methods 293T and NIH3T3 cells were cocultured by MMP9 overexpressed clone plasmid and RNAi lentivirus vector. Real time PCR and Western blot were adopted to observe the downregulation of MMP9 mRNA expression in 293T and NIH3T3 cells by RNAi. Results The constructed MMP9 RNAi lentivirus vector significantly decreased MMP9 expression in 293T and NIH3T3 cells. Conclusions RNAi lentivirus vector inhibiting MMP9 expression is successfully constructed， laying foundation for the research in vivo.

【Key words】 Matrix metalloproteinase (MMP)9; RNA interference; Lentivirus vector

动脉粥样硬化(AS)斑块破裂是急性缺血事件的主要原因。细胞凋亡和基质降解机制与斑块破裂过程有关〔1〕。循环中细胞外基质(ECM)标记物的水平常常与AS疾病的危险分层密切相关。基质金属蛋白酶(MMPs)降解ECM，破坏动脉壁的完整性，触发急性动脉血栓形成〔2〕。MMPs是与ECM蛋白质降解密切相关的蛋白水解酶，在组织重塑过程中起重要作用〔3〕，是造成AS斑块不稳定的重要原因之一。不稳定的人AS斑块局部MMPs的主要来源为单核细胞/巨噬细胞，而MMPs的主要成分是MMP2和9〔4〕。因此，抑制MMP9在不稳定斑块中的表达，可能抑制斑块破裂。为此，本实验构建小鼠MMP9 RNA干扰(RNAi)质粒，采用Western印迹和实时荧光定量PCR法，验证MMP9干扰质粒在工具细胞中的沉默效应，为进一步在体研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 由上海吉凯基因有限公司构建合成并包装的MMP9 RNAi慢病毒载体;DMEN、胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶(上海化学试剂公司);Lipofectamine2000、Trizol(美国Invitrogen公司);兔GFP多克隆(Abcam公司);山羊抗兔IgGHRP(Santa Cruz公司);预染的蛋白标志物(中晶公司);荧光显微镜(Olympus公司);实时荧光定量PCR仪器(BioRad公司)。

1.2 方法

1.2.1 Western印迹检测293T细胞中MMP9表达 将构建好的MMP9基因过表达克隆质粒和针对不同靶点RNAi病毒载体质粒，共转染入293T细胞，于转染后72 h，收集培养上清行12%SDS聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，电转至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用TBST(TBS+0.05%Tween20)加5%脱脂奶封闭过夜;用含5%脱脂牛奶的TBST稀释与一抗相应的辣根过氧化物酶驴抗小鼠二抗(1∶4 000)，于室温下孵育2 h，用Amersham公司ECL+plusTM Western印迹试剂盒检测蛋白表达。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测NIH3T3细胞中MMP9 mRNA的表达 NIH3T3细胞慢病毒感染实验在6孔板中进行，分为正常对照组、阴性对照组和RNAi组。MMP9基因引物采用Beacon designer 2软件设计，上游引物：GGCGTGTCTGGAGATTCG，下游引物：TACTGGAAGATGTCGTGTGAG;分别取转染后的NIH3T3细胞，按Invitrogen公司的Trizol操作说明书抽提细胞总RNA;RNA逆转录获cDNA，在Biorad的iQ5上完成实时荧光定量PCR检测。

1.2.3 荧光显微镜观察GFP表达 将生长状态良好的NIH3T3，在病毒感染前一天分入6孔培养板培养，感染当天按实验设计的组别分别加入不同复合感染(MOI)的RNAi慢病毒颗粒进行感染实验。感染72 h后荧光显微镜下观察GFP表达情况，进而判断MMP9的干扰效果。

1.3 统计学处理 采用SPSS11.0统计软件进行χ2检验。

2 结 果

2.1 293T细胞中Western印迹鉴定慢病毒介导的RNAi 于转染后72 h，收集培养上清作Western印迹检测，利用0.25和0.5 μg两种不同质粒浓度进行实验。1#、2#、3#这三种不同干扰靶点的敲减作用不同，2#对MMP9有显著的敲减作用，在两个质粒浓度下的作用是一致的;3#也有一些敲减作用，特别是在高质粒浓度下;1#靶点基本没有作用，如图1。

PC为MMP9阳性参照;NC1为共转染过表达融合蛋白质粒，加NC RNAi质粒的细胞组;NC2为针对鼠源GAPDH的有效干扰载体，作为第二个阴性对照;1#、2#、3# 为共转染过表达融合蛋白质粒，不同靶点加RNAi质粒的细胞组

图1 Western 印迹检测293T细胞中RNAi作用

2.2 实时荧光PCR定量检测NIH3T3中MMP9 mRNA的干扰作用 分别提取转染后的NIH3T3细胞总RNA，利用实时荧光PCR定量分析各组MMP9 mRNA表达量的变化。RNAi组MMP9 mRNA相对表达量为0.25，阴性对照组为1.00，正常对照组为1.52。RNAi组在NIN3T3细胞上对MMP9 mRNA基因表达有显著干扰作用，干扰效率75%以上，与其他两组比较有显著差异(P

2.3 NIH3T3细胞感染病毒的荧光观察 慢病毒载体上带有GFP绿色荧光基因标记，在488 nm蓝光照射下可激发出507 nm的绿色荧光。感染72 h后在荧光显微镜下可见，阴性对照组几乎100%的NIH3T3细胞都可发出绿色荧光，说明MMP9过表达质粒大量转染入NIH3T3细胞;慢病毒介导的RNAi组绿色荧光表达明显减少，说明慢病毒介导的RNAi能够有效抑制MMP9表达。见图2。

图2 RNAi靶点验证荧光图

3 讨 论

基因治疗的关键在于筛选有效基因、构建高效表达载体、定位靶向治疗。以往实验研究中常用的载体有腺病毒和逆转录病毒载体。腺病毒载体是基因治疗常用的病毒载体，具有感染能力强、滴度高、多拷贝高效性、无插入突变性等优点〔5〕，但是目的基因不能整合至靶细胞基因组，仅能短暂表达，且反复应用容易引起免疫反应。逆转录病毒载体虽然可以使目的基因整合至靶细胞基因组，实现稳定表达，但只能转导分裂期细胞，不能转导非分裂期细胞。慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒1(HIV1)，具有可感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点，因此越来越受到人们重视。

RNAi是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性转录后基因表达沉默〔6，7〕。作为一种反向遗传学手段，RNAi广泛应用于基因功能分析、信号转导通路研究和基因治疗之中。由于慢病毒载体介导的RNAi 作用时间持久，不易诱发宿主免疫反应，因此慢病毒成为基因治疗载体研究的热点。 用慢病毒载体介导RNAi的研究〔8～10〕显示，该技术在基因功能和基因治疗等领域具有广泛的应用前景。

MMPs是活性依赖于内源性Zn2+及Ca2+的存在、主要由平滑肌细胞和巨噬细胞分泌和表达的一类蛋白水解酶，目前发现有16种以上。Peter等〔11〕的研究显示，巨噬细胞过表达活化的MMP9时显著增加弹力蛋白的降解，诱导有效的斑块破裂。因此，抑制MMP9的表达可能对AS的进程及不稳定斑块的破裂产生重要影响。

本实验以MMP9为干扰靶点构建的慢病毒载体，在生长状态良好的工具细胞中，通过Western印迹和实时荧光定量PCR验证其靶点的有效性，结果显示构建的慢病毒载体能够有效敲减工具细胞中MMP9表达。这为以后的动物体内基因治疗研究奠定了基础。

参考文献

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第3篇：反向遗传学研究方法范文

关键词：小麦；白粉病；WRKY；VIGS

中图分类号：S512 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.05.001

Abstract：WRKY transcription factor family can help improve plant stress tolerance， which widely exist in various plants. After TaWRKY gene was silenced by VIGS method， it was found that the proportion of succeed Bgt inoculation increased， and the percentage of abnormal appressoria declined， such as papilla. The results indicated that TaWRKY gene played an important role in wheat- Bgt interaction.

Key words：wheat； powdery mildew； WRKY； VIGS

小麦白粉病是由布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. Tritici）侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高温多湿天气病害流行，会使小麦严重受害，导致减产13%～34%[1]。 因此，科学家一方面通过抗病育种，不断培育新的抗病小麦品种来抵御病害，另一方面通过深入的抗病分子机理研究，克隆抗病相关基因、弄清抗病信号通路以及基因工程等技术手段，以达到抗病分子育种的目的。

转录因子可以与真核基因启动子区中的顺式作用元件互作，激活或抑制多个下游功能基因转录，从而使植株获得综合改良效果。研究表明，WRKY转录因子家族几乎存在于所有植物中，它们共同含有一段高度保守氨基酸序列WRKYGQK[2]。WRKY广泛参与植物种子萌发与休眠、开花、代谢、激素信号转导，还参与抵御生物和非生物胁迫等反应过程。拟南芥AtWRKY33基因直接调控了植物抗毒素Camalexin 的合成[3]，并且调控大量抗病相关基因的表达[4]。大豆中GmWRKY58和GmWRKY76的过表达会造成作物提早开花，表达量的区别对花形态造成不同影响[5]。水稻中OsWRKY6基因的过表达有助于提高作物对病原菌的抗性，同时可直接调控异分支酸合成酶的表达从而增加水杨酸的浓度实现自我调节[6]。小麦（Triticum aestivum）TaWRKY93可调节作物对渗透压、高盐、干旱和低温等胁迫的耐性[7]。迄今为止，研究人员已经在大麦[8]、拟南芥[9]、大豆[10]和水稻[11]等多种植物中都鉴定到不同数量的WRKY转录因子。

病毒诱导基因沉默（VIGS-induced gene silencing， VIGS）是引起内源mRNA特异性降解、引起基因转录沉默的技术。VIGS试验周期短，操作简便，并且无需转化。近年来，在植物基因功能研究中，VIGS技术作为一种简单、快速、高效的反向遗传学技术在禾本科植物基因功能研究中发挥了重要作用[12-13]。

本研究以前期工作获得的TaWRKY基因为基础[14]，利用VIGS技术获得沉默植株，通过对基因沉默前后白粉菌侵染情况进行观察统计，最终确定TaWRKY基因在小麦抗白粉病过程中的功能。

1 材料和方法

1.1 试验材料与试剂

抗白粉病品种Brock，由Ray Johnson博士惠赠。

小麦白粉菌15号生理小种，由中国农业科学院植物保护研究所提供。

1.2 沉默TaWRKY的VIGS载体构建

在目的基因核苷酸序列的非保守区，设计上、下游特异性沉默引物TaWRKY-VIGS-F和TaWRKY-VIGS-R，以抗病小麦Brock总RNA合成的cDNA为模版，扩增富集沉默片段，将该片段与BSMVγ：连接构建重组载体BSMVγ：TaWRKY，构建过程参见Li 等[15]。

1.3 基因沉默效率检测

通过限制性内切酶酶切线性化、体外转录后，获得病毒RNA组分通过摩擦接种方法接种到小麦第2叶上，待接NH2O（对照1）、BSMV：GFP（对照2）和BSMV： TaWRKY组小麦第3叶伸展完全，采用抖拂法对各株植株第3叶均匀高密度接种新鲜白粉菌孢子，在相应时间点取叶片，利用半定量PCR方法检测这3组植株中TaWRKY基因的mRNA水平的水平变化，从而确定TaWRKY基因沉默的效率。

1.4 基因沉默后对小麦抗白粉病表型的影响

取接种48，72 h和7 d后的小麦叶片，用考马斯亮蓝染色方法染色并观察统计白粉菌孢子的生长发育情况，通过与对照白粉菌孢子萌发、畸形胞比例等的对比分析，确定目标基因在抗白粉病过程中的贡献。

2 结果与分析

2.1 VIGS沉默载体构建

根据已获得TaWRKY基因序列，在基因的非保守区设计添加了NheI识别序列的引物WRKY-V-F（AGCCGCAGCAGCAGAACG）、WRKY-V-R（CTTGAAGCTGGGGTCCCTC）。以含TaWRKY基因序列的重组质粒作为模板，扩增用于构建BSMV重组载体的目的基因片段，扩增结果如图1所示。目的片段大小约为250 bp左右，随后将回收后的目的片段进行酶切形成粘性末端，BSMV载体同样经过酶切回收，与目的片段进行连接，通过进一步筛选、验证，挑选阳性克隆送测验证。

2.2 VIGS技术沉默靶基因后TaWRKY表达水平检测

在TaWRKY基因的特异性核苷酸序列区段设计引物，扩增一个长227 bp的片段构建TaWRKY基因沉默载体BSMVγ：TaWRKY。本次沉默试验共设置4个组别，分别为H2O对照组（空白对照）、BSMV：GFP对照组（阳性对照）、BSMV：PDS对照组（沉默PDS基因）、BSMV： TaWRKY试验组（沉默目的基因TaWRKY）。为了验证本试验所建立的沉默体系成功有效，分别对各组摩擦接种后约15 d的小麦第3叶进行表型观察，结果如图2所示。除BSMV：PDS对照组叶片发生明显白化现象之外，其他组叶片均呈绿色，说明该基因沉默体系构建成功。

2.3 TaWRKY基因沉默效率验证

为了进一步证实TaWRKY基因是否被有效沉默，采用半定量PCR的方法，对沉默后各组植株中TaWRKY基因的转录水平进行了检测，结果如图3所示。从图中可以看出，摩擦接种后，TaWRKY试验组的mRNA水平明显低于H2O和GFP对照组，说明小麦内源TaWRKY基因被有效沉默了。另外，在接种重组病毒BSMV：GFP后，TaWRKY基因的表达也有轻微下调，该现象可能是由于病毒的侵染对植株造成了影响。

2.4 TaWRKY基因沉默植株抗病分析

为了进一步研究TaWRKY基因在小麦叶片与白粉菌的互作过程中所起到的调控作用，本研究使用考马斯亮蓝染色法分别对接种48，72 h和7 d后的GFP组、TaWRKY组小麦植株的第3叶进行固定、染色、制片，在显微镜下进行镜检，观察各时间点中，白粉菌萌发形态及生长状态，如图4所示。从图4中可以看出：染菌48 h后，TaWRKY组白粉菌孢子萌发状态优于对照组，孢子萌发，芽管伸长，形成附着胞；染菌72 h后，TaWRKY试验组白粉菌孢子大量萌发形成次生菌丝，而各对照组中，孢子萌发出现分瓣型畸形附着胞、纤细型畸形附着胞等；染菌7 d后，TaWRKY试验组白粉菌孢子大量生成串珠状分生孢子，而各对照组中，仅有少量孢子萌发形成次生菌丝。

在镜检观察孢子发育结构的同时，统计各个视野内白粉菌孢子萌发率、畸形率、寄主抗性等参数。统计结果如图5、图6所示。由图可以得出，接种白粉菌48 h后，白粉菌对TaWRKY基因沉默后的植株侵染成功率增加，畸形附着胞比例下降，与GFP对照组相比，TaWRKY基因沉默组植株白粉菌孢子萌发率上升，畸形附着胞（分瓣型附着胞、纤细型附着胞等）比例下降。

3 结论与讨论

自1994年，Ishiguro和Nakamura[16]首次母适恚Ipomoea batatas）中克隆出第一个WRKY蛋白SPF1，研究人员对于植物WRKY转录因子家族开展了大量研究。越来越多的研究结果表明，WRKY 蛋白在植物生长发育，抵御生物以及非生物胁迫等多种生理生化过程中发挥重要作用[17]。前期工作中，笔者在小麦Brock中分离到一个WRKY类转录因子基因TaWRKY，并初步证实该基因参与了小麦的白粉菌胁迫应答反应，但还不能够较确切了解TaWRKY基因与小麦抗白粉病之间的关系[12]。

关于病毒介导的基因沉默技术已经广泛地应用于基因功能研究[18-21]，但该方法由于涉及到病毒感染，从而影响对正确结果的判断而备受争议。本研究为了降低这种系统误差，采取了3个对照组，即用GKP缓冲液作为摩擦接种介质为阴性对照，用绿色荧光蛋白基因构建γ载体BSMVγ：GFP、编码叶绿素关键酶基因PDS基因构建γ载体BSMVγ：PDS为两个阳性对照组。结果发现：GKP缓冲液和GFP对照组生长正常，没有病毒侵染后留下的病斑，生长正常，说明病毒对叶片生长没有明显影响；PDS组出现了叶片白化现象，说明PDS基因被有效沉默，表明基因沉默系统可用；基因沉默后再接种白粉菌孢子7 d后，白粉菌孢子充分萌发。与GFP组相比，TaWRKY基因沉默组小麦叶片表面的白粉菌附着胞畸形率明显下降，白粉菌的成功侵染率显著上升。因此，推测TaWRKY基因可能在小麦抗白粉菌反应中发挥着重要作用。

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