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【关键词】 分型标准物 短串联重复序列 重组质粒 遗传多态性 DXS8378
ABSTRACT: Objective To investigate the genetic polymorphism of DXS8378 STR locus of chromosome X in Chinese Lisu, Pumi and Deang populations in Yunnan and construct relative standard allelic ladders. Methods After being amplified by PCR, different STR allelic fragments were isolated from the PAG electrophoresis. The STR allelic fragments were extracted by kit and reamplified by PCR to obtain purified allelic fragments. Next, the purified allelic fragments were subcloned inpidually into the PUC plasmid vectors, and the size and structure of the inserts were confirmed by the analysis of their DNA sequences. Then we transfected it into competent E.coli DH5αTM cells, and finally, the recombinant plasmids DNA with the inserts were used as template for reamplification to generate the standard ladders. Results The standard allelic ladder for DXS8378 locus was obtained, with which the genetic polymorphisms of DXS8378 locus in three Chinese populations in Yunnan were studied. Conclusion The standard ladder made by this method is excellent, and DXS8378 is powerful for forensic practice in Chinese population.
KEY WORDS: allelic ladder; short tandem repeat; recombined plasmid; genetic polymorphism; DXS8378
人类X染色体由于其独特的遗传方式[1],在X染色体连锁遗传病的基因定位、遗传病的基因诊断和法医学的性别鉴定等多方面具有重要的价值。两个多态信息含量(polymorphism information content, PIC)相当的STR位点作比较时,X染色体上的STR位点的平均排除率(mean exclusion chance, MEC)比常染色体上的位点要高的多。因此,在姐妹认定和女性的父权鉴定等法医学领域中,X染色体特异性的STR有重要的应用价值[24]。
用PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分析STR基因座时,分型是依据谱带的位置,而采用分子克隆技术制备大量优质的等位基因分型标准物,既可以提高分型的准确性,又可以增加实验结果间的可比性。目前,分型标准物主要依靠国外几家试剂大公司提供,其价格昂贵,对于新发现的STR位点,其分型标准物在市场上也无法购得。同时,一些在中国群体中识别机率和非父排除概率高的STR位点的分型标准物不能提供[56]。为此,我们应用分子克隆技术,在国内外首先制备出DXS8378位点的STR分型标准物。应用自制的分型标准物,首次调查了中国云南地区傈僳、普米[7]、德昂族群体中的DXS8378基因型分布频率,对其在法医学中的应用价值进行评价,对实现以此技术为基础的STR分型标准物的标准化、国产化进行了探索[8]。
1 材料与方法
1.1 样本与引物 遵循知情同意原则,随机抽取中国云南地区93名普米族(其中女性37名)、95名傈僳族(其中女性38名)和83名德昂族(其中女性38名)群体中无亲缘关系个体的静脉血,EDTA抗凝,-20℃保存。引物序列查自GenBank,分别为F:CAC AGG AGG TTT GAC CTG TT;R:AAC TGA GAT GGT GCC ACT GA,由奥科公司合成。
1.2 试剂与仪器 2×Taq polymerase mix和DH5α感受态细胞(天为时代公司);pGEMT EasyVector SystemⅠ(美国Promega公司);聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒(Biospin公司);EDTA等其余试剂均为国产分析纯。台式高速离心机(德国Hermle公司);微量可调加样器(10、20、50、100、200、1000μL)(法国Gilson公司);三相恒压电泳仪(美国BiaRad公司);干热器(美国Bellco公司);旋涡混匀器(日本Tomy kogyo公司);超净工作台(中国扬州医疗设备厂);低温冰箱(-30℃,-70℃)(日本Sanyo公司);ABI3730自动测序仪(美国ABI公司)。
1.3 制备标准分型物模板DNA 通过Chelex法提取云南普米族、傈僳族和德昂族群体样本DNA,PCR扩增,反应体系:总体积13μL,2×Taq polymerase mix 6μL,引物1μL(5nmol/L),DNA 2μL,H2O 2μL。反应条件为:变性94℃ 30S, 退火61℃ 45S,延伸72℃ 60S,共30个循环。
用60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶(交联度5%)电泳分离PCR扩增产物,银染显色。从群体样本的扩增产物中,选出了5个不同大小片段长度的等位基因,用聚丙烯酰胺凝胶DNA回收试剂盒纯化各个片断,制备成PCR再扩增的模板。
1.4 PCR再扩增、产物鉴定与纯化 将制备好的5份DNA进行扩增,反应体系及条件如前。扩增产物进行电泳、银染后再确定其片段大小,并进行纯化。
1.5 PCR产物的克隆 采用pGEMT Easy Vector SystemⅠ克隆试剂盒,将纯化后的PCR片段直接插入质粒的多克隆位点。重组后的质粒转化DH5α感受态细胞,选择培养筛选,再用以上的扩增方法选出含有正确插入片段的克隆。
1.6 重组质粒的DNA测序 采用ABI3730全自动遗传分析仪,以质粒公用的M13正反引物对重组质粒的插入片段进行双向循环测序,确定插入片段的大小及组成,以国际法庭血液遗传学学会(International Society of Forensic Haemogenetics, ISFH)推荐的命名原则进行各等位基因命名[9]。
1.7 重组质粒的扩大培养与保存 对经测序证实的含有正确等位基因插入片段的质粒扩大培养、纯化后,得到该基因座的等位基因分型标准参照物重组质粒。-20℃保存。
1.8 等位基因分型标准物的制备和再鉴定 用含该基因座等位基因插入片段的重组质粒DNA为模板,进行PCR扩增,反应体系及条件如前。纯化各基因座各等位基因的PCR产物,混合制备成等位基因分型标准物阶梯,通过60g/L变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染显色,验证所得标准分型物的可用性。
1.9 数据分析 利用SPSS12.0统计学软件计算各基因座等位基因片段的频率和基因型频率。利用χ2检验进行HardyWeinberg平衡吻合性检验。根据100名普米族、98名傈僳族、83名德昂族无关个体该基因座的等位基因和等位基因型,分别计算杂合度(heterozygosity, H)、个人识别率(power of discrimination, PD)、多态信息量(polymorphism information content, PIC)。
2 结果
2.1 重组质粒插入片段的序列分析及DXS8378的阶梯状分型标准物的制备 用ABI3730测序结果分析,得知DXS8378的5个插入片段是以四核苷酸CTAT为核心序列重复9-13次,其长度为199-215bp,与GenBank中公布的数据完全一致。根据ISFH规定的命名原则,插入片段的几个等位基因分别命名为9-13。用分子克隆技术制备等位基因的阶梯状分型标准物(图1)。
2.2 分子克隆制备的DXS8378基因座分型标准物应用于群体研究的结果 将制备的DXS8378阶梯状分型标准物用于云南地区普米族、傈僳族、德昂族群体,分别检出5种等位基因以及11种不同的基因型,等位基因频率分布范围为0.132-0.649。基因型频率范围为0.026-0.450,各基因座的具体遗传学和法医学信息见表1至表4。
图1 DXS8378等位基因分型标准参照物的电泳分型结果(略)
Fig.1 The electropherotyping results of DXS8378 allelic ladder
M: the mixture of DXS8378 allelic ladder; M: DXS8378 allelic ladder; 1-5: the fragments amplified by recombinant plasmid; 1-5 the repeat structure (ctat) range from 9-13
表1 DXS8378位点在傈僳族、普米族和德昂族人群中的基因频率分布(略)
Table 1 Distribution of allelic frequencies for DXS8378 locus in Chinese Lisu, Pumi and Deang populations in Yunnan
表2 DXS8378基因座女性的基因型频率分布(略)
Table 2 The distribution of genotypes for DXS8378 locus in Chinese Lisu, Pumi and Deang female populations in Yunnan
表3 女性基因型分布的HardyWeiberg平衡定律检验(略)
Table 3 Test for HardyWeinberg equilibrium of distribution of female genotypes
表4 DXS8378基因座在5个民族中的统计学数据(略)
Table 4 Statistical data of DXS8378 in five populations of the locus
H: heterozygosity; PIC: polymorphism information content; PDF: power of discrimination in females; PDM: power of discrimination in males; PE: power of exclusion
3 讨论
只有具备了一套精确的国际标准化命名的标准参照物,才有可能对STR分型结果做出正确的分型和命名。我们采用分子克隆技术,在国内首先制备出精确的DXS8378基因座的5个等位基因标准片段,通过测序后又按国际命名原则进行了命名,得到了可以大量复制的DXS8378等位基因分型标准参照物,为该位点分型技术标准化及DNA数据库的建立奠定了基础。
在傈僳族群体中,共发现了5个等位基因和6个基因型。其中,在女性中,等位基因10最常见(频率为0.613),在男性中,等位基因10最常见(频率为0.649)。基因型10/10最常见(频率为0.450)。
在普米族群体中, 共发现了5个等位基因和8个基因型。其中,在女性中,等位基因10最常见(频率为0.513),在男性中,等位基因10最常见(频率为0.491)。基因型10/11最常见(频率为0.421)。
在德昂族群体中,共发现了3个等位基因和6个基因型。其中,在女性中,等位基因10最常见(频率为0.408),在男性中,等位基因10最常见(频率为0.467)。基因型10/11最常见(频率为0.263)。
对每个群体的基因型进行Fisher确切概率计算法计算后,可以检测其是否符合HardyWeinberg平衡(表3)。DXS8378位点在三个中国群体中均符合HardyWeinberg平衡(P均>0.05)。三个中国群体中的期望排除机率在0.188-0.404之间,女性识别效能在0.758-0.808之间(表4)。
χ2检验比较DXS8378位点在三个群体女性的等位基因频率分布,结果提示德昂和傈僳(P=0.006)、德昂和普米(P=0.019)群体之间有统计学意义,而普米和德昂群体之间无统计学意义(P=0.195)。χ2检验比较DXS8378位点在三个群体男性的等位基因频率分布,结果提示德昂和傈僳(P=0.008)、德昂和普米(P=0.009)群体之间有统计学意义,而普米和德昂(P=0.168)群体之间无统计学意义。
综上表明,通过重组质粒所获得的STR等位基因分型标准物,谱带清晰均一,虽然对试剂要求较高、制作工序及时间较多,但具有花费少、产量高及稳定性强的优点,既便于保存和繁殖,又便于远距离运输等其他方法无法比拟的优点,不同实验室可以使用相同的分型标准物,在我国的法科学领域中有较高的应用价值。本研究首次获得了X染色体DXS8378位点的等位基因分型标准物和在傈僳、普米、德昂族中的完整基因频率数据,其在其他人群中的情况,尚需进一步的研究。
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[关键词] STR 基因座;遗传多态性;等位基因频率;福州地区
[中图分类号] D919 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616(2013)17-14-04
短串联重复序列(short tandem repeat,STR)又称微卫星DNA(micro satellite DNA),是一种广泛存在于人类基因组中可遗传、不稳定、且具高度多态性的DNA序列[1]。目前人类基因组内已发现了七千个以上的STR位点,平均每15kb就存在一个STR基因座。由于STR核心单位重复数目的变化,构成了STR基因座的遗传多态性。STR基因座因其分布广泛、信息量大,基因片段短、扩增效率高、易于检测,判型准确,且具有高度多态性并遵循孟德尔共显性遗传等诸多优点,已广泛应用于遗传连锁分析、肿瘤等疾病相关基因的定位、器官移植、人类遗传学、法医学亲权鉴定及个体识别、身源认定等研究领域。由于STR 的基因频率和基因型的分布在不同地区之间存在差异,法医学应用价值及特点都有所不同,因此,各实验室利用STR 遗传标记开展群体遗
传学研究及法医鉴定工作[2],国内外许多DNA 实验室致力于DNA 检测基因座的群体遗传学研究[3-6],以寻找到适合于不同民族、不同群体个人识别和亲权鉴定的基因座。本研究对350例福建福州地区汉族无关个体的15个STR基因座遗传多态性进行调查,并对其应用进行评估。
1 材料与方法
1.1 样本
取来自福建省立医院司法鉴定所2012年3月~2013年1月的日常检案,总共350例无关个体,均来自福州五区八县地区汉族人群。
1.2 DNA提取
采用chelex-100快速提取法从血样中提取DNA,经DNA浓度测定符合标准后-20℃保存。
1.3 试剂
AmpFlmSTR IdentifilerTM试剂盒(ABI,美国)。
1.4 PCR扩增
PCR反应在Eppendorf Master Gradient型PCR扩增仪上进行,反应体系和条件严格按说明书进行操作。
1.5 毛细管电泳
将PCR扩增产物与DNA分子量标准550及去离子甲酰胺(HIDI)混匀,95℃变性3min,立即冷却到4℃,在Applied Biosystems 3130遗传分析仪上进行毛细管电泳。
1.6 荧光检测分型
用基因扫描软件(Date collection)检测扩增片段的荧光标记,以LIZ-550等为内标,根据扩增的STR片段大小确定STR基因座,以等位基因梯阶(Ladder)为标准,用基因分型软件(Genemapper ID v3.1)确定15个常染色体STR基因座的等位基因型。
1.7 统计学处理
运用PowerMarker V3. 1软件及Modified-powerstate 软件记录无关个体的基因型,对15个STR 基因座进行 Hardy-Weinberg 平衡检验,计算各STR 基因座等位基因数目及基因型数目、等位基因频率、杂合度观察值Ho、个人识别DP、非父排除概率 PE、多态信息含量PIC 以及该15个基因座的累计个人识别率TDP、累计非父排除概率 CPE。
2 结果
350份福州地区汉族无关个体15个STR基因座的基因型频率分布均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),具体见表1。350例福州地区汉族无关个体发现的稀有等位
基因情况见表2。检测的15个STR遗传标记均具有高度多态性,除基因座TPOX外,其他基因座杂合度均超过0.60, 匹配概率0.032~0.225,个体识别力0.775~0.968, 多态性信息含量0.55~0.86,非父排除率0.285~0.761,具体见表3。
3 讨论
3.1 应用STR 基因座作为亲子鉴定的优点
STR 基因座在人类基因组中分布广泛,基因片段长度差异较小,容易扩增,各基因座的扩增条件相似,没有优先扩增的问题,适用复合扩增,简化程序,分型规范,自动化程度高,效率高[7]。本研究对15个STR基因座进行基因分型,其重复单位在3~5bp,因此分型结果稳定,可重复性好,符合理想STR基因座的条件。
3.2 IdentifilerTM体系15个STR基因座在福州汉族人群中的法医学应用评估
这15个STR基因座在福州地区汉族人群中基因频率分布均匀,表现出高度多态性,分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。Gin等[8]认为DP≥0.9,H≥0.7的基因座具有高鉴别力。按此标准,本研究选择的10个基因座 D8S1179、D13S317、D19S433、D18S51、D21S11、D16S539、vWA、D5S818、D2S1338、FGA属于高鉴定力、高杂合度的基因座。这15个STR基因座具有较高法医学个人识别和亲子鉴定运用价值。通常情况下检测这些试剂盒的STR 基因座已能够基本满足法医物证中个体识别和三联体亲子鉴定的检测要求。但是在一些二联体和出现了突变可能的三联体案件中,需要增加检测更多的STR 基因座。有关方面的研究进展还待于学者们进一步的探索。一方面STR 基因座具有高度多态性, 另一方面,STR 的突变率也很高[9-10]。故2010年由司法部制订出台的亲权鉴定技术规范中对常染色体STR基因座的选择有明确的要求[11]:(1)经过群体遗传学调查,多态性高,非父排除率在0.7以上。(2)经过500次以上减数分裂的家系调查,基因座的突变率在0.002以下。按此标准,IdentifilerTM体系15个STR基因座在福州汉族人群中的非父排除率只有D18S51、FGA两个基因座满足0.7以上,其余13个基因座并没达到此标准。同类的现象在本地区曾健等[12]学者的研究中也见报道。本研究认为可能是IdentifilerTM体系的15个STR基因座主要是针对欧美群体而设计的,并非完全符合福州地区人群个体识别和体亲子鉴定的检测要求。为此学者必须进一步寻求更符合该地区鉴定要求的新的STR基因座。
3.3 福州汉族人群中所发现罕见等位基因的应用价值
当大量群体进行STR分型时,往往会发现一些新的等位基因。由于这些等位基因在等位基因阶梯中没有对应大小的片段,通常需要自己去定义,在实践中称这些等位基因[13]为“off-ladder(OL)”等位基因,即罕见等位基因。本研究所发现稀有等位基因均在美国国家标准和技术研究所(NIST)STRBase网站上公布的各种常用STR基因座的“off-ladder ”等位基因范围内。其类型有两种[14]:一是超出该基因座ladder范围的罕见等位基因(第一类型);二是出现在两个等位基因之间的罕见等位基因(第二类型)。国内学者徐志成等[15]用IdentifilerTM系统对罕见等位基因及其频率的研究提出,IdentifilerTM检测系统中,ladder主要以欧美等西方人群遗传背景为基础制备,而 STR基因座的核心序列,在不同种族的人群中分布差异较大,因此该体系并不完全适用于中国人群的基因检测。这些罕见等位基因的出现,给检测结果判读带来一定的困难。而本研究也认为罕见等位基因的存在及其确定,有助于提高各STR基因座的个体识别能力、非父排除率等。同时也提示各试剂生产公司应
制备更加完善的、 适合中国人群的 ladder以分析这些数据。尤其在试剂国产化的过程中更加要注重这方面数据的收集,并将这些数据放在ladder中,使DNA个体识别和亲权鉴定的试剂更加符合中国人群。当然,若要发现更多稀有等位基因,无疑需要进一步扩大群体数量。
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【关键词】STR基因座;遗传距离;进化树;遗传多态性
doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.09.304文章编号:1006-1959(2010)-09-2548-02
表1中国17个人群遗传距离
短串联重复序列(short tandem repeat,STR),又称微卫星DNA或简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)是存在于人类基因组中的一类具有高度多态性的遗传学标记,一般是由2~6bp作为核心单位串联重复形成的DNA序列[1],其长度多态性来源于重复单位拷贝数的个体差异,很容易通过PCR扩增,进行基因检测。凭借其扩增成功率高,个体识别力和多态信息总量高等特点,不仅是在法医个人识别工作中,在亲权鉴定、DNA数据信息共享,以及人类群体遗传学研究工作中起到越来越大的作用[2][3]。
1.材料和方法
1.省略),收集河北汉族、内蒙古汉族、福建闽南地区汉族、江苏汉族、江西汉族、山东汉族、甘肃汉族、青海蒙古族、陕西延安地区汉族、四川成都地区汉族、藏族、重庆汉族、广东潮汕地区汉族、广西金秀瑶族、广西苗族、海南黎族、河南汉族[4-7]这17个人群的STRs资料,筛选TPOX、D3S1358、CSF1PO、D5S818等15个基因座的等位基因频率。所有文献数据均符合如下原则:三代以内均为同一民族的无关个体,并世代居住于该地区;每个地区民族的样本采集数均大于90例。通过对各个基因座频率进行X2检验,其P值均大于0.05,符合Hardy-Weinberg平衡。
1.2统计学处理:比较文献17个人群的15个基因座基因频率的分布特征,使用phylip3和mega4.1统计软件包计算他们之间的Nei`s遗传距离,并构建系统发生树(UPGMA法)[8]。
2.结果
2.1高频、低频等位基因频率及常见基因型分布。从统计中的基因频率可以发现:各个相聚类的群体中,在等位基因频率上有相似之处,聚类比较远的群体之间在等位基因型及频率上有一定的差别。例如:在vWA基因座上,汉族群体中发现了A8、A10、A12、A13这几个在少数民族并没发现的等位基因。
2.2Nei`s遗传距离。采用phylip-3.8软件计算17个群体的遗传距离(见表1)。结果显示:河北汉族与山东汉族遗传距离最小(0.0072),江西汉族与四川汉族之间的遗传距离次之(0.0076);青海蒙古族与海南黎族遗传距离最大(0.0713)。其他各人群之间的遗传距离均有不同程度改变。
2.3发生树聚类分析。根据Nei`s遗传距离,采用非加权平均法(UPGMA法)构建17个群体的系统发生树(见图1),在所测的17个民族群体中,10个汉族群体与藏族首先聚类,然后与陕西延安地区汉族和甘肃汉族聚类;广西瑶族,苗族聚类,然后与海南黎族聚类;最后两者与青海蒙古族聚类。
图1中国17个群体系统发生树
3.讨论
短串联重复序列的群体遗传多态性能反映群体分化的历史,群体中频率最高的等位基因被认为是群体中最原始、最保守的,其余的等位基因是群体分化过程中由频率最高的等位基因突变形成的。
中国是一个历史悠久的多民族国家,在漫长的历史进程中经历过多次的迁移、融合和分化,形成了具有不同地域分布、不同语言文化、不同风俗习惯和不同的群体遗传结构特征的民族与族群。根据Nei`s遗传距离计算,随着遗传距离计算中的基因等位点数目的增加,各个群体的遗传距离计算更加明显,在UPGMA法中会把各个群体的聚类更加细化,即在中国东南部的汉族首先聚类,然后与藏族及中部汉族聚类,使聚类分布在地理上呈阶梯状分布,这样结果更加符合由于地理差异造成的群体分布。
基因是遗传物质DNA的核苷酸序列,在自然界以一定的频率发生变异,所产生的变异体大部分是中性的,并稳定地世代相传。STR由于具有高度的多态性和稳定性,在进行民族间的群体遗传结构分析中是理想的遗传标记。
需要指出的是,通过对全国各地人群STR基因座的等位基因频率资料收集的过程中发现,在法医学发展比较好及其邻近地区的STR基因座资料比较全面,部分地区部分民族的STR基因座资料比较欠缺。在法医发展相对落后及部分民族群体中的遗传学资料比较匮乏的地区,应该在调查研究中投入更大的精力,建立本地区,本民族的基因分布频率资料,以在检验中提供相对科学的基础数据。
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关键词应用型高校;遗传学;课程内容;教学策略;评价体系
作者简介张红利(1985—),女,山西寿阳人,副教授,博士,从事分子生物学研究。
收稿日期2020-03-19;修回日期2020-04-09
遗传学是高等院校生物类专业必修的一门主干基础课程,也是21世纪生命领域中发展最为迅速的学科之一。遗传学的研究范畴已大幅度拓宽,由最初的植物、动物和微生物遗传学延伸到医药学、免疫学、生态学、环境科学、分子生物学、基因组学、生物信息学等各个生命领域[1-2],迫切需要从教学内容、教学策略、考核方式等多个方面进行教学改革,以培养具备扎实基础知识、较强应用能力的优秀人才。
1遗传学课程教学现状
1.1遗传学教改现状
遗传学是生命科学的核心课程。近5年,本科阶段的遗传学课程教学已在课程内容更新和知识传授方式上进行了一系列卓有成效的探索,主要体现在3个方面:①《遗传学》教材版本的丰富和多样化,如《普通遗传学》《现代遗传学》《分子遗传学》《动物遗传学》《医学遗传学》《数量遗传学》《群体遗传学》等[2];②遗传学精品课程的创设,如浙江大学、武汉大学、复旦大学、厦门大学、云南大学等各大名校相继开设了遗传学、医学遗传学、动物遗传学等国家级精品课程;③遗传学教学改革的初探,如遗传学网络课程方面的建设与探索[3-5],在遗传学教学内容以及教学方法上的教改探析[6-9],以及针对不同类型高校进行的遗传学改革探索[1,10-12]。
1.2遗传学教学现存问题
由于各高校培养对象、任务与侧重点、目标各有差异。山西大同大学现为山西省首批应用型转型试点高校,结合学校发展定位,遗传学课程教学面临严峻的挑战,目前主要存在几个问题:①教学内容缺乏整合,且与实践应用脱节;②教学理念和策略保守;③课程评价体系单一且不完善。传统的遗传学教学体系让学生感受不到挑战性、实用性和前沿性。如何对课程进行合理规划,以及如何挖掘学生的探究潜力已成为教师面临的首要问题。因此,遗传学课程教学改革迫在眉睫。
2优化知识体系,体现专业特色
2.1章节内容的精选和整合
遗传学在生物科学领域中发展迅速,内容在深度和广度上都发生了变化,必然要求高校教师在教材内容的选取上做合适的调整,内容要突显基础性、新颖性及适用性。第一,从章到节均需要精简,如高中遗传知识点(遗传的物质基础,孟德尔遗传定律,伴性遗传、物种形成与自然选择学说等);与细胞学和基因工程课程内容重叠的章节(体细胞遗传、细胞质遗传的分子基础、基因突变、基因表达调控、基因工程)。第二,遗传学教材各部分内容相互渗透、实际教学中需要将这些分散的内容进行整合,补充和联系,使学生对遗传学知识结构有清晰的框架和脉络认识。如孟德尔定律、连锁交换定律、伴性遗传这些章节均属于细胞核遗传信息的传递规律。它们之间既有区分,但又密切联系,在研究多个性状的遗传时,决定这些性状的基因既可能遵循孟德尔自由组合定律也可能遵循连锁交换定律,而单个基因的遗传只遵循孟德爾定律。另外,伴性遗传性状并非独立与前二者,而是孟德尔定律和连锁交换定律在某些性状传递过程中的特殊体现。在细胞核遗传规律内容基础上,细胞质遗传和母性影响对性状的遗传方式做了进一步补充和扩展,将三者比较区别联系,能更好地理解拓展性状的遗传方式,即决定性状的遗传信息因其所在位置不同,性状的遗传方式将呈现不同的规律,但又有内在关联。单基因决定性状的遗传方式是遗传学中最基础的内容,现实中有许多性状是由几个甚至多个基因共同决定的,数量遗传学对于理解这些性状的遗传尤为重要。
2.2遗传学案例的引入
教学内容中引入实践性、趣味性较强的典型案例,能使学生通过悬念和联想空间达到理性升华。第一,通过引入能够激发学生关注遗传学疾病案例,如常染色体遗传病、性染色体遗传病、染色体畸变以及基因突变相关的特殊性医学病例,学生分组绘制疾病的家族系谱图并分析其遗传特点,能使学生更充分地理解人类的性状遗传需用系谱这种特殊的方式进行研究,调查疾病和绘制系谱是遗传疾病研究的前提基础,通过分析讨论疾病在家族系谱中的遗传特点激发学生的思维火花,更好地理解掌握人类遗传病的遗传特点[13]。第二,通过引入与农业生产相关的遗传学案例,如以袁隆平为首的科技组进行的“三系”配套法、两系杂交稻关键技术研究以及杂交水稻超高产育种的实现;荷兰皇家温血马协会利用杂种优势培育的享誉世界的荷兰温血马;标记基因在高赖氨酸玉米选育时的应用、不育基因或致死基因在防治害虫时的应用。分子遗传学和遗传工程在农业上也已经有广泛的应用前景,如通过转基因可以提高作物产量、改善植物品质,通过导入抗病、抗虫基因增强作物的抗性。第三,遗传学实验案例。如大熊猫的分类和起源在过去较长时间中一直存在争议,有学者提出大熊猫是熊和浣熊共同祖先的后裔。也有学者提议大熊猫应单列为熊猫科。通过染色体核型分析发现大熊猫染色体核型在数量排量上更类似于小熊猫,与熊存在显著差异;但是进一步通过G带染色,结果表明大熊猫部分染色体带型和熊的带型非常相似,意味着大熊猫可能起源于熊科,学生通过此案例能更好地理解领会染色体核型分析的原理和作用。
通过在教学内容上进行合理的精简整合以及引入遗传学案例更新优化知识体系,以培养具有遗传学系统知识框架的优秀生物学应用型人才。
3更新教学策略,挖掘学生的自主探究能力
3.1教师的教学策略需发生转变
因章节内容的差异,多数章节仍需要以传统的讲授方式进行教学,但是部分章节与社会发展紧密关联,传统讲授限制了学生的主观能动性,教师的教学理念就需从传授知识转变为辅助学生获取知识,挖掘学生探究潜力,因此相应的教学策略就需要更新并融合应用。如将基因定位和遗传学作图、质核互作遗传、细菌的遗传重组作为试点章节,采用社会情境—问题导向—探究合作组合教学策略模式,应用启发式、探究式、开放式、讨论式、案例式等多种交互式对话的教学方法引发学生的自主思考,自主探究和自主发现,激发学生的内在学习动机,最大程度地启发学生的主观能动性,在掌握基本理论知识的同时,全面提高学生分析和解决遗传学问题的能力及综合素质,培养学生自主学习和创新的能力。
3.2课后任务需明确合理
课堂在多数情况下是重点核心知识讲授的环节,对于无法开展多样化课堂形式的教学内容可通过课外多种方式激发学生的学习动机。通过引入带有疑问的案例,安排学生课后通过查阅资料解决案例中问题,激发学生对知识的求知欲,促进学生主动预习和学习,课堂中才能更好地将基础内容与生产实践相联系。另外,选择适量的难度适合的习题或考研题作为课后任务,学生通过练习思考探究才能更好地巩固掌握课堂所授知识,且实践性案例习题能更好地帮助激发学生的兴趣。学生习题的解答需在完整性、逻辑性、程序性方面提出高要求,有利于反馈学生的过程式思维。另外还需建立线上互动课堂,将习题反馈的疑问以及学生习题过程中遇到的困惑做合理的引导和科学的解答。
3.3注重知识框架的构建
章节教学结束后及时安排学生小组完成细节内容、知识点的脉络图解。同时也要注重章节与章节之间联络知识的衔接及中型框架的构建,另外学期末要求学生结合遗传学课程教学大纲重建知识点大框架和思维导图,有利于学生形成完整的系统的遗传学知识框架体系,并掌握概念图知识框架构建的方法,培养学生构建整体知识脉络的能力。
4评价体系多样化深入化,提升学生分析解决问题的能力
一、在充分调动学生学习兴趣的基础上发挥其主体作用
兴趣是一个人工作及学习动力的一个重要来源。因为遗传学内容相对来说较为抽象,若果说课堂上教学方法生硬,采用讲授的方式定会降低学生学习的兴趣,学生若培养起了浓厚的学习兴趣不但有利于其提高自控注意力,而且可以有效的激发其学习情绪,提高学习效果。在教学时,采用什么样的方法教学内容才可以引发学生学习的激情是每个教职人员应该思考的问题兴趣。一般来说,教师在上课时要善于充分组织及引导的作用,做好自己的角色定位,用生动的语言来打破枯燥的说教激发学生的学习热情,同时注意将教学与生活紧密联系。可以借助多媒体、图像和动画结合的方式给学生以直观理解。
二、引导学生自主思考,加深学习印象
学思结合是提高教学效果的一个重要方法,老师在进行课堂教学时要注意总结所授内容的关键问题,并注意设计适当的情境,必要时可举适当的事例用提问的方式将主题引出,带动学学生自主思考,积极寻找探索并主动构建相关知识体系,加深对知识的理解,这种教学方式不但能够很好的启发学生的思维,而且很容易带动学生的学习兴趣,课堂互动多了,气氛活跃后,学生的学习效果自然就提高了。有研究记录在课堂学习“连锁遗传”一课时,授课老师首先提出连锁遗传现象是在1906年贝特森和庞尼特进行香豌豆杂交试验得出的,然后顺带提问以紫花及红花、长花粉粒及圆花粉粒这两对相对性状的杂交实验结果如何呢,因为基本的遗传学基础,学生自然会根据遗传规律推导实验的结果为9B3B3B1。之后,老师公布答案F2中4种表型和不表现型9B3B3B1比例的杂交结果,这就会让学生怀疑,并主动思考为什么会有不同的结果呢?此时,老师接着引申,当时这两位科学家认为这种表现为连锁遗传,但是确没有合理解释,后来到1911年摩尔根果蝇杂交试验才提出了合理解释,我们可以想象到这个时候所有学生应该都在自主思考并迫切想知道原因,这时老师就可以布置生物情境,分析摩尔实验,以果蝇正常翅及残翅、红眼和紫眼这两对相对性状为研究对象进行了测交实验并引出重点进行有针对性的讲解。
综上,老师在教学时要注意方法,可以采取先设置情境,让学生在旧知识的不断思考运用中自觉的接受新知识,通过不断设置疑问对学生进行适时引导,让其产生参与意识,并积极寻求矛盾的解决方法,加深对所学知识的热情及印象。
三、设置必要的讨论课程,让学生自主分析总结
因为遗传学的内容较为抽象,学生很难掌握,容易产生枯燥厌烦的心理,教师在授课时可以针对这个特点单独安排一些即兴讨论,将每章节的重点及难点总结后,进行分组讨论分析。如有丝分裂和减数分裂的不同比较,两者的最主要不同处即为染色体在分裂时表现出不同的变化,遗传学三大遗传规律的实质及相互的联系区别等,这些问题都能够作为问题讨论。另外,还可以通过在课后设置讨论题目的方式,让学生在课下思考,并将自己的想法以书面的形式递交,同时尽快安排课时针对设置的问题进行讨论。这些方法都能够打破原来的老师枯燥的讲授的方法,让学生能够独立思考,自主总结,一方面,可以促使学生从自己的角度理解问题;另一方面,还能够让学生对所学知识有深入的了解,提高自身的总结分析能力。
四、将所学的理论与实际密切结合
理论是枯燥单调的,但是一旦将理论与实践结合起来,其所发挥的效果又是巨大的。在课程中增加实验教学是理论学习的补充、继续及深化,在遗传学学习中必不可少。学生通过亲身实验不但可以验证所学习到的遗传规律,而且能够有效地加深对于理论知识的理解。
五、培养学生加强对信息的敏感性及自学主动性
在教学中,教师要充分利用网络资源及共享资料,及时了解遗传学的最新发展成果,闭幕会注意将相应的网络遗传资源深入到课堂教学中来,这对与及时更新遗传学知识体系,扩展学生获取信息的敏感素质具有重要的意义,而且能够引导学生提高学生的自主意识及能力。
一般情况下,遗传学的课堂教材的内容均会落后于遗传学的发展,所以仅仅通过课本来获取知识具有一定的片面性及滞后性。所以说,在遗传教学中充分认识到网络共享信息资源重要性,根据教学内容提出学习的主题或是关键词,引导学生自觉上网查询,将网上最新的知识信息与教材中所学习到的内容紧密结合,并学会共享,不但可以有效地巩固所学知识,而且还可以拓展学生的视野,丰富其知识结构,培养运用信息的能力和主动学习的能力。
遗传学飞速发展,这对于高校的遗传教学提出了一个很高的要求。所以,高校如何做好遗传教学工作,寻找较为有效的教学模式,来构建一套整体的遗传学教学体系,最大限度地培养学生综合能力是高校遗传教学的一个重要发展方向。针对这些特点,高校一定要从长远出发,认真思考有效的教学模式,有针对性地改进教学方式,选择最佳的教学方法,以适应医学人才培养的需要。
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关键词 德保矮马;遗传资源;保护;利用
中图分类号 S821.2 文献标识码 A 文章编号 1007-5739(2016)19-0261-01
德保矮马与英国Shetland矮马被称为世界两大矮马源流,是当地同胞在海拔700~800 m的干旱石山村寨中长期自繁自养、封闭繁育形成的稀有矮马品种。德保矮马是唯一既具有多基因遗传特性,又具有在漫长进化过程中自然形成和基因相对保守特性的矮小马品种。德保矮马体高在100 cm左右,最矮的仅有85 cm,具有色纯、体型秀美、性情温顺、灵巧等特征,是珍贵的种质资源。目前德保矮马存栏量不足1 000匹,不达全国马匹总数的1/10 000。英国的Shetland 矮马是经人工矮化形成的,中国的德保矮马是全球仅有的非人工矮化自然形成的珍稀品种。
中国矮马主要分布于我国西南地区,是体高处于西南马下线的低矮群体,按地理区域的不同主要划分为广西德保矮马、贵州矮马、云南马关矮马、四川安宁矮马、陕西宁强矮马[1-3]。德保矮马属于中国西南马系百色马中的石山矮马,主要分布于广西西南石灰岩地区的德保县。主产区为云贵高原东南边缘余脉,北纬23°10′~23°46′,东经106°37′~107°10′,喀斯特半喀斯特地形纵横交错,地形地貌特殊复杂,属于南亚热带季风气候。德保矮马2002年被列为全国78个国家级畜禽重点保护品种之一,成年母马平均体高(98.35±4.55)cm,成年公马平均体高(97.42±3.76)cm[4-5]。
1 德保矮马起源
德保矮马是在石山地区特殊地理自然环境下长期选育形成的遗传性稳定的马品种。其原名为百色石山矮马,属中国西南马系山地亚系[6]。德保矮马于1981年被西南马考察组发现,1986―1990学者们以广西德保县为基地,综合生态学、血型学、考古学、养马学等多学科进行研究,证实德保矮马的矮小性状可稳定遗传,是一个古老的马品种[7-11]。脊椎动物学家研究发现德保矮马是我国汉代史书中记载的“果下马”的后裔之一,是中国小型马的代表[4,12]。2009年国家畜禽遗传资源委员会审定正式从“百色马”中分出,成为独立的畜禽遗传资源,正式命名为德保矮马。
2 德保矮马遗传资源特征
2.1 遗传资源特点
德保矮马是世界上稀有珍贵自然形成的优良马种。成年马体型矮、短、粗、壮,结构匀称;头清秀且长,少数有额星,额宽适中;鼻翼张弛灵活,鼻梁平直,少数稍弯;头颈结合良好,颈长短适中,清秀;胸宽、深、发达;腹圆大,向两侧凸出,稍下垂,后腹上收;毛色有红、黄、白、黑、片花及沙毛等;蹄型复杂,个别马有明显黑或褐色背线;四肢端正,整体稍有前冲姿势;眉毛浓密,长至地面;膝关节、飞节、腕关节坚实、强大。
2.2 现状
随着社会进步及运输业的发展,马属动物在我国大部分地区的役用地位明显降低。主要马品种面临种质资源退化、种群数量及质量降低的严峻形势。德保矮马的存栏量一直在减少,1983年德保县存栏矮马不足2 200匹;2006年末,存栏量不足1 000匹;现在德保矮马数量越来越少,被国家农业部列为稀有物种[5]。近年,国内有关马的研究主要集中在根据马种外在特征与其细胞、分子遗传学、生化的关系等方面研究马的起源、遗传种质及遗传差异。为加强德保矮马保种育种工作,保护这一稀有品种,现已开展德保矮马生长激素基因的克隆与序列分析,以研究生长激素基因位点突变与矮小的相关性[5];开展德保矮马品质分析及冷冻保存方法的研究,研究开发及优化德保矮马冷冻保存的配方[7-8],以保护、开发、利用德保矮马种质资源。
3 德保矮马遗传资源保护理论与方法
3.1 保种理论
保种理论主要有2种,即随机保种理论和系统保种理论。随机保种理论认为保种应该是保存现有的全部基因,“原封不动”地保存品种或群体;从畜牧学角度讲就是保存现有的品种及品种特殊的变异类型,避免其混杂、退化、泯灭。系统保种理论把一定时空内某种畜禽品种所具有的全部基因种类或基因组合体系组成的基因库作为保种对象,依照基因库与品种生物学特性及育种目标性状的遗传关系,经系统规划分配到各个品种中去,并结合一切可用的技术手段,建立并筛选能够最大限度保存畜禽品种全部基因种类的基因库及基因组[9-11]。
3.2 保种方法
保种方法目前主要采用活体保种即动态保种、生物技术保种即静态保种。活体保种即可保留畜禽对外界环境的适应能力,甚至还可增强该种能力;在保种的同时可检查和消除基因缺陷,改良不利性状[10-13]。生物技术保种有冷冻保存、建立DNA基因文库、克隆、胚胎分割、分子遗传标记辅助保种等。冷冻保种即超低温冷冻、卵子、胚胎或品系的配子及胚胎进行保存。从理论上讲建立DNA基因文库进行保种是一种最安全可靠、维持费用低的动物遗传资源保存方法,该方法可长期保存畜禽基因,并可随时取用[14]。胚胎分割可增加优质种畜的数量、保护濒危野生动物并有效保存遗传资源。分子遗传标记可基本保存群体中全部的基因,但也可能使群体生产性能下降。
现已建立国家级德保矮马资源保护场,创建保种场“集中保种”,保种基地“国有民养保种”,对德保矮马进行活体保种。蒋钦杨等[5]克隆、分析德保矮马生长激素基因全序列,以寻找生长激素基因位点突变与矮小基因的相关性。杨胜林等[15]利用13个微卫星基因座对中国5个矮马品种即德保矮马、贵州矮马、宁强矮马、四川矮马、云南矮马进行遗传平衡检测。蒋钦杨等[16]采用聚合酶链式反应――单链构象多态性(PCR-SSCP)技术分析德保矮马生长激素受体基因的多态性,为深入研究矮马矮小性状形成的分子机制打下基础。马月辉等[17]及周向梅等[18]分别采用胶原酶消化法、组织块直接培养法将德保矮马耳缘组织进行培养并建立该组织成纤维细胞系,使德宝矮马种质资源在细胞水平保存下来,为基因组和体细胞克隆等进一步研究提供理想的生物材料。
活体保种种群会受到疾病、近交、有害基因等不利因素的侵袭,会使保种群遭到严重损害;建立专门的保种群体,维持成本较高;自然选择也会造成群体遗传结构的改变。活体保种时,应严格禁止亚种或品种相互间进行杂交,按亚种或品种划定一定区域和亚群。目前及今后相当长一段时间内活畜保种是畜禽遗传资源保存的主要方式,应用现代生物技术保种是另一条有效途径。
4 德保矮马保护现状及展望
针对德保矮马濒危现状,当地政府采取“国有民养”及建立保种场、保护区的方法,建立德保矮马活体保种体系及保种核心群。随着德保矮马主要产区农业机械化普及和交通基础设施的完善,矮马使役价值降低,农民养马积极性下降。现以建立国家级保种场为重点,进行集中保种,同时建立“企业+景区”开发模式,以促进德保矮马资源保护。
在我国畜禽遗传资源的管理主要是政府行为,设立经常性的管理机构很有必要。建立德保矮马冻精、冻胚“基因库”,开展细胞工程、胚胎工程方面的研究;依据群体遗传学理论以各家系性别比例等量留种,但不一定采取随机,以避免全同胞、半同胞以降低近交率,进而提高保种效果。保种应当尽可能与利用结合,并把从利用中取得的经济效益投入到保种中去[19]。
应进一步深入研究德保矮马的遗传系统、地域系统、生态类型、经济用途及文化特征等,以揭示德保矮马起源进化、传播路线、经济性状及遗传资源多样性,为德保矮马遗传资源的开发利用及有效保护提供科学依据。
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关键词:遗传算法;机会约束;半绝对离差;投资组合模型;随机模拟
中图分类号:F830.59 文献标志码:A 文章编号:1673-291X(2008)15-0090-02
引言
证券投资组合[1],是指为了避免或分散大的风险,投资者将资金分散投资到若干种证券中,以降低风险。一般来说,把全部资金投在一种或极少种证券上,则不论证券的质量多好,风险也是很大的,为了避免或分散较大风险,投资者可按不同的投资比例对多种证券进行有机组合,即所谓证券投资组合,以期取得最大的经济效益。
1991年KONO等[2~3]提出了绝对离差投资组合模型,用收益率的绝对离差表示风险,由于绝对离差不具备良好的解析性质,无法给出投资组合解的解析表达式。后来在绝对离差的基础上,该模型发展成了半绝对离差投资组合模型[4~5]。半绝对离差投资组合模型更符合投资者的心理,且能用非数值算法求解。在现实生活中,投资者选择证券投资组合,要求在实际收益率大于期望收益率的概率不小于某一置信水平的前提下,使风险达到最小,这就是机会约束下的投资组合模型[6~10];一般来说,求解机会约束的方法通常是将机会约束转化为相应的确定性等价类型来对其求解,但是现实中,能转化为确定的等价类型的机会约束是很少的;随机模拟是一种实现随机系统抽样实验技术。虽然随机模拟是一种很不精确的技术,但对那些无法用解析方法处理模型却是一种十分有效的方法。
遗传算法[11~12]是建立在自然选择和群体遗传学基础上的一种非数值计算优化方法,随机产生若干个染色体构成的初始种群,通过对种群的选择、交叉、变异等遗传操作,从一初始解的种群开始迭代,逐步淘汰较差的解,产生最优解。
大量实证结果表明:风险资产收益的联合分布往往呈现厚尾特征且服从自由度较低的分布,同时基于正态分布的各种资产定价定价理论在分布下通常也是正确的[2,13]。
一、模型的建立
在现实生活中,由于风险资产收益率本身具有随机性,投资者选择证券投资组合时,要求在实际收益率大于期望收益率的概率不小于某一置信水平的前提下,使风险达到最小,这就是机会约束下的投资组合模型,其数学表述为:
二、随机样本模拟
在资产收益率不服从正态分布的情况下,模型(2)中的机会约束可能不一定有相应的解析表达式,很难计算出相应的确定等价类型,计算起来也很困难,故对这样的模型采用随机模拟技术来近似求解比较方便。模型(2)中的机会约束可采用随机模拟(Monte Carlo)方法[14~15]近似计算,具体实现方法如下:
步骤1:置N=0,固定机会约束中的x,用Metropolis 算法从t分布的概率密度函数中产生M个服从t分布的样本。
步骤2:判断M个样本的组合值是否大于R;如果大于R,则保留这M个样本;则N= N+1。
步骤3:重复以上步骤1和步骤2共N次( N
≥1-a。
步骤4:利用步骤1的方法随机产生大小为M的样本,重复步骤1共T―N次。
步骤5:从以上步骤1、2、3、4中得到M×T维样本矩阵。
三、遗传算法
用遗传算法求解模型(2)的基本思想是随机产生一个初始种群,然后反复进行选择、交叉、变异等遗传操作,并利用目标函数作为适应度函数对每一代的染色体进行评价,给定终止条件,从而得到最优解的最近解,具体算法过程如下:
步骤1:设置种群规模、最大遗传代数、交叉概率、变异概率。
步骤2:在可行域内,随机生成二进制编码的初始染色体种群,并对初始种群进行解码和归一化。
步骤3:计算适应度函数的值和每条染色体的选择概率。
步骤4:根据选择概率、交叉概率和变异概率对初始染色体种群进行选择、交叉、变异操作。
步骤5:重复以上步骤3和步骤4,直到满足迭代终止条作,得出最优染色体和目标值。
步骤6:画出迭代次数与目标函数的关系图。
四、模型求解与实例分析
对上述算法应用matlab软件进行编程求解。假设证券随机收益服从自由度为m=5的t分布时,选取深证A股15支股票,2003年1月至2008年1月,共60个月的月收益数据,应用matlab软件对模型(2)进行实证分析,具体数据见下表:
利用遗传算法求解时输入参数:交叉概率PC=0.86,变异概率Pm=0.058,迭代次数500,代沟为0.9,R=0.03,a=0.1.求得目标函数最优值等于0.0084,最优权重向量:
X=(0.0381,0.0874 ,0.2338,0.0985,0.0419,0.1982,0.0204,
0.0947,0.0678,0.0397,0.0095,0.0194,0.0028,0.0062,0.0417)
迭代次数与目标函数的关系
从迭代次数与目标函数值的关系(见左图)可以看出该算法经过280代后开始收敛,并且得到了该模型的近似最优解。
五、结束语
本文研究了机会约束下求解半绝对离差投资组合模型的一种方法,利用随机模拟技术在资产收益服从自由度为5的t 分布时,以机会约束作为样本产生的依据来随机产生风险资产的随机收益率;利用遗传算法来求解半绝对离差投资组合模型。实验结果表明:该方法用随机模拟技术和遗传算法在matlab软件中成功地实现了模型的求解,避免了将机会约束转化为确定的等价类型的求解的复杂计算过程,同时也易得到全局最优解,进一步研究可以广泛应用于金融和最优控制等许多领域。
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人类将步入21世纪,我国精神医学的发展也将进入一个新的时代。
1生物精神医学的发展
21世纪初,将完成精神疾病群体遗传学、遗传流行病学研究,精神疾病遗传学研究将从细胞水平向分子水平过渡。从分子生物学探索精神疾病的病因将得到全面的发展,重点在Alzheimer病、精神分裂症及情感性精神障碍候选基因的研究。随着分子生物学技术的持续发展和人类基因组-环境基因组计划的完成,精神科各种疾病和致病基因将被陆续克隆,在此基础上,21世纪的后期将可能开展对精神疾病有效的基因治疗,从而完成精神医学发展史上一个质的飞跃。
20世纪60年代开始提出的各种神经生化假说(主要指经典神经递质假说和神经肽假说等),将在新世纪陆续得到验证;随着神经生物学对各种与精神疾病有关的功能蛋白(包括受体、代谢酶等)性质的了解,各种精神疾病的发生机制也将得到阐明。在20世纪80年代后,CT、MRI、SPECT等现代先进检测仪器开始用于精神医学,使神经影像学在精神医学领域有了初步的发展。21世纪我国各大城市将逐步装备PET仪在临床科研中应用,精神医学的脑功能影像学将出现一个新的研究热点,对活体脑部受体的研究将彻底取代20世纪在精神病患者尸体脑组织上的研究,这对克服许多实验不稳定因素对研究结果的影响是一个很大的进步。
20世纪90年代热衷于寻找直接服务于精神疾病临床诊断的某些精神生理学标志,虽然探索的结果往往自相矛盾、莫衷一是,但这方面的工作在新世纪会得到加强,除了在脑电生理、眼球运动等方面的研究继续深入、推广之外,新的、更多的精神生理学标志将被应用于临床辅助诊断。
免疫学、神经内分泌学等多种学科与精神医学的结合发展也势所难免,精神医学将出现相当多个互相联系但又独立性极强的分支学科,是21世纪精神医学发展的体现。
2联络精神医学的发展
在步入21世纪后,心理卫生知识将得到普及,内外科医师对心理障碍的识别率将大幅提高,市级综合性医院将建立精神科联络-会诊机构,并且有专门的心理工作者和精神科医师参加临床各科的防治工作。
3社区精神医学的发展
康复精神医学在新世纪中也将得到充分的发展,以功能训练、全面康复、重返社会和提高生活质量为宗旨,逐步建立适合我国国情的社区康复模式,造就一批从事精神康复的专业工作者,以及社区服务工作者,广泛地推行各种技能训练、社区病例管理及某些职业康复方案等,以促进精神病人的心理社会性康复。这使精神卫生服务社会化变得十分紧迫和必要。
4精神卫生机构领导和医护工作者应作的努力
21世纪精神卫生机构领导和医护工作者应作的努力主要包括以下几个方面:
(1)人才队伍的建设精神医学的发展主要靠科研、临床、社区服务三支人才队伍的建设。新世纪精神医学分支学科的大发展主要靠科研队伍,我们需要通过自我建设、同国际先进国家合作交流,尽量同国际接轨,进行大量的跟踪性科研,缩短同国际先进水平的差距,以便在新世纪中进行更多的创新性研究,赶超国际先进水平。其次,随着精神医学的发展,强大的临床队伍是必不可少的,使疾病病因学理论、药理学理论付诸实践,更好地为患者服务。社区服务队伍的建设和壮大是21世纪精神医学发展的特色,这支队伍使精神医学走向广阔的社会,使精神医学充满生命力,也是精神医学在21世纪发展的标志。新晨
(2)精神卫生知识的普及21世纪人人关心精神卫生、人人了解精神卫生的普通知识、人人接受精神卫生教育,对在社区开展疾病的一级预防具有决定性的意义,也是精神卫生工作者的工作得到社会普遍支持的主要途径。
(3)提高临床服务质量随着临床诊断从症状描述性的表层向分子水平深层的转化,临床诊断的准确性在不断提高,我们对临床分类与诊断标准的要求也不断提高。21世纪生物学的高度发展可能使目前的精神疾病分类标准发生根本性的变迁,比如,“精神分裂症”可能依据某些生物学指标而分成多个不同的较为合理且有说服力的新疾病类别,而“神经症”属下的8种疾病类别也可能依据某些生物学指标而重新组合分类;另外,新的诊断标准中必定会增加许多可靠的生物性指标,并且会出现许多疾病“早期诊断”的标准。
【关键词】 注意缺陷障碍伴多动;基因;青春期;预后
中图分类号:R749.94 文献标识码:A 文章编号:1000-6729(2008)009-0684-05
注意缺陷多动障碍(Attention deficit hyperactivity disorder,ADHD)是儿童期最常见的行为问题,通常7岁前起病。ADHD症状从儿童期持续到青春期是比较常见的临床现象[1-2],对88名中国ADHD男性患儿的随访研究发现,到青春期仍有48例(54%)符合ADHD诊断,21例(24%)已不符合任何精神疾病诊断;另外19例(22%)虽不符合ADHD,但仍存在行为、心境或学习等方面的障碍[3]。本课题组以家系为基础的关联分析表明,COMT基因第四外显子Val108/158Met多态性和汉族ADHD男孩存在关联,即低活性的Met等位基因在ADHD男孩中优先传递[4]。迄今为止,尚未见COMT基因与ADHD青春期预后关系的研究报道。本研究探讨COMT基因Val158Met多态性对汉族男性ADHD患儿青春期预后的影响。
1 对象和方法
1.1 对象
为1999年9月至2001年7月在北京大学第六医院门诊就诊的中国汉族男性儿童,居住在北京市或近郊区。经主治医师以上的精神科医师确诊,符合美国《精神障碍诊断与统计手册(第4版)》(DSM-Ⅳ)中ADHD标准,并于2004年1~12月接受随访。基线至随访时限为3~5年,平均3.6 ±0.5年。符合研究标准者共113例,随访到88例,随访率为77.9%。其中具有COMT基因型患儿77人纳入本研究,患儿基线年龄为7.5~13.5 (10.7 ±1.7)岁,随访时的年龄为12.5~16.5 (14.5 ±1.4)岁。有14例(18%)接受了系统治疗,其中3例哌甲酯治疗, 11例脑电生物反馈治疗,1例接受了上述两种治疗。在随访前6个月无人接受任何形式(药物或非药物)的治疗。
DSM-Ⅳ标准将ADHD分为两组核心症状群(注意缺陷和多动/冲动),每组均有9条症状。国外研究者将ADHD的预后界定为:综合征缓解(syndromatic remission,每组症状群条目数是4~5条),症状缓解(symptomatic remission,每组症状群条目数均少于4条,同时无功能恢复),功能缓解(functional remission,每组症状群条目数均少于4条,同时有功能恢复)[5-6]。由家长评估患儿的社会功能,包括学业状况、同伴关系、亲子关系、行为表现和情绪状态等五个方面。家长评定的五方面功能均≥70分者为功能恢复[7]。根据上述界定方法,将ADHD青春期预后划分为:无缓解组(即ADHD组)和缓解组(分为综合征缓解组、症状缓解组和功能缓解组)。
本研究经过了北京大学医学部伦理委员会的批准。患者监护人签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 诊断 医师与家长进行定式访谈、面见孩子进行精神检查以明确诊断;在征得父母亲同意后,请教师填写SNAP-IV教师评定问卷[3]以了解患儿在校的情况。在入组的77例患儿中,直接面见了医师的有55 例( 71.4% ),通过电话交谈的有22例( 28.6% )。
1.2.2 工具
1.2.2.1 儿童临床诊断性会谈量表[8] 根据DSM-Ⅳ标准编制而成的定式访谈工具,基线和随访均采用此量表。内容包括儿童期主要的行为和情绪障碍(如ADHD、对立违抗、品行障碍、抽动障碍、心境障碍等), 该量表灵敏度为97.2% , 特异度为100.0% ,重测信度为0.9[9]。基线和随访的定式访谈各由1名研究人员完成,随访开始前2名医生经过一致性培训, 研究者间评定一致性ADHD的Kappa值为0.81,对立违抗障碍为0.70,品行障碍为0.81,心境障碍为0.76。
1.2.2.2 自拟调查问卷 由家长填写。包括一般资料、学习成绩、治疗情况、社会功能。
1.2.3COMT基因第四外显子Val158Met多态性的检测
1.2.3.1 引物设计 上游引物5'-TCG TGG ACG CCG TGA TTC AGG-3',下游引物5'-ACA ACG GGT CAG GCA TGC A -3'。该序列所扩增的产物长度是217bp。
1.2.3.2 PCR总反应体系 20μl,包括: 2ul 10×Buffer,0.4ul 10mMdNTPs,0.5ul 10uM Primer, 1UTaq聚合酶,基因组DNA为100ng。
1.2.3.3PCR反应条件 95℃预变性3分钟,反应35个循环(每一个循环为94℃,30秒;68℃,60秒;72℃,90秒),出循环后于72℃延伸7分钟。反应在双槽PTC-200型PCR仪上进行。
1.2.3.4基因型的判读 PCR产物用Nla Ⅲ 酶切,置37℃温箱过夜,然后通过4%琼脂糖水平电泳分离鉴定基因型,以50bp DNA ladder作分子量标准物。电泳后用Gel Doc2000呈像系统照相,读取基因型[4]。野生型Val等位基因含2个Nla Ⅲ酶切位点,被切成(81+114+22)bp;突变型Met等位基因含3个Nla Ⅲ酶切位点,被切成(81+18+96+22)bp。
1.3 统计方法 基线资料以EPI.6软件二次录入,随访资料采用SPSS11.5 软件录入后并核对。对计数资料进行四格表χ2 检验。
2 结果
经χ2的吻合度检验显示基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05),说明本研究样本来自随机婚配的大群体,没有近亲婚配、人口迁移等因素对群体遗传学特征的干扰,具有代表性。77名病例中,41人(53.2%)无缓解,满足ADHD诊断;36人(46.8%)达到不同程度的缓解,其中16人(20.8%)满足功能缓解,7人(9.1%)满足症状缓解,13人(16.9%)满足综合征缓解。缓解表型与无缓解型的COMT基因Val158Met基因型和等位基因频率差异无统计学意义,P值均>0.05(见表1)。缓解组内各亚组与无缓解组间,无论以基因型还是等位基因计,分布差异均无统计学意义(确切概率法均P>0.05)。
3 讨论
注意缺陷多动障碍通常7岁前起病,70%可延续至青少年,30%可持续终生,可引起儿童的学习障碍、情绪障碍以及适应障碍,对患者的学业、职业和生活等方面产生广泛的消极影响[10-11]。目前认为遗传因素在疾病的发展过程中决定了症状的稳定性和演变情况[12]。ADHD的遗传度较高,平均遗传度为75%,但由于异质性较强,分子遗传的候选功能基因研究结果一直没有明确的结论[13]。为解决上述问题,目前采用疾病亚型或内表型来替代整体疾病进行研究[14],同时还可以界定明确的ADHD疾病表型[15]。有学者已经将青春期ADHD作为疾病亚型进行研究[16]。因此可以推论ADHD的青春期预后与遗传因素密切相关。
本研究发现COMT基因Val158Met多态性对汉族男性ADHD患儿青春期预后无关联,可能的原因是目前ADHD青春期男孩的样本量较小,有待于进一步扩大样本量进行验证。ADHD本身是一种多基因遗传疾病,而每个基因在其注意缺陷、多动、冲动等症状谱系中只有微效作用。目前几个ADHD候选基因多态性位点(包括DRD4第三外显子7次重复的VNTR,DRD5的148 bpCA重复,DAT1的10次重复VNTR,DBH基因的TaqI A,SNAP-25的T1065G,5-HTT的长等位基因和HTR1B的G861C)的OR值都低于1.5[13]。因此有必要进行基因-基因和基因-环境交互作用的研究。
ADHD分子遗传学研究一直集中于多巴胺、5-羟色胺和去甲肾上腺素等递质系统及其代谢酶等功能基因的研究。多巴胺系统基因是主要的ADHD候选功能基因[17]。儿茶酚-O-甲基转移酶(COMT)是多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素的主要代谢酶之一。影响COMT酶活性的基因多态性位点位于第四外显子,当可溶型COMT(S-COMT)和膜结合型COMT(MB-COMT)第108/158个密码子出现单核苷酸GA的替代后,会发生单个氨基酸的替代(缬氨酸Valine蛋氨酸Methionine),使得红细胞的酶活性和热稳定性发生改变[18-19]。Val是高活性等位基因,Met是低活性等位基因。该多态性对前额叶的影响具有区域选择性[20]。COMT在ADHD中具有重要作用,原因在于:第一,对前额叶参与的认知任务影响的研究表明,met纯合子患儿的成绩比较出众,尤其是相对于val纯合子而言,这些过程需要视空间加工过程、工作记忆、注意力和认知灵活能力[21-23]。功能影像研究表明,需要反应抑制[24]、持续注意[25]和工作记忆[21]的任务能够激活大量的神经网络,这些神经网络集中在前额叶皮质,而COMT基因型可以部分说明其活动形式[21]。第二,ADHD儿童在完成需要工作记忆、反应抑制或持续注意能力的任务中的执行功能受损[26-27], 结构和功能成像研究表明前额叶皮质区域(如前额叶背外侧)[28-29]和纹状体连接处[30]功能失调。与前额叶多巴胺翻转有关的COMT的val能够加重ADHD的这种前额叶执行功能缺陷。而前额叶(执行功能的大脑基础)在青春期迅速发育[31]。
本研究尚存在一定的局限性:首先,对ADHD青春期预后的影响因素较多,如DRD4基因48bpVNTR的7次重复等位基因与ADHD临床诊断、良好的临床预后和大脑皮质发育相关[32]。本文对ADHD青春期预后的遗传影响因素仅仅进行了探索性研究,还有待于结合其他影响预后的因素进行分析。另外,本文的样本量较小,也限制了研究结果的可信度,还需要进一步扩大样本量完善研究。
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