正向遗传学克隆基因的方法精选(九篇)

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第1篇：正向遗传学克隆基因的方法范文

目前世界上。在应用高新技术的生物工程上开展了剧烈的竞争，谁先掌握到最新资源、最高技术和最优品种的成果，就有可能垄断一定的市场。在农林业方面，竞争的焦点主要集中在种子上。有科学家预言。在这场“种子战争”中。或许可以利用一种资源、一个品种而在种子战争中称雄于世；进而指出.一个基因就有可能影响到一个国家或地区的兴衰。但我国在林木种子新技术革命上，起步较晚，基础比较薄弱，应该加强这方面的研究，期望在林木种子革命中有所突破。为林业现代化作出新贡献。

1 林木种子革命的背景和意义

70年代以来，世界上提出“绿色革命”的口号，其实质是指种子革命。应该说绿色革命首先是从农业开始的。世界人口的爆炸带来粮食的紧缺，建设的需要使耕地越来越少，迫使人们必须加快研究选育和推广应用优良的农作物新品种，及其配套改革栽培管理技术。使作物单位面积的产量越来越高，以解决人类的吃饭问题。随着现代社会的发展，资源短缺以及环境恶化的矛盾日益突出，世界的生态平衡受到破坏，人类的生存受到威胁。此时，人们不仅要考虑吃饭问题，还要考虑生存及可持续发展等问题。因此“绿色革命”从农业延伸到林业等学科。

森林是地球上生态系统中最重要的因素。人们对森林的认识已从单纯索取木材转变到可持续经营的角度上来，提出分类经营思想，即把森林区分为生态林与商品林来经营。用80％～90％的林地建设生态林，采用复层林作业，其主要作用是保护生态环境；把条件较好的10％～20％的林地用于商品林建设，进行高度集约经营，主要用于向人们提供木材等林产品。例如。新西兰的商品林仅占其森林总面积的8％.但提供木材占其总产量的90％以上。其关键的技术是林木种子的革命。我们用“革命”这个字眼。是因为良种对林业生产力起着决定性作用，它的变革是根本性的，可带来翻翻的产量。是现代林业的一个核心技术。

国内外通过林木种子改良取得明显效益的事例，不胜枚举。桉树原产澳大利亚等地，引进巴西后，经过改良，采用无性系营造商品林，5年生时，树高可达25m，7～8年即可砍伐更新，每公顷蓄积量超过600m3。刚果进行的桉树育种计划取得的遗传增益为：种源选择50％-80％ ；杂交、个体选择、无性系增益100％～150％。

以上事例可以说明，林木良种化带来的效益是十分明显的。林木与农作物有所不同，树木多为异花授粉，多数处于野生或半野生状态，大部分林木是未经过改良的原始材料。它们的变异普遍，变异的性状多、幅度大，蕴藏着大量尚未利用的优良变异类型。这些优良类型一旦被选育出来，就可以显著地提高林业的生产力，加上多数林木具有容易进行基因型“克隆”的特性，一经选择，马上采用无性繁殖，大量复制，就可很快投入到林业生产实践中。

林业上选育良种与农业比较，具有更加经济长效的优点，在生产周期中只需采用一次，即能获得长久的效果。农业上一个品种不行，第二年甚至第二季就可换一个。而林木生长周期长，一粒种子播下后，十几年或几十年才能砍伐，如果选用良种，年年可获取增益。从这个意义上看，林木良种选育具有更为迫切的意义。

2 林木品种改良的途径

2.1 林木遗传改良的一般过程

林木遗传改良的形式多种多样，可以用如下图式表达其一般过程：

(1)基本群体表型选择优良类型

(2)优良类型遗传测定原种

(3)原种良种繁育品种

(4)品种区域化测定良种

可见一个新品种的培育过程经历了选择——测定——繁育——推广等过程，极为精细复杂，需要耗费大量的时间和经费。

2.2 种质资源开发利用

树木基因资源是地球人的宝贵财富，也是选育树木优良品种的物质基础。不论是常规育种，还是诱变育种乃至遗传工程研究，都离不开基因资源。实践证明，搜集的基因资源越丰富、越全面，对它们研究得越深入、越有针对性，就越能满足各种育种目标的要求，选育出人们所期望的新品种。同时，基因资源不仅用于当前的育种，而且要为将来培育更高质量的新品种服务。

据分类学家估计，全世界现有植物5O多万种，高等植物23万多种。经人类长期驯化栽培，提供人类吃、穿、用等方面的植物种类，只不过1％～2％。约有2000多种。常见栽培作物只有175种，其中16种提供了人类食物的2／3。正是这些为数不多的栽培种类，成为人类社会物质文明的重要基础。譬如树木中的三倍体山杨、直干蓝桉等都是从野生林分中发现的快速生长的优良单株。因此，从某种意义上讲，基因资源的收集和保存比创造新品种更为重要，是一项具有战略意义的工作 。

2.3 选择育种

选择育种是获得优良品种和生产群体的重要手段，在林木改良中具有极其重要的意义。选择育种可以在较短时间内，得到人们需要的基因型，经过繁育马上就可投入到生产之中。例如笔者在天然马尾松林中发现红心率达8O％以上的马尾松单株，这类马尾松1996年的价格是3000元／m3，为普通马尾松的5倍。

选择的物质基础是所研究材料的变异，材料的变异越大，变异越丰富，选择的效果越好。以往林业上多用天然变异，从野生树木中，筛选符合人们愿望的类型，通过培育为新品种。这种利用天然变异材料仍不失为林木选育新品种的有效途径。但天然变异毕竟有它的局限性，难于满足社会发展的需求。于是人们又创造了人工的变异方法，以扩大变异范围和增加选择机会，成为直接改良品种的有力手段。如19世纪已开始的树木杂交育种，通过不同种质问的有性杂交，使父本母本的基因进行交换重组，产生变异。这种方法不仅可以使杂交亲本双方的性状互补，取长补短。而且可能出现超过亲本的性状，产生原来亲本所没有表现出来的新性状。现已从种内杂交发展到种间杂交。进入2O世纪以来，人工促进遗传变异的技术得到很大的发展。7O年代以前主要用物理和化学因素来诱发植物体的遗传物质发生变异.使基因突变的频率比自然界自发突变高出100～1000倍。但这种诱变的方向和性质不易控制，选种的效率较低，因此进展不快。6O年代以来.植物的生物技术发展得很快，从器官培养到细胞培养、原生质体培养、体细胞杂交等，直到现在的细胞工程、染色体工程、基因工程，新技术、新成果不断涌现，给林业带来革命性的变化。

2.4 遗传测定

在目前树木育种工作中，处理的育种材料多数属于未经遗传鉴定的表现型。表现型是树木遗传性与环境条件相互作用的结果.所以优良的表现型并不等于它的遗传性优良。只有经过遗传测定，认定优良的经济性状受遗传控制，从属于优良的遗传性，才能作为原种，进入到更高一级的育种阶段。

2.5 林木良种繁育

良种繁育是林木良种化中重要的环节之一。当通过表型测定选育出来的品种.经过区域化试验，确定推广地区后，便要做好良种的繁育工作，直至该品种被更换了为止。良种繁育是育种工作的继续，是前承育种后接推广并不断提高种性的一个重要环节。如果繁育措施不当.使良种变为劣种，就会失去它的增产效益。良种繁育不仅是前一轮育种成果进入生产的唯一手段，而且也是下一轮育种所需要的遗传信息和基础材料获得的来源。

目前林木良种主要采用有性和无性两种形式进行繁育。营建无性系种子园是有性繁育的主要方式，它的营建技术较简单，繁殖系数较大，被广泛采用。其实质是通过选择.改良原有群体的基因的频率，提高其正向选择的遗传增益，达到改良的目的。目前种子园主要的问题是产量低，实生种子的遗传基础不一致，对高度集约的商品林来说，木材以及林产品的不一致性，给利用带来困难。在无性繁殖的情况下，无性系分株的遗传成分与其原株的完全相同，它们不仅继承了原株的加性效应，而且继承了原株的显性和上位作用效应。所以在选择差相同的情况下，能取得较大的遗传增益，因此近代国内外都趋向于无性系育种和无性系林业。

总之，林木种子从原来的见种就采、见苗就种的局面，到现在选择优良种源、优良林分、优良家系、优良无性系，建立种子园与采穗圃生产良种，已经大大地向前迈进了一步。它已发挥出明显的作用，产生了巨大的效益。从某种意义上说，已经开始了林木种子的革命。但这还不够，现代科技的发展，还要求我们加快生物技术应用的步伐，开展更深层次的林木种子新技术革命。

3 生物技术与林木种子革命

近年来生物技术发展迅速.它包括细胞工程、染色体工程和基因工程。

3.1 细胞工程

细胞工程主要包括原生质体培养、大规模的工厂化的细胞培养、组织培养和快速繁殖等技术，以生产大量的优良无性系，并可获得人类所需要的多种代谢物质，如黄连素、人参皂甙等。细胞融合，它可打破种属间的界限，在树木新品种的培育上有着巨大的潜力。目前，胚胎分化人工种子等技术的利用也日益普及。

3.1.1 林木的组织培养

树木组织和细胞培养的研究也取得了重要的进展。目前由体细胞再生出完整植株的有：欧洲桦、柠檬桉、巨桉、杨树、花旗松、长叶松、杉木、柳杉等几十种树种。林木原生质体培养及细胞杂交也进行了探索，欧洲云杉、花旗松、火炬松、短叶松、杨树、泡桐等树种已分离出原生质体，并进行了培养。日本对杨树种和泡桐的原生质体做了融合试验。

用组织培养繁殖树木，不仅和无性繁殖一样，能保持树木的优良性状，同时还具有如下特点：(1)繁殖系数大；(2)缩短良种的推广周期；(3)培养无菌苗；(4)繁殖难于用常规方法营养繁殖的树种；(5)发育阶段返青；(6)可作用保有基因资源的一种手段；(7)变异培养无性系利用啕。

3.1.2 胚胎发生及人工种子

器官与胚胎发生是培养植物细胞分化的两种主要途径。用胚状体形成植株主要特点是增殖迅速、遗传单一。在组培中获得胚状体以后用适当方法加以包裹即可制成人工种子。根据Flick和Ammirato(1983)统计，经胚胎发生途径得到完整植株的植物有91种。其中有火炬松、糖松和挪威云杉获得体细胞胚胎及小苗。我国培育成功的树木体细胞胚胎发生及小苗形成是中国科学院于1988年以华北云杉(Picea wilsomii)为试材研究成功的。人工种子研制的关键是选择适当的方式进行包被.最常见的是凝胶法包裹。随着人工种子研究的深入.将有愈来愈多的人工种皮材料被开发出来。

3.1.3 原生质体培养

自从Cocking在1960年用纤维素分解植物细胞壁首获原生质体以来，在原生质体培养和融合方面已取得突破性进展。国内外约有2O种林木获得原生质体，其中一部分已诱导成植株。

3.1.4 体细胞融合

体细胞融合试验应在诱导原生质体再生植株的基础上进行。体细胞融合方法对于树木改良特别适合.该法与常规有性杂交比较，具备以下特点：(1)能形成两个亲缘关系较远的种间杂种，克服了有性杂交的配子不亲合性；(2)能获得一些含有另一亲本非整倍体的杂种或胞质杂种；(3)能设计出一次两个以上亲本的融合；(4)能获得在遗传上呈双亲个体基因型总和的杂种；(5)能获得一些有性生殖障碍的植物种类的体细胞杂种；(6)能获得具有不同遗传变化亲本的杂种。

3.2 染色体技术

染色体技术在树木的核型、组型、带型分析的基础性研究较为深入。速生丰产树种杉木、杨树、马尾松等既有常规的细胞学研究，也有地理种源的染色体性状比较。经济林树种山茶、油茶、漆树、桑树、猕猴挑等染色体研究资料也较为深入，药用植物杜仲、银杏等有一定的研究。染色体研究在科以上的有杉科、松科、芍药科、银杏、山茶科等；地域性染色体资源研究有云南、广西、宁夏、贵州等地。这些基础性研究为保护植物种质资源，研究树种的分类、分化、系统发育提供了详实的细胞学材料。

3.3 基因工程

树木基因工程取得的进展及其作用主要有：

3.3.1 DNA分离与转导

基因工程的一个最关键技术是把目的基因转导到目标植物中去，并使其能准确地表达出来。8O年代初.人类首次从细菌中分离出来一些分解抗生素的基因，成功地转移到植物细胞中，并获得能在含抗生素的培养基上生长的植株。此后即出现了一系列转基因植株。同时转基因技术也日益成熟。目前林木转基因技术有不少成功的事例：

(1)抗虫转基因植株。1988年美国依阿华大学林学系利用从马铃薯中提取的蛋白酶抑制剂Ⅱ号(InhibitorⅡ)为目的基因，与以新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NoemycinphosphotransteraseⅡ，即N Ⅱ)为标记基因制成嵌合基因，以根癌农杆菌 grobacteriumtumefeciens)的Ti质粒为载体，以叶盘转化再生法(Leaf disk transf~lrmation regeneration me山ed)为组培手段，用杨树杂种无性系(Popuius albaxPopulus grandidentata)为试材，经测定这种抗虫的转基因植株具有高毒性，幼虫取食后死亡率很高。

(2)抗除草剂转基因植株。1987年美国加州和威斯康星州的科学家利用杨树杂种无性系(alba.xP.grandidentata)为试材，从土壤中沙门氏细菌(Salmenella bacteria)提取抗除草剂的DNA.这种基因能控制一种特殊的酶，它能解除除草剂的作用，而对沙门氏菌安全。经培养获得除草剂转基因植株。

(3)通过基因操作控制木素的生物合成。在生产纸桨的过程中，为除去不需要的木素需要大量的能源，处理木素废液还要庞大的设备，于是就产生了培育木素含量少或易提取木素林木的想法。有人用“反意法”研究培育木素含量少的林木。另一项试验是把合成阔叶树型木素的基因导入针叶树，培育含有大量易提取木素结构的林木。

(4)抗大气污染气体的林木的培育。其重点在活性氧解毒上起重要作用的谷胱甘肽还原酶的基因上。有报告指出，把出自大肠杆菌的基因导入杂种杨，培育提高此种酶活性的转化体。在一般情况下，林木对大气污染物质也有很强的吸收和解毒能力。而此种酶活性进一步提高的转化体，作环境绿化木是大有可能的，它具有很强的耐SO：和臭氧的性质。

(5)控制林木形态的形成。对控制柳杉花形态形成的基因和变应原基因进行了分离.利用这些基因培育出能控制产生雄花和合成变应原的柳杉。有报告说：把白葶苈的控制芽分化的基因导入杂种杨，得到了花芽形成时间由通常的8年缩短到仅7个月的转化体。

(6)通过基因操作扩大林木的生育范围。一般来说，植物生长发育的场所是不能变动的，个体或种的维持是靠与光照条件、大气成分、土壤水分、土壤养分、有害物质的吸收、病原菌的感染等环境条件相应的复杂的适应机制。例如，若能对平时出现过剩的基因进行操作。这种基因是控制耐干燥、耐盐基因群的基因，那么，影响出现前转化体就有防御机制，其结果就扩大了生长范围。如果耐冻性、耐寒性、耐高温性、抗紫外线性等受到重视，那么控制林木生长范围(南限和北限、海拔高度界限等)的基因操作就会成功。

3.3.2 林木遗传图谱的构建

遗传图谱是选用合适的自然群体或通过人工技术手段构建的人工作图群体，利用各类遗传标记和定位的基因构建的遗传标记与基因的线性排列图。林木遗传图谱是对林木基因组进行系统研究的基础。由于林木生育周期长，利用形态标记来构建遗传图谱几乎不可能，所以过去几乎找不到林木遗传图谱。由于同工酶技术的发展，7O-8O年代构建了一部分树种的同工酶标记的遗传图谱。但同工酶利用的标记有限。难以构建高密度的遗传图谱。由于分子标记的开发，近年林木遗传图谱构建已成为林木遗传学研究的热点，有利于在短期内构建高密度的图谱。共显性以分子标记如RFLP、SSR、STS等适合于任何作物群体的遗传作图；而显性标记如RAPD只适合于单株针叶树构成的群体(因其来自亲本的单倍体胚乳)和DH群体。利用大量分子标记构筑高密度连锁图后，有利于今后未知基因的定位、克隆及分子标记辅助选择等。

3.3.3 目标基因定位和克隆

利用已有的遗传图谱及适当的分离群体可以将目标基因或数量性状座位(Quantitative TraitLoci。简称QTL)定位于某条染色体的某一区段或每两个遗传标记之间。这些被定位的主基因或QTL可利用位置克隆的办法被分离克隆，一些作物的有用基因如水稻白叶枯病抗性基因Xa2 ，就是这样被克隆到的。

数量遗传学作为遗传学的一个分支一直是独立发展的。但到8O年代却处于低谷。由于分子生物学的崛起，分子标记的开发，数量遗传和分子生物学的结合产生了新的边缘学科——分子数量遗传学，使得数量遗传学重新获得新生。因为利用分子标记对QTL的定位，可象一般主基因那样将QTL克隆出来加以利用。这对林木遗传育种将产生重大影响。因为许多经济性状都是由QTL控制的。

3.3.4 分子标记辅助选择育种

分子标记辅助选择(Maker Assisted Selec—tion。简称MAS)。是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来判断目标基因是否存在的一种植物育种选择方法。这种方法不受其它基因效应和环境因素的影响，因此结果较可靠，而且可以进行早期选择和对隐性基因的选择，从而大大加快育种进程。提高选择效果。特别对于生育周期长的林木来说更具有重要意义。

3.3.5 物种、品种及优良无性系鉴别

不同物种、品种及单株在基因组上均存在差异，不同植株(不同无性系)之间的差异在多数情况下是难以鉴别出来的。但由于分子标记的无限性，总可以将其区分开来。因此分子标记可非常有效地用于林木育种特别是优良无性系的鉴别，还可用于物种、品种分类。利用分子标记可以检测出林木种子园外来其它花粉的污染情况，也可鉴定其生产的种子是否真由种子园亲本之间杂交产生，以检测种子的混杂性。

3.3.6 在林木基因研究上的应用

林木的生理现象还有很多是未知的，用基因结构和机能加以说明是验证科学世界的要求。例如把控制形态形成的基因导入钻天杨并出现过剩。那么就会改变叶的形态，或者节间变短或者短化。因此我们认为，这种基因有调节叶的形态、节间长短和树高的可能性。总之，基因操作可称作是解析未知的基因机能的重要技术。林木研究方面也在寻求开发组织特异的或生长阶段特异的促进剂。我们在世界上率先对与裸子植物光合作用有关的基因的促进剂结构与机能进行了解析。分析基因促进剂时。要求在促进剂范围内让信使基因连结。向基因分离了的该生物种类基因转移，通过信使基因的出现，分析促进剂的机能。

3.3.7 在林木染色体组研究上的应用

对人及实验动植物的染色体组研究正在蓬勃开展。为了推进林木的染色体组研究，用DNA限制酶断片多型分析，成功地编制了柳杉连锁图。对部分连锁群来说。利用三体生物能使其处于与特定染色体相对应的状态。该连锁图将向未来高密度连锁图发展。与11条染色体的对应及染色体上的基因配置也能得到理解，作为有关柳杉染色体组的结构与机能的基础信息将会起重要作用。

第2篇：正向遗传学克隆基因的方法范文

摘要:

种质资源又称遗传资源，其不仅是进行农业科技原始创新以及现代种业发展的物质基础，更是保障粮食安全、建设生态文明并实现农业可持续发展的战略性资源。本文从种质资源的收集、鉴定和评价、创制及利用等方面进行了综述，以期为分子育种时代的种质资源创新和利用工作提供可利用的信息。

关键词:

分子育种;种质资源;创新;利用

种质资源又称遗传资源，是进行新品种选育的基础材料。古老的地方品种、重要的遗传材料、野生近缘植物以及利用上述繁殖材料人工创造的各种植物的遗传材料，都属于种质资源的范畴。就作物而言，种质资源不仅是进行农业科技原始创新以及现代种业发展的物质基础，更是保障粮食安全、建设生态文明、实现农业可持续发展的战略性资源。种质资源的核心是其所携带的基因，对优异基因进行挖掘和充分利用可使农业生产取得突破性进展，举世闻名的第一次“绿色革命”就源于小麦和水稻中矮秆基因的发现和应用［1］。长期以来，我国作物种质资源工作的重点一直停留在收集、保存与鉴定等方面，导致具有广泛应用前景的高产、优质、多抗、高效等关键功能基因的发掘与利用滞后，突破性新种质匮乏以及特有基因资源流失严重等问题。根据《国家中长期科学和技术发展规划纲要》精神，从国家科技发展总体布局出发，结合经济发展和国家安全需求，在现代生物技术高速发展的时代背景下，作物种质资源的工作重心将转向其优异基因资源发掘与种质创新，包括高产、优质、抗生物及非生物逆境、水肥高效利用等基因资源，在明确其功能和应用价值的基础上，创造一批可直接用于育种的中间材料。最新公布的七大作物育种专项也将优异种质资源鉴定与利用作为各项工作的重中之重。本文对我国种质资源的收集、鉴定和评价、创制及利用现状等方面进行了综述，以期为作物种质资源的创新和利用工作提供可利用的信息。

1种质资源的收集

种质资源的收集是一个很古老的话题。作为作物种质资源大国，长期以来，我国政府和科学家也一直非常重视作物种质资源的收集工作。自20世纪50年代以来，不仅先后组织了多次农作物种质资源征集和考察工作，而且在保存设施建设方面也加大了投入，挽救了一大批濒临灭绝的地方品种和野生近缘种及其特色资源，建立了完善的种质资源保护体系［2］。2015年，农业部、发展改革委和科技部联合印发了关于《全国农作物种质资源保护与利用中长期发展规划(2015—2030年)》的通知，深入分析了在现代农作物种业发展过程中我国目前农作物种质资源保护与利用工作存在的问题，严密部署了第3次全国农作物种质资源普查与收集行动，并就实施过程提出了详细的技术规范。

2种质资源的鉴定与评价

目前我国编入全国作物种质资源目录的材料约48万余份，跃居世界第2位［3］。如何对数以万计的种质资源进行精准评价，从中发掘出优异基因并将其应用于现代化育种工作，是现阶段我国进行种质资源收集的最主要的目标之一，也是亟待解决的科学问题之一。在对种质资源进行广泛收集和考察的基础上，我国相关研究人员也对所保存的资源进行了基本农艺性状的鉴定，并进行了综合评价。而这些基于不同年份、不同地点的调查所进行的评价，由于以易受环境影响的表型特征为依据，同时受研究条件和研究方法的制约，不能全方位、多层次地展开，因此精度有限。与表型鉴定相比，基于DNA序列多态性的分子标记则能在DNA水平上揭示种质间的不同，不受环境及发育时期等因素影响，而且具有较高的稳定性和可重复性，从而成为进行种质资源的鉴定和评价的一个更直接、高效且可信的工具。现阶段，我们应重点基于分子标记进行种质资源的DNA指纹分析、遗传多样性分析、核心种质构建以及功能基因的鉴定和评价等。

2.1DNA指纹分析

DNA指纹分析是分析并比较任何生物体之间DNA序列的非常快速的方法，该方法已被广泛且有效地用于种质资源的管理。目前，用于指纹识别的分子标记有简单重复序列或微卫星、SCoT、抗性基因同源序列、SNP等多种类型。这些分子标记大多为单位点，符合孟德尔遗传规律，而且多态性高、信息量丰富。随着测序技术的不断发展，基于高通量测序的基因型检测方法也逐渐成为研究热点之一。

2.2遗传多样性分析

遗传多样性是生物多样性的核心问题，是种质资源研究的重要方向。物种内或物种间的遗传多样性可以表现在多个层次上，如分子、细胞和个体等，遗传多样性是物种保持进化潜能的基本条件。近年来，遗传多样性的研究发展迅速，新的理论和方法不断产生、发展和完善。基于分子标记的遗传多样性分析可直接用于指导育种实践，例如利用分子标记技术对作物种质资源的群体结构与遗传多样性进行分析，可以帮助育种家更有目的地选择杂组亲本，提高育种效率。

2.3核心种质构建

对资源的广泛征集和不断累积交换使得种质资源越来越多，但数量的增加并不意味着遗传变异也得到相应增加，因为资源库中可能含有较大比例的遗传冗余甚至重复的材料。这就为我们种质资源工作了提出一个新的问题，就是如何对数目庞大的种质资源进行评价和有效利用，“核心种质”这一概念的提出为这一问题提供了解决办法。构建核心种质是提高种质资源利用效率、提升种质创新能力的基础。另外，核心种质本质就是一个基因库，在作物优质单元型区段(或基因)的发掘过程中也具有广泛的应用价值。近年来，作物遗传资源核心种质的构建越来越受到学者的关注。目前，我国已构建了水稻、小麦、玉米、大豆等几大作物的核心种质库。在国家973项目的资助下，我国科学家还开展了水稻、小麦和大豆核心种质重要农艺性状单元型区段及互作研究，该项工作也将为以上作物的分子设计育种和遗传转化育种提供基因资源，为未来重要基因的合理布局提供科学依据。

3种质资源的创新

种质资源创新的过程，就是对现有种质资源中所包含的遗传信息采取某种手段或方法进行改变的过程，传统意义上的杂交育种就是种质创新的一种最基本和常用的途径。随着人们对生物体认识的不断深入以及生物技术的不断发展，种质资源创新的方法也不仅仅停留和局限于通过杂交来进行，还在组织、细胞乃至分子水平上进行。创新途径主要包括诱变、染色体工程技术、小孢子培养、原生质体融合基因工程等。近化手段、生物技术的兴起也极大地提高了人们创造和利用变异的能力，为种质创新提供了多种可利用的手段。突变体库的建立和筛选也是基因挖掘的重要基础。国际上已构建了4个大规模水稻插入突变体库。通过60Co－γ射线照射、甲基磺酸乙酯(EMS)诱变等技术，各国科学家也创制了多个水稻、玉米、小麦、大豆等主要作物的突变体库［4］。单倍体育种技术是近来发展成熟的、基于小孢子培养、花药培养等组织培养技术的育种方法，它是对植物单核晚期的花粉进行培养，诱导其形成胚状体，并通过染色体人工或自然加倍产生纯合的二倍体或多倍体植株的过程。该方法可快速获得大量纯合、稳定的双、单倍体再生植株，为保存和创造作物种质资源提供了一条有效途径。转基因技术的发展则实现了不同物种间基因的交流。转基因育种就是根据育种目标，利用现代生物技术从供体生物中分离目的基因，经DNA重组和遗传转化将其导入受体作物，经过筛选获得稳定表达的重组单株，最终结合大田选择和田间试验培育新品种或新种质的过程。该技术可以突破物种间的遗传障碍，大跨度地超越物种间的不亲和性，从而打破了遗传物质分类上的界限，实现了基因在不同物种间的转移，大大拓宽了作物遗传改良可供利用的基因来源［5］。目前，转基因育种在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中都已取得成功［6］。多项研究表明，基因序列的微小变化可以对植物基因型产生显著影响，从而影响植物的表型。新近发展起来的基因组编辑技术有望成为继突变和转基因技术之后的育种技术发展的又一个里程碑，主要包括寡核苷酸介导的定点突变、转录激活类似效应因子核酸酶技术、锌指核酸酶、成簇的规律间隔的短回文重复序列系统。以上技术不仅可以特异地修饰某个靶向序列，从而创造新的等位基因，而且与传统的点突变相比，效率更高、速度更快、无多余的随机突变。目前，基因组编辑技术在植物的抗病性、除草剂抗性以及营养代谢等相关领域得到成功应用［7］。我们相信在不久的将来，这些基因也将对作物育种产生深远影响。

4种质资源的利用

4.1作物种质资源利用的传统途径

我国对种质资源的传统利用大致经历了直接利用、杂交育种和杂种优势利用3个阶段。20世纪50年代初期到60年代中期，我国生产上以直接利用种质资源中的优异地方品种进行就地繁殖和推广为主。在此基础上，各地不但相互交换优良品种，而且还从许多其他国家引进了多种农作物优良品种，并通过系统选择和杂交改良等途径，实现了两次品种更新换代，使优良品种得到迅速普及［3］。尽管当时这些改良品种对产量的贡献率比较低，但是，通过对全国种质资源的筛选，明确了这些作物种质资源所具有的不同特性，为后来作物新品种选育奠定了良好基础。20世纪50年代后期，杂交育种技术初露端倪，我国就迅速推广普及杂交育种技术，大规模独立自主地培育主要农作物新品种。60年代以后，我国自育优良品种已经覆盖大部分生产面积。这期间，在第一次“绿色革命”浪潮的影响下，我国科学家利用水稻地方品种“矮子占”和小麦创新种质“矮孟牛”以及从国外引进的矮秆种质资源育成了大量的水稻和小麦矮秆新品种，进一步提高了水稻和小麦的产量水平。杂种优势是在杂交育种过程中，后代所表现出的超亲现象。早在20世纪60年代以前，一些国家就开始在玉米和高粱育种中利用杂种优势，并使得产量大幅提高。我国的杂种优势利用工作起步相对较晚，前期工作主要是从国外引进了玉米自交系和高粱雄性不育系，并加以利用，该项工作为我国两系杂交技术的迅速发展奠定了基础。20世纪70年代以来，我国“杂交水稻之父”袁隆平院士利用“野败”不育株，实现了水稻的“三系”配套，成功育成了杂交稻，水稻产量得到大幅提高，并使得我国迅速摆脱了粮食紧缺的困扰，有效提高了我国生产技术水平和粮食自给能力。此后，我国杂种优势利用技术得到进一步发展，目前，在水稻、玉米、高梁、谷子、小麦、蔬菜、大豆、棉花、油菜等主要农作物新品种培育过程中都不同程度地利用了杂种优势，不仅使得新品种的产量和品质得到大幅提高和改善，同时为提升我国粮食综合生产能力和国际农产品市场竞争力提供了坚实的支撑［3］。

4.2与生物技术相结合的种质资源利用途径

种质资源利用的最终目的是培育出新品种。目前，世界范围内的育种研究已从传统的常规育种进入依靠生物技术育种的时代，从单个基因的测序转为有计划、大规模地检测水稻等重要生物体的基因图谱。目前，全世界已有6000多项农作物方面的生物技术研究成果进入田间试验，这些也表明，生物技术在作物育种中具有巨大的应用潜力。

4.2.1优异基因挖掘。要实现生物技术在作物育种中的重要作用，首要任务是确定植物群体内基因或基因片段的表达及与表型现象的内在关联。在这一过程中，目前常用的方法就是基于双亲分离群体(F2、RIL、CSSL、NIL等)的数量性状位点定位和基于连锁不平衡的将标记或候选基因的等位变异与目标性状联系起来的关联分析，这2者都属于正向遗传学的研究范畴。随着测序技术的飞速发展，基于高通量测序的QTL定位和关联分析相关研究也取得了较大进展，并显示了广阔的应用前景。而在反向遗传学中，基因所影响的表型并不清楚，但可通过基于遗传转化所进行的基因功能获得或缺失技术研究基因所引起的表型变异及其功能，并对其加以利用。随着水稻、玉米等基因组测序的完成，以及结构和功能基因组学的飞速发展，越来越多的作物中的重要性状相关基因被克隆，如水稻中已克隆的产量与品质相关基因GS3、GS5、GW2、Ghd7，抗病相关基因xa13，抗褐飞虱基因Bph14等［8］。根据已克隆的基因信息，在种质资源中进行目的基因的等位变异分析，找到优异的等位基因，这样不仅能完成对现有种质资源的精确鉴定，还能对鉴定的含有优异等位基因的材料通过分子标记辅助选择应用到育种中，从而培育出优良的品种。而对于大麦、小麦等基因组庞大的作物来说，也可以参考水稻等模式植物的研究结果，通过同源克隆、关联分析等策略对一些重要性状产生的分子机理进行解析，并对相关基因进行功能鉴定和利用。随着现代生物技术的高速发展，作物基因发掘出现了一些新的发展趋势，例如基因组测序技术的更新换代、高通量基因型和表型分析平台的建立，都将促进基因发掘的规模化和高效化。

4.2.2分子标记辅助选择。20世纪80年代后期，我国开始利用分子标记辅助选择进行新品种的培育。分子标记辅助选择的核心是借助与目标基因紧密连锁的分子标记，直接选择目标基因型个体。分子标记辅助选择不受环境影响，可在早代进行准确、稳定的选择，而且可以克服再度利用隐性基因时识别难的问题，并能同时聚合多个目标基因，因此，可大大提高育种效率和水平。随着现代生物技术的高速发展，各主要作物越来越多的重要性状相关基因被定位或克隆，这将极大地促进作物分子标记辅助选择育种技术的应用。在种质资源的应用工作中，我们应以种质资源的鉴定评价、种质创新和优异基因挖掘等工作为基础，通过分子标记辅助选择，有目的的将野生近缘种属、地方农家品种和国外引进优异种质中的有益基因导入栽培种中，从而对栽培种进行性状改良，创造出一批更适合育种需要的中间材料。

4.2.3分子设计育种。种质创新和基因挖掘是对种质资源研究工作的提升，对种质资源进行充分利用则是作物种质资源研究工作的最终目的。科学技术的不断发展将使得作物基因发掘的速度和数量大幅提高，这也将促进后基因组时代的到来，加深我们对基因互作的了解，从而揭开作物重要性状的基因网络调控途径。因此，在创制一批满足育种需要的中间材料的同时，还应着眼于未来，结合分子标记辅助选择，将挖掘到的优异基因导入到该作物的当前应用广泛、综合性状优良的某一品种中，构建包括高产、优质和高抗等基因的一系列的近等基因系;以上述近等基因系为材料，通过基因的定向组装达到性状的协调改良，突破传统育种的瓶颈，实现作物品种的精准分子设计育种。同时，我们也应该把握机遇，充分利用植物基因组学和生物信息学等前沿学科的重大成就，及时开展分子设计育种的基础理论研究，建立具有自主知识产权的分子设计育种技术体系和技术平台［9］。

5展望

当代生物技术的高速发展，如高通量表型和基因型鉴定技术，使得种质资源创新和利用的各个环节都融入了现代高新科技的元素。有理由相信，这些工作的顺利完成将为选育突破性农作物新品种、发展现代种业、保障粮食安全提供物质和技术支撑。

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第3篇：正向遗传学克隆基因的方法范文

关键词秀丽隐杆线虫 模型 药物筛选 药靶筛选

Applications of Caenorhabditis elegans in drug screening

ZHOU Yu-meng，CHEN Dai-jie*

（Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry of China State Institute of Pharmaceutical Industry，

State Key Lab for New Drug and Pharmaceutical Process，Shanghai，200040）

ABSTRACTCaenorhabditis elegans (C. elegans) has attracted an increasing attention of pharmaceutical scientists working on drug screening. A relatively complete technology platform for drug screening has been formed by this model. The characteristics of C. elegans as new drug screening model，disease models established by C. elegans currently and their application in discovery of new drug are described in this review.

KEY WORDSCaenorhabditis elegans; model; drug screening; target of drug screening

生物学界对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C. elegans）的研究始于20世纪60年代。英国科学家Brenner [1]选择了线虫作为确定完整神经系统的较为简单的生物模型。随后，Sulston经过20年的努力，到20世纪90年代中期构建了完整的线虫细胞谱系图，使线虫成为唯一一个身体中所有细胞能被逐个盘点并归类的生物。Horvitz利用遗传突变和基因克隆等手段，揭示了线虫细胞程序性死亡的遗传调控机制，并证明相应的调节基因在高等动物和人体中也存在。这三位科学家的研究对生命科学领域做出了极为重要的贡献，于2002年分享了诺贝尔生理或医学奖[2]，使秀丽隐杆线虫成为当代生命科学和医学研究中最重要的模式生物之一。

近年来，秀丽隐杆线虫在药物或靶蛋白筛选方面越来越受到药物学家的青睐，已形成了较为完善的药物筛选技术平台。本文从药物研发的角度讨论线虫作为模式生物的特点，以及目前利用秀丽隐杆线虫建立的疾病模型在新药发现中的应用。

1秀丽隐杆线虫整体生物模型的特点

秀丽隐杆线虫属于线形动物门线虫纲动物，结构如图1[3]所示。利用秀丽隐杆线虫整体生物能够建立和模拟与人类疾病相关的模型、筛选不同的新型活性物质并发现新颖生物功能的靶点或靶标，实现这些目标的基础主要在于以下两个方面。

1.1线虫整体生物模型的优点[4]

1）虫体小（成虫1 mm），容易操作（线虫可以饲养在含有大肠埃希菌的琼脂平板或是液体培养基中）并且便于长期保藏（虫体可以冻存在甘油中）。2）发育的各个阶段虫体呈透明状，可以通过微分干涉对比（differential interference contrast，DIC）显微镜和各种荧光显微镜对所有细胞进行观察。3）世代和生命周期较短。在实验室20 ℃的环境下，从卵发育到成虫只要4 d，平均寿命为3周。4）繁殖快并且多产。一只雌雄同体线虫可以产下300多个后代，经雄虫后可以产下1 000多个后代。5）一个雌雄同体的成虫完整固定不变的体细胞有959个，雄虫有1 031个。6）发育专门的生理器官，神经环和神经节、肠道、肌肉、皮下组织、排泄系统、先天免疫系统、性腺和子宫。7）完整的神经网络图，302和391个神经元组成雌雄同体成虫和雄虫的神经系统。8）具有复杂的行为学特征，包括机械感知和化学感知，避免有害刺激物和温度趋向性。9）拥有完善的实验技术，包括转基因动物技术、单细胞激光光解技术、通过化学诱变和RNA干扰进行正向和反向的遗传基因筛选、通过个体大小和荧光采用流式细胞仪对线虫进行数量控制、表型特征对应的单细胞多态性图谱（SNP mapping）和小分子化合物库的筛选。10）一个完整的基因组序列，含有约19 700编码序列和约1 300非编码RNAs。11）完整的基因组文库和cDNA克隆。12）一个线虫突变保藏中心，拥有大量突变体线虫。13）丰富的免费网络资源（如WormBook）和数据库（如WormBase）。

1.2线虫与人类基因之间的保守性

以秀丽隐杆线虫为模型来模拟人类疾病是最简单直接的，但是两者之间的药物靶点要具有保守性。庆幸的是，这种保守性的确存在。依靠生物信息学方法，发现已知的秀丽隐杆线虫药靶基因与人类基因的同源性达到60%～80%[5]。在许多重要的信号传导途径中，线虫都存在高度保守性，如与细胞增殖分化相关的途径包括RAS信号途径、Notch信号途径和Wnt信号途径[6～8]；与免疫相关的途径包括TGF-β信号途径、胰岛素信号途径、p38 MAPK信号途径和Toll信号途径[9～12]等。在孟德尔人类遗传资料库（Online Mendelian Inheritance in Man）的2 466个人类疾病基因中，有533个与秀丽隐杆线虫同源[13]。

鉴于线虫具有丰富的生物学、遗传学信息的研究以及作为模式生物的优越性，使其在人类疾病研究和新药开发中发挥着重要的作用。

2基于秀丽隐杆线虫的疾病模型及在新药发现中的应用

目前，已建立了大量的秀丽隐杆线虫模型和有效的研究方法来模拟人类疾病，并实施大规模高通量化合物的筛选。

2.1代谢综合征疾病的线虫模型

2.1.1糖尿病模型

胰岛素超家族基因普遍存在于脊椎和非脊椎动物中。在秀丽隐杆线虫中存在胰岛素样信号途径（insulin-like signaling pathway），负责控制代谢、生长和寿命，其中daf-2基因编码属与哺乳动物同源的胰岛素样生长因子（insulin-like growth factors，IGFs）受体家族[14]。秀丽隐杆线虫daf-2基因突变株发育受限，只能停留在dauer幼虫期，但当胰岛素样信号途径被刺激后，可以二次生长，发育成成虫，故能使daf-2基因突变株转变成成虫的化合物可能对人类胰岛素信号传递存在调节作用。因此，DevGen公司利用daf-2基因突变株建立了抗2型糖尿病的药物筛选模型，并于2001年申请了专利[15]。随后，该公司又构建了能产生定量荧光信号的daf-2基因工程虫体，建立了高通量筛选方法。

2.1.2脂肪代谢模型

研究人员利用线虫寻找影响脂肪代谢的相关基因，为治疗肥胖和相关疾病提供研究靶点。Lemieux等[16]对3 200个化合物进行筛选，用尼罗红（Nile Red）染色来监测处理2 d后的线虫脂肪水平，发现有2种化合物可以诱导脂肪增加、8种化合物可以降低脂肪含量。实验人员针对F17化合物进行研究，发现该化合物是AMP-活化蛋白激酶（AMP-activated kinase，AMPK）拮抗剂，能有效降低线虫脂肪储存（见图2[17]）。

用野生型线虫对3 200个化合物进行筛选，2 d后尼罗红染色并检测脂肪水平。大部分化合物是无效的，线虫脂肪水平与对照相似（中间的线虫）。2个化合物可以增加线虫脂肪含量（顶部的线虫），8个化合物可以降低脂肪含量（底部的线虫）。其中一个化合物F17影响脂肪含量降低是依赖于AMPK（aa-1）和转录因子K08F8.2。

Chronogen公司采用另外一种线虫脂肪代谢模型[18]，利用clk-1缺陷型线虫排便循环的长短直接受胆固醇量调节的特点，筛选了20 000个小分子化合物，得到190个阳性化合物（hits），再用人肝癌细胞HepG2验证，其中15个化合物能减少细胞ApoB100的分泌，而化合物CHGN005效果最好。在随后的小鼠活体高血脂模型中，CHGN005可以明显降低胆固醇和甘油三酯的含量，进一步验证了此化合物的活性。

2.1.3衰老模型

利用秀丽隐杆线虫研究衰老现象和老化相关的疾病已经有近30年的历史。秀丽隐杆线虫生命周期较短，使其成为衰老研究和抗衰老药物筛选的理想模型。目前，主要采用野生型N2和突变体线虫（如daf-16、daf-9等）作为实验动物。

Evason 等[19]以具有不同结构、不同药效的19个经FDA 批准的药物组成小样本库筛选发现，抗癫痫药物乙琥胺（ethosuximide）能使秀丽隐杆线虫的寿命延长17%，并存在明显的量效关系。构效关系研究表明，与乙琥胺结构类似并具有抗癫痫作用的化合物三甲双酮（trimethadione）和3，3-二乙基-2-吡咯烷酮（3，3-diethyl-2-pyrrolidinone）也能明显延长秀丽隐杆线虫的寿命，而与乙琥胺结构类似、但无抗癫痫作用的化合物丁二酰亚胺（succinimide）却没有延长秀丽隐杆线虫寿命的作用。作者推测，可能是上述化合物的抗癫痫机制与延长秀丽隐杆线虫寿命的机制相同、通过影响线虫的神经活动而导致生命延长。

Petrascheck 等[20]用秀丽隐杆线虫筛选抗衰老药物，筛选了 8.8 万个化合物，发现 115 个化合物能延长秀丽隐杆线虫的寿命，有4个化合物是5-羟色胺受体抑制剂，它们能使秀丽隐杆线虫的寿命延长22%～30%，其中包括抗抑郁药米安色林（mianserin），但米安色林不能延长对5- 羟色胺的合成、摄取发生变异的线虫寿命。研究人员认为，米安色林能阻断线虫与觅食有关的神经递质的信号传递，产生饥饿感，导致线虫寿命延长。

Gerisch等[21]发现一种胆酸化合物dafachronic acid与秀丽隐杆线虫的衰老调控有关。白藜芦醇（resveratrol）能延长酵母、果蝇、小鼠的寿命，也能延长秀丽隐杆线虫的寿命[22]。具有抗氧自由基损伤的化合物如维生素E、辅酶Q等以及蓝莓、银杏叶提取物也能延长秀丽隐杆线虫的寿命[23]。

延长人类寿命一直广受关注，但是有关人类生命周期的探索才刚刚起步，基因调控、系统调控、环境和精神因素等都在不同水平上影响人类寿命。能延长线虫寿命的化合物（见图3）在结构上差异较大，说明小分子对衰老的干预具有多靶点、多机制的特征。值得注意的是，干预神经活动的小分子能延长秀丽隐杆线虫寿命，说明神经活动可能与衰老现象有关，但是这些分子能否成为抗衰老药物还需要一个漫长的评价过程。而白藜芦醇是通过Sir2蛋白进行调控，与神经干预机制无关，这种分子似乎更具有抗衰老研究的价值。

2.2神经系统退化性疾病的线虫模型

2.2.1阿尔茨海默病模型

研究者在线虫中发现早老素（presenilin）sel-12基因，其编码的蛋白具有多跨膜结构域，并且与阿尔茨海默病（AD）相关蛋白S812相似。目前已构建了转基因线虫模型，将人源β-淀粉样蛋白在线虫中异源表达，诱导淀粉样蛋白沉淀物形成，引起线虫麻痹，从而导致线虫“排卵”困难[24]。Pharmacia & Upjohn公司开发了一个“几丁质酶检测”方法，可以间接地监测排卵数量，其原理是：秀丽隐杆线虫的胚胎会分泌几丁质酶，以便从卵中孵化出来。几丁质酶浓度越高，线虫排卵数量越多。辉瑞公司正利用转基因线虫AD模型和几丁质酶检测技术对10 000多个化合物进行高通量筛选，期望获得有效的抑制剂[25]。

2.2.2帕金森病模型

利用线虫建立帕金森病模型主要有两种：转基因线虫模型和药物诱导模型。转基因模型是通过过量表达人源α-突触白、导致线虫的神经元和树突损伤模拟帕金森病的[26]，而药物诱导模型是利用神经毒素1-甲基-4-苯基吡啶 （1-methyl-4-phenylpyridine，MPP）选择性诱导多巴胺神经元凋亡，使线虫运动能力下降、死亡数增加。Braungar等[27] 对一些帕金森病治疗药物进行评估，其中多巴胺受体拮抗剂麦角乙脲（lisuride）和阿朴吗啡（apomorphine）以及蛋白激酶C抑制剂卡马拉素在低剂量和高剂量时都对线虫有治疗效果。

2.2.3亨廷顿病模型

已知亨廷顿病的病因是由于亨廷顿（Huntingtin）蛋白末端的多聚谷氨酰胺（polyQ）延伸造成的。线虫模型就是采用转基因技术，将人源亨廷顿蛋白的N末端基因序列注射到线虫体内，转基因动物神经细胞凋亡，出现神经细胞蛋白沉积并随年龄逐步增加的症状[28]。利用此模型，Voisine等[29]评估了9个可能有治疗效果的药物，其中4个能缓解polyQ的毒性，以FDA批准的亨廷顿病治疗药物光辉霉素（mithramycin）和氯化锂表现尤为突出。

2.3抑郁的线虫模型

抑郁线虫模型研究就是利用化学遗传学方法将抗抑郁药物氟西汀作用于线虫，观察药物对线虫表型的影响。氟西汀会阻断5-羟色胺再摄取转运载体（serotonin reuptake transporter，SERT）MOD-5，增加突触间5-羟色胺的浓度。由于5-羟色胺信号增强，从而刺激控制线虫排卵的肌肉神经，增加线虫排卵量[30]。在哺乳动物中，SERT是MOD-5的同系物，也是氟西汀作用的主要靶标，说明利用线虫模型可以发现治疗抑郁的有效药物。

2.4肌肉萎缩症模型

模拟人类遗传疾病的线虫模型包括多囊性肾病、肌肉萎缩症等。研究人员发现线虫的dys-1基因与导致人肌肉萎缩症（DMD）的肌萎缩蛋白基因同源，采用基因敲除技术构建突变体线虫dys-1，此突变体表现出类似人类DMD的肌肉组织逐渐退化、运动能力丧失的病症。当实施强的松治疗后，这种症状可以得到缓解[31]。

2.5高通量筛选和靶点研究的方法

线虫既提供了完整动物实验系统，又避免了小鼠模型的高价费时，是最适合大规模药物筛选的多细胞动物。目前，秀丽隐杆线虫越来越受到生物化学家的青睐，利用线虫高通量筛选活性化合物、研究药物作用靶点正在成为流行趋势[32～36]。Roy等[37]建立了一个24孔板高通量筛选系统，使用秀丽隐杆线虫模型发现具有生物活性的小分子化合物，并用化学遗传学方法鉴定化合物作用靶点。整套系统由两个主要的设备组成：COPAS（Complex Object Parametric Analyzer and Sorter）Biosort和自动图像获取处理系统（见图4[37]）。每周可以筛选化合物达到2 400个。通过观察表型的变化（见图5[37]），推测筛选化合物的生物学活性。为了进一步确证其作用靶蛋白，利用甲磺酸乙酯使线虫突变，筛选对此化合物具有抗性的突变体线虫（见图6[37]），确定突变蛋白，最终确证作用靶标。对于靶点的鉴定大约需要几个月的时间。

采用这套系统，Roy等研究人员对14 100个小分子化合物进行筛选，有308个化合物可诱导野生型线虫产生表型异常，最终发现一个小分子钙离子通道拮抗剂nemadipine-A。其与二氢吡啶类抗高血压药（DHPs）类似，能够引起线虫形态缺陷和排卵、产卵困难，通过遗传学方法确定L型钙离子通道的α1亚基是nemadipine-A的作用靶点，与已知的DHPs作用机制完全一致[38]。

线虫是一种简单的模式宿主，可以被多种人类病原菌感染和杀死，其中包括革兰阳性菌粪肠球菌、金黄色葡萄球菌，革兰阴性菌铜绿假单胞菌、沙门菌以及一些真菌白色假丝酵母等。Moy等首次利用秀丽隐杆线虫这一特性，建立了粪肠球菌感染模型，对6 000个化合物和1 136个天然提取物进行筛选，其中16个化合物和9个天然提取物具有提高线虫存活率的活性[39]。随后，他们对方法进行改进，建立了384孔板自动化分析采集的高通量筛选系统[35]。这套系统采用SYTOX 黄染料将存活线虫和死亡线虫进行区分并用荧光检测，通过对比荧光强弱判断线虫存活率，较之前的人工操作系统工作效率提高5倍以上。将筛选规模扩大到37 200个化合物和天然提取物，发现了28个未经报道的具有提高线虫存活率的活性化合物，其中有6个结构新颖的化合物体外不影响病原菌生长，说明它们与临床上所用的抗生素具有明显不同的作用机制。目前还建立了白色假丝酵母-线虫感染高通量筛选模型[32，34]，对3 228个化合物筛选，发现了19个化合物具有抗真菌感染活性，其中7个是临床上用于抗真菌感染的药物、12个临床上没有用作抗感染药物，还有另外3个药物是免疫抑制剂。这些事实说明线虫感染模型不但可以发现抗感染化合物，还可以寻找到一些作用机制新颖、具有其它生物学活性、辅助抗感染作用的化合物。

3结语

在许多生物途径中，秀丽隐杆线虫与人类之间都具有保守性。因此，从某种程度上讲，秀丽隐杆线虫的研究数据可以预测药物-靶标相互作用和确证靶点。通过对秀丽隐杆线虫的研究可以更好地了解许多人类疾病的病理机制。尽管存在很多优点，但是不可否认，秀丽隐杆线虫体系在新药发现中仍存在缺陷。例如，线虫没有心脏、获得性免疫系统、呼吸系统等，一些分子途径在线虫体系中不存在，这些途径就不能通过线虫进行研究。此外，秀丽隐杆线虫与人类种间距离太远，不能完全模拟或无法模拟人类病理。因此，周密的实验方案设计、模型潜在缺陷的克服、线虫疾病模型和人类病理某一方面具有一致性的确证成为模型成功和新药发现的关键。当这些条件具备时，秀丽隐杆线虫在医药研究领域的价值就会更好地表现出来。秀丽隐杆线虫模型为体外筛选和体内筛选架起了一座桥梁，为新药的发现增加了一个新途径。

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第4篇：正向遗传学克隆基因的方法范文

[关键词]瘢痕疙瘩；Fas基因；多态性；遗传易感性

[中图分类号]R619+.9[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2008）03-03

Fas gene -670 polymorphism and susceptibility to keloid in a Chinese population

ZHUO Yang,ZENG Xing-ye, ZHOU Xue-xue,HUANG Da-dao,CAO Xiao-en,HUANG Zheng-lian

（Department of Surgery,the 118th Hospital of PLA,Wenzhou 325000,Zhejiang, China）

Abstract:ObjectiveTo investigate the relationship between Fas-670 polymorphism and susceptibility to keloid in a southern Chinese population.MethodsThe Fas-670 genotypes were determined by polymerase chain reaction-reverse dot blot(PCR-RDB) and DNA direct sequencing in 75 patients with keloid and 120 unrelated healthy controls.ResultsThe frequency of the Fas-670 A allele among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=4. 408,P=0.036). The A/G and G/G genotype distribution among keloid patients was not significantly different from that among healthy controls(χ2=1.051 and 1.134; P=0.305 and 0.287, respectively). However, the A/A genotype frequency among keloid patients was significantly higher than that among healthy controls(χ2=5.207,P=0.022). The Fas-670 A/A genotype significantly increased the risk for developing keloid,compared to the combination of A/G and G/G genotypes,with the odds ratio(OR) of 2.122, (95%CI: 1.105～4.077).ConclusionDetermination of the Fas-670 genotype may be used as a stratification marker to predicate high-risk individuals for keloid.

Key words: keloid; Fas gene; polymorphism; genetic susceptibility

近几年的研究结果提示，瘢痕疙瘩成纤维细胞的过量增生和凋亡相对减少在瘢痕疙瘩的发生、发展中起着重要作用[1]。而Fas蛋白是细胞表面一种与凋亡相关的抗原，Fas介导的凋亡被认为是介导死亡信号传递的最主要通道。为此,我们从分子遗传学角度，探讨Fas基因-670位点多态性与浙江地区汉族人群瘢痕疙瘩发病风险的关系, 以便深入地、多层次地解析瘢痕疙瘩的分子生物学机制。

1对象和方法

1.1 研究对象：瘢痕疙瘩患者和正常对照人群均为浙江地区汉族居民。瘢痕疙瘩患者均经本院临床及病理诊断证实，共75例，其中男41例、女34例,年龄9～53岁，病变位于前胸、三角肌区及耳垂，病史6个月～15年。正常对照为有外伤史而无瘢痕疙瘩产生，且无瘢痕疙瘩家族史的健康居民，共120例，其中男69例、女51例,年龄13～60岁,平均年龄29.6岁。用于基因分析的DNA全部来源于研究对象的外周静脉血，血样本用枸橼酸钠抗凝，置于-20℃保存备用。

1.2聚合酶链反应-反向点杂交（PCR-RDB）

1.2.1基因组DNA提取：采用北京赛百胜生物技术有限公司的基因组DNA提取试剂盒提取DNA。

1.2.2 ASO（等位基因特异性寡核苷酸）探针设计：应用Primer Premier5.0设计探针，氨基标记，探针序列分别为：NH2-5′-CATTCCAGGAACGTCTGTGA-3′；NH2-5′- CATTCC AGA AACGTCTGT GA -3′，由上海生工生物公司合成。

1.2.3 PCR反应：用于扩增Fas基因-670位点的引物5′端标记了非同位素检测介质Biotin,引物序列为：Bio-5′- TGTTCACCAGAGCACGAAAG -3′；Bio-5′- GCTGGC ATCTCACTTCAGGT -3′，由上海生工生物公司合成。反应在PE-480型扩增仪(美国PE公司)上进行。在50μl反应总体积中,含引物8.0pmol/L，DNA模板1μl，加入2UTaq酶(鼎国生物公司)。热循环参数：95℃热启动2min后，95℃45sec，55℃1min，72℃/2min；共35个循环 72℃延伸 10min。取3μl扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，溴化乙锭染色,紫外透射仪下观察结果。

1.2.4 杂交：固化上寡核苷酸探针的膜条连同40μlPCR产物加入含5ml 2×SSC～0.1%SDS的试管中，100℃水浴变性7min，置杂交仪中42℃杂交3～6h；然后放入42℃预热的0.5×SSC～0.1%SDS中洗膜10min；将膜条转入含2.5U辣根过氧化物酶连链酶抗生素蛋白的10ml 2×SSC～0.1%SDS试管中，室温反应15min；再用2×SSC～0.1%SDS洗膜5min×2次；最后，将膜条转入20ml显色液[19ml 0.1mol/L柠檬酸钠(pH5.0)中加30%过氧化氢3μl和0.1mg/ml TMB]中避光显色5～15min,期间观察、记录结果。

1.3 为检验反向点杂交结果的正确性，随机抽取18例PCR扩增产物送上海生工生物公司测序。

1.4 统计学处理：应用SPSS10.0统计软件包处理数据，采用χ2检验分析各组等位基因和基因型频率分布的差异，并计算表示相对风险度的比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间(confidenceinterval,CI)。

2结果

根据我们设计的方案，杂交结束后膜条上格显示蓝紫色斑点为A/A基因型，中格显示蓝紫色斑点为G/G基因型，而上、中全部显示为A/G基因型，下格为空白对照，无斑点显示（图1）。瘢痕疙瘩组和正常对照组Fas基因多态性比较如表1、2所示。

实验中，在瘢痕疙瘩和正常对照组间的年龄构成比例相似，对照组及瘢痕疙瘩患者组的Fas-670位点基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡的情况下，结果显示：①瘢痕疙瘩组的A等位基因频率(54.7%)明显高于正常对照组(43.8%)(χ2=4.408,P=0.036,P＜0.05)；而瘢痕疙瘩患者的A/G、 G/G基因型频率分别为40.0%和25.3%， 与正常对照组相比差异无显著性 (χ2值分别为1.051和1.134； P值分别为0.305和0.287)；②瘢痕疙瘩组的A/A 基因型频率为34.7%，明显高于正常对照组(χ2=5.207,P=0.022,P＜0.05)。与A/G、G/G基因型相比，A/A 基因型者患瘢痕疙瘩的相对风险性(OR)明显增高(OR=2.122,95%CI: 1.105～4.077)。我们随机抽取的18例PCR扩增产物测序结果与反向点杂交结果完全吻合（图2），证明了聚合酶链反应-反向点杂交结果的正确性。

3讨论

近年来，遗传因素在许多疾病的发生中所起的重要作用备受重视，且已发现了多种易感基因的存在。Fas基因即是目前较为关注的与瘢痕疙瘩疾病相关的基因之一。人Fas基因组DNA位于染色体10q24上，是全长36Kb的单拷贝基因，由8个内含子及9个外显子组成，编码335个氨基酸，其全称是factor associated suicide，又称CD95/APO-1，属于NGF/TNF受体家族，其相应的配体及单克隆抗体与之结合后可诱导细胞凋亡。Fas蛋白包括膜外区、跨膜区和膜内区，Fas蛋白的重要功能结构“死亡域”编码区位于膜内区[2]。已证实FasR-FasL系统在调控细胞增殖和凋亡中起着重要的作用[3-4],Fas介导的凋亡被认为是介导死亡信号传递的最主要通道。

Fas 基因启动子区域存在两个多态性位点[5],其启动子-670 核苷酸APG多态性位点位于核转录元件GAS 中,能影响干扰素的信号传导。干扰素与其受体结合后,激发了酪氨酸激酶Jak(janus kinases),使转录信号传导和激活因子-1(signal transducers and activitors of transcription1,STAT1) 酪氨酸磷酸化,磷酸化的STAT1 形成同源二聚体与GAS元件结合,诱导含有GAS元件的基因转录[6]。当然其他细胞因子与其受体结合后,也可通过STAT家族成员诱导含有GAS元件的基因转录[7]。若Fas-670 位点碱基为G,则含有GAS元件的一致序列TTCNNNGAA(N3 位点) ,该序列能被STAT家族的多数成员识别[8],细胞因子-受体作用激活STATs,从而诱导Fas基因转录。而碱基A代替G后,则DNA序列变为TTCNNNAAA,可能影响Fas转录，影响Fas蛋白表达。已有报道其他基因GAS元件能够影响转录水平[9]。

国外对Fas-670位点多态性与自身免疫性疾病相关性研究,提示AA 基因型与白种人类风湿性关节炎的临床亚型相关[10]，系统性红斑狼疮、多发性硬化患者A等位基因频率显著增高[9-10]。然而,国内外尚未见Fas 基因多态性与瘢痕疙瘩的相关性研究。本研究初步结果提示，Fas基因-670位点A等位基因及AA基因型是中国浙江地区人群对瘢痕疙瘩的易感因素。我们的初步研究结果对瘢痕疙瘩的预测诊断及筛选具有较大潜在的临床意义，然而更大样本、更多地域、多民族的印证研究尚有待完善。

本实验采用的聚合酶链反应-反向点杂交方法是由Saiki RK[11]于1989年首次提出，虽然在原理上与正向斑点杂交相似，但却巧妙地反其道而用之,即反方向的将各种探针固定在基质上,用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。近年来应用此法进行β-地中海贫血、囊肿性纤维化等疾病的基因诊断，取得较好效果。该方法分辨率高，技术简便、快速、可靠，其检测结果与DNA测序符合率高，值得推广应用。

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第5篇：正向遗传学克隆基因的方法范文

[关键词]生命伦理学；中国难题；现代医疗技术

[中图分类号]B82～05[文献标识码]A[文章编号]1671-511X（2012）02-0005-06

一、问题的提出

生命伦理学的诞生和发展，与现代医疗技术的高速发展及其不断展现的复杂而多变的“医疗实践”领域及其急速变革有关。进入20世纪以来，现代医疗技术以前所未有的方式凸现出日益尖锐的生命伦理难题，它们在不断地“书写”人类依靠技术治疗疾病、增进健康、强化生命的各种“传奇”的同时，也对人类的伦理规范和法律制度带来了前所未有的挑战。一种我们可以称之为“医疗-技术”现象（或者“技术-医疗”现象）的医学进步和生命伦理实践，正在不断地将遗传学、神经科学（脑科学）、干细胞技术、基因技术和计算机辅助技术（例如影像技术）等现代科学技术，带人医疗实践；而与此同时，几乎每一项由现代科技进步带来的医学进步，都对旧有的生命伦理学理论与实践以及与之相关的医事法学带来咄咄逼人的挑战。生命伦理学面临如许众多的质询，例如：如果我们相信技术进步能够带来医学进步（这一点我们坚持一种朴素的信念），那么它如何才是一种道德的进步以及法律的进步？该问题使得现代医疗技术所开启的医疗技术行为，俨然成了从生命伦理学视野上影响现代技术挑战伦理及法律问题的“爆发地”！而每一次技术对伦理或法律的挑战（如器官移植技术、克隆技术、基因诊断技术、以神经科学为基础的脑服务技术等），都迫使科学家、医生、法学家、社会学者、政府、媒体和公众必须动员起来寻找应对的良方。各种各样的伦理难题、法律难题和伦理一法律难题仍然如挥之不去的魅影，与现代医疗技术及其医疗实践如影随形。

于总体上看，生命伦理学的中国难题，以现代医疗技术为例，主要集结于现代医疗技术中的伦理难题以及法律难题。从逻辑上看，它大致包括伦理难题、法律难题以及伦理一法律难题三个方面。

其一，伦理难题。即使法律支持该技术，我们在伦理上仍然面临无法解决的难题，存在着诸“理”之冲突而每一种“理”都有理的情况。伦理难题的典型形式有三种：（1）伦理与伦理之间的冲突。即有两种伦理，一种是从个体自由出发的伦理（它主要关涉权利问题），一种是从总体责任出发的伦理（它以义务为首要原则），这两种伦理在特定的医疗技术境遇中，存在相互冲突的情况。（2）一种伦理体系的内部存在着的道德与道德之间的冲突。即医疗行为主体之间（医生与病人）可能存在道德理由或道德主张上的分殊和相互冲突的情况，从而在医生的权利与病人的权利之间产生尖锐的道德冲突。（3）在一种集团伦理或组织伦理的特定境遇中存在着伦理与道德之间的冲突。比如医院组织对个体有普遍性的伦理约束，而个体的道德原则又可能存在着与组织的伦理规约相冲突的情况，于是在特定的医疗技术行为中，出现了“道德的个人和不道德的组织”这样的伦理一道德悖论。

其二，法律难题。广义的法律难题必定是从伦理难题而来，然而在生命伦理学中存在着一类相对狭义的法律难题，它将伦理的讨论存而不论，在寻求一种“伦理中立”的法律解释和立法实践的过程中遇到了支持与反对都有法律依据的情况，包括两个方面：一是法律解释的难题，如两种解释都可能是正确的，但它们彼此相互冲突；一是立法依据的难题，在是否立法（比如针对安乐死或医自杀的药物和技术的应用问题）以及如何立法等问题上皆存在着相互抵牾的主张，且似乎各自都能自圆其说。

其三，伦理一法律难题。伦理一法律难题或者主要地由伦理难题而来，或者主要地由法律难题而来，它是内含着伦理和法律因素且在二者之相互关联问题上呈现的难题。代表性的伦理一法律难题有两大类：（1）现有伦理上的析理无法为法律上的适用提供依据，而现有法律规范或解释又无法体现伦理的价值、原则和道德理由，于是出现了伦理失灵和法律失灵的情况；（2）又或者，伦理上的支持和反对都符合法律解释原则，而法律上的支持和反对都有强有力的伦理上的支持。伦理分析、道德论争和推理是法律问题之求解的基础，许多法律难题的产生乃由于伦理难题尚得不到治理或澄清；同样，法律的解决方案往往又作为权宜之计不能真正地为伦理难题找到出路。

二、生命伦理学的中国语境与问题症候

近十年来，伴随着克隆的多利羊（1997年）的诞生以及人类胚胎干细胞被成功地分离（1998年），以及人类基因组图谱的绘制成功等一个又一个的技术进步及其在医疗实践中的运用，生命伦理学愈来愈聚焦于现代医疗技术及其医疗技术实践所展现的伦理难题、法律难题以及伦理一法律难题。生命伦理学的中国语境亦受到医疗技术最新进展的影响：（1）在汉语语境下，现代医疗技术对伦理与法律的挑战，成为亟需从文化、社会、宗教、伦理、法律等人文价值世界领域进行治理的难题；（2）而一些似乎已经被解决的问题（如脑生或脑死的问题）又重新成为新的伦理一法律难题；（3）由于现代医疗技术及其临床研究和应用，前所未有地关涉到相关主体的权利、责任、义务和相关制度的公正问题，以及前所未有地标示出技术本身存在的大量风险和不确定性，因此它必须获得伦理与法律的支持，且极大地依赖于伦理难题或法律问题的治理或解决。在复杂的国际背景下，各国政府被迫对现代医疗技术的伦理与法律挑战作出回应，即从伦理治理与法律对策两个方面筹划或者设计一种有利环境，既促进现代医疗技术（尤其是高新生物医学技术）的发展，又尽量避免社会被高新技术所侵害。这使得生命伦理学的研究于总体上愈来愈面向“应用”，且愈来愈介入具体的社会决策或社会行动。例如：针对干细胞转化医学等高新生命技术的医疗实践及其产生的生命伦理难题，英国于2005年通过英国经济和社会研究理事会启动了“社会科学干细胞行动”，鼓励人文学者、伦理学家、法学家等介入这一领域；欧盟的BIO-NET项目，旨在希望中欧合作研究生物医学技术中的伦理治理问题。

中国卫生部于2009年3月2日出台了《医疗技术临床应用管理办法》。这个文件可以视做我国从政策层面应对现代医疗技术带来的各种问题（尤其是伦理问题与法律问题）的官方文件，是一个里程碑式的文件。它对我国医疗领域的技术创新和医疗抉择有指导性的作用。然而，这个“管理办法”并不是我们解决现代医疗技术的伦理与法律问题的“灵丹妙药”，由于遇到的问题有些是非常棘手的伦理难题或法律难题，它甚至无法给出具体的实施细则。因此，中国生命伦理学亟需完成一种“语境梳理”，即从理论与实践两个方面，从更广泛深入的实践探索中，以及更多维交叉的跨学科视野的关注或研究中，尤其重要的是在与科学家或医疗领域研究者和实践者的对话研究中，进一步探讨我国现代医疗技术中的伦理治理和法律对策。

另一方面，我们应该看到，现代医疗技术在中国医疗实践领域的研发、传播和使用，除了造成普遍的伦理与法律问题之外，也正在形成“医疗技术的中国问题”。这些问题主要表现在：第一，现代医疗技术的发明、应用及其对社会整体的影响，对中国人的传统哲学观、价值观、生存方式和生活方式的冲击，让中国人产生越来越大的“隔离”感；第二，各种高新生命技术的研发和使用，也正在影响着人们的具体生活，比如，医疗上的器官移植技术、基因诊断技术、试管婴儿技术，等等，这些技术的使用也正在考验中国人的伦理意愿，改变中国人的道德生活方式，同时也对现有的法律解释提出了挑战；第三，由于中国传统伦理道德、社会文化形态和生活思维方式，与主要是在西方文化传统上建构起来的现代性医疗技术体系存在一定的差异，一些在西方语境中可以发挥作用的伦理或法律规范有可能在中国社会失效，从而形成了具有中国特色的“中国生命伦理学难题”。

生命伦理学的中国语境，一般而言，源于现代社会对现代医疗技术中产生的与权利、义务、责任和公正有关的伦理及法律问题的广泛而深刻的关注与激烈的论辩；特别地说，源自医疗技术在挑战伦理及法律的过程中，对中国医疗民生和中国医疗技术进步带来的重大影响。

从学说史的角度或者学术语境看，中国大陆学者对生命伦理的中国难题的研究和关注，是与生命伦理学这门新兴交叉学科在中国大陆的产生、发展和不断成长的历程密不可分的。一般认为，大陆生命伦理学开始于1979年，以美国肯尼迪研究所的学者访问中国社会科学院哲学所为事件的标记。同年12月全国医学哲学的会议在广州召开，会上著名的生命伦理学家、中国社会科学院哲学所邱仁宗研究员介绍了英语国家有关辅助生殖技术，脑死亡和安乐死及其他生命伦理学问题的争议。1980年，《医学与哲学》杂志创刊，邱仁宗研究员的开篇论文为“死亡和安乐死”。1987年，邱仁宗教授出版了《生命伦理学》一书，成为将美国和西方生命伦理学介绍到中国的开篇著作。1988年10月《中国医学伦理学》创刊。1988年7月全国“安乐死伦理、法律、社会问题”研讨会召开，1988年11月“人工授精的伦理，法律，社会问题全国会议”召开。上述两本杂志的出版，两个会议的讨论，标志着大陆生命伦理学的正式开始。从1997年至今，大陆生命伦理学进入了“体制化”和“法规化”的新阶段。更多的机构审查委员会（IRB）或医学伦理委员会建立了起来，生命伦理学的研究更多集中在制订符合生命伦理的政策和法规上。同时，也有许多学者试图从中西方文化的传统资源中寻找生命伦理学中国化的启示，有所谓“儒家生命伦理学”、“道家生命伦理学”、“基督教生命伦理学”等学术探索和有益尝试。

然而，客观地分析生命伦理学的中国语境，有两大问题症候不可不察：一是缺少“对话”；二是不够“关心”。前者突出地表现为，伦理学家、法学家和科学家往往各自以一种自说白话的“自信”来应对或解决难题，但并未真实地面对问题；后者突出地表现为，中国生命伦理学热心于追踪生命伦理前沿问题，对中国生命伦理的问题现状缺乏调查研究的热忱或者不够“关心”，对中国医疗民生难题缺少足够的关心，因而不能真正地立足于中国本土并面向中国问题。因此，在现代医疗技术对生命伦理及法律带来的严峻挑战中，中国生命伦理学面临的更为紧迫而重大的难题是：如何在强调“对话实践”和关注“中国问题”的基础上，面对现代医疗技术中的伦理及法律难题，分析我们进行医疗抉择的理由和治理方案，探索中国生命伦理面临的困境和体系构建的路径，并给出相关问题的国情调研或国情对策。这意味着，生命伦理学的中国难题亟需完成两大语境的梳理：

其一是生命伦理学作为“对话的伦理学”的理念的确立。“对话”理念的核心，是生命伦理学在跨学科的条件下，真实地面对现代医疗技术中的伦理及法律问题，推进伦理学家、法学家、科学家、医生、政府主管部门以及公众进入深层次对话与商谈的学术旨趣或良知抉择。因为，无法对话的、或者只是寻求独自的生命伦理学，习惯了将现有的道德理论或权利理论（如道义论、后果论和四项原则或者附加原则）应用到现代医疗技术的伦理及法律问题的分析或解决上，往往使得伦理学家和法学家无法真正地沟通或理解，他们与科学家或医疗（卫生）政策的制订者，亦存在着不利于对话或商谈的知识“偏好”或学科“阻隔”，这不利于相关难题的梳理与解决。生命伦理学中国难题要完成语境梳理，首先必须作为融合或打通“人文价值世界”和“医疗技术世界”的对话实践才是可行的；其“生命力”并不主要地在于探讨某些备选原则的应用问题，（当然这些原则的讨论同样也是非常重要的）而是力图在推进对话或商谈实践上有所作为，并在肃清问题或治理难题的基础上探讨我们如何应对现代医疗技术中的伦理、法律难题。

其二是生命伦理学的中国理念的确立和中国问题的应对。生命伦理学是在以问题或难题为取向的研究中产生和发展起来的，它在两个视野上展开相关难题的分析与治理：一是与医疗民生相关；一是与医疗技术的最新进步相关。中国理念和中国问题，无疑是我国生命伦理学应对现代医疗技术中的伦理与法律难题的基本立足点。它在现代医疗技术之总体进展中，确定了面向中国医疗民生难题和中国技术进步难题的价值旨归。因此，尽可能多地关注中国的医疗民生，以及尽可能多地针对中国问题的现状进行调查研究，是中国生命伦理学的立身之本。

三、生命伦理学的中国形态及构建方向

一般意义上的生命伦理学是与生命科学和医疗技术相关联的应用伦理学。然而，在当代汉语语境或者在生命伦理学面临的中国难题的意义上，我们可以思考生命伦理学作为一种新型伦理形态（Ethictopology）的意义。一方面，中国语境将从一种伦理观的意义上揭示生命伦理学的中国形态作为涵盖生命科学、医学、伦理学、法学、社会学等诸多学科的生态文化系统的本质，及其对重整人类性或民族性的伦理生活形态的医疗实践运动的重要价值；另一方面，中国生命伦理的“形态”理念，将从总体上回应现代医疗技术在医疗实践中带来的世界性的伦理、法律和社会问题，实现一种立足于中国伦理现实和法律实践对现代医疗技术进入伦理和法律的路径辨识或探索，建构中国医疗技术的生命伦理体系，从原则和理论、问题和难题、政策和实践三大向度建构伦理体系和法律解释框架。从这一意义上看，中国生命伦理学的研究路径，首先依赖于我们如何回到中国生命伦理的“道德乡土”，以一种科学的调查研究的审慎性、精确性和实证性，捕捉中国生命伦理的问题境域及其客观现实。我们过去关于医疗技术的生命伦理和法律研究，或者主要地关注抽象的理论思辨而缺乏现实关怀，或者着眼于具体境遇中的具体因素而缺乏整体架构，缺乏对相关主体或利害相关人的主观伦理意愿的调查研究；而实际上，回归中国语境的最初步伐，必然是以当代中国人对医疗技术问题的伦理意愿为核心进行的实证调查，这是一项为生命伦理的中国形态奠基的工作。在此基础上，突破过去按照技术分类体系展开、以具体问题为直接对象、即时性的和碎片化的研究范式，建构一个将具体技术活动形态和历史背景、价值观念、道德意见、生活境遇、实践者意愿、社会责任、法律规范以及未来发展诉求整合在一起的分析模式。进而，通过理论和实践研究，在综合医疗科技行为带来的医疗伦理、法律和社会问题的基础上，为中国未来医疗卫生事业和医疗技术的发展，有针对性地在调查研究的基础上，在重大伦理难题和法律难题的治理和应对，以及道德文化建设、社会制度建设、立法与法治化建设，和未来发展总体战略等方面，提供一系列的对策建议、理论论证和国情分析。

基于对生命伦理学的中国形态的一种理论预设和学术期待，我们多少能够展望一下中国语境下的生命伦理学在其形态构建上亟待完善并着力建构的三大方向：

第一，宏观视野上的突破。生命伦理学是一个包含了生物学、医学、社会学、法学和伦理学等诸多学科，高度交叉与综合的创新性研究系统，是以伦理学为主轴贯通自然科学、社会科学与人文学科三大领域，围绕“现代医疗技术”、“生命的诊治或加强”、“社会、法律、文化”三大关键论题展开的理论与实践紧密结合的综合型论题。生命伦理学的中国形态必须厘清这三大概念的区别、联系及其各自的问题范围。因此，宏观视野的研究，主要是运用伦理学案例分析和道德哲学反思的方法，从多学科交叉融合的视野上基于对伦理难题与法律难题的领域界划或治理机制的探索，分析研究现代医疗技术作为一种现代性的医疗一技术现象在医疗实践中带来的伦理难题和法律难题。伦理是在“道德原理”和“道德规范”的论证、辩护、反思和批判的意义上为法律的应用或立法实践提供应然性之评判、正当性之理据和善的目标参照，它在“活的好”与“做的好”两个方面关涉权利、义务和责任问题，并将之融合到道德论辩和法理依据的分析之中，为法律问题的解决，特别是立法实践提供原理支持、原则辩护和价值引导；法律则是通过强制性的规范体系包括立法、判例和针对具体问题的司法解释，体现伦理的价值、原理、原则和规范，它在强制性规范或判例的“适用”层面，以不容争辩的形式关涉权利、义务和责任，面向行为或应用层面解决有关难题。而“现代医疗技术”作为人的“医疗技术行为”，将医疗技术变革与生命伦理突破以一种亘古未见的方式相互紧密关联起来了，它凸显了技术干预所进入的“从生到死”的生命之过程，以及“从身体到心灵”的生命之体系，从而在实践上给医疗抉择带来了各种各样棘手的伦理难题和法律难题。这一研究进路，并不仅仅是为了描述或者讨论在技术发展、运用的具体过程中产生的具体的伦理和法律难题，而是将“现代医疗技术”视为一个动态演进的现代技术变革与人类医疗实践相互融合的过程的基础上，揭示技术活动与人类伦理生活和法律秩序之间的本质关联，并在此基础上去审视由于现代医疗技术所引发的一般社会问题、生命伦理难题和法律难题的产生根源、呈现形式和治理机制，为从理论上解决这些问题奠定逻辑和概念基础。

第二，中国生命伦理状况及法律问题的调查。生命伦理学的研究，在其本质上是对人类生存实践活动的直接关照，因此，通过社会学的实证研究来发现当代中国医疗技术实践中存在的问题，是理论研究和对策研究的必要基础和基本前提。生命伦理学的中国形态及其构建路径，其真实的开端处或起点处，乃在于我们运用社会学调查方法，比如通过文献研究、深度访谈、问卷被试和现场考察等诸多路径，获取中国本土面临的医疗科技的伦理及法律问题的数据库和典型案例，以为进一步的综合研究提供调查分析之依据。比如说，我们可以根据现代医疗技术中人与人之间或者人与物（或者以技术为中介）之间的权利、义务、责任和公正四大主题，设定相关问卷，对其中产生的生命伦理及其法律问题进行社会伦理状况的调查，获得中国本土（通过多群体分类调查）看待现代医疗技术及其应用的主观意愿方面的第一手数据和案例。这将使生命伦理学的中国语境变得清晰、明确、有力，从而使得生命伦理学的语境梳理真正向中国的现状和国情靠拢，找出中国问题的特殊难题。以医疗技术的生命伦理和法律的中国难题为例，可能有三种具体表现形式：普遍性问题，普遍性问题在中国语境中的特殊表现，以及发源于中国现实的特殊问题。我们如何对这些问题进行区分并加以科学的描述，清理出造成这些区别的中国历史文化和现代社会生活条件，准确把握当代中国人的伦理、法律和医疗生活的真实状况，以及我们如何认识、理解和应对这一生存境遇及其中蕴含的生活体验和伦理意愿，决定了我们的生命伦理学研究开启或者梳理中国语境的基本方式及其特有的学术品质。

第三，重大应用难题和前沿问题研究。生命伦理学的中国难题关涉诸多复杂艰巨的问题域或问题系列。在现代医疗技术的范例中，核心的问题轴线是以“生命伦理”为基点或主轴，通过伦理分析和法律分析力图辨析或澄清医疗技术行为中面临的权利、义务、责任和公正等方面的伦理难题、法律难题和伦理一法律难题。因此，生命伦理学的中国语境，除了要在宏观理念研究的推进策略上根据伦理难题、法律难题、伦理一法律难题的问题轴线展开，还必须面对具体的重大应用难题和前沿问题，强调从“伦理观念变革”的意义上理解现代医疗技术以及在伦理一法律难题的具体问题境遇中展开道德辩护、伦理分析和法律分析。这表明，我们在问题域和研究对象的划分上，要通过综合医疗技术行为对生命过程或生命体系的干预，以及医疗技术发展演进的逻辑线索，对现代医疗技术中的生命伦理的语境进行梳理。比如说，我们可以从两大轴线上捕捉其中遭遇的重大应用难题或前沿问题：（1）在技术演进或变革的历史轴线上，梳理出“常规治疗技术”、“高新生命技术”和“涉及人类发展性需求的医疗技术”三大类；（2）在技术与人（医疗主体）相关的空间轴线上，梳理出与身体相关、与神经或心灵相关、与遗传和世代相关三大类。由此，形成了一个由“时空交织”的问题网络，并系统探讨其内在伦理难题、法律难题和伦理一法律难题的立体性的应用难题和前沿问题。现代医疗技术对人的生与死、身与心、遗传与世代等至为根本的生命之过程和生命之体系进行操作、干预或控制，对现有的（包括传统的）伦理观与法律规范体系带来了重大挑战和冲击。

四、生命伦理的道德前景与研究路径

当代生命伦理学是一个涵盖了生命科学技术、伦理学、哲学、法学、社会学和社会实践活动的生命文化运动，生命伦理学及其原则（四原则）的讨论就是在这一背景下展开的。在半个多世纪的探索中，国际生命伦理学的研究不断地在道德论辩和法律解释两个维度对有“乔治顿咒语”（尊重、行善、无害和公平）之称的规范体系提出了严肃的批评和质疑，生命伦理学的众多研究成果都试图对原则进行重新审查或补充。因此，以生命伦理为主轴，将道德理由（辩护和论辩）和法律依据的探讨作为生命伦理体系的两翼，突破现有的生命伦理学的进路，是生命伦理学面向中国问题或中国语境进行医疗抉择和问题治理的必然选择。中国生命伦理的道德前景，有赖于这种理论与实践之良性互动的生命伦理运动之勃兴，以及我国生命伦理学理论研究在进入或梳理自身语境时贯通宏观与微观、理论与实证、哲学论辩与难题治理等区隔或阻滞所具备的实践智慧。

从这一意义上看，生命伦理学的中国难题，择其要者而言，主要地是由一系列嵌入在当代中国医疗技术实践中的伦理难题、法律难题和伦理一法律难题构成的，它本身预设或者预期了一个与中国医疗民生和医疗技术实践密切关联的生命文化运动（或生命伦理运动）的可能。生命伦理学的中国难题的展开及其研究范例的形成，从一种伦理形态的意义为中国生命伦理的道德前景指引着方向。它强调以中国生命伦理的理念，回应以生命科学技术和神经科学为主体的现代医疗技术在医疗实践中带来的世界性的伦理、法律和社会问题；强调在综合医疗科技行为带来的医疗伦理、法律和社会问题的基础上，建构中国医疗技术的生命伦理体系。这意味着，一种着眼于生命伦理之道德前景的生命伦理学研究，必须格外重视其对中国未来医疗（卫生）事业发展之民生价值内涵的关注，所以既包括对实践问题进行理性反思的研究，也包含对具体问题进行理论分析、论证和理论指导，以及在社会政策、制度和国家法治建设方面的指导策略，和面对具体实践问题时所应采取的伦理和法律技术策略。因此，这是一个涵盖了基本理念、理论逻辑、政策和制度设计、法律规范体系和具体行动技术策略，并以促进和改善中国未来生命科学技术体系、医疗卫生事业和社会和谐发展为最终目标的系统工程。

基于以上分析，我们认为，中国生命伦理学在研究路径方面面临三大转型：

其一，以“对话”和“商谈”的研究方法，推进生命伦理学的跨学科研究。我们在生命伦理学的中国难题的应对方略上倡导一种“对话”和“商谈”的伦理学，用意乃在于：力图使得“以问题为取向”的生命伦理学在一种跨学科对话和跨文化商谈中，打破学科壁垒，打通人文价值世界和医疗技术世界的阻隔，以“对话伦理学”的交叉融合的视角，进行难题分析、现状调查、问题治理，并提供指导医疗抉择的对策建议，从而进一步推进生命伦理学的跨学科研究。我们知道，对当代生命伦理学而言，现代医疗技术所产生的生命伦理和法律问题，已不再是单个学科的事情，而是一个关涉多个学科的集群性问题，没有多学科的共同介入和合作研究，人们无法真正回应这些重大的现实问题以及由之产生的诸种理论问题甚至文化问题。在强调多学科的共同合作和研究的同时，运用对话和商谈的研究方法，力图打破原有的学科界限，在众多相关交叉研究视域中（比如医学伦理、医学社会学、医事法学、伦理社会学、法伦理等）进行问题分析和理论探析，这不但能改变以前各学科各自为伍、单兵作战的“独白叙事”的状况，促进学科交叉与融合，还能形成以问题为中心的多学科研究方法，形成一种跨学科的研究进路。

其二，以对“问题”或“难题”的充分关注，推进生命伦理学的跨文化研究。生命伦理学从其诞生之日起就被界定为：运用种种伦理学方法，在跨学科的条件下，对生命科学和医疗保健的伦理学维度，包括道德见解、决定、行动、政策，进行系统研究的学问。以问题为取向的研究路径，在生命伦理学和医事法学的研究进展中，在根本上颠覆原有的关于理论与实践、思想与世界的关系的传统认识，它使得生命伦理学总是在一种伦理突破的意义上，着意去介入、去发现或者重建一种生机勃勃的伦理生活及法律秩序的可能性。在这个意义上，中国医疗技术的生命伦理学和法学的应用研究，既是世界伦理学形态整体变革之大潮的一个组成部分，也是我们创建新的、顺应世界潮流而又具有中国特色的中国伦理文化运动的一个具体实践环节。虽然今天的生命伦理学理念主要是发端于西方文化传统之中，但由于生命伦理学问题往往对任何文化来说都是难题，生命伦理事件的全人类性和前沿性使得任何一个国家的文化传统都不能独善其身，也无法仅仅在自己的话语体系中提供一个可以被普遍接受的解决方案，故而取消了任何一种特殊文化的话语霸权。因此，以问题或难题为取向的生命伦理学研究，最有希望提供一个跨文化的伦理视野和论辩平台，使不同观点可以在生命伦理实践中更平等、更自由、更深刻地进行对话交流，在属于全人类的范畴内进行广泛的合作；在这些事件的启发下重新审视我们的整个道德体系，判断、描述并引导我们未来生活的应然。