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【关键词】农村订单定向医学生;社区卫生服务站;实习
本文针对农村订单定向医学生的特殊性质,分析其在社区卫生服务站实习中最需要的知识和技能,得出一个特定的实习模式,并在农村订单定向医学生的实习中予以应用,以提高农村订单定向医学生的实习质量。
1 农村订单定向医学生在社区卫生服务站实习模式研究的必要性
社区卫生服务是融预防、医疗、保健、康复、健康教育、计划生育技术服务为一体“六位一体”的基层卫生服务。乡镇卫生院实际上也是社区卫生服务的延伸。农村订单定向医学生在社区卫生服务站的实习可视为仿真实习,在社区卫生服务站,他们不仅能够掌握常见病、多发病及慢性病的日常治疗及康复技能,而且还可以学到社区卫生服务站规范化的管理、居民健康档案的管理、与居民的沟通能力等等,这些都将对其毕业后回到乡镇卫生院工作有着重大的帮助。因此,研究农村订单定向医学生在社区卫生服务站的实习模式很有现实意义。
2 农村订单定向医学生在社区卫生服务站实习面临的问题
2.1缺乏统一的社区卫生服务实习基地的选择要求和标准??城市社区卫生服务站建设的基本标准和社区卫生服务实习基地建设的基本标准有很大差异,并非所有的社区卫生服务机构都符合社区卫生服务实习基地建设的要求。由于受已有教学大纲和教学目标的限制以及缺乏统一的社区卫生服务实习基地选择要求和标准,各医学院校就如何使用社区卫生服务机构来完成教学实习尚缺乏经验和系统的运作机制。
2.2社区医学教学基地全科教学师资力量严重不足??
由于历史原因, 社区卫生实习基地医务人员不仅普遍存在学历低、职称低、业务水平低的问题, 而且对预防、保健、康复等全科医学知识也相当缺乏, 因此, 能够符合全科医学师资要求的人员少之又少。没有合格的社区卫生服务实习基地和高素质的实习指导师资队伍, 医学实习生全科医学能力和意识的培养目标就难以实现。
2.3社区医学教学基地实习内容不系统??
从目前社区卫生服务实习的执行情况看,实习内容和课堂教学内容吻合程度较低。社区卫生实习安排时间较短,能够开展的社区卫生实习项目较少,实习内容不完善。“六位一体”的社区卫生服务内涵未能在社区卫生实习项目中得到充分体现,实习内容不统一。而且,社区卫生实习时间和内容与其他实习环节衔接不紧密。
2.4学校参与共建社区卫生服务基地建设的长效机制尚未形成
从目前社区卫生服务实习基地的共建情况看,运行机制单一。学校对社区卫生服务基地的建设仅限于简单地挑选,然后通过协议的方式予以规范。学校和社区卫生服务基地之间的权利和义务关系不明确,后期主动培育和完善社区卫生服务基地的意识不强,共建的投入力度不够,没有和社区卫生服务实习基地形成双赢格局,社区卫生服务基地建设的后劲不足,缺乏长效运行机制。
3农村订单定向医学生在社区卫生服务站实习模式研究
3.1 制定社区实习教学计划
根据学生临床实习的知识掌握情况,结合社区实习基地的实际,制定规范、可操作性强的教学实施计划十分必要。通过进行了解,可知社区实习内容主要包括社区常见病、慢性病的一体化处理;常见病、慢性病的保健康复;随访和家访技能的教育和实践;重点人群的健康教育,如妇幼保健、计划免疫、社区传染病的管理、社区卫生服务需求和现状调查评价等内容;个人及社区健康档案的内容、书写与管理规范;社区卫生服务信息系统及其管理程序;医患沟通技巧;双向转诊的流程等。
3.2 建立学校、社区联动的教学方法
学校与社区服务中心共同研究、制定教学方法,学生可充分利用社区实习基地作为了解社区、接触社会、体察民情的窗口,激发他们学习掌握医学科学知识和技能的热情,产生为社区服务的动力。在实习过程中,学校与中心带教老师可充分结合学生实际情况,采用启发式、讨论式、角色模拟等教学手段,开展“以问题为中心教学方法”。带教老师还和学生共同参与社区调查、家庭访视、健康档案建立、资料分析与评价等活动,把加强学生医患沟通能力、团队合作能力、健康教育能力、社区预防保健能力、卫生服务管理能力等方面的培养融入教学全过程。在这种联动的教学过程中,学生得以发挥主观能动性,提高了认识,增加了学习和从事该事业的兴趣。
3.3 建立学校、社区卫生服务站、定岗单位联动管理制度
首先,学院领导高度重视与定岗单位、社区建立长期友好的合作关系,为社区实习工作奠定良好的基础;其次,学校聘任社区管理及临床经验丰富的医师为兼职教师,让他们责任更明确,积极性更高;第三,学校定期进行教学巡查和举办任课教师、兼职教师教学交流研讨会,使学生实习过程遇到问题能与老师实现无缝对接;第四,社区定期举办学术讲座或学生学习小结讨论会,及时纠正错误模糊认识,对共性问题进行集中讲解。
3.4 社区实习效果评价
农村订单定向医学生在社区卫生服务站的实习模式是一种新尝试,我们可以采用教师评议、学生自评、实习前后调查、实习结束后考核、论文点评分析等形式对实习效果进行评价。通过反馈得来的结果,我们可以对实习的效果进行分析评价,找出优势与不足,从而巩固优势,改善不足,不断完善农村订单定向医学生在社区卫生服务站的实习模式。
参考文献
1. 孙伟民.医学院校附属医院在开展社区卫生服务中的作用[J]. 邯郸医学高等专科学校学报,2001(3):241
2. 宋平. 医学本科生服务农村医疗机构的促进因素与对策探讨[J].成都中医药大学学报,2010(12):16-18
1996年元月29日,宜阳县卫生防疫站做出宜卫罚字(96)第2号卫生行政处罚决定书,认定许海棠的“熟肉加工店用的塑料包装袋未经有关部门检验,用于熟肉包装;于8月27日(实际是8月28日——编者注)出售给张午‘福雅轩酒家’的熟肉未经检验,又在未放凉的情况下装入塑料包装袋;在8月29日(实际是8月30日——编者注)对该店进行模拟采样检验中,该熟肉细菌总数严重超标;该店两人未进行健康检查,未办健康证。由此推断,该酒家27日卖给张午福雅轩酒家的熟肉引起食物中毒,可能在该加工点已造成污染。”上述事实已违反了《洛阳市〈食品卫生法试行〉实施细则》第七、十一、三十二、四十八条之规定,依据《洛阳市〈食品卫生法试行〉实施细则》第四十八条第四款第五、十项之规定,决定给予许海棠一千元罚款的处罚。
许海棠不服该处罚决定,向宜阳县人民法院提起诉讼。诉称自己使用的塑料食品袋是市场上通用的,从未有人通知过需要检验,也没规定每天出售熟肉时都要送防疫部门检验。当天出售的熟肉其他单位食用后都没出问题。说明问题不在本店。“福雅轩酒家”发生食物中毒后,次日防疫站对该店熟肉进行模拟采样检测不能说明当日出售的熟肉在店内细菌指数超标,防疫站对我的处罚没有科学根据,要求撤销该处罚决定。
被告宜阳县卫生防疫站辩称:一、因该店所用食品袋上印刷的所有文字全为外文,属进口的塑料包装袋,未有国境口岸食品卫生监督机构的检验证明,又未经当地卫生检测部门检验,是不符合食品卫生法要求的;二、原告以“从未有人通知过每次出售熟肉时都要进行检验”为借口,否定防疫站依法行政是站不住脚的;三、模拟采样检验和推断是食品卫生法允许的。防疫站对其处罚是正确的,请求人民法院予以维持。
「审判
宜阳县人民法院经审理认为,1995年8月29日张午“福雅轩酒家”食物中毒事件属变形杆菌所致,并非大分子化合物中毒,而新塑料食品袋的卫生指标为正已烷提取物。被告8月30日对原告店中卤肉模拟采样检验结果说明原告的卤肉加工点存在不卫生情况,但该模拟采样检验不能证明8月29日出售给福雅轩酒家的卤肉已携带(变形杆菌)致病菌或未携带致病菌。卤肉从加工出锅到食用前存在着多个可能污染的环节。在未排除卤肉从“福雅轩酒家”来人装入塑料编织袋运至张午及第2天的再加工这一系列过程中可能造成污染前,以或然性的推断结论进行处罚,事实不清,主要证据不足,依法应予撤销。根据《中华人民共和国行政诉讼法》第五十四条第二项之规定,该院于1996年5月27日作出判决;
撤销宜阳县卫生防疫站1996年1月29日(96)宜卫罚字第2号行政处罚决定。
判决后原被告均未在法定期限内提起上诉。
「评析
本案涉及以下几个方面的问题:
一、卫生防疫站的行政处罚主要证据不足
这是因为:(1)卫生防疫站没有对原告使用的塑料食品包装袋进行检验,没有证据证明包装袋的卫生状况与食物中毒有直接因果关系。根据国家标准总局的GBn146-81食品包装用聚炳稀树脂卫生标准,检验项目为正乙烷(大分子化合物)提取物,而不是细菌、致病菌的卫生指标。卫生防疫站既然没有对塑料袋的卫生状况进行检验,也就无法确定塑料袋在用时是否携带致病菌。从“8。29”中毒事件原因看属致病菌中毒,而不是大分子化合物中毒,故无法确认塑料袋的使用与食物中毒有直接因果关系,以此进行处罚,实属勉强。(2)“8。29”食物中毒的直接致害物是卤肉。而卤肉从加工出售到消费者使用前,存在着多个可能造成污染的环节,因此只有排除了“福雅轩酒家”从购入、运输、保管、再加工到出售这一系列过程不存在污染的可能性之后,才能认定卤肉的病害是在原告加工的过程造成的。而在缺乏上述结论的情况下,以原告加工的卤肉未经检验,原告加工店中有人没有健康证为由推定卤肉在原告加工点受到污染发生病变是没有根据的。以这种或然性的结论来进行处罚难以令人信服。(3)8月30日的模拟检验不能作为认定“8。29”食物中毒事件原告具有过错的直接证据。从8月30日卫生防疫站的抽检情况看,原告食品加工点存在有“从业人员没有健康证”,加工的卤肉细菌超标等违反食品卫生法的行为。但此结论并不能必然说明或证明原告8月28日卖给“福雅轩酒家”的卤肉不符合卫生标准,卫生防疫站以8月30日的核检结论作为依据进行处罚是没有道理的。
二、卫生防疫站不具有进行处罚的主体资格
根据1995年10月30日新颁布的《中华人民共和国食品卫生法》第三十二条“食品卫生监督的行政处罚权在县级以上地方人民政府卫生行政主管部门”的规定,在95年10月30日以后对食品卫生违法事件进行处罚的应该是县卫生局,卫生防疫站无权作出处罚决定。因此,县卫生防疫站于1996年1月29日作出行政处罚决定属越权处罚,是无效的。审理中有人认为“8。29”中毒事件发生时新的食品卫生法尚未颁布,卫生防疫站已调查处理,且处罚适用的法律《洛阳市〈食品卫生法试行〉实施细则》尚未废除,卫生防疫站是有权对此事件进行处罚的。我们认为这种认识是错误的,因为法律一经生效就应不打折扣的执行,如有地方性法规与国家法律、行政法规不一致的,应以国家法律、行政法规为准。所以“8。29”食物中毒事件的处罚发生在1995年10月30日之后,就应由县卫生局实施,卫生防疫站不具备处罚的主体资格。
三、卫生防疫站的处罚适用法规错误
关键词:教学改革;自主学习;以学生为中心
中图分类号:G642.0 文献识别码:A 文章编号:1001-828X(2016)033-000-01
《商务定量分析》是将《管理统计学》与《运筹学》两门管理类专业的专业基础课内容按照企业经营管理活动的需要整合而成的课程,课程内容涵盖描述统计、推断统计、预测分析、规划分析、决策分析等基本定量分析知识,注重培养学生理性思维发展,锻炼学生深入研究问题的素养和撰写分析报告的能力,为其今后在管理岗位的进一步发展打下基础。但是,《商务定量分析》通常在学生学习了高等数学、线性代数、概率论及数理统计等数学基础理论课程后开设,学习过程中需要学生具备一定的数学基础,这就造成了部分数学基础较为薄弱学生在学习过程中感到课程有一定的难度,以致于产生厌学态度,而同时学有余力的学生又希望深入学习,因此在传统的“以教师为中心”教学理念下的教学活动使得课程的教学效果大打折扣。
“以学生为中心”的教学理念提倡“让学生自己去发现和创造知识”,由传统的“课堂、教师、教材”向“学生、学习、学习过程”的转变。承认学生的个体差异,教师通过多种教学手段引导学生自主构建学习体系,在教学过程中不断通过教学评价了解学生的学习效果,不断改进教学,提高教学教学效果。
基于以上两点,在《商务定量分析》课程从课程内容设计、教学方法和手段、教学评价等三个方面进行了一系列的探索。
一、以实用性为原则构建课程内容主体框架
《商务定量分析》课程教学目的在于从实用性角度培养学生从事管理类岗位的基本职业素养和能力,因此课程内容也主要围绕企业经营管理活动相关内容而展开,内容涉及面较广,注重知识的应用,理论够用即可。因此课程多与实际经营活动中的案例相结合,通过实景式学习背景激发学生学习的热情,打破传统的统计学、运筹学只注重理论忽视应用的模式,让学生在学习的过程中能够切实感受到知识的实用性,从而产生浓厚的学习兴趣。
但是少部分学生也有继续深造研究的需要,因此对于这部分学生,可以在教师的指导下完成课程延伸知识的学习,完成下一步深造的知识储备。
二、多种教学手段相结合促进学生自主学习
引导学生自主学习、构建学习体系是“以学生为中心”的教学目的,因此教学目标设置、教学材料组织以及教学方法运用方面都应围绕该目的展开。
1.明确教学目标促进学生自主学习
根据学生的个体水平在每个知识模块中设置基本目标、提升目标以及晋级目标等三个等级的教学目标,三个学习目标的学习难度是逐渐增加的。教师在学生开始学习每个模块之前都会对该模块的三级学习目标做出提示,以便于学生在自主学习过程中参照三级学习目标进行有针对性地学习和训练,在模块的总结和复习中有目的的对学习内容进行回顾,满足不同基础的学生的学习要求。
2.基于基础理论应服务于知识的运用的原则设置教学内容
教学内容弱化传统教学中对于统计学、运筹学中定理、公式的推导过程而注重于数据分析方法的应用,相关理论做到够用即可。与此同时,通过教师对知识的进一步梳理,在传授知识的同时侧重于学生解决实际问题的能力,各模块的课后思考题和作业的设置既能够让学生牢固掌握基础理论知识同时又能够通过较为复杂的案例分析完成对基础知识应用能力的提升锻炼,这就要求教师在教育教学环节对各模块的知识体系做出详尽的分解,合理设计教学内容、教学环节。
3.丰富多样的教学材料拓展学生的专业知识
围绕学生的兴趣,从经济、生产、质量、物流、人力资源、财务等多方面丰富教学材料,让学生在阅读教学材料的同时对企业经营管理有宏观的认识,从学生个人的兴趣角度出发,有针对性地选择他们所感兴趣的专业知识进行深入的思考和探讨,告别传统教学中由一本教材贯穿整个课程的教学模式。这对教师的课程准备工作带来了新的挑战。
4.多种教学手段辅助教学过程
传统的教学往往是教师讲,学生听的模式。以学生为中心的教学中则可以采用小组讨论、辩论、案例讨论、角色扮演等多种以W生为主的教学手段,在教师的组织下完成学生通过自主学习就能够完成的内容,而教师在课堂上的讲授将主要围绕学生自主学习过程中遇到的难点问题给予及时的指导。其次,运用信息化手段将教学目标、教学材料、教学内容设计可以满足学生随时随地学习的愿望,是实现自主学习的必要支持手段。
5.重点强调计算机软件的使用技能
当今社会,计算机已成为人们工作中不可缺少的工具,在数据分析领域,计算机的作用更是重要。学生在校学习期间如果能掌握一到两种计算机分析软件,将会为他们未来的职业发展奠定良好的基础。因此在课程的教学过程中,避免了让学生进行长篇累牍的手工计算,取而代之的是常用的计算机软件完成复杂的数据处理和分析功能,如Microsoft Excel、SPSS等软件的学习都能够起到让学生开阔视野的作用。而且当今的学生具备很强的自学能力,他们完全可以在教师的指引下,通过教学材料的自学、网络搜索、讨论学习等手段初步掌握这些软件的使用。
三、合理的学习效果评价及时反馈教学效果
根据各个学习模块的不同特点设定合理的学习效果评价体系,一方面为学生自测学习效果提供了依据,另一方面为教师进一步改进教学方法提供了依据,是学生学习过程的重要组成部分。在教学组织过程中要注意学习效果的及时反馈才能起到应有的效果。学习效果评价机制可以采用学生自主测评、师生互评、生生互评等多种渠道展开,通过学习过程中的反馈、案例讨论报告、随堂测试、学生自主学习汇报等多种手段实施,其目的都是掌握学生自主学习的动态,及时地纠正偏差。
教师们经常感叹现在的大学生与以往的大学生不一样了,那是因为环境在变化,学生也在变化,因此教育教学手段和方法也要随之而改变,其目的都是为了更好地培养培养具备创新意识的现代人才,因此“以学生为中心”的教育教学改革在大学教育中任重而道远,值得我们不断地深入挖掘教育的潜力。
1 嗜热微生物
1.1 嗜热微生物的定义及分布
嗜热微生物也被称为嗜热菌或者高温菌。嗜热微生物主要分布于温泉、堆肥、煤堆、有机物堆、强烈太阳辐射加热的地面、地热区土壤以及陆地和海底火山口等高温环境[2]。
1.2 嗜热微生物的分类
嗜热微生物分为耐热菌、兼性嗜热菌、专性嗜热菌、极端嗜热菌、超嗜热菌,根据嗜热微生物对高温环境的耐受程度不同,学者们作如下的区分(表1)。
1.3 嗜热微生物的应用
1.3.1 嗜热酶及超级嗜热酶 嗜热酶(55~80 ℃)和超级嗜热酶(80~113 ℃)具有与普通化学催化剂不同的高催化效率、很强的底物专一性、在高温条件下稳定性良好等优点。这些酶在食品工业、造纸工业、烟草业、石油开采、医药工业、环境保护、液体燃料的开采、能源利用等领域中具有广阔的应用前景。
1.3.2 抗生素 嗜热微生物生活在高温环境中,能够产生多种特殊的代谢产物,其中有一部分是抗生素类,为目前抗生素的开发和生产提供了新的思路,有较大的应用前景。
1.3.3 嗜热微生物菌体及其它活性物质 嗜热微生物菌体可直接用于工业生产,同时嗜热微生物在高温的条件下还会产生维生素等物质。
2 嗜冷微生物
2.1 嗜冷微生物的定义
嗜冷微生物是适应低温环境生活的一类极端微生物[3]。
2.2 嗜冷微生物的分类
嗜冷微生物分为专性嗜冷菌、兼性嗜冷菌、极端嗜冷菌、耐冷菌,根据嗜冷微生物对低温环境的耐受程度不同,学者们作如下的区分(表2)。
2.3 嗜冷微生物的应用
2.3.1 环境保护方面 通过嗜冷微生物产生的冷适应酶来实现低温下的污染物生物降解。
2.3.2 食品方面 嗜冷微生物常用于牛奶加工业、果汁提取工艺、肉类加工业、烘培面包工艺、乳酪制造业等食品制作方面。
2.3.3 生物技术方面 嗜冷微生物也用于生物降解或生物催化。混合培养的专一嗜冷微生物在污染环境中扩增和接种产生的酶可提高不耐火化学药品的降解能力。由于嗜冷微生物的特殊蛋白质结构,嗜冷微生物在生物催化方向上具有更大的优越性和更好的应用前景。
3 嗜酸微生物
3.1 嗜酸微生物的分布及定义
自然界存在许多强酸环境,如废煤堆及其排出水、酸性温泉、废铜矿、生物沥滤堆及酸性土壤等。其中,许多微生物的代谢活动也会产生酸性环境。生长在酸性环境中的微生物被称为嗜酸微生物[4]。
3.2 嗜酸微生物的分类
嗜酸微生物分为嗜酸型、耐酸型、极端嗜酸微生物,根据嗜酸微生物对酸性环境的耐受程度不同,学者们作如下的区分(表3)。
3.3 嗜酸微生物的应用
3.3.1 在冶金方面的应用 冶金方面利用嗜酸微生物是将贫矿和尾矿中金属溶出并回收,即我们常说的生物湿法冶金。 []
3.3.2 环境保护应用 利用嗜酸微生物处理重金属,去除率可达到80%以上,而且处理成本比传统方法要降低很多。
3.3.3 能源应用 利用嗜酸微生物为催化剂,可以构建成为微生物燃料电池。
4 嗜碱微生物
4.1 嗜碱微生物的定义
一般把最适生长pH值在9.0以上的微生物称嗜碱微生物[5],其所耐pH值可高达10~12。到目前为止,嗜碱微生物还没有确切的定义。
4.2 嗜碱微生物的分类
嗜碱微生物分为嗜碱菌、耐碱菌、专性嗜碱菌、兼性嗜碱菌,根据嗜碱微生物对碱性环境的耐受程度不同,学者们作如下的区分(表4)。
4.3 嗜碱微生物的应用
4.3.1 发酵工业 嗜碱微生物可以作为许多酶制剂的生产菌。如洗涤剂酶和环糊精的生产都是利用嗜碱微生物的胞外酶获得的。
4.3.2 造纸工业 嗜碱微生物被应用于革脱脂、造纸木浆脱脂等。
4.3.3 其他方面 嗜碱微生物和碱性纤维素酶在碱性废水处理、化妆品、皮革和食品等方面也具有独特用途。在环境保护方面嗜碱微生物可发挥巨大作用;碱性淀粉酶可用于纺织品退浆及淀粉作粘接剂时的粘度调节剂;用于皮革工业中的脱毛工艺以提高脱毛效率和质量,利用嗜碱微生物进行苎麻脱胶。
5 嗜盐微生物
5.1 嗜盐微生物的分布及定义
在自然界中,有许多含有高浓度盐分的环境,如美国犹他大盐湖(盐度为2.2 %)、着名的死海(盐度为2.5%)、里海(盐度为1.7%)、海湾和沿海的礁石池塘等。在这些高盐环境中仍然存在许多抗高渗透压微生物,即嗜盐微生物。
5.2 嗜盐微生物的分类
嗜盐微生物分为弱嗜盐微生物、中度嗜盐微生物、极端嗜盐微生物,各自最适生长盐浓度如表5。
5.3 嗜盐微生物的应用
利用菌体发酵,可生产高聚化合物。除去工业废水中的磷酸盐,用于开发盐碱、生产嗜盐酶。嗜盐古菌和紫膜蛋白能通过构型的改变储存信息,可作为生物计算机芯片的新材料,还可用于高盐污水的处理。
6 嗜压微生物
6.1 嗜压微生物的定义
需要高压才能良好生长的微生物称嗜压微生物。最适生长压力为正常压力,但能耐受高压的微生物被称为耐压微生物。
6.2 嗜压微生物的分类
嗜压微生物分为耐压菌、嗜压菌、极端嗜压菌,各自的最低生长压、最适生长压、最高生长压如表6。
6.3 嗜压微生物的应用
关键词:微生物发酵;发酵饲料;生产菌种
中图分类号:S816.6文献标识码:A文章编号:1674-9944(2012)11-0265-02
1引言
20世纪 50 年代之前,人们一直都被动物的生产问题所困扰,纷纷试着寻找其他途径来解决这个难题。而在50年代时,人们发现如果动物食用加有抗生素的口粮,则可明显提高其产量。此项发现对畜牧业的发展做出了重要贡献。然而,随着时间的推移,添加抗生素这一举措带来的危害日益显现且逐渐加重,受到社会各界的重视。2004年,三大组织包括WTO、联合国粮农组织和世界动物卫生组织联合召开专题讨论会,讨论了非人用抗生素的使用和抗生素的耐药性问题.[1]。人们开始试着探索其他的方法或物质来替代抗生素的使用,以保证不影响畜牧业生产的效率与效益。近年来,随着生命科学的兴起,利用生物技术,特别是微生物发酵技术来实现新型优质饲料资源和新型添加剂受到广泛关注。
由于我国是人口大国,饲料和粮食的缺少便是最难通过的一关,而其生产也是我国国民经济的薄弱环节。整体来看,我国人均占有粮食为 400 kg 以下,在这之中,总产量的40%左右都用于饲料生产。从长远来看,牲畜与人争粮问题仍然是我国不能掉以轻心的大事,这是由我国国情及粮情所决定的.[2]。因此,迅速高效发展高效饲料工业,生产生态健康型饲料刻不容缓。
2微生物发酵饲料的一般概念
2.1微生物发酵饲料的定义
虽然发酵现象几乎和地球同时诞生,但只是在近200年人们才对其本质有了一定的了解。发酵在英语中为“fermentation”,由拉丁语“ferver”派生而来,原意是翻涌,就是看到了发酵现象。许多现代化发酵工业的建立是近10年的事情.[3]。发酵饲料定义为:在人工控制条件下,微生物通过自身的代谢活动,将植物性、动物性和矿物性物质中的抗营养因子分解或转化,产生更能被畜禽采食、消化、吸收且无毒害作用的饲料原料.[4]。实验证明:饲料经过发酵处理,可以提高其营养吸收水平,降解其原料中可能存在的毒素,且促进生长、维持动物体内微生态平衡、增强机体免疫力、防病治病等这些作用也可以得到体现。
2.2微生物发酵饲料的主要特征
天然微生物发酵饲料味道很香,具有不错的诱食效果,能明显提高动物的适口性。其次有益菌数量极多,而有害菌(例如大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)数量极低,不超过 10cfu/g,并且发酵成品的pH值在 4.5 左右,较低,含有较多的乳酸和乙酸。
3微生物发酵饲料的种类
依据含水量的多少可将微生物发酵饲料分为液体发酵饲料和固体发酵饲料两类。液体发酵饲料国外使用较多,普遍采用饲料中天然存在的乳酸菌、酵母菌发酵;而国内普遍使用微生物发酵剂或菌种,使用固体发酵饲料技术.[5]。
关键词:农药;土壤污染;微生物;修复
农药,作为人类文明进步的产物,为解决人类温饱、增强社会稳定、促进社会发展做出了贡献,对人类健康起到了积极作用。尤其是20世纪三四十年代,有机农药的成功发现和生产,为控制害虫的危害提供了有效的手段。然而,从现阶段看,农药的使用已不可避免,为了人类更加健康安全地生存,了解、避免、减缓和解决这一越发严重的问题,有必要和必须探索和研究农药的环境污染机理。
1 概述
1.1 农药的定义
农药广义的定义是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草和其他有害生物以及有目的地调节植物、昆虫生长的化学合成或者来源于生物、其他天然物质的一种物质或者几种物质的混合物及其制剂。是指在农业生产中,为保障、促进植物和农作物的成长,所施用的杀虫、杀菌、杀灭有害动物(或杂草)的一类药物统称。特指在农业上用于防治病虫以及调节植物生长、除草等药剂。
1.2 农药的毒性
农药对人体的危害主要表现为急性毒性和慢性毒性。农药经口、吸呼道或接触而大量进入人体内,在短时间内表现出的急性病理反应为急性中毒。急性中毒往往导致神经麻痹乃至死亡,甚至造成大面积死亡,成为最明显的农药危害。据世界卫生组织和联合国环境署报告,全世界每年有300多万人农药中毒,其中20万人死亡。时至今日,由于农药在各方面的广泛应用,任何一个生活在现代生活中的人都不可能避免每天接触很低浓度的各种不同种类的农药,或是通过食物,或是通过饮水。由此所产生的可能对人体健康的危害属于连续的低水平暴露,这是一种潜在的慢性毒性效应。
1.3 农药对土壤的污染
土壤是污染物的汇也是污染物的源。农药土壤污染是农药污染最典型的例子之一。农药的理化特性决定了它在土壤中的分布、降解速率及对环境的影响。农药在土壤中经土壤微生物作用,可以迁移、转化直至矿化。土壤污染了,土壤上所生长的作物和所结的果实也会吸收污染空气。一种简单的植物物种,吸收也是多种多样的,植物根系可以吸收土壤溶液中的农药,土壤中固体颗粒也能吸收土壤溶液中的农药。有些农药易挥发,植物的叶子可以吸收空气中的农药蒸气;而根又能吸收土壤中的农药,再从叶面上蒸发出它,过程相当复杂。植物根茎叶吸收农药后,继而在植物体内提升,最后可残留在植物体内,人们摄入该植物可直接摄入农药。
2 农药在土壤中的环境行为与降解机理
2.1 农药在土壤环境中的滞留、迁移
一般而言,如果农药能被强烈地吸附,则它们就容易滞留在土壤的固相,不易进一步造成对周围环境的污染;反之,就容易发生迁移,如被淋溶进入地下水而造成污染。农药滞留、迁移的物理化学原理有:表面功能基团;表面配合物;表面吸附。
2.2 农药在土壤中的水解作用
农药的水解是农药分子与水分子发生相互作用的过程,它是农药在环境中迁移转化的一个重要途径。水解反应是许多农药如有机磷、菊酯、氨基甲酸酯及羧酸脂等降解的主要步骤,与农药在环境中尤其是在水体中的持久性是密切相关的,是影响农药在环境中归宿机制的主要判据之一,也是评价农药在水中残留特性的重要指标。研究农药在环境系统中的水解,尤其是一些有机磷酸脂类杀虫剂、磺酰脲类除草剂水解反应是其在环境中降解转化的初始步骤,对于了解这些农药在环境系统中的归宿机制、残留特性及其对靶标与非靶标生物的毒理效应具有重要意义。
2.3 农药在环境中的光降解
农药可以吸收一定的光能量或光量子,发生光物理和光化学反应。光物理反应包括辐射能以光、热等能量形式吸收或释放,但农药分子形态没有变化;而光化学反应则是通过农药分子的异构化、键断裂、分子重排或分子间反应生成新的化合物。环境中农药的光化学反应可在气相、水相、固相中发生。尽管评价农药在环境中迁移、转化行为时,有一些农药光化学降解可以忽视,但许多农药的光降解还是其在环境中主要的降解途径之一。农药光解释农药真正的分解过程,它不可逆地改变了反应分子,强烈影响着某些农药在环境中的趋势。因此研究农药的光化学降解具有非常重要的意义。
3 农药污染土壤的生物修复技术
微生物修复技术是利用微生物的生命代谢活动对有机农药的降解作用使受污染土壤恢复到健康状态。所利用的微生物主要有土著微生物、外来微生物和基因工程菌3种类型。微生物修复技术可分为原位修复、现场修复和异位修复,其中原位修复不仅操作简单、成本低,而且不破坏植物生长所需要的土壤环境,污染物氧化安全,无二次污染,处理效果好,是一种高效、经济和生态可承受的环保技术。
微生物降解农药有2种方式:一是微生物直接作用于农药,以农药成分作为唯一的碳源或氮源、磷源,通过酶促反应降解农药;另一种是将农药与其它有机质进行共代谢。微生物修复与植物修复不同,通常一种微生物能降解多种农药,
如假单胞杆菌可降解DDT、艾氏剂、毒杀酚和敌敌畏等。另外,微生物也可通过改变土壤的环境理化特征降低农药有效性,从而间接起到修复污染土壤的作用。如:刘宪华等人用假单胞菌AEBL3降解呋喃丹污染,结果发现未加菌土壤呋喃丹在0 ~7cm土层中含量已达90mg/kg,加菌土壤呋喃丹含量为48mg/kg,后者降解率达96.4%。
现今微生物修复农药污染已进入基因水平,通过基因重组、构建基因工程菌来提高微生物降解农药的能力。目前对微生物修复技术的研究已相当成熟。世界各国的科研工作者分离筛选了大量的降解性微生物,利用基因工程技术,人们按照需要构建具有特殊功能、降解效率高、降解范围广和表达稳定的新菌株。有微生物原位修复技术的构成提高修复效果的技术措施的成功例子,但存在的问题也非常突出。首先,虽然已经筛选到许多有机农药降解菌,但高效菌种不多;其次,降解菌的降解谱不够广,不能完全代谢有机农药中各组分;另外,许多实验室得到的高效降解菌在实际应用中效率不高,修复效果不理想。为此,有机农药高效降解菌的筛选及降解效果的改良是环境科学工作者的研究热点课题。基因工程菌用于污染物处理的研究成果令人鼓舞,发展潜力很大。但是,基因工程菌的应用研究尚停留在实验室水平,真正投入污染物处理的还很少,而且基因工程菌在实际应用中存在一些问题,主要包括基因工程菌构建的技术问题和应用的安全性问题。如今,微生物修复技术作为一种有效的环境治理措施, 在治理土壤污染方面的作用已越来越突出。
参考文献
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【关键词】宏基因组学;微生物群落;遗传物质;口腔
【中图分类号】Q781
【文献标志码】A
宏基因组学认为,生命研究的对象应是生物环境中全部微小生物的基因组,即特定环境下所有生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和不可培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌;因此,宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物群落研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。
利用宏基因组学技术研究口腔微生物,无需单一分离培养某一种类的微生物,即可直接在基因水平上研究口腔微生物,包括可培养和不可培养微生物。宏基因组学应用于口腔微生物的研究,主要包括两个方面:一方面进行微生物生态学研究,从整体微生物群落水平来研究口腔微生物,揭示口腔微生物群落多样性及其变化;另一方面是进行口腔微生物及其基因的研究,从中筛选到新的功能基因及其产物。通过这两方面的研究,较全面地了解口腔微生物的群落结构和功能基因组,为深入探索口腔微生物的代谢活动,最大限度地发掘口腔微生物资源提供可能。
1 宏基因组学的研究方法
宏基因组学是从特定环境中直接分离所有微生物的DNA,选择合适的载体用于克隆DN段,将DN段克隆到宿主细胞中进行表达,根据某些生物活或基因序列筛选有价值的克隆并进行其功能分析。
1.1宏基因组文库的构建
1.1.1环境微生物DNA的提取 环境样品DNA的提取是基因组文库构建中最重要的一步,不仅要尽可能地将环境中所有微生物的DNA提取出来,而且还要保证一定的DN段长度和完整性。根据提取样品总DNA前是否需要分离细胞,可将其提取方法分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可直接破碎样品中的微生物细胞而使其DNA得以释放。原位裂解法无需对样品微生物进行复苏,黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表微生物的多样性。由于原位裂解法所提取的DN段仅为1~50kb,故其通常用于构建小片段插入文库(以质粒或入噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后以较温和的方法抽提其DNA。此法提取可以获得长度为20~500kb的大片段DNA,而且纯度高,但却容易丢失微生物物种信息。该方法适用于构建大片段插入文库(以黏粒或细菌人工载体为载体)的DNA提取。
1.1.2载体选择 目的基因能否有效地转入宿主细胞并在其中高表达,在很大程度上取决于载体。通常用于DNA克隆的载体包括质粒、黏粒和细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome,BAC)等。质粒一般用于克隆小于10kb的DN段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒又称柯斯质粒或柯斯载体,用于克隆大片段的DNA分子,其克隆外源DN段的极限高达350kb,远远超过质粒载体的克隆能力。BAC用于克隆150kb左右大小的DN段,最多可保存300kb个碱基对,转化率高,而且其以环状结构存在于细菌体内,易于分辨和分离纯化。另外,构建能容纳40kb外源DNA插入片段的fosmid文库也有报道。
1.1.3宿主选择 目前,常用的宿主主要有大肠埃希菌以及链霉菌属或假单胞菌属。一些缺陷型突变体细菌也可以作为宿主进行宏基因组文库的功能筛选。宿主的选择主要应考虑其转化率和宏基因表达以及重组载体在宿主细胞中的稳定性和目标性状的筛选等。对于任何宏基因组来源的基因来说,大肠埃希菌依然是最理想的克隆和表达宿主。也可以用其他宿主菌,例如被用来鉴定与新抗生素生物合成相关基因的浅青紫链霉菌和一些革兰阴性细菌。也可以用穿梭黏粒或BAC载体将构建于大肠埃希菌的文库转入其他宿主,如链霉菌属或假单胞菌属中。根据不同微生物产生活性物质的差异和研究目标的不同,选择不同的宿主。随着技术的成熟和新宿主的选择,基因筛选率和功能基因检测率得以提高,进而宏基因组文库的目标基因的表达也得以提高。
1.2宏基因组文库的筛选
根据研究目的,宏基因组文库的筛选通常有功能筛选和序列筛选两种方法。功能筛选最常用方法是根据重组克隆产生一些酶蛋白功能活性,采用各种检测手段,挑选活性克隆子,得到完整的功能基因和带有目的基因的基因簇,发现全新的基因或活性物质。功能筛选首先要求功能基因或带有目的的基因簇在宿主中表达,但因其受到检测手段的限制,往往是在数千个甚至数百万个重组克隆子中才能检测到有用的活性克隆。序列筛选是依赖于目的基因的保守DNA序列,以序列相似性为基础,执行某类功能的酶可能具有相似的基因序列,根据已有的序列信息设计引物,进行PCR扩增或杂交筛选阳性克隆子。序列筛选一般只能获得结构基因的片段,而不能获得完整的功能基因;但是,它可以将扩增产物进行标志并将其作为探针筛选宏基因文库,以获得完整的功能基因。用这种方法有可能筛选到某一类结构或功能的蛋白质中的新分子。
宏基因组文库的筛选除了功能筛选和序列筛选法外,还可以采用底物诱导基因表达法(sub-strate-induced gene expression,SIGEX)。SIGEX是以代谢相关基因或酶基因往往有底物存在的条件下才表达,反之则不表达的原理来筛选目的代谢基因的。SIGEX的优点在于它为高通量筛选提供了保障,而且不需要对底物进行修饰。
2 宏基因组学在口腔微生物研究领域中的应用
2.1口腔微生物群落结构分析
口腔是一个由大量微生物组成的复杂的生态系统,人类口腔中寄居着大约700多种细菌。人类口腔适宜的温度、湿度,丰富的营养来源,结构的复杂性和理化性质的不同,为口腔内各种微生物的生长、繁殖和定居提供了非常适宜的环境,因而也就造就了口腔微生物群的多样性。口腔微生物大部分可以相互关联并形成生物膜,抵抗机械清除力或抗生素治疗,但是在环境变化或其他口腔情况(如个人口腔卫生质量)变化触发时,它们也可成为致病微生物。
菌斑指示剂和传统培养方法以及常规的PCR特异性扩增的分子生物学方法在某种程度上都不能完整地反映整个微生物群落的组成和动态变化,不适合用其研究复杂的口腔微生物群落。此外,在难培养或不可培养的微生物当中,可能也有致病菌匿藏其中,因而也不能有效地用其研究与病程相关的微生物。
随着分子生物学和分子遗传学技术的发展,在基因组学的基础上诞生了宏基因组学这一门崭新的交叉学科。宏基因组学是继发明显微镜以来研究微生物最重要的进展,将为微生物世界带来革命性的突破。Turnbaugh等利用16S rRNA基因测序发现:胖人和瘦人的内脏中有着不同的微生物菌群;当胖人减肥的时候,他们内脏中的细菌群基因也同样发生变化,更加接近瘦人内脏中的细菌群。
基于常规的口腔细菌培养方法和细胞学显微镜检查,目前公认变异链球菌和乳酸杆菌等是引起龋病的主要致病菌;但是,随着宏基因组学在微生物的种类和多样性研究中的应用,有关龋病是由单一细菌引起或是由生物膜中的多种细菌引起的定论面临质疑。目前普遍认为,龋病并不是仅由变异链球菌或其他任何一种菌斑中的细菌单独引起的,而是由各种产酸菌相互作用的结果。
Aas等在对51名龋患者的1285个菌斑细菌的16S rRNA序列进行分析后发现,50%的细菌不能识别,一些新的细菌菌种与龋病的发生有关。Keijser等在用焦磷酸测序法分析健康人涎液和牙菌斑中细菌群时发现,口腔微生物具有多样性。即他们从98名健康成人口腔中取得的牙菌斑就由1万个微生物表型组成,其种族数远远超过之前报道的通过培养或者传统克隆和测序技术定义的700种口腔微生物表型。
Zaura等在利用焦磷酸测序技术检测了3名健康高加索人口腔内5个部位的微生物组后发现,在健康人的口腔中微生物有3600种独特物序列,超过500种不同的分类单元或“物种级”表型和88~104种高级分类群,每个单独的样品平均藏匿有266种分类单元。从这3名个体微生物组的测序结果分析可知,高级分类群、分类单元和独特序列都有一个较大的重叠,即84%的高级分类群、75%的分类单元和65%的独特序列至少在这3个微生物组中的2个组中存在。这3名个体的总共6315个独特序列中有1660个相同序列,这1660个相同序列,即“核心微生物组”贡献了66%的测序内容,重叠的分类单元贡献了94%的内容,而几乎所有的内容(99.8%)都属于共享的高级分类群。
研究证实,在不同的健康人的口腔微生物中,大部分微生物组是相同的,提示可能存在健康口腔核心微生物组。Kanasi等在对80名患龋和无龋婴幼儿牙菌斑微生物的16S rRNA序列克隆分析中发现,两者之间存在着139种不同微生物。Gross等通过酶促法测序技术对无龋和患龋年轻恒牙牙菌斑微生物的16S rRNA序列进行分析后认为,龋齿中产酸菌除了变异链球菌和乳酸杆菌外,月形单胞菌、奈瑟菌和缓症链球菌同样是潜在的产酸细菌。Willner等等在利用高通量测序技术检测了19名健康人口腔咽部的病毒宏基因组序列后发现,口腔咽部是一个潜在的被噬菌体T3侵蚀的肠道菌储存库。另外,他们还发现了编码血小板凝集因子PblA和PblB的两个寄生于变异链球菌中的噬菌体sm-1基因,而之前有研究称在心内膜上发现了变异链球菌。这说明,口腔中的病毒与心脏疾病存在潜在的联系。
宏基因组学技术可以避开传统的培养方法,在DNA水平来探讨口腔微生物群落结构及其与环境微生物的关系。微生物多样性在基因水平上主要表现为基因组大小和基因数目的多样性,遗传物质化学组成的多样性和某些特异性序列的差异。宏基因组技术为研究口腔微生物复杂群落和多样性提供了重要的技术手段,通过快速可靠地获得口腔微生物中各种微生物的菌落指纹和特征性核苷酸序列,以系统分析口腔微生物的多样性及其分类地位,发掘丰富的口腔微生物资源。
2.2口腔微生物宏基因组文库中的新型基因筛选及其功能
宏基因组学除了研究微生物群落结构及其功能外,还可用于发现新的基因和开发新的微生物活性物质。Jiang等构建土壤宏基因文库,成功地克隆和鉴定出一种新型的β-葡萄糖苷酶基因,该基因包含一个由151个氨基酸编码组成的多肽。该研究对深入挖掘土壤未培养微生物的β-葡萄糖苷酶基因资源和该基因功能具有的重要意义。陈春岚等从富集培养物宏基因组文库中筛选出一个表达木聚糖酶基因umxyn10B,该基因大小为999bp,编码产物的氨基酸序列具有较好的同源性。对其功能进行研究发现,该酶具有优良的理化特性,可广泛应用于食品、能源、造纸和纺织等行业。Yu等利用宏基因功能筛选发现的两个新型低温活性酶脂EstM-N1和EstM-N2,属于细菌脂肪分解酶Ⅷ家族成员。这一发现将推动生物催化剂的应用。
当前,宏基因组学技术已经在微生物学研究的诸多领域,尤其是在发现具有潜在应用价值的次生代谢产物方面显示出了无穷的魅力,但是,利用宏基因组技术探索口腔微生物的新的功能基因尚处于起步阶段。Warburton等对口腔细菌群体中的耐药基因进行了分析,结果发现一个新的耐四环素基因tet32能够使四环素失活。虽然对口腔微生物新的功能基因及其功能研究还太少,但依然可以借助宏基因组学技术发掘新基因,以利用这些新基因在口腔医学行业发挥应有的作用。
关键词:植物-微生物联合修复;重金属污染;底泥/土壤
中图分类号 X53;X820.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731(2016)06-83-04
The Research Progress on Plant-microorganism Combined Remediation of Heavy Metals-contaminated Soil & Sediments
Wen Xiaofeng1 et al.
(1School of Hydraulic Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha 410004,China)
Abstract:As a kind of persistent toxic,heavy metals pollution has caused a high degree of attention recently in China.As a green technology,plant-microorganism combined remediation are increasingly mature on its application in the oil pollution of soil,so appllying to the restoration of sediment/soil heavy metal pollution has been gradually carried out.This article summarizes the current situation of sediment/soil heavy metal pollution,the processing method and so on.Also the definition,principle about the plant-microorganism combined remediation was expatiated,and the different forms of plant-microorganism combined remediation on plant-microbial was described.Finally,the application foreground of the plant-microorganism combined remediation in sediment/soil heavy metal pollution repair was prospected.
Key words:Plant-microorganism combined remediation;Heavy metals pollution;Sediments & Soils
重金属(Heavy metals)一般是指密度大于5g/cm3,超过一定量后对生物具有明显毒性的金属或者类金属元素,如镉、铬、锌、铜、铅、汞、砷等[1]。这些(类)金属元素及其化合物在环境中只是发生形态或者价态的变化,难以被降解,属于持久性的累积性毒物,对人类有着潜在长久的危害[2]。底泥、土壤是众多底栖生物、陆生生物的栖息觅食生活场所,在底泥/土壤中累积的重金属会通过食物链的放大,最终进入人体,使得人体内的重金属含量逐渐增多,从而出现慢性中毒,对人类的健康造成长久且不可挽回的损害[3]。因此,对底泥/土壤中重金属污染的治理研究有着重要的意义。中国对重金属污染底泥/土壤的治理始于20世纪70年代,对重金属污染底泥/土壤的处理机理分为固定、活化2种,前者降低底泥/土壤中重金属离子的有效性,使其沉淀化从而降低其生物有效性,降低对植物的毒害,后者通过一系列措施提高重金属的生物有效性,再通过植物、微生物等吸附提取从底泥/土壤中去除[4]。目前用于处理重金属污染底泥/土壤的方法可分为原位修复(In-situ Remediation)与异位修复(Ex-situ Remediation)。物理修复法见效快,但工程量大,耗财耗力,且通过物理修复后均难以使底泥/土壤达到要求的标准;化学修复法能在短时间内大幅度去除底泥/土壤中的重金属,但去除一般都不彻底,且治理成本高,人力物力耗费较多,易造成二次污染,化学药剂也会对水生/陆生生态系统构成潜在的威胁[5]。植物-微生物联合修复在进入21世纪后得到了快速发展,近年来由于其在富营养化污废水、石油污染水体/土壤中的良好治理效果而引起了高度关注[6],在重金属污染底泥/土壤的处理中极具潜力,是今后治理重金属污染底泥/土壤着重研究发展的方向。
1 植物-微生物联合修复的定义及原理
植物-微生物联合修复属于生物修复,它通过建立植物-微生物共生体系,通过微生物加强植物富集、固定底泥/土壤中重金属的能力,利用植物-微生物共生体系富集、固定底泥/土壤中的污染物[7]。微生物强化植物修复主要是强化植物富集、固定能力,主要表现在2个方面[8]:(1)活化或固定底泥/土壤中重金属;(2)促进植物生长。用于重金属污染修复的植物-微生物联合修复中的植物与微生物两者是互惠互利的关系,土壤-微生物共存环境中,底泥/土壤中附着在根际的微生物能将土壤有机质、植物根系分泌物转化成自身可吸收的小分子物质,同时通过分泌有机酸、铁载体等螯合物质改变底泥/土壤中重金属的赋存状态或者氧化还原状态,降低重金属的毒性,增加重金属的生物有效性,减少重金属对植物本身的毒害,有利于植物对重金属的吸收、转移、富集,从而增加了累积植物重金属的生长量、富集量[8-9]。体外微生物对土壤中Fe、Mn氧化物进行还原,解析出其中的重金属,也可将硫等氧化成硫酸盐,降低土壤的pH值,进而增加了重金属的活性,转换成易于被植物吸收的形态;活动于植物体内的根内菌则通过分泌一定量的生长促生剂促进宿主植物生长,进而增加宿主植物对重金属的富集量,有利于植物对底泥/土壤中重金属的吸收[6,10]。而植物对微生物修复的强化则体现在植物根际分泌物上,根际的分泌物对根际微生物起着很关键的作用,根系分泌物数量丰富,一般包括糖、蛋白质、氨基酸、有机酸、酚类等,其中有机酸通过螯合、活化作用改变土壤中的重金属化学行为、生态行为,进而改变重金属对植物、微生物生物有效性、毒性[11]。同时,蛋白质、糖等有机质分泌物可以作为根际微生物的营养、能源来源,大大提高了根际微生物的活性,根际微生物活性的增加又反过来作用于植物根际,影响了根的代谢活动和细胞膜的膜透性,并改变了根际养分的生物有效性,促进了根际分泌物的释放[12]。植物-微生物二者的联合对植物、微生物修复法各自处理底泥/土壤中的重金属起到了强化作用,提高了对底泥/土壤中重金属的处理效率,在处理重金属污染底泥/土壤中有着很大的潜力[13]。
2 植物-微生物联合修复技术的几种形式
2.1 植物-土著优势菌联合修复 随着底泥/土壤中重金属污染的加重,某些微生物能对重金属表现出耐受性,从污染底泥/土壤中分离出来的此类微生物即为土著优势菌种[14]。真菌、细菌、放线菌是底泥/土壤中分布广、生物量大的微生物,表面积/体积比很大,表面附着的羧基、磷酰基、羟基等负电荷的功能基团使得它们对重金属阳离子有着很强的吸附作用[15]。土著优势菌强化植物富集重金属的机制主要表现在以下几个方面[16]:(1)微生物分泌胞外聚合物与重金属离子络合解毒,降低重金属毒性;(2)分泌的酸类对重金属起到活化作用,提高重金属的生物有效性,增强了植物对重金属的富集能力;(3)微生物对土壤中金属离子进行氧化还原及甲基化作用,从而对重金属离子产生作用,将重金属转化为低毒、无毒的形式。陈文清等[17]利用盆栽实验研究了鱼腥草与内源根际微生物联合修复镉污染土壤,发现在土壤镉浓度为5mg/kg、10mg/kg时,鱼腥草的富集率分别为2.86%、1.63%,吸收量最高可达培养前自身镉浓度的200倍(种植前鱼腥草镉含量0.114 6mg/kg,富集后最高达24.44mg/kg),根际的细菌、霉菌耐性较弱,培养初期放线菌对镉耐性很强,较高浓度镉可能刺激了放线菌的大量生长,在两者联合下,土壤微生态系统能够保持较好的稳定性。高亚洁等[18]利用草本植物紫花苜蓿-土著微生物对重金属污染的河道底泥进行修复,在经过6个月的PVC箱培养后,底泥中的Ni、Cu、Pb、Cr、Mn、Zn都得到了一定的去除,Ni、Cu、Pb、Cr、Zn均累积在紫花苜蓿根部,其中对Zn的总累积量最大,而Mn则在紫花苜蓿叶片中累积最多,占植物中总累积量的42.47%,而根际微生物也对植物修复起了辅助强化作用,其中的Cu与细菌总数有着相关系数为0.90的相关关系。
2.2 植物-根际菌根真菌联合修复 菌根是一个微生物团,主要包括真菌、放线菌、固氮菌,是在植物根际发现的有助于植物生长的菌丝团,是土壤中的微生物与根系形成的联合体[19-20]。菌根表面微生物形成的菌丝大幅度增加了根系吸收面积,而菌根真菌是处理重金属的主要部分,真菌的酸溶、酶解能力使得它们能为植物提供了一部分营养物质,增加了植物的长势,同时改善根际土壤环境,增加了植物抗虫、抗逆的生存能力[21]。菌根真菌在自然界分布广泛,一般来说,重金属污染区域的菌根植物根际的真菌对重金属会有着强的耐受力,也可从未受重金属污染土壤中分离菌根真菌再进行筛选强化。李芳等[22]选了未受重金属污染的点柄粘盖牛肝菌、卷缘桩菇2种外生菌根真菌,研究二者对Pb、Zn、Cd的耐受性,发现卷缘桩菇比点柄粘盖牛肝菌更耐受Pb、Zn的毒害,点柄粘盖牛肝菌则对Cd有更强的耐受性。
2.3 植物-植物内生菌联合修复 植物内生菌(Endophytes)是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官体内或细胞间隙的真菌和细菌,被感染的宿主植物不表现或暂时不表现外在病症[23]。内生菌通过代谢作用利于宿主植物的生长和抗重金属毒性,可通过沉淀重金属离子、产有机酸和蛋白降低植物毒性、产生促进植物生长的植物激素、抗氧化系统抵御重金属毒性、增强植物对营养元素的吸收能力等来强化植物修复[24]。万勇等[25]通过在龙葵种子中接种来自龙葵的抗性内生菌(S.nematodiphila,LRE07)来处理污染土壤,对龙葵富集镉浓度没有显著影响,但极大地促进了植物的生长量,间接地提高了植物对镉的总富集量,在10μM镉浓度下,植株镉富集量比对照组增长了(72±5)%。Sheng等[26]将来自油菜根部的内生菌P.fluorescens G10、Microbacterium sp.G16接种于铅污染土壤,极大地提高了土壤中可溶态铅的含量,有利于植物对铅的富集吸收。Badu等[27]将从欧洲赤松根部内分离得到的抗性菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,GDB-1)接种于赤杨皮树苗体内,用以处理污染土壤,发现相对对照组赤杨皮树根部重金属浓度分别提高了154%(Ni)、135%(Cd)、120%(Zn)、117%(Pb)、114%(Cu)、113%(As),茎部重金属浓度分别提高了175%(Ni)、160%(Cd)、137%(Zn)、137%(Pb)、161.1%(Cu)、110.1%(As)。
2.4 植物-其他微生物联合修复 除了以上3类联合,可以和植物联合修复底泥/土壤重金属污染的微生物还包括产酸微生物、基因工程菌等。杨卓等[28]利用印度芥菜与能产生有机酸、柠檬酸的巨大芽孢杆菌-胶质芽孢杆菌、黑曲霉混合制剂来修复Cd、Pb、Zn污染的土壤,添加巨大芽孢杆菌-胶质芽孢杆菌混合制剂时,污染土壤中印度芥菜对Cd、Pb、Zn的提取量分别提高了1.18、1.54、0.85倍,污染底泥中印度芥菜对Cd、Pb、Zn的提取量分别提高了4.00、0.64、0.65倍;添加黑曲霉时,污染土壤中印度芥菜对Cd、Pb、Zn的提取量比对照提高了88.82%、129.04%、16.80%,污染底泥中印度芥菜对Cd、Pb、Zn的提取量比对照提高了78.95%、113.63%、33.85%。在基因工程菌的研发方面,Lodewyckx等[29]将植物内生菌的抗性基因ncc-nre耐镍系统接种到Burkholderia cepacia L.S.2.4,再将B.cepacia L.S.2.4接种到羽扇豆(Lupinus luteus),发现根部的镍浓度比对照提高了30%。
3 研究展望
植物-微生物联合修复技术中能用于单一重金属或有机物污染底泥/土壤的植物修复相对较多,多种重金属和重金属与有机物的复合污染的植物修复则相对较少。目前已发现的重金属超积累植物大都为单一重金属的超积累植物。超积累植物存在着个体矮小、生长缓慢、根系扩张深度有限、对重金属有选择性、从根部到茎叶的重金属转移率较低等缺陷。而微生物对影响生长代谢的生物因子均有一定的耐受范围,超出范围微生物易死亡或休眠,因此在联合修复中还应根据微生物的需要,对环境因子做出相应的调整,使微生物的代谢活动处于最佳状态。
在实际利用植物-微生物联合修复重金属污染土壤时,“植物-微生物”联合体的选择至关重要。从目前来看,彻底解决底泥/土壤中的重金属污染问题还需要很长一段时间。为了加速改善这种状况,推进植物-微生物修复在重金属污染底泥/土壤实际修复中的应用,近期应该注重以下几个方面的深入研究:(1)对植物-微生物不同联合形式修复底泥/土壤中重金属吸收、转运、忍耐机制进行深入研究;(2)寻找能缩短修复周期、增强植物生长量、解决植物植株矮小等问题的手段;(3)针对超累积植物处理重金属种类单一的缺点,应加强对能同时修复多种重金属的陆生、水生、湿生植物品种的筛选培育;(4)利用基因工程、分子技术研制适用于植物微生物联合体系的微生物的筛选研发,同时加强对底泥/土壤中土著微生物方面的研究;(5)尽快探索出能解决接种微生物与土著微生物竞争及适应性问题的方案。
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关键词:微生物 壳聚糖酶 壳寡糖 发酵
中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:1672-5336(2014)10-0002-01
1973年,Monaghan等在研究细菌和真菌过程中,首次提出壳聚糖酶的概念。1992年壳聚糖酶被系统命名为EC3.2.1.132。2004年,国际酶委员对壳聚糖酶重新定义为:一类催化氨基葡萄糖间的β-1,4-糖苷键断裂,从而专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶,壳聚糖酶的发现可克服壳聚糖生产成本高和溶解性的缺陷,从而转化为溶解性更优越、溶液稳定性更强、生物活性更丰富的壳寡糖,这就成了现今研究的热点方向。作者结合近年来国内外壳聚糖酶的研究成果,综合分析了壳聚糖酶的分类、性质和制备方法等研究现状。
1 壳聚糖酶概述
壳聚糖酶目前有3种分类方法[3]:底物专一性差别和酶的产生特点。根据底物专一性差别,壳聚糖酶可以分为三类,第一类可以水解GlcN-GlcN键及GlcNAc-GlcN键;第二类只能水解GlcN-GlcN键;第三类既可水解GlcN-GlcN键,又可水解GlcN-GlcNAc键。根据酶的产生特点,可以将壳聚糖酶分为组成型和诱导型。
壳聚糖酶大部分为碱性蛋白,其最适pH值范围一般在4.0~8.0。酶的等电点(pI)变化范围大多集中在4.0~10.1。壳聚糖酶具有较好的热稳定性,最适反应温度在30~60℃。研究发现金属离子尤其是重金属离子对壳聚糖酶活性有不同程度的影响。大部分壳聚糖酶属于内切酶,降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物,壳聚糖酶在酶解过程中的活性是随着N-乙酰化度、N-取代基团及其不同取代位置以及均相和非均相反应体系而变化的。
2 壳聚糖酶的微生物制备方法
2.1 微生物液体发酵
目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶,因此当以壳聚糖作为唯一碳源时,微生物的产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。一般的液体发酵步骤是通过平板分离初筛和摇瓶培养复筛,从土壤中筛选出产壳聚糖酶菌株,然后经酶活力检测比较,挑选出产酶能力最强的菌株作为产酶试验菌。当然也可通过人工诱变处理来获得高产突变株,最常用的方法是化学法和物理法诱变,可采用单因子诱变处理和复合因子处理。目前对于壳聚糖酶的分离纯化方法主要有(NH4)2SO4分级盐析、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换、Sephacry S-100凝胶过滤分离等方法。酶活单位定义为每分钟催化生成相当于1μmol氨基葡萄糖的还原糖所需的酶量。测定壳聚糖酶最常用的方法是DNS法,此外还有粘度法快速测定法和铁氰化钾显色法。对已筛选出的产壳聚糖酶菌种的鉴定一般包括①形态学特征鉴定;②生理生化特性鉴定;③16S rDNA序列分析。由于壳聚糖酶的稳定性不高、寿命短、且无法循环使用,在生产中的应用受到了极大限制,但是通过固定化后上述缺点都可以解决。
2.2 丝状真菌固态发酵
工业上固态发酵是生产酶制剂的主要方式,对于菌丝体有利于保持其自然生理状态和生长,所用培养基和发酵条件更加低廉和简单,而且投资较少;纯化步骤少,产品纯度高,是丝状真菌的一种理想培养方法,糖化工业中以常见的根霉菌丝体替代纯壳聚糖为诱导原料。
2.3 基因工程育种
除了在自然界中继续筛选产酶活性较高的微生物菌种外,现在越来越多的研究人员利用基因工程通过对产壳聚糖酶菌株的基因分析,运用分子方法克隆并高效表达所选菌种的壳聚糖酶基因,以实现重组菌的壳聚糖酶高效表达,具体技术路线如下:根据所选菌株壳聚糖酶基因序列或参照其他菌株的壳聚糖酶基因序列PCR引物设计,引物合成提取所选菌株总DNAPCR扩增获得目的基因构建原核表达载体重组菌高效表达条件研究壳聚糖酶高效表达。
3 研究展望
继续筛选产酶活性较高的微生物菌种的过程中,要合理运用新的诱变方法或进行复合诱变,以减小菌种对诱变方法的抗性,从而获得高产菌株。另外,对发酵条件也要进行优化和改进,筛选出最佳产酶条件,以获得最大的产酶量。另一方面,应该紧跟国际前沿,进一步在分子水平上研究壳聚糖酶的分子结构和作用机制,以便更有效地克隆细菌壳聚糖酶基因,构建能高效表达壳聚糖酶的工程菌株,对酶分子进行定向修饰,从本质上提高壳聚糖酶的活性与稳定性,加速其应用的大规模实用化和产业化。
参考文献
[1]RL Monaghan, DE Eveleigh, RP Tewari. Chitosanase, a novel enzyme[J]. Nature New Biology, 1973,245(142):78-80.