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【摘要】 目的 构建一种能预防Asia Ⅰ型口蹄疫病毒（FMDV）的感染表位重组蛋白疫苗，并对其免疫学活性进行研究。方法 以Asia Ⅰ型FMDV VP1上的B细胞表位和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点，设计了包含上述位点的、具有最佳空间构象的重组蛋白，命名为“CZ1”。通过PCR及基因克隆等方法构建了其表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。通过镍亲和层析和G25凝胶过滤层析纯化及复性，获得具有免疫学活性的重组蛋白CZ1。免疫豚鼠获得含针对AsiaⅠ型FMDV中和抗体的血清，通过细胞中和试验及乳鼠中和试验，检测豚鼠血清中抗FMDV的保护性中和抗体滴度。结果 该基因工程重组蛋白能够在动物体内诱导产生抗AsiaⅠ型FDMV具有保护性的中和性抗体。结论 该基因工程重组蛋白有望开发成预防AsiaⅠ型FDMV感染的新型疫苗。
【关键词】 基因工程疫苗；FDMV；重组蛋白；活性检测
口蹄疫（FMD）是由FMD病毒（FMDV）引起的一种人和动物共患的急性发热性高度接触性的传染病〔1〕。传统FMD疫苗为弱毒疫苗或灭活疫苗，虽具有良好的免疫原性，但由于存在着灭活不彻底以及防护不当，而致病毒扩散传播的危险，这些不安全因素促使人们寻求新型的疫苗。有研究证明，T和B细胞抗原原位串联连接构建而成的基因工程疫苗能引起有效的机体免疫应答，有利于具有保护性的中和抗体的产生〔2〕。本研究以Asia Ⅰ型FMDV VP1上的B和T细胞表位氨基酸序列为抗原位点，采用计算机软件筛选出最佳的表位组合形式，拟利用基因工程方法构建、表达包含上述位点的氨基酸序列的重组蛋白，以探索一种新型的AsiaⅠ型FMDV基因工程疫苗。
1 材料与方法
1.1 菌种、质粒、引物、试剂、动物及FMD灭活疫苗
JM109菌种、BL21(DE3)菌种、质粒pMD18T和pET28a(+)均由本室保存。引物均由上海生工生物工程技术有限公司合成。Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、dNTP、T4连接酶均购自TAKARA公司。IPTG购自Promega。其他试剂均为国产分析纯或试剂纯。层析介质NiSepharose 4B、G25 Superdex 购自Healthcare GE。牛AsiaⅠFMD灭活疫苗购自内蒙古生物药品厂。豚鼠购自长春高新技术开发区医学动物实验研究中心。
1.2 重组质粒pET28aCZ1的构建及鉴定
结合文献报道，选取Asia Ⅰ型VP1上的B和T细胞表位的氨基酸序列，结合计算机空间构象模拟筛选出多个T、B细胞表位串联形式的重组蛋白。用PCR法构建表位的基因序列，将其与pMD18T连接后，构建串联的重复序列；采用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，将基因片段亚克隆至经同样双酶切的pET28a（+）质粒上，构建成含目的基因片段的pET28aCZ1重组质粒；送上海生工生物工程技术有限公司进行测序。
1.3 CZ1重组蛋白疫苗的表达
将重组质粒pET28aCZ1转化至E.coli BL21(DE3)表达菌中，经LB平板筛选后，挑取单克隆接种至LB培养液，于37℃、220 r/min振荡培养，当菌液A600=0.6时，加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，37℃、220 r/min振荡诱导、培养3 h，离心收集细菌。取诱导前后样品进行SDSPAGE鉴定。
1.4 CZ1蛋白的纯化
取10 g湿菌与裂菌液（含8 mol/L尿素）按1∶5(M/V)重悬后，4℃、搅拌4 h。10 000 r/min离心15 min，取上清加载至预先平衡的NiSepharose 4B层析柱中。用含4 mol/L尿素的洗涤液洗涤至A280到基线后，洗涤液中尿素浓度降至3 mol/L，洗涤1 h后，尿素浓度降至1 mol/L洗涤3 h后，洗脱CZ1蛋白；收集目的蛋白后，加载到预先平衡的G25 Superdex层析柱中，收集CZ1蛋白。将每步骤留取的样品进行SDSPAGE鉴定。
1.5 豚鼠免疫
取3只体重为300 g左右豚鼠，股内侧肌肉注射CZ1蛋白质（200 μg/只），同时设立PBS对照和AsiaⅠ型FMDV灭活疫苗阳性对照。免疫后第21天采集血清。
1.6 中和试验
①96孔板细胞培养板中加50 μl/孔的细胞维持液，再加入50 μl/孔倍比稀释的免疫后21 d的豚鼠血清，最后加入50 μl/孔200 TCID50稀释的病毒，CO2培养箱中孵育1 h后，加入BHK21细胞，CO2培养箱中培养72 h后，萘黑蓝染色，Karber法计算血清中和抗体滴度。②取灭活补体的免疫21 d后的豚鼠血清分别按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释，病毒用维持液稀释至200 TCID50/100 μl，将病毒稀释液和各稀释度的血清等量混合后，37 ℃水浴1 h，乳鼠背部注射，100 μl/只，每份血清的每个稀释度注射4只二日龄乳鼠，观察并记录注射后68 h每组乳鼠的存活情况，并以Karber法计算保护性中和抗体的滴度。
1.7 统计学处理
应用SPSS11.0软件进行两组间方差检验。
2 结 果
2.1 重组蛋白质空间结构的预测
通过DNA star软件及Expasy网站，对表位的多种构建方式进行蛋白质的二及三级结构预测，筛选出一种能模拟天然构象的表位组合形式，其空间结构预测结果见图1，其RGD序列（如箭头所示）充分暴露在细胞表面，可能有利于中和性抗体的产生。后续实验按照这种表位组合形式构建并表达目的蛋白，并命名为“CZ1”。
2.2 pET28aCZ1重组质粒的构建
通过PCR法合成目的基因经TA连接后，将其亚克隆至原核表达载pET28a，获得重组质粒pET28aCZ1。pET28aCZ1 经EcoR I和Hind Ⅲ双酶切后，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期相符（预期为945 bp），见图2。DNA测序结果与预期相符。
2.3 CZ1蛋白的表达及纯化
将重组质粒pET28aCZ1转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌后，接种至LB培养基中，待细菌生长至A600=0.6时，加入IPTG继续诱导培养3 h。SDSPAGE分析显示，目的蛋白质分子量约为42 kD，与预测结果相符，表达产量约占菌体总蛋白的50%左右。经诱导后的菌体，以8 mol/L 尿素裂解包涵体，上清经镍亲和层析和G25凝胶过滤层析纯化，得到纯度达到90% 的重组蛋白CZ1。见图3。
2.4 FMDV细胞中和试验
观察在牛Asia Ⅰ型FMDV活病毒的攻击下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否中和该病毒对BHK21细胞的感染。若该血清中含有针对牛AsiaⅠ型FDMV的中和抗体，则可中和FMDV对BHK21细胞的感染而使其存活。结果显示，免疫后第21天的3份豚鼠血清中和抗体滴度的几何均数为286，灭活病毒组为320，与PBS组（≤3）比较差异显著(P
2.5 中和试验
观察在活的Asia Ⅰ型FMDV的攻击下，CZ1蛋白免疫的豚鼠血清能否保护乳鼠抵抗该病毒的攻击。将PBS组和CZ1蛋白免疫的各3份豚鼠血清分别按1∶32、1∶64、1∶128、1∶256稀释，分别与FMDV孵育1 h后，注射4只乳鼠。如豚鼠血清中含有针对AsiaⅠ型FMDV的中和抗体，则乳鼠存活。结果显示，CZ1重组蛋白免疫的3份豚鼠血清中，针对Asia I型FMDV的中和抗体滴度分别为1∶90、1∶256和1∶90，几何均数为1∶127，与PBS组比较差异显著(P
3 讨 论
FMDV共有 A、O、C、Asia 1、SAT 1、SAT 2、SAT 3等7个血清型，血清型之间没有交叉免疫〔3〕；在我国，FMD疫情主要以O型、A型、AsiaⅠ三个血清型为主。2005 年初，我国江苏、山东等省相继暴发了AsiaⅠ型FMD，感染动物以牛为主，波及我国大多数省区〔4〕。基因工程疫苗由于安全有效、价廉、易于大规模生产等，成为新型疫苗研究的热点。
在本研究中，根据蛋白质的一级结构决定三级结构从而决定蛋白质功能的原理，通过计算机模拟空间构象的方法筛选最适的基因序列，这种方法大大节省了时间、节约了成本。在设计时，考虑我国及周边国家AsiaⅠ型 FMDV 流行株VP1 基因的抗原位点，以 FMDV VP1 的B和T细胞表位串联的方式，成功地构建了由6个表位组成的重组蛋白。选用大肠埃希氏菌作为表达系统，并考虑了大肠杆菌密码子的偏爱性，对部分基因序列进行了同义突变，以便提高多表位基因在大肠杆菌中的表达效率〔5，6〕，极大提高了重组蛋白CZ1的表达量，约占菌体总蛋白的50%。虽然pET表达系统所表达的蛋白产物带有6个His标签，易于纯化，但大肠埃希氏菌表达系统表达的蛋白缺少诸如糖基化和磷酸化之类的翻译后修饰作用，常形成包涵体，不利于表达产物的纯化回收，且对获得有生物学活性的表达产物造成极大的困难。重组蛋白CZ1为包涵体表达，本室采用了在NiSepharose层析纯化的同时，通过逐步降低洗涤缓冲液中的尿素浓度，使重组蛋白CZ1复性，实现了重组蛋白质纯化和复性同时进行，极大简化了工艺。
本试验结果表明，该重组蛋白疫苗能够诱导豚鼠产生具有针对Asia Ⅰ型FMDV的保护性中和抗体，可以中和该病毒对BHK21细胞的感染，且能够保护乳鼠抵抗同型活病毒的攻击，原因可能是由于重组蛋白CZ1能形成类似于天然FMDV VP1蛋白的三维构象。以上结果表明，该重组蛋白具有保护牛抵抗Asia Ⅰ型 FMDV 的潜能，有可能开被发成为Asia Ⅰ型FMD基因工程疫苗。
致谢：感谢内蒙古金宇生物公司实验中心协助完成细胞中和试验和乳鼠保护试验。
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人胎球蛋白A （Fetuin-A）即α2-HeremansSchmid glycoprotein（AHSG） 胎球蛋白A于1944年由Pederson发现，是一种59kD的糖蛋白，是cystatin超家族（半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族）的一员，由两个cystatin样决定区和一个小的无关决定区组成［1］。AHSG具有多种生物学功能：与骨重塑、胎脑发育密切相关，并能维持体外细胞生长；在肿瘤细胞表面，AHSG结合MMPs，可能涉及到肿瘤的发生、发展。AHSG主要在肝脏合成，含有两个肽链结构糖蛋白。在脑皮质和骨骼骨髓也有人AHSG的分布。研究表明，AHSG在血液循环中可形成可溶性的AHSG钙磷酸复合物，是体内最强大的抑制软组织钙化作用的蛋白质，因此慢性肾病患者非常高的组织或心血管组织钙化的发生率与此有关。此外，AHSG可以用来观察代谢综合征血管钙化、肾脏移植后软组织的钙化、血管和心脏瓣膜的钙化、动脉粥样硬化等的生物学指标。本文就AHSG在钙化、炎症及胰岛素抵抗中的病理作用作一综述。
1 胎球蛋白A与异位钙化
目前，国际上对慢性肾病患者的血管钙化有较深入的研究，引起血管钙化的原因主要与磷、甲状旁腺素相关肽、维生素D、骨调节蛋白及脂质紊乱等相关［2］。但体内也存在一些钙化抑制物，充分利用钙化抑制物，可减慢尿毒症病人的血管钙化的速率，AHSG就是近年发现的主要的系统钙化抑制物。AHSG广泛大量地存在于细胞外液，是一重要的循环钙化抑制剂，在血液中能与基质G1a蛋白（MGP）和钙、磷形成复合体［3］，抑制磷灰石前体矿物质的形成和沉积，占抑制血清钙磷沉积作用的50％［4］，AHSG是属于胎球蛋白族的血浆糖蛋白，主要由肝细胞合成和分泌，随后进入循环，聚集于骨骼中，在血液和脑脊液中含量都比较高，在钙化的骨质中浓度最大。AHSG分子的氨基末端存在与转化生长因子-β（TGF-β）受体相似的序列，可与TGF-β结合，抑制依赖其的成骨细胞增生。TGF-β由骨基质释放的生长调节因子，在骨形成过程中起重要的调节作用。ASHG的N端富含酸性氨基酸残基，是碱性磷酸钙（BCP）的结合位点，可与Ca2+、PO43-形成可溶性的无定形胶体微球，抑制血清过饱和的钙磷盐沉积［5］。
AHSG是一种体循环内的系统钙化抑制物，胎球蛋白的减少可引起异位钙化，包括软组织钙化和血管钙化，抑制钙化的作用机制可能是通过与基质Gla蛋白（MGP）、钙、磷形成复合物，抑制磷灰石前体的形成和沉淀有关，而不影响骨骼矿化。血管钙化在老年病人，特别是肾功能衰竭的透析病人中大量存在，已有临床证据显示ESRD患者血AHSG水平降低，而且低AHSG水平与心血管死亡率、全因死亡率相关［6］。Coen等应用CT对血液透析患者进行了冠状动脉和腹主动脉钙化的检测，同样发现血AHSG水平与冠状动脉钙化积分和腹主动脉钙化面积相关［7］。Jahnet-Dechent等发现AHSG敲除的老鼠发生严重的软组织钙化和血管钙化［4］。近来在肾功能衰竭病人中发现AHSG明显减少的病人血管钙化和软组织钙化的发生率明显增加，从而心血管疾病发病率也明显提高。Kettleler等［8］通过对312例透析病人研究发现，透析病人血清胎球蛋白A水平明显低于对照组，最近的一项研究显示低的胎球蛋白A是一个与营养状态、炎症和动脉粥样硬化相关的因素，随着肾脏替代治疗的进行，胎球蛋白A水平进一步下降。这种下降与病人的血磷和钙磷乘积相关，但与血钙水平无关。Cozzolino等［9］研究认为透析病人与正常人有相似的AHSG基因多样性分布，但血清胎球蛋白A减少。透析病人的胎球蛋白A的减少原因认为透析病人营养不良发生率较高，身体抵抗力下降，长期存在一些慢性炎症有一定的关系，当然透析病人的血管钙化还与钙磷代谢、甲状旁腺功能亢进有关。
2 胎球蛋白A与炎症
研究认为胎球蛋白也是一种负性炎症急性相蛋白［10］，感染性疾病（败血症、肺炎、脑膜炎、外伤等）的患者在急性炎症阶段血清胎球蛋白A水平明显下降，而在炎症控制后其水平升至正常［11］。其原因可能是由于在炎症状态下，肝脏对其合成受损，溶菌酶及其他蛋白水解酶对其的降解增加有关。高水平胎球蛋白A可抑制TGF－α的产生，具有对抗炎症的作用［12］。胎球蛋白参与巨噬细胞灭活，提高细胞摄取阳离子能力以减轻炎症因子如TGF－α、L－1β和L－6对细胞的损害［13］。近来一些研究认为胎球蛋白不仅是急性炎症阶段明显下降，透析病人慢性炎症及慢性重症肝炎也是明显下降的，张磐等［14］证实了慢性重型肝炎病人胎球蛋白A水平明显下降，认为急性肝衰竭时，大量的肝细胞凋亡或坏死，胎球蛋白A合成减少，在抑制TNF－α 过程中被大量消耗和TNF－α通过抑制mRNA转录来抑制胎球蛋白A的分泌有关。因此，胎球蛋白A可作为体内反映炎症状态的标志物。
3 胎球蛋白A与胰岛素抵抗
胎球蛋白A不但具有促异位钙化，调节炎症反应，而且具有抑制胰岛素受体的酪氨酸酶活性作用［15］。动物实验表明该蛋白兼有抑制胰岛素活性的作用［16］。Mori等发现，降低血清胎球蛋白A是吡格列酮改善胰岛素抵抗的可能机制之一［17］，体内缺乏胎球蛋白A增加病人对胰岛素的敏感性。肥胖是代谢综合征的重要组成成分，腹部脂肪过多与重要的代谢异常有关，如胰岛素抵抗、高胰岛素血症、高甘油三酯血症、高血压病、糖耐量受损和糖尿病等。Norbert等［18］通过对47例无糖尿病的健康白种人进行纵向分析，发现体重减轻后，肝脏脂肪的下降，随之伴有胎球蛋白A水平的降低。动脉实验也证实，胎球蛋白A基因敲除的鼠在喂高脂饮食后，体重并不增加，血脂也明显下降［16］，说明胎球蛋白A与肥胖有明显相关。高水平胎球蛋白A与罹发代谢综合征风险增大和所有致动脉粥样硬化脂质谱异常皆明显独立相关［19］。因此它是冠状动脉病的危险因素之一。
综上所述，胎球蛋白A是体液中存在的系统性钙化抑制物，它的缺乏引起组织钙化，透析病人中存在血液胎球蛋白A明显下降的现象，透析病人异位钙化发生率也远高于正常人，但透析病人引起胎球蛋白A下降的机制并不清楚，能否通过胎球蛋白A作为治疗靶点，减少透析病人的异位钙化是今后研究探索的方向。血液胎球蛋白A水平增高与代谢综合征相关，致罹发MS风险增大。另外，胎球蛋白A作为体内炎症标志物指导临床治疗有一定的意义。
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【关键词】 小牛血清去蛋白；阿魏酸钠；高压氧；急性一氧化碳中毒
[Abstract] Objective Discuss the treatment effect of deproteinized calf bloodserum，sodium ferulate and high pressure oxygen on acute carbon monoxide poisoning. Methods Seventy-five cases with coma acute carbon monoxide poisoning were randomly pided into two groups: the treated group (37) and the control group(38). The two groups were treated with high pressure oxygen，high flow oxygen uptake and support treatment，The treated group were treated with deproteinized calf bloodserum and sodium ferulate . The control group were treated with Bao’erlindanjian act medicaments. Results The occurrence and injury degree of myocardial damage and delayed encephalopathy were markedly attenuated（P
[Keywords] deproteinized calf bloodserum; sodium ferulate; high pressure oxygen; acute carbon monoxide poisoning
急性一氧化碳（CO）中毒患者经抢救在急性中毒症状恢复后易发生迟发性脑病，近年来迟发性脑病及其严重的后遗症已引起高度重视。自2008 年10 月我们对收治的中、重度急性CO中毒37 例患者应用阿魏酸钠、小牛血清去蛋白联合高压氧治疗，收到较好的临床效果。
1 资料与方法
1.1 临床资料
在有昏迷史的75 例急性CO中毒住院病人中，随机分为治疗组和对照组。治疗组37 例，男16 例，女21 例，年龄14～80 岁，平均年龄47 岁；对照组38例，男18 例，女20 例，年龄13～82 随，平均47.5 岁。2 组性别、年龄、既往史、中毒程度无显著差异性（P>0.05）。
1.2 治疗方法
2 组均在确诊后生命体征平稳的情况下即行高压氧治疗，急性期每天2 次，恢复期每天1 次，疗程15～30 次，同时给高流量氧气吸入3～5 天及对症支持治疗。治疗组应用阿魏酸钠300 mg入5%葡萄糖250 ml中静脉滴入，小牛血清去蛋白1.2 g入5%葡萄糖250 ml中静脉滴入，连用14 天。对照组应用胞二磷胆碱等药物。
1.3 观察指标
入院后第1、3、5 天静脉查心肌酶谱及心电图，观察心肌损伤的发生率及其严重程度，记录神智转清的时间，出院后2 个月内电话随访病人了解迟发性脑病发生的情况。
1.4 诊断标准
有明确CO气体接触史，均有昏迷过程，除外其他疾病导致的昏迷，碳氧血红蛋白均大于50%；心肌损伤的诊断标准及评分按2008 年1 月北京市科委重大项目“多器官功能障碍综合征/降低病死率研究”课题组发表的《多器官功能中障碍综合征（MODS）诊断标准、病情严重程度评分及预后评估系统和中西医结合证型诊断》标准[1]。
1.5 统计方法
计数资料采用x2检验，计量资料采用两样本t检验分析，P
2 结果
2.1 2 组心肌损伤的发生率及其严重程度评分
见表1。
表1 2组心肌损伤的发生率及严重程度评分比较
组别例数（n）心肌损伤（n）严重程度评分(n)
1分2分3分
治疗组3716*（43.2）114*1
对照组3825*（63.1）714*4
与对照组比较P*
2.2 2组昏迷时间迟发性脑病发生率及死亡率比较
见表2。
表2 2组昏迷时间、迟发性脑病发生率及死亡率比较
组别例数（n）昏迷时间（h）迟发性脑病（n）死亡（n）
治疗组374.62±2.46**1*（2.7）1（2.7）
对照组387.25±3.319*（23.6）2（5.2）
与对照组比较P*
3 讨论
急性一氧化碳中毒导致脑缺氧后，脑血管随即麻痹扩张，脑容积增大，脑内神经细胞ATP很快耗尽，钠泵不能运转，纳离子积累过多，导致严重的细胞内水肿而血管内皮细胞肿胀，造成脑血液循环障碍，进一步加剧脑组织缺血缺氧，导致昏迷，经抢救在急性中毒症状恢复后经过数天或数周表现正常或接近正常的“假愈期”后，再次出现以急性痴呆为主的神经精神症状和锥体外系症状的脑功能障碍。其机理：①微栓子学说：急性中毒后缺氧致血管内皮细胞遭受损害，内膜粗糙引起血小板聚集形成微栓子，使白质弥散缺氧缺血致脱髓鞘改变，②自由基学说：缺氧后新供氧时产生大量自由基(类似缺血再灌注)，自由基所诱发的脂质过氧化反应对神经纤维髓造成损害。由于脑组织对缺氧的耐受能力最差，最先受累的是脑组织其次是心肌。与本研究结果相似：心肌损伤的发生率54.7%。
阿魏酸钠是从当归川芎中提取的有效单体成分，其化学名3—甲基—4羧基桂皮酸钠盐2 水化合物，阿魏酸钠能扩张心脑血管，增加组织血液灌流量，改善微循环，减少组织细胞的缺血缺缺氧，促进细胞修复及再生。阿魏酸钠已被证实能直接捕获氧自由基，其分子结构中的酚羟基具有消除自由基的功能。许多研究表明， 阿魏酸钠对羟自由基和过氧化氢有直接清除作用，可减少超氧自由基和H2O2引起的膜脂质过氧化，降低MDA的生成，是一种很强的天然抗氧化剂[2]。小牛血清去蛋白注射液，由多种游离氨基酸、小分子肽和寡糖等成分制成，能够提高局灶性脑缺血大鼠脑血管的化学储备能力[3]，对缺氧引起脑细胞损伤可改善脑细胞能量代谢，促进细胞对氧的摄取，保护在缺氧状态下的脑神经细胞[4]。其药理作用有：①作用于神经细胞膜上的葡萄糖载体，促进细胞对氧和葡萄糖的摄取；②促进线粒体合成ATP，改善缺血状态下细胞对氧的利用，活化细胞；③转变细胞的无氧糖酵解为有氧糖代谢，延长细胞在缺血缺氧状态下生存的时间，增加组织细胞的抵抗力；④可以抑制缺血瀑布中的重要介质一氧化氮的合成，从而全方位阻断缺血瀑布反应；⑤小分子激活肽能够阻断并修复损伤的神经细胞[5]。
本研究显示中、重度急性CO中毒后应用小牛血清去蛋白、阿魏酸钠联合高压氧治疗，治疗组较对照组心肌损伤的发生率及严重程度评分显著降低（p
参考文献
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