单细胞研究精选(九篇)

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第1篇：单细胞研究范文

利用哺乳动物细胞大规模培养来生产重组蛋白技术已成为生物制药领域最重要的关键技术之一,并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言:蛋白治疗药物如糖蛋白,抗体和多肽药物仅仅只是开始进入市场,预计在下一个10 年或20 年会有一个更为快速的发展。蛋白治疗药物的迅速增长和市场需求已远远超过目前全世界的生产能力。

哺乳动物细胞大规模培养生产重组蛋白中，开始常用的细胞系有CHO和HEK293两大类细胞。使用较多的COS细胞，由于其强烈的贴壁作用，曾经限制了大规模悬浮细胞培养生产的实际应用。随着生物技术的发展，CHO细胞可以贴壁培养，也可以经过驯化悬浮培养，是生产包括基因工程抗体药物（人源化或人源抗体）在内的重组糖蛋白的首选工具细胞。HEK293细胞主要用于蛋白瞬时表达及腺病毒生产，尚未见以HEK293表达的药物获得批准。目前，正在进行大规模培养生产的研发中的哺乳动物细胞株还有猿细胞衍生的Vero，Vero细胞是依赖于贴壁培养的细胞，主要用于病毒疫苗的生产；SP2/0和NS0主要用于制备杂交瘤细胞，生产鼠单抗，也有用来生产人源化单抗的报道；以及人的胚胎干细胞等。

建立和优化高效的表达载体系统是重组蛋白在哺乳动物细胞生产的关键，是抗体产业化的前提和瓶颈，是提高重组蛋白在单细胞中的表达量的基础。人工构建的哺乳动物细胞表达载体为穿梭载体，含有原核基因序列：大肠杆菌复制子及抗生素抗性基因等，这样便于载体在原核细胞中扩增和大量制备。另外含有能使外源基因在哺乳动物细胞中有效转录的启动子和增强子元件，以及终止子和加polyA信号序列。目前常见的哺乳动物细胞表达系统主要有二氢叶酸还原酶基因扩增系统及GS基因拷贝扩增系统，但是这两种扩增系统所需时间为6~12个月，蛋白的表达不能在早期得以预测，是此表达系统的限速步骤。造成限速的原因是由于基因的沉默现象产生了特定基因的转录降低或取消。导致基因沉默的主要原因是目的基因所插入位点染色体的结构。异染色质区DNA较浓缩，转录不活跃，而常染色区较松驰，转录活跃。国外最近一直在发展一次性表达的技术，以此来达到提速和优化的目的，方式一是通过在转录水平及翻译水平的修饰改构，如MARS、STARS和UCOS等序列的添加；方式二是通过筛选标记基因的弱化来提高表达量；方式三是通过定点整合的方式来提高表达量。

在哺乳动物细胞大规模培养的工业化生产过程中，主要目的是提高产物的产量和质量。绝大数是在生物反应器中进行的哺乳动物单细胞培养都是悬浮式培养，具体来讲就是要提高细胞密度和产物浓度，降低培养基成本与过程运行成本，同时满足产品质量要求和安全性要求。当前动物细胞大规模培养研究主要集中在技术优化方面，包括发展高通量细胞克隆技术筛选高表达细胞株，进行细胞驯化改变细胞的生长方式及生长环境，针对特定细胞的营养需求进行培养基优化，针对特定细胞与产品的过程优化等，这些都是提高细胞密度与产物浓度的有力途径。以培养基是否添加血清成分，可以分为血清培养基和无血清培养基。血清的成分和作用复杂，同时存在价格昂贵、血清成分不明确、批间差异大、存在潜在污染等缺点，使培养过程具有不可控制性，同时血清的使用也给蛋白纯化带来困难。因此，尽管血清培养基适用于大多数细胞的培养，血清培养及动物来源成分培养已经逐渐被FDA等药物管理部门限制。无血清培养始于二十世纪六、七十年代，现已有各种商业化无血清培养基或针对特定细胞的工业用无血清培养基用于细胞的大规模培养。成分明确、无动物来源成分或无蛋白培养基用于工业生产可以有效降低培养及下游纯化成本、提高过程稳定性、同时避免了外源生物污染，更容易被FDA等药物监管部门批准。而化学成分明确的培养基更易于对细胞的营养需求进行研究，使得过程优化工作更加容易进行。因此无血清无动物来源成分或无蛋白培养基是大规模动物细胞培养的主要原料取向。细胞驯化的实质是对细胞进行条件筛选的过程，其目的是通过改变细胞的生长方式和生活环境以适应特定的工业化需要。根据不同需要可以对工程细胞进行各种驯化：如贴壁的CHO细胞有悬浮生长的倾向，可以进行由贴壁生长到悬浮生长的驯化，血清培养的细胞经过驯化可以无血清无蛋白培养，经过驯化工程细胞可以提高对NH4+等有毒代谢物的耐受力，延长培养维持时间，提高产物浓度。动物细胞培养的流加工艺从二十世纪九十年代开始，日趋成熟，其目的是为了避免培养过程中的营养限制和有毒副产品积累，使细胞生长的营养和理化环境尽可能长地保持稳定，提高细胞密度和维持时间，从而提高产物浓度。

目前世界上大约有60%以上的重组蛋白质药物的生产采用哺乳动物细胞培养技术。哺乳动物细胞制备的蛋白质药物质量高,它们与天然蛋白质具有相似的理化性质和生物学功能。随着对基因组学、蛋白质组学和代谢组学不断深入研究，人们对哺乳动物宿主细胞的生理、生化有了更深入的了解。通过对生产药用蛋白的哺乳动物工程细胞表达系统、培养、生产技术等关键环节上进行不断优化,从而达到高效、安全、经济生产模式的核心生产技术。

第2篇：单细胞研究范文

[关键词] 丹参酮ⅡA；肝癌细胞；HepG2；凋亡

[中图分类号] R735.7 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）08-0004-03

恶性肿瘤严重危害着人们的健康和生命。随着环境的恶化、人们工作生活压力的增加，恶性肿瘤的发病率逐年上升。恶性肿瘤的发病与细胞的增殖和凋亡异常有密切关系。肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其死亡率较高，仅次于胃癌[1]。临床上的治疗方法主要有手术、放疗和化疗，但每种治疗方法都有较大的不良反应。近年来生物疗法逐渐引起临床医生的重视，其具有副作用小、疗效高、避免正常细胞免受损伤的优势。丹参酮ⅡA可以增强细胞Caspase-3的活性，抑制细胞的癌基因的表达，从而诱导细胞凋亡[2]。目前国外有关丹参对肝癌HepG2细胞有抑制作用的报道屡见不鲜，但关于丹参酮ⅡA对肝癌HepG2细胞的作用的报道还比较少。本文主要是研究丹参酮ⅡA对肝癌HepG2细胞生长的抑制作用以及对其凋亡的诱导作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

肝癌细胞株HepG2购自上海博谷生物科技有限公司。丹参酮ⅡA由西安鸿生生物技术有限公司提供。

1.2实验方法

1.2.1 细胞培养 （1）肝癌细胞HepG2复苏，将细胞置入30℃～40℃水浴中迅速溶解，移至培养瓶，添加培养液到5 mL。培养条件37℃，5%CO2湿度饱和。每48 h换液一次，当细胞生长密度达到70%～80%时进行传代。（2）细胞传代：取出细胞，倒掉培养液，PBS缓冲液洗涤3次。加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆盖细胞，30 s后加血清的DMEM培养液，分装其他培养瓶，并补充培养液。（3）将培养好的细胞进行冻存。取出培养好的细胞，倒去培养液，PBS缓冲液洗涤3次，加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆盖细胞，30 s后加细胞冻存液，分装至冻存管。4℃冻存10 min，-20℃冻存30 min，-70℃保存。

1.2.2 药物处理 无水乙醇溶解丹参酮ⅡA，配成2.0 mg/mL备用。将含有10%胎牛血清的细胞培养液进行稀释，共分为5个浓度：0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL；0 μg/mL为对照组。

1.3观察指标

1.3.1 不同浓度丹参酮ⅡA对肝癌细胞HepG2生长的抑制 将对数生长期的肝细胞HepG2 PBS缓冲液洗涤3次，加入0.2%的胰蛋白酶消化，加入培养液配成单细胞悬液，浓度为1×105个/mL。将单细胞悬液接种于96孔板，每孔接种100 μL，培养24 h后换含药的培养液。空白组为不含细胞只含培养液；阴性对照组为含0 μg/mL丹参酮ⅡA；实验组为5个不同浓度丹参酮ⅡA。每组共重复8孔，分别培养24 h、48 h、72 h。然后弃去培养液，加入20 μL新鲜MTT液，培养4 h候弃去培养液。每孔加入120 μL DMSO，震荡至结晶完全溶解，使用酶标仪在490 nm处读取吸光度值（A），共重复3次。细胞抑制率=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。

1.3.2检测细胞周期和凋亡情况 收集不同浓度丹参酮ⅡA处理过的细胞1×105个，离心后弃上清液，PBS缓冲液洗涤3次，缓慢加入70%乙醇1mL，4℃下保存过夜。取出后离心去除固定液，PBS缓冲液洗涤3次，加1.0 mg/mL的RnaseA 200 μL，37℃下水浴30 min，加PI 800 μL染色液，避光，4℃保存30 min，进行检测。采用流式细胞仪（美国BD流式细胞仪）进行检测，采用分析软件计算凋亡率和各凋亡周期的比例。荧光显微镜下观察细胞的凋亡形态。

1.4统计学方法

采用SPSS12.0统计学软件进行数据分析，计数资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用方差分析，组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹参酮ⅡA对肝癌细胞HepG2生长的抑制作用

相同的浓度，随着时间延长吸光度逐渐下降，而同一时间，随着浓度的增加吸光度也逐渐下降。见表1。相同浓度，随着时间的延长，丹参酮ⅡA对肝癌细胞HepG2生长的抑制率逐渐增加；相同时间，随着浓度的增加，丹参酮ⅡA对肝癌细胞HepG2生长的抑制率也逐渐增加。见图1、2。

2.2细胞周期分布和凋亡率

搜集丹参酮ⅡA作用72 h的细胞，观察细胞周期，可见随着丹参酮ⅡA浓度的增加，G0/G1的比例逐渐升高（2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL），与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。随着丹参酮ⅡA浓度（0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL）的增加，细胞凋亡率逐渐升高，与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。荧光显微镜下的细胞凋亡形态见图3、4。

3 讨论

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，目前针对肝癌的治疗方法较多，涉及到多个学科的共同协作，如能得到正确合理的治疗，肝癌远期疗效还是比较理想的。目前临床上的治疗方法主要有手术、化疗、放疗等。手术治疗对患者本身也是一种创伤，而化疗和放疗均对患者有较大的副作用。因此，了解肿瘤发生发展的机制，寻找效果好、副作用小的治疗方法成为临床的热点。目前生物疗法，包括免疫疗法等逐渐在临床上广泛应用。肿瘤的发生发展与细胞的异常增殖和凋亡有关。1972年Kerr等三位科学家首次提出了细胞凋亡的概念。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡。细胞凋亡与细胞坏死不同，细胞凋亡不是被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，它并不是病理条件下自体损伤的现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中十分必要。凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守。迄今为止，已发现多种凋亡抑制分子，包括P35、CrmA、IAPs、FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。

丹参酮ⅡA为唇形科植物丹参（salvia miltiorrhza）中分离的二萜醌类化合物，临床应用广泛[3-6]，能够改善冠状动脉循环，抑制血栓疾病发生，具有显著扩张冠状动脉、增加冠脉血流量、降低心肌耗氧量、减慢心率和增加心肌收缩力的作用。丹参素及丹参酮IIA均能显著延长小鼠耐缺氧时间，减轻缺氧引起的心肌损伤，同时，改善心肌收缩力，促进心肌再生，具有抗氧化作用，可防止LDL的氧化，从而保护EC，维持其分泌PGL2的正常功能，抗AS形成。研究报道，丹参酮对多种肿瘤细胞具有抑制和诱导凋亡的作用。吴俊伟[7]研究丹参酮ⅡA抑制人食管癌细胞的生长及机制，结果显示其对Eca-1-9细胞的增殖具有抑制作用，丹参酮ⅡA浓度在1 μg/mL及以上浓度抑制作用明显，并随着浓度升高抑制作用增强。不同浓度的丹参酮ⅡA处理过Eca-1-9细胞后，抑制细胞凋亡的基因Bcl-2 mRNA的表达明显下降。钟志宏等[8]研究结果显示，丹参酮ⅡA对HepG2细胞生长的抑制作用具有明显的时间和剂量依赖性。荧光染色可以观察典型的凋亡细胞形态特征，琼脂糖凝胶电泳可见明显的凋亡细胞形成的梯状条带，作用72 h后，随着浓度的增加细胞的凋亡率也逐渐增加。江城锋等[9]研究结果显示，丹参酮ⅡA及其衍生物对Hela细胞的增殖具有抑制作用，对丹参酮ⅡA进行结构修饰，能够增强其抑制作用。

MTT全称为3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐，主要用于细胞增殖及细胞活性测定。1983年由Mosmann等[10]首先报道用MTT比色法测定细胞活性剂抗癌药物对细胞增殖、活性效应。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能[11]。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲臜，用酶标仪在490 nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。本文采用MTT方法检测丹参酮ⅡA对肝细胞癌HepG2的生长抑制作用。结果显示，相同浓度随着时间的延长，吸光度逐渐下降，而相同时间，随着浓度的升高吸光度也逐渐下降。说明丹参酮ⅡA对肝细胞癌HepG2的生长抑制作用具有时间和浓度依赖性。0.5 μg/mL的浓度对细胞生长的抑制作用不明显。对作用72 h的细胞检测不同细胞周期所占比例，发现随着浓度增加，G0/G1期的细胞比例逐渐增加。G0期是细胞休眠期，而G1期是从有丝分裂到DNA复制前的一段时期，又称合成前期。G0/G1期细胞的上升，S期细胞的下降提示丹参酮ⅡA抑制细胞生长的同时，也在诱导细胞向正常细胞分化。对凋亡率的检测显示，随着浓度的升高，细胞的凋亡率逐渐升高，说明丹参酮ⅡA能有诱导肝细胞癌HepG2的凋亡，并且具有浓度依赖效应。

综上所述，丹参酮ⅡA作为中药的提取物，在临床的应用广泛。其对肝癌细胞HepG2的生长具有抑制作用，并且具有时间和浓度依赖性，对凋亡的诱导作用具有浓度依赖性。

[参考文献]

[1] 汪福昌，郭武华. 肝细胞癌生物标志物研究进展[J]. 山东医药，2012， 52（42）：87-89.

[2] 袁淑兰. 丹参酮ⅡA诱导肿瘤细胞凋亡分子机制[D]. 四川大学：2004.

[3] 赵兴琼. 丹参酮ⅡA磺酸钠、川芎嗪配合西药治疗心肌缺血临床效果观察[J]. 大众健康：理论版，2012，（10）：173-174.

[4] 马丽虹，李冬梅，李可建. 丹参酮ⅡA治疗缺血性卒中急性期疗效评价[J]. 中国医药导报，2012，31（11）：1510-1512.

[5] 于陈宝，范建生，张传明，等. 曲美他嗪联合丹参酮ⅡA磺酸钠注射液在慢性心力衰竭患者治疗中的疗效研究[J]. 中国医药科学，2012， 1（20）：51-52.

[6] 马丽虹，李冬梅，李可建. 丹参酮ⅡA治疗缺血性卒中急性期疗效评价[J]. 中国医药导报，2012，31（11）：1510-1512.

[7] 吴俊伟. 丹参酮ⅡA抑制人食管癌细胞生长及机制研究[M]. 石家庄：河北医科大学，2009：19-26.

[8] 钟志宏，陈文贵，柳永和，等. 丹参酮ⅡA抑制HepG2细胞生长及诱导其凋亡的实验研究[J]. 中南大学学报（医学版），2007，2（1）：99-103.

[9] 江城锋，李瑞峰，薛丹，等. 丹参酮ⅡA结构修饰及其对HeLa细胞的抑制作用研究[J]. 天然产物研究与开发，2012，24（3）：385-388.

[10] Berridge MV，Tan AS. Characterisation of the cellular reduction of 3-（4，5-dimethylthiazol-2yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide （MTT）：Subcellular localization，substrate dependence，and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction[J]. Archives Biochem Biophys 1993，303：474-482.

[11] Berridge MV，Herst PM，Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology：new insights into their cellular reduction[J]. Biotechnology Annual Review，2005，11：127-152.

第3篇：单细胞研究范文

一、信用担保机构运行效率的涵义

1．效率的经济内涵

不同经济学者对于“效率”一词内涵的理解并不一致，目前还没有一个明确的含义界定。经济学泰斗萨缪尔森在《经济学》一书中，是这样定义“效率”的：“效率意味着不存在浪费，即当经济在不减少一种物品生产的情况下，就不增加另一种物品的生产，它的运行便是有效率的”[1]。这时经济处于生产可能性边界之上。国内经济学者樊纲、光等在《公有制宏观经济理论大纲》中给经济效率下的定义是“经济效率是指社会利用现有资源进行生产所提供的效用满足的程度，因此也可一般地称为资源的利用效率”[2]。它是需要的满足程度与所耗费资源（成本）的对比关系。需要明确的是，它不是生产多少产品的简单的物量概念，而是一个效用概念或社会福利概念。对于资源配置的效率问题，意大利经济学家帕累托提出了广为人知的帕累托效率标准，得到经济学界广泛的认可和应用。

最常见意义上的“效率”是指投入与产出或成本与收益之间的关系，也就是指现有生产资源与它们为人类所提供的效用之间的对比关系。这里指的产出或收益，指的不是任意的物品，而是能够为人们提供满足的有用物品。从经济的角度看，最终的产出就是人们的满足即效用。而投入或成本．从一般意义上说，是在一定的科学技术条件下生产一定产品所需的生产资源，包括劳动力资源和物质资源。依据考察主体不同，效率分析具有一定的层次性。当效率概念应用于个别企业的时候，有其特定的含义，所要研究的问题主要是该企业是否利用一定的生产资源生产出了最大量的产出，或者是否在产出量一定时实现了成本最小。这种效率称为技术效率。就整个社会经济效率而言，它要揭示的就是全部生产资源与所有人的总经济福利之间的对比关系，而在给定各生产单位的技术效率的前提下研究经济效率问题时，主要的问题在于资源是否在不同生产目的之间得到了合理配置，使其最大限度地满足了最大部分人们的各种需要。用于分析这一问题的概念就是“经济效率”，也称“配置效率”。

2．信用担保机构运行效率的涵义

对信用担保机构的效率问题，目前讨论主要集中在信用担保机构的运行是否有效率上，而对于其具体的涵义还没有一个明确的界定，更缺乏比较完整的理论体系。尽管不同的学者对信用担保机构的效率有不同的理解，但比较一致的看法是，信用担保机构的效率是信用担保机构在业务活动中投入与产出或成本与收益的对比关系。从本质上讲，信用担保机构的效率是指信用担保机构在有效地保证其资产安全的基础上，能够合理配置信用担保机构的资源并能最大限度地推动社会经济资源的流动，是信用担保机构市场竞争能力、投入产出能力和可持续发展能力的总称。信用担保机构的效率可以从微观和宏观两个方面加以考察。从信用担保机构单个部门来考察，其效率就是指各信用担保机构所完成的金融资源配置达到最优状态，也就是其投入与产出或成本与收益的比较。从宏观层面来考察，信用担保机构效率就是信用担保制度对国民经济增长的贡献率，也就是把信用担保机构要素的投入与国民经济的增量和增长质量进行比较。

二、信用担保机构运行效率的度量方法

如何度量信用担保机构的运行效率，不同的学者从不同角度来度量，下面介绍三种效率度量方法，即财务比率分析法、成本收益法和投入产出法。

1．财务比率分析法

信用担保机构的财务数据一般是比较容易获取的，所以一些学者考虑用一些运行指标来度量其绩效，并监管其日常的运行。陈乃醒(2001)建立了由担保贷款额相当于代偿能力的倍数、每百元担保贷款占用担保基金额、代偿率、担保贷款的经营费用占用率、担保贷款的总成本占用率、盈利额、破产临界点、担保基金利润率等8个指标构成的信用担保的经济效益的评价指标体系[3]。梅保平(2004)从信用扩张、风险控制、风险分散、持续发展等方面建立了信用担保机构的运行能力评价指标体系[4]。放大倍数是一个重要的财务指标，放大倍数为担保余额与担保机构总资本金的比例，放大倍数越高，担保基金的成效就越大，但其范围总要控制在最大放大倍数之内，并且受相关因素的影响。陈晓红、谢晓光(2005)通过模型分析得出，担保机构对企业的调查监控成本、反担保控制能力和银行对担保机构的监控成本是决定担保放大倍数的关键因素并由此认为互担保在提高担保放大倍数方面具备一定优势[5]。林毅(2006)以财务比率分析法为基础，参照国内学者任永乎、梅强(2002)等人的研究从担保机构的角度来衡量信用担保体系的运行绩效，分析的结果表明我国担保机构整体的效率比较低，其外部的社会经济效益也没有充分地发挥出来[6-7]。

信用担保计划的成败与违约率直接相关，但是违约率的衡量也是个权衡取舍的问题，零担保率虽然可以确保零违约率，担保机构的资产安全性也可以得到保障，但也意味着担保机构的无效性和不作为。大量的实证检验也表明较高的违约率和较高的金融附加量是相关的，违约率应该维持在一定限度内，超过这一限度会不可避免地导致担保机构的破产风险。加拿大学者赖丁和海恩斯(Riding&Haines，2001)构建了一个模型，以加拿大的SBLA（小企业贷款管理局）贷款项目为基础从贷款银行的期望收益角度对信用担保机构的违约率进行了测量[8]。

需要注意的是在应用财务比率法时要尽量避免以偏概全，要权衡各方面得失。不仅要考虑信用担保计划所覆盖的范围，又要认识到其可能面临的风险。尽可能地发掘信用担保更多的技术指标，以有效地衡量和监管其日常的运行。

2．成本收益法

用成本收益法来衡量信用担保机构的效率，关键在于如何确定成本和收益，但是实践操作中要准确地确定其成本和收益却面临众多困难。一方面数据的来源是个问题；另一方面，有时即使数据准确无误，在不同的经济环境下用它们来解释信用担保机构的效率还是会引起很大争议。以下是学者们衡量时常用的指标和方法。

(1)成本

信用担保机构的成本主要包括启动成本、维持成本、交易成本，交易成本又包括运行成本和违约代偿成本。启动成本包括投入的资本金以及建立相应机构、雇佣人员、对工作人员进行教育培训和对外宣传等相关费用。维持成本是指持续的政府补贴或外部融资来解决贷款代偿后的担保基金缺口。运行成本是指经营过程中的正常运转管理费用、学习费用和维持准备金比率的风险准备。违约代偿成本是指当借款方违约时担保机构向金融机构代偿的金额。启动成本和维持成本一般比较容易测量。学者们往往着重于衡量担保计划的交易成本，即运营成本和违约代偿成本。例如，DavidCanuno和ClaraCradone(1999)提出了一个评估模型，较好地测量了西班牙的LGA(贷款担保协会)的交易成本，他们的论文中就没有过多地考虑启动成本和维持成本而将重点放在交易成本上。

(2)收益

信用担保计划所带来的收益主要集中表现在金融附加量上。所谓金融附加量，是指通过执行信用担保计划使得目标群体从金融机构获得的贷款额度增加或贷款条件改善。能否产生金融附加量是判断信用担保计划执行收益的核心标准。如果没有金融附加量，则信用担保计划就没有收益可言。金融附加量主要包含以下几个方面的内容：贷款额度增加、贷款期限延长、贷款费率减少、抵押比例降低、贷款流程加快等（龚瑾瑜和韩刚，2006）[lo]。同时，信用担保计划的执行还会产生派生收益即经济附加量。经济附加量是指由于信用担保计划的支持，目标群体获得了更多的贷款额度或更有利的贷款条件，并由此使其市场机会增多，而新增加的收入额、利税额和就业人数。经济附加量用来衡量信用担保对整个经济的贡献度。

Boocock和Sheriff(1996)运用了上述金融附加量指标对马来西亚信用担保公司的NGPS项目进行了评估，结果表明90%的借款者在没有NFUDES担保的情况下不能获取正常的贷款。后来Boocock还通过调查问卷的形式进一步研究，调查的结果表明在所调查的32家企业中63%的担保贷款是额外提供的，而不是其他金融贷款形式的替代品。加拿大学者赖丁和海恩斯(Riding＆Haines)对3000户接受SBIA贷款的中小企业作了随机调查，根据粗略计算，每创造一个就业岗位需要耗费SBLA小额贷款担保成本不到l000加元，大额贷款担保成本不到3000加元，平均成本约为2000加元。从成本收益来比较．SBIA贷款在创造就业机会上的效率极高。对于这些数据的可靠性，有些学者表示了怀疑，但是信用担保计划增加对目标群体的贷款量这点是毫无疑问的，只是我们需要进一步地细化其衡量的指标和方法。

3．投入产出法

投入产出法用来评价效率主要有参数法和非参数法。参数法在测度信用担保机构效率时，需要规定效率前沿函数的具体形式，并通过样本信用担保机构估算出效率前沿函数中的各个参数。参数法大致可以分为随机前沿法(stochasticFrontierap-proach，SFA)、自由分布法(distribu-tion-freeapproachDFA)，厚前沿分布法(thick-frontierapproachTEA)和递归厚前沿法(recursivethick-frontierapproachRTFA)等。这种方法有两个缺陷：其一，函数形式需事先假定；其二，参数估计的有效性和合理性需要检验，参数的检验需要关注统计检验的有效性和经济含义的有效性。

非参数法对信用担保机构效率进行测度时，不必估算效率前沿函数中的参数及规定函数的具体形式。非参数方法主要指数据包络分析法。数据包络分析(dateenvelopmentanaly-sis)简称DEA，是数学、运筹学、数理经济学和管理科学的一个新的交叉领域。它摒弃了参数方法研究中的弱点，不去寻求生产前沿面的具体形式，而是通过所观测的大量实际数据基于一定的生产有效性标准找出位于生产前沿面上的相对有效点。这种方法的优点在于：①无需知道生产函数的具体形式，在研究中受到的约束较少；②经济生活是一个动态发展的过程，测度相对效率的意义将是更为深远的。

Hway-BoonOng,MuzafarShahHabibullah,AliasRadma,M.Azali(2003)等人，运用数据包络分析法(DEA)对马来西亚的信贷担保公司(CGC)的技术效率、纯技术效率和规模效率进行研究。他们运用CGC的历史面板数据，将由CGC所同意的担保贷款作为产出量，将CCC的固定资产、经营费用和租赁房屋费用作为投入量，他们的研究结论表明马来西亚的信贷担保公司总体技术效率是比较低的，因此他们建议应当考虑重新配置已有的资源、避免浪费以增加纯技术效率。并且应该降低其对中小企业担保的要求，为中小企业提供更多担保，以提高其规模效率。

三、信用担保机构运行效率度置的现实约束

尽管国外很多学者针对信用担保计划的执行效率从不同的方法和不同的角度进行了实证研究，国内官方近年来的信用担保发展报告也使用以上方法中的一些指标来评价我国信用担保机构的运行效率，但是目前为止仍然难找到令人信服的信用担保机构运行效率的评价报告。这主要是因为在实际经济运行中，对信用担保机构运行效率的度量远比对其内容和结构的分析判断要困难得多。主要面临以下几方面的约束：

1．基础数据来源与准确性方面的约束

在世界范圈内，从信用担保计划产生至今已经有七八十年的历史．国外的统计机构对于信用担保机构的运营大都有一套完整的统计系统，这就为其运行效率的实证分析提供了基础的数据来源。但是并不是所有的实证研究数据都能从统计系统获取．例如，成本收益法中的交易成本、金融附加量中的指标诸如贷款期限延长、贷款费率减少、抵押比例降低、贷款流程加快等。经济附加量指标：新增加的收入额、利税额和就业人数即便有数据来源其准确性也因种种原因而受质疑，例如信用担保机构为获取政府补贴在上报数据时往往夸大数据或虚报数据。为了研究需要通过对借款人和贷款人进行问卷或访谈调查的办法，但是这种主观调查方法本身有两个局限性：一是样本通常较小，误差很大；二是容易受到“霍索恩效应(HawthorneEffect)”的影响，即被调查人很可能做出他们认为调查人希望听到的回答。

我国信用担保机构的发展也就十几年的历史，农村信用担保机构的发展历史则更短，主要是这几年的事，很多地区对于信用担保机构的经营情况不列入统计的范围，基础的数据缺乏这就在一定程度上限制了对其实证研究的展开。这也是我国学者在研究信用担保机构问题时理论说得多而实证研究缺乏的原因。

2．替代问题的约束

担保贷款的规模、担保企业个数和担保笔数等指标，常常被引用来说明信用担保机构运行效果，但是由于替代问题的存在，这些指标并不能精准地度量金融附加量。信用担保机构运行过程中可能遇到的替代问题有两种：一种是贷款方式替代问题；另一种是贷款机构替代问题。

(1)贷款方式替代。这是发生在与信用担保机构合作的金融机构内部的贷款方式替代问题。合作的金融机构并没有增加新的贷款客户，是从已经建立贷款关系的客户群体中筛选出部分客户纳入信用担保计划的范围，在贷款操作上仅仅是对该部分客户的贷款方式作一个变更，例如，从原来的抵押担保贷款变更为信用担保贷款，客户群体和贷款额度都没有因为信用担保机构的加入而增加。这种替代主要发生在合作的金融机构认为信用担保计划并不能增加其利润的情况下；并且合作的金融机构为了转移和规避信贷风险，会将原有客户群体中风险最高的那部分转入信用担保计划的范围。

(2)贷款机构替代。这是发生在贷款人之间的替代问题。拿农村信用担保来说，农村信用担保计划的执行并没有使得某个农村经济体中的农户和农村中小企业获得更多的贷款支持，而仅仅是贷款机构的变更。贷款机构的替代又可以分为两种情况：一种是正规金融机构之间的相互替代：另一种是正规金融机构与民间金融组织之间的替代，这种替代更易发生。

3．贡献模糊的约束

在信用担保计划执行后，即使非常理想地不发生替代问题，也就是金融机构对纳入信用担保计划范围的客户所投放的担保贷款全部是净增贷款，信用担保计划收益的度量还会面临贡献模糊问题的约束。如前面所述，信用担保计划收益可用金融附加量（新增贷款额等）和经济附加量（新增加的收入额、利税额和就业人数）来度量，因而本文所说的贡献模糊是指这样一种情况：在推行信用担保计划的过程中，国家宏观经济、国家产业政策、区域经济政策、行业竞争状况、金融体制改革、出口贸易机会、社会服务功能等都可能发生有利于金融机构增加目标群体贷款的变化，这些因素都对金融机构净增目标群体贷款做出了贡献，从而也为目标群体的收入额、利税额和就业人数的增加做出了贡献，但是各个贡献因素的界限是模糊的，无法将信用担保计划的贡献客观地从这些综合贡献因素中剥离出来，这也约束了信用担保计划收益的准确度量。口

参考文献(References)

[1]萨缪尔森．经济学（第12版）[M]．北京：中国发展出版社，1992.

[2]樊纲，光，等，公有制宏观经济理论大纲[M]．上海：上海三联书店,1990．

[3]陈乃醒，中小企业信用担保的经济效益与指标体系[J]．经济管理，2001(7):36-37．

第4篇：单细胞研究范文

Study on the expression of calreticulin in hypertrophic scar-derived fibroblasts

【Abstract】Objective To investigate the expression level and intracellular distribution of calreticulin(CRT) in hypertrophic scar-derived fibroblasts(HSF)and normal skin-derived fibroblasts(NSF).Methods Using anti-CRT antibody， CRT was detected in HSF and NSF by immunocytochemistry and ELISA technique.Results CRT was present in the cytoplasm and nuclei in proliferating HSF or NSF in culture， but HSF possessed significantly higher expression level of CRT than NSF(P＜0.01). When these cells (HSF and NSF) were fused ， neither intracellular nor intranuclear staining for CRT was observed.Conclusion In HSF and NSF，the distribution of CRT is widespread. Because of its abundant expression in HSF， we postulate that CRT as a multifunctional protein plays an important role in Ca2+ sequestering， integrin-mediated signalling and cell adhesion.

【Key words】 Hypertrophic scar Fibroblast Calreticulin Expression

增生性瘢痕(Hypertrophic scar， HS)作为创伤及外科手术后常见且十分棘手的皮肤组织疾病，瘢痕组织内成纤维细胞异常活化和细胞外间质过度沉积既是HS的重要组织学特征，也是HS发生、发展的物质基础。钙网蛋白(Calreticulin， CRT)最早是作为一种存在于非肌细胞内质网上的主要钙结合蛋白得以认识的［1］，近几年的研究发现：除具有钙离子储藏作用外，CRT在参与并调节众多细胞生物学活性功能上有着积极影响［2-5］，同时它还作为自身抗原在某些免疫性疾病的发病机制中有着极其重要的价值［6］。我们通过CRT抗体并利用原位ELISA及免疫细胞化学染色技术检测瘢痕成纤维细胞体外表达CRT水平，辅以正常皮肤成纤维细胞作对照，探讨CRT在瘢痕成纤维细胞发挥异常生物学活性功能中的作用。

1　材料与方法

1.1　组织标本

增生性瘢痕及正常皮肤组织标本均取自住院病人，年龄17～40岁。患者在取标本前无长时间外用各种防治增生性瘢痕药物史，不伴肿瘤及其他严重疾患；瘢痕组织生长时间均在6～9个月之间。

1.2　主要试剂及物品准备

羊抗CRT抗体：Michalak博士惠赠。辣根过氧化物酶标记兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。细胞培养基：DMEM添加10%小牛血清(上海华美生物技术有限公司)。96孔塑料培养板及100mm培养皿(丹麦Nunc公司)。

1.3　成纤维细胞培养

手术切取增生性瘢痕及正常皮肤组织，去皮下脂肪，0.01%新洁尔灭浸洗10min，PBS洗3次，用组织剪将组织剪成细小碎块并接种于培养皿内，加少量10%小牛血清的DMEM培养基，37℃5%CO2静止培养，3天后补充少量培养剂，隔2天换液，见有细胞从组织块爬出生长后每天换液，传代。

1.4　CRT免疫细胞化学染色

体外培养的成纤维细胞去培养基后，PBS轻洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗体37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反应1h，DAB显色；显微镜下观察显色信号。

1.5　CRT原位ELISA检测［7］

选择第5代培养细胞为实验对象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集细胞，调整细胞浓度至106/ml，每孔100μl接种于96孔培养板内。培养16h后，去培养剂，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%双氧水反应5min，PBS洗；与0.1%Triton X-100 4℃作用3min后，进一步分别与5%小牛血清(37℃、20min)、抗CRT抗体(37℃、1h)、5%小牛血清PBS稀释的HRP-兔抗羊IgG(37℃、1h)反应；PBS清洗后加入OPD底物液100μl，作用30min后用50μl1mol/L硫酸中止反应。ELISA reader 上读取492nm的P值。

2　结果

2.1　成纤维细胞初代培养结果

在体外相同培养条件下，细小的瘢痕及正常皮肤组织块接种后2天见有部分贴壁，培养1周后有少量的成纤维细胞从组织块边缘爬出，2周后细胞在组织块周围呈晕状分布，此后细胞开始向外旺盛扩散增殖。显微镜下观察瘢痕及正常皮肤组织来源的成纤维细胞形态，发现细胞均呈细小梭形状，二者未见明显差异。

2.2　成纤维细胞CRT表达的免疫细胞化学染色结果

原代培养的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞在未生长融合前，细胞内均有不同程度的CRT阳性表达；一旦细胞生长融合后，在融合区内的成纤维细胞中均未见有明显的CRT阳性信号出现，但在融合区边缘仍处于增殖、迁移扩散的瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内，则仍有CRT的阳性信号分布；就二种细胞内 CRT的表达信号强弱来看，瘢痕成纤维细胞内的CRT阳性信号相对较强，而正常皮肤成纤维细胞内CRT阳性信号相对较弱；另外，当瘢痕及正常皮肤成纤维细胞以较高密度传代培养时，细胞内CRT表达在接种后16h较为明显，而在培养24h细胞接近融合时信号较弱。

此外，CRT在瘢痕及正常皮肤成纤维细胞内的表达区域无明显差异，往往在细胞浆、核膜及核内均有表达。

2.3　成纤维细胞CRT表达的ELISA检测结果

根据CRT免疫细胞化学染色结果，我们对第5代瘢痕及正常皮肤成纤维细胞(接种后培养16h)进行CRT表达的ELISA检测，其中正常皮肤成纤维细胞组的CRT表达值为1.43±0.12(A)，瘢痕成纤维细胞组为1.97±0.15(A)，二组间差异有非常著性意义(P＜0.01)。

3　讨论

增生性瘢痕是伤口上皮化愈合后组织内成纤维细胞异常活化即继续旺盛增殖并分泌大量胶原、纤维连接蛋白及蛋白多糖等细胞外间质所造成的一种组织病理改变，有关瘢痕成纤维细胞为何异常活化一直是整形烧伤外科领域里重点探索的课题之一。转化生长因子β1、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1和类胰岛素生长因子-1等在增生性瘢痕组织内的过度表达一直被认为是引起成纤维细胞异常活化不可忽视的因素，但越来越多实验研究表明瘢痕成纤维细胞自身生物学特性改变是触发其功能异常的关键［8］。我们通过对细胞内CRT的表达检测，进一步发现CRT不但在瘢痕成纤维细胞内分布广泛，而且其表达量明显高于正常皮肤成纤维细胞内水平。

CRT作为钙离子主要结合蛋白，早期研究认为CRT主要是通过影响细胞内钙离子的储存与释放而影响细胞的一些生物学活性效应，但近几年的研究结果表明CRT除上述作用外，它在细胞迁移扩散及细胞内相关基因表达等方面均有直接的介导和调节作用。1997年，Zhu等人［9］通过对B16细胞CRT表达的深入研究发现实细胞内的CRT分子常常与整合素粘附分子的α链胞内区结合并成为双向传导细胞内外信号的复合体；Coppolino等人［5］利用CRT缺乏而整合素表达正常的胚胎干细胞进行细胞体外迁移粘附研究，证实在正常培养条件下干细胞的迁移扩散能力很弱，而经转染CRT基因后，细胞的迁移粘附作用显著增强。因此，Coppolino认为细胞内CRT与整合素粘附分子直接参与细胞的信号传导、粘附、迁移扩散等生物学活性功能。Tsai等［10］曾利用体外结缔组织收缩模型发现增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞在体外有着比正常皮肤成纤维细胞更强的迁移扩散能力，并认为其作用可能与细胞内肌动蛋白丝积聚有关。笔者在博士后研究工作阶段却发现在相同培养条件下增生性瘢痕组织来源的成纤维细胞除有着较强迁移扩散能力外，还具有高表达β1、α1、α2、α3及α4整合素粘附分子的特性［11］，从而提示瘢痕成纤维细胞的强迁移扩散能力与高表达整合素粘附分子有关；而从本实验对CRT在瘢痕成纤维细胞内的表达情况来看，细胞内其CRT表达并不属持续性表达，CRT的高表达期一般是在细胞的迁移扩散阶段，而当细胞融合后细胞内CRT表达甚少。但就与同一时期培养的正常皮肤成纤维细胞相比，瘢痕成纤维细胞内的CRT表达则显得更为丰富。因此，结合我们以往的研究工作结果，我们认为：瘢痕成纤维细胞异常的迁移扩散能力是细胞内丰富的CRT、整合素粘附分子表达及肌动蛋白丝积聚共同作用的结果，其中积聚的肌动蛋白丝是其异常迁移扩散的重要动力来源，而有效表达的CRT及整合素粘附分子则是细胞与细胞外间质之间迁移动力的传递媒介；另外，CRT的丰富表达对瘢痕成纤维细胞钙离子的储存、释放及其信号传导等也有着重要的意义。

参考文献

1　Krause KH， Michalak M.Calreticulin. Cell， 1997， 88:439-443.

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3 Liu H，Bowes RC， van-de-Water B， et al. Endoplasmic reticulum chaperones GRP78 and calreticulin prevent oxidative stress， Ca2+ disturbances， and cell death in renal epithelial cells. J Biol Chem， 1997， 272:21751-21759.

4 Burns K， Opas M，Michalak M. Calreticulin inhibits glucocorticoid-but not cAMP-sensitive expression of tyrosine aminotransferase gene in cultrued McA-RH7777 hepatocytes. Mol Cell Biochem， 1997， 171:37-43.

5 Coppolino MG， Woodside MJ， Demaurex N， et al. Calreticulin is essential for integrin-mediated calcium signalling and cell adhesion. Nature， 1997， 386:843-847.

6 Eggleton P， Reid KB， Kishore U， et al. Clinical relevance of calreticulin in systemic lupus erythematosus. Lupus， 1997， 6:564-571.

7 Winisk A， Foster C. ICAM-1 expression in a spontaneously transformed human keratinocyte cell line:Characterization by a simple cell-ELISA assay. J Invest Dermal， 1992， 99:48-52.

8 Tredget EE， Nedelec B， Scott-PG， et al. Hypertrophic scars， keloids， and contractures. The cellular and molecular basis for therapy. Surg Clin North Am， 1997， 77:701-30.

9 Zhu Q， Zelinka P， White T， et al. Calreticulin-integrin bidirectional signaling complex. Biochem Biophys Res Commun， 1997， 232:354-358.

第5篇：单细胞研究范文

[关键词]信贷保证保险；逆向选择；道德风险；信用机制

中小企业融资难问题是制约中小企业发展的瓶颈，我国为解决该问题已从多方面着手，在一定程度上扩展了中小企业融资途径。但这些措施还不能完全满足中小企业发展的资金需求，所以适时推出中小企业信贷保证保险制度是极为必要的。该制度的建立具有重大的经济效益及社会效益。

一、中小企业信贷保证保险的涵义

信贷保证保险是指以信用风险为保险标的的保险。它包括两类保险：一类是狭义的保证保险，另一类是信用保险。它们的保险标的都是被保证人的信用风险，当被保证人未按照基础合同约定履行义务，使权利人遭受经济损失时，保险人负代为履行付款义务(给付保险赔偿金)责任。凡被保证人根据权利人的要求，由保险人承担自己(被保险人)信用的保险，属狭义的保证保险；凡权利人要求保险人担保对方(被保证人)信用的保险，属信用保险，权利人即被保险人。

狭义的中小企业信贷保证保险的被保证人指的是中小企业，它在保证保险中作为投保人，通常是保费的缴纳者；受益人是债权人，在中小企业信贷保证保险中指向中小企业贷款的金融机构。信用保险的权利人指的是向中小企业贷款的金融机构，它是信用保险的投保人，通常是保费的缴纳者，同时也是保险合同的受益人；被保险人是债务人，即中小企业；保险责任是被保险人到期不能履行还本付息的风险。

二、建立中小企业信贷保证保险制度的意义

(一)增强中小企业信用等级，缓解中小企业资金需求

中小企业贷款难的原因之一是由于大型商业银行对中小企业的还款能力存有疑虑，而中小企业又无充足的资产作为抵押。中小企业信贷保证保险制度的建立可以使中小企业信用等级得到升级，将有效地消除大银行对中小企业还款能力的顾虑，当中小企业不能如期还本付息时，保险公司要按照保险合同约定履行替中小企业还本付息的责任，银行也不会因此而遭受损失。因此，在具有中小企业贷款保险制度的情况下，中小企业将可以和其他大企业一样从银行获得更多的贷款，以满足自身发展的需求。

(二)降低信贷金融机构的风险，提高银行资金收益率

近年来，我国商业银行的存款总额在逐年扩大，而贷款总额相对缩小，存贷比自1995年首次突破“广后，逐步放大。由此可以看出，我国的商业银行存在着大量的剩余资金，银行的资金利用率较低，不利于银行本身的发展。但银行在提高收益率的同时必须考虑资金的安全性，如只注重收益而忽略资金安全则有可能对银行更加不利，所以银行在资金运用上常常处于矛盾的境地。若中小企业信贷保证保险制度得以建立，则商业银行可以在保险公司的参与下，将资金贷给中小企业，既可以提高资金的收益率又可以保证资金的安全。

(三)拓宽保险业务，提高保险公司整体竞争力

保险公司承办中小企业贷款保险业务，可以扩大保险公司的业务量，增强保险公司的竞争实力。自1980年我国恢复办理国内保险业务以来，我国的保险业得到了迅速发展，截至2006年底，保险业总资产达1.9万亿元，但我国的保险深度与保险密度仍然很低，总体上来说，仍处于发展阶段，竞争能力与发达国家相比还比较弱。加之我国加人WTO后，国外的保险公司不断涌人，国外保险公司具有技术与资产等方面的优势，将给我国的民族保险业造成巨大的威胁。发展中小企业贷款保险业务，可以使我国的保险公司增加资金实力，提高整体竞争能力。

(四)促进金融深化与宏观经济的迅速发展

开展中小企业贷款保险业务，一方面可以使银行、保险公司等金融部门之间相互配合，扩大自身业务，增加其资金实力，促进金融深化进程，增加金融部门对宏观经济的贡献率；另一方面，该业务还可以解决生产部门，尤其对中小企业的资金短缺问题，促进中小企业等生产部门发展；最后，金融部门与生产部门的发展是相互促进的，其任何一方的发展都离不开对方的支持，它们的发展是互为因果、轮番促进的。开展中小企业贷款保险业务，可以为之创造出一种相互促进、相得益彰、和谐发展的大好局面。

三、中小企业信贷保证保险制度建立的可行性

(一)建立中小企业信贷保证保险制度符合国家扶持中小企业发展的政策

我国政府一直在积极为中小企业解决资金短缺难题，如创建中小企业板、设立担保机构、进行银行制度改革等，虽然有较大的财力投入，但效果不佳。推出中小企业信贷保证保险业务，符合国家扶持中小企业发展的政策要求，客观上会得到政府的大力支持。因为，该业务属于一种纯商业行为，保险公司是以盈利为最终目的，无须政府太多投入。在这种情况下，保险公司实际上是为政府分担了部分职责，政府再通过诸如税收等优惠政策予以扶持，就可以在不增加财政支出的基础上缓解中小企业资金短缺这一棘手问题。

(二)建立中小企业信贷保证保险制度会得到信贷机构的支持

信贷风险是银行等信贷金融机构面临的重大风险之一，如违约数额较大，则会对其稳定经营造成威胁。信贷金融机构可以通过避免、自留、转移等多种方式进行风险管理。进行风险管理时，风险主体应根据自身抵抗风险的能力以及风险的大小来选择防范风险的最佳方式。对于这样重大的风险，风险转移是银行等信贷机构处理风险的最好选择，而保险又是风险转移中最完善、最合理的方式。因此，信贷保证保险制度的建立必将得到信贷机构的支持。

(三)建立中小企业信贷保证保险制度可以拓展保险公司业务，提高经济效益

我国的保险业经过二十多年的迅猛发展，正在逐渐走向成熟，已在各种传统险种以及近年来推出的汽车信贷保证保险、住房信贷保证保险、出口信贷保证保险等险种的经营方面取得了丰富的经验。无论对标的风险的评估，对风险的技术处理，还是对风险的承保能力都已达到了一定的水平。另外，近年来我国的保险人才不断涌现，保险精算师的数额在逐年增加，为信贷保证保险条款的设计及保险费率的计算提供了人员上的保障。最后，通过开办中小企业信贷保证保险业务能给各保险公司带来经济效益。

四、建立中小企业信贷保证保险制度可能存在的问题

建立中小企业信贷保证保险制度在中小企业、金融机构、保险公司三方“共赢”的同时，还会产生不少问题，其中最严重的问题是“逆选择”与“道德风险”。

“逆选择”是由于信息不对称引起的。中小企业对自己的经营水平、还款能力有着充分的了解，而保险公司对各中小企业的具体情况没有深入了解，常常处于信息不对称状态。在这种情况下，那些经营状况好，还款能力强的企业不愿意投保，而那些经营状况差，还款能力弱的企业则非常愿意投保，这最终将危及保险业的稳定经营，更不利于信贷保证保险制度的实施。

“道德风险”则主要主要来自中小企业和银行等信贷机构两方面。对于中小企业而言，如果投保了信贷保证保险，往往会将资金运用到高风险的项目，如果投资成功则会给企业本身带来巨大的投资回报，倘若投资失败也会有保险公司为其偿还贷款；对银行等信贷机构而言，有了信贷保证保险往往会忽视债务人的信用等级，对于本不应贷款的客户，大量放款，以追逐利润的最大化。道德风险的存在给信贷保证保险制度的建立带来了难度，应为此筹划相应的策略，以化解这些负面因素的影响，充分发挥其积极作用。

五、建立我国中小企业信贷保证保险制度的总体思路

(一)合理选择中小企业信贷保证保险制度建立的方式

建立我国中小企业信贷保证保险制度的方式大体有两种模式：一是筹建新型的专业保险公司来承办中小企业的信贷保证保险业务，出资形式可以由政府承担或由某些大机构牵头组建股份公司；二是由现有的优质保险公司在原有基础上开办该种业务，由专门的下属部门从事中小企业的信贷保证保险业务。考虑到我国的现状，后一种形式应该更为合适。因为这样不仅可以为国家节省财政资金，避免重复建设的问题，还可以增强我国现有公司的实力，树立国家民族保险晶牌。综上所述，建立我国中小企业信贷保证保险制度的最佳方式是利用现有的优质保险公司，先开展试点业务，待机会成熟再全面放开。

(二)实行强制保险，差别费率，防止逆向选择

为了避免出现“逆选择”问题，我国应该对中小企业贷款采取强制性政策。如果实行自愿投保，那么银行对于实力较强的中小企业贷款则不愿投保，而对实力较差的中小企业贷款却非常愿意投保，这将不利于保险公司的长远经营。鉴于此种情况，对于中小企业贷款应采取强制性的贷款保险。但采取强制性保险，采取相同费率，会产生对各个投保主体有失公平的问题。因为，保险公司在制定保险费率时，是根据投保者的风险等级进行计算的，对于违约风险较小的绩优公司的贷款，应实行较低的保险费率；而对于违约风险较大的绩差公司的贷款，应实行较高的保险费率。所以，在实行强制保险，防范逆选择的同时，还应对于不同的信贷主体实行差别费率，以保证公平合理。

(三)实行比例赔付、免赔额等措施，防止道德风险

信贷保证保险过程中，无论是信贷机构还是中小企业都会出于利润最大化的动机，人为的增加贷款风险以及资金运用风险，产生道德风险。实行比例赔付、免赔额等措施是防范道德风险的有效方法。比例赔付是指在贷款发生损失时，保险公司只对贷款进行部分赔偿，其余部分由中小企业和银行承担。实施比例赔付可以使中小企业和银行等贷款机构在发生贷款损失时，承担部分损失。所以，贷款机构在贷款时会非常谨慎，中小企业在利用资金时也会再三珍重，从而有效地防止道德风险。免赔额是指被保险人根据保险合同，在赔付之前，先要自己承担的损失额度。其实施的意义有两个：第一，免赔额可以大大减少保险公司的工作量，减少赔付率，提高其偿付能力。第二，免赔额的实施，可以使信贷机构贷款后保持对贷款人的监督，督促中小企业合理运用资金。由此看来，免赔额同样可以抑制道德风险。

(四)实行再保险、共同保险方式分散风险

大额的信贷保证保险如果一旦债务人违约失信则会给保险公司的稳定经营带来巨大的影响，直接损害其它投保人的利益。因此，保险公司对于数额较大的信贷保证保险应采取合理的风险分散机制，以避免风险集中。具体方法有再保险和共同保险。再保险是指原保险人在与投保人签订保险合同后，与再保险人签订再保险合同，当贷款发生损失时，原保险人和再保险人按合同约定进行赔偿。再保险使原保险人在不损失保险业务的情况下，分散了巨额风险，防止了风险集中，是原保险人经常采取的一种化解巨额风险的方式。共同保险是指由多家保险公司对同一巨额风险共同承保。共同保险同样也可以做到使保险公司扩大承保能力，分散巨额风险的作用。

(五)完善损失补偿机制

加强代位追偿原则的实施，完善损失补偿机制是促进中小企业信贷保证保险制度健康发展的重要保障。代位追偿是指当债务人违约失信，保险公司代之向债权人履行了赔偿义务之后，所取得的向债务人追偿的合法权益。保险公司为了能有效地对债务人进行追偿，可以建立自己的追偿队伍，或者委托专业追账中介机构履行代位追偿的权利。在权利人的积极配合下，代位追偿可以使保险公司的损失得到部分补偿，降低信贷保证保险的经营成本。

第6篇：单细胞研究范文

关键词：氧化低密度脂蛋白；THP-1细胞；细胞凋亡；内质网应激

中图分类号：R329.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）08-0973-03

近年来,细胞凋亡在动脉粥样硬化的形成和进展中的作用日渐成为研究热点,斑块破裂伴血栓形成是造成动脉粥样硬化临床急性症状的主要原因,而大量的细胞凋亡直接造成斑块不稳定［1］。巨噬细胞通过对斑块内脂质含量、炎症反应、纤维成分的降解及新血管形成等方面来影响动脉粥样硬化病变的进展,在动脉粥样硬化形成的所有阶段都起着极其重要的作用［2］。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是动脉粥样硬化重要的危险因素,ox-LDL被巨噬细胞大量吞噬后会导致巨噬细胞胞浆内大量胆固醇的聚集并进一步形成泡沫细胞，同时会导致血循环中的单核细胞向内皮表面黏附并不断向内皮下趋化,并在内皮下分化成常驻的巨噬细胞［3］。内质网是细胞内重要的细胞器，内质网功能的损伤引起内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），通过激活未折叠蛋白质反应（UPR）以保护由ERS所引起的细胞损伤，长期过强的内质网应激便会诱导内质网相关性细胞凋亡［4］。不同于经典的凋亡途径，内质网应激反应性凋亡途径是一种最近提出的新的凋亡途径，研究其发生机制可为动脉粥样硬化等相关疾病的预防和治疗提供新的方向。本研究主要探讨ox-LDL对人单核巨噬细胞（THP-1）凋亡的影响及其引起凋亡的内质网应激机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器 CO2孵箱（HERA cell 150）,倒置显微镜（Nikon TS100，日本）,超净工作台（LONGHONG，中国）,恒温水浴箱（HS-4，成都仪器厂）,低温台式离心机（Labofuge 400R，Heraeus），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.1.2 实验试剂 人 THP-1单核细胞购自中科院上海细胞库。ox-LDL由北京医科大附属医院实验室馈赠。RPMI1640培养基（GIBCO公司，美国）,10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）,胰蛋白酶（solarbio,Spain），PMA（Sigma,美国），鼠抗人GRP78、Caspase-12、CHOP一抗及羊抗鼠IgG二抗均购自Santa Cruz美国公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与诱导 将人THP-1单核细胞悬浮于含10%胎牛血清的1640培养液中，在5% CO2、37℃、饱和湿度培养箱中静置培养。在光学显微镜下可见细胞呈球形，悬浮状态。视细胞生长情况进行传代、换液，选择生长良好的第3代～第5代细胞用于实验。实验前在培养液中加入终浓度为100 mmol/L的PMA孵育48 h，诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞。在光学显微镜下可见细胞转化为贴壁状态，并伸出伪足，呈现巨噬细胞形态。

1.2.2 实验分组 对照组:细胞置1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养。ox-LDL组:在细胞培养瓶中分别加入ox-LDL（25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL）在1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养48 h。在细胞的培养瓶中加入ox-LDL 75 μg/mL在1640培养基中于5% CO2、37 ℃、饱和湿度培养箱中培养24 h、48 h、72 h。

1.2.3 细胞凋亡的检测 采用Annexin V-FITC/PI双标记染色法进行检测，分组分孔收集细胞（1×106个），1 000 r/min离心5 min，弃上清液，每管用200 μL PBS重悬成单细胞悬液。加入10L Annexin V-FITC和5L PI，加入300L Binding Buffer轻轻混匀，避光室温反应15 min，流式细胞仪检测，以凋亡的巨噬细胞占巨噬细胞总数的百分比为凋亡率。

1.2.4 Western blot测GRP78、Caspase-12、CHOP的表达 分组分孔收集细胞（1×106个）,进行免疫印迹法（Western Blot）检测GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表达。将每管细胞洗涤,离心,用细胞裂解液裂解细胞,在其中加入等体积的样品缓冲液混匀，沸水煮沸5 min，使蛋白质变性，将蛋白质分装并冻存于-70 ℃冰箱中保存。取样品蛋白质100 μg,用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白、转膜、封闭，依次加入一抗4 ℃孵育过夜，二抗孵育2 h后，ECL发光液孵育5 min后，置于图像分析系统进行图像扫描及强度分析。

1.2.5 统计学处理 所有数据以均数±标准差（x±s）表示，使用SPSS 13.0统计软件对实验数据进行单因素方差分析，多重比较采用LSD法，P

2 结 果

2.1 ox-LDL对THP-1细胞凋亡的影响 各组细胞经流式细胞仪检测结果发现,对照组细胞生长良好， ox-LDL处理的细胞则出现凋亡细胞。与对照组相比差异有统计学意义（P

表1 不同浓度ox-LDL作用THP-1细胞

48 h后凋亡情况（x±s）%

表2 75 μg/mL ox-LDL作用于THP-1细胞

凋亡情况（x±s）%

2.2 各组细胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表达 常规培养的对照组无GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白的表达，用50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL浓度的ox-LDL培养细胞48 h后 GRP78、CHOP、Caspase-12表达均增加。详见图 1。

注：1为对照组，2为50μg/mL组，3为100μg/mL组，4为200 μg/mL组。

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图1 各组细胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表达

3 讨 论

细胞凋亡是动脉粥样硬化病变的主要特征之一,其中巨噬细胞凋亡贯穿动脉粥样硬化的整个过程。巨噬细胞泡沫化及其最终凋亡的过程中泡沫细胞聚集坏死形成脂核并使其不断增大,导致临件发生［5］。内质网是细胞内蛋白质折叠和钙离子存储的主要场所，对多种生理功能的完成具有重要意义。然而，细胞内外环境的改变导致内质网腔内氧化环境被破坏，钙代谢紊乱，突变的蛋白质产生或蛋白质的二硫键不能形成，大量异常的蛋白质聚集在细胞内，内质网的稳态失衡，这种内质网功能紊乱状态被称为内质网应激［6］。 GRP78被认为是内质网稳态的中心调节剂，也被认为是内质网应激的标志，但是过强或时间过长的内质网应激可能会导致细胞死亡［7］。Caspase-12 激活是触发内质网应激相关凋亡途径的重要信号转导通路。Caspase-12 以酶原形式存在于内质网膜胞浆侧,在ERS 时被特异激活而诱导细胞凋亡［8］。CHOP也是触发内质网应激相关凋亡途径的重要信号转导通路。CHOP 又称生长停滞及DNA 损伤基因（Growth Arrestand DNA Damage Induciblegene 153,GADD 153）,存在于细胞浆内,在ERS 时被活化转位至细胞核,通过下调Bcl-2 表达而促进细胞凋亡。 本实验以不同浓度的ox-LDL与THP-1细胞共同培养不同时间,结果发现ox-LDL以时间和浓度依赖的方式诱导THP-1细胞的凋亡。ox-LDL浓度为100 μg/mL作用48 h最明显。随着时间的延长和浓度增加THP-1细胞凋亡呈递增后递减变化。内质网应激启动的凋亡途径是近年才发现的一种新的凋亡途径，用ox-LDL培养人THP-1细胞并检测Caspase12、CHOP、GRP78蛋白的变化来探讨ox-LDL是否通过内质网应激途径诱导细胞凋亡。结果发现100 μg/mL 的ox-LDL作用于细胞48 h后,GRP78、Caspase-12、CHOP的表达都明显增加,提示ox-LDL可以通过内质网应激引发细胞凋亡。 不同于线粒体介导的凋亡途径，ERS引起的细胞凋亡有一套自身的信号传递通路，称为内质网相关性死亡（ER-associated death，ERAD）途径，而且参与ERS 的分子伴侣和感受蛋白是ERS 特异诱导的，因此能够作为治疗相关疾病的有效靶点。

参考文献:

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作者简介：张峰娟（1981―），女，医师，现为山西医科大学2008级研究生（邮编：030001）；边云飞，工作于山西医科大学第二医院；刘金帅，工作于潞安集团总医院。

第7篇：单细胞研究范文

【关键词】 天花粉蛋白；，，HeLa细胞；，，细胞凋亡

摘要：目的研究天花粉蛋白(TCS)对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用， 探讨TCS抗肿瘤的作用机制。方法采用MTT法检测TCS对Hela细胞的抑制作用，形态学观察、DNA电泳及流式细胞仪检测TCS对HeLa细胞的诱导凋亡作用。结果TCS对HeLa细胞的生长具有明显的抑制作用，显微镜下可见细胞圆缩，胞浆凝聚等凋亡细胞的形态学改变，DNA凝胶电泳呈梯级格局，流式检测出现凋亡峰，凋亡比例具有剂量和时间依赖性。结论 天花粉蛋白通过诱导细胞发生凋亡而抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖。

关键词：天花粉蛋白； HeLa细胞； 细胞凋亡

Experimental Study of Trichosanthin's Effect on Hela Cells Proliferation

Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effect of trichosanthin(Tcs) on Hela cells and its anti-tumor mechanism.MethodsThe antiproliferative effect of TCS on Hela cells was measured with MTT assay. Light microscopy was used to observe the morphology changes ， DNA agarose electrophoresis and FCM analysis were carried out to examine the induced apoptosis.ResultsThe proliferation of HeLa cells was significantly inhibited by TCS， Hela cells showed a serial of characteristic changes of apoptosis such as cell volume shrinkage ， chromatin condensation; the occurrence of DNA ladder and apoptosis rate of Hela cells was dose and time dependent. Conclusion Trichosanthin can inhibit the proliferation of Hela cells by its induction of apoptosis.

Key words： Trichosanthin; Hela cell; Proliferation

宫颈癌是导致妇女死亡的第二大原因，严重威胁女性身体健康。天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）是从葫芦科植物栝楼（Trichosanthin kirilouii Maxim）的块根中提取出来的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome - inactivating protein ， RIP)，具有多种生物学效应，主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等作用［1］ 。目前，TCS的抗肿瘤研究主要集中在绒毛膜上皮癌、胃肠道肿瘤和白血病等方面［2～3］。本实验研究TCS对人宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用，并从诱导细胞凋亡的角度探讨其抗癌作用，为药物的进一步研究开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂 MEM培养基和胎牛血清（FBS）购自美国GIBCOBRL公司，碘化丙啶（Propidium Iodide ，PI）及RNase A (RNA酶)为Simga公司产品，噻唑蓝(MTT)购自Amresco公司。二甲基亚砜(DMSO)购自Fluka公司，TCS购自上海金山制药厂（纯品，规格为1.2 mg/ml）。

1.2 细胞培养人宫颈癌HeLa细胞为本室传代保存，培养于5%CO2，37℃湿化孵箱中。培养基MEM含10%FBS，0.1 U/L青霉素，0.1 U/L链霉素，取对数生长期细胞待用。

1.3 细胞生长抑制实验采用噻唑蓝(MTT)还原法进行检测:将Hela细胞接种于 96 孔细胞培养板内(每孔的细胞数为2×104个)，细胞贴壁后对照组换新鲜培养基，实验组换用含有不同浓度TCS的培养基，置 CO2 培养箱内分别培养 24 ，48，72 h ，去上清，加入 MTT 溶液200 μl/孔，置 CO2 培养箱内培养 4 h，去上清，每孔加入200 μl DMSO ，轻度振荡后，测定 570 nm 处光吸收值。取8孔吸收值平均数，按公式细胞抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值)×100%计算药物对细胞生长的抑制作用。

1.4 细胞凋亡的检测

1.4.1 细胞形态学观察 将处于指数生长期的Hela细胞以不同浓度的TCS处理后，倒置显微镜下观察Hela细胞的形态改变。

1.4.2 DNA琼脂糖凝胶电泳　胰蛋白酶消化收获实验组及对照细胞， 1 000 r/min离心5 min，PBS清洗细胞两遍， NP40溶液作用细胞沉淀，加入SDS(终浓度1%)及RNase(终浓度2 μg/μl)，56℃处理2 h，蛋白酶K(终浓度2 μg/μl)37℃作用3～5 h， 加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍体积的无水乙醇，轻轻振摇后置于-70℃冰箱中过夜， 14 000 r/min离心15 min，弃上清，用冰冷的 70％乙醇漂洗，1.2% 琼脂糖凝胶30 V电泳3～5 h，紫外观察拍照。

1.4.3 流式细胞仪检测分别离心收集对照组及实验组细胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定， 在10 000 r/min条件下离心5 min，去乙醇，PBS洗涤两次，弃上清；用0.5 ml PBS重悬，加入等体积的细胞裂解缓冲液室温作用5

min，加Rnase A (终浓度30 μg/ml)置37℃水浴中消化30 min，离心后再加人1m1 PI染色(终浓度50 μg/ml)避光染色30 min，以300目尼龙网滤过，上流式细胞仪检测， Multicycles 软件分析结果。

1.5 数据统计分析用 SPSS 10.0 for windows统计软件包作ANOV方差分析。

2 结果

2.1 MTT法测定结果20，40和80 μg/ml的天花粉蛋白分别作用于Hela细胞后，随着作用时间的延长，细胞的生长抑制率逐渐升高，且抑制率随药物浓度增加而上升， 呈一定的剂量、时效依赖性。结果见图1。

图1 TCS对Hela细胞作用的时间-剂量曲线（略）

2.2 Hela细胞的形态学改变 镜下可见(×200)对照组Hela细胞始终为多角形，梭形，贴壁牢固， TCS处理的Hela细胞逐渐变圆， 细胞体积缩小，胞浆凝缩， 折光率增强， 呈现凋亡细胞的形态改变。结果见图2。

图2 Hela 细胞形态改变（略）

2.3 DNA凝胶电泳图谱 凝胶电泳分析经不同浓度的TCS（20，40和80 μg/ml）处理48 h的Hela细胞DNA断裂成相差约200 bp的片段，呈现凋亡细胞的梯级（ladder）格局，而对照组细胞DNA无断裂现象。结果见图3。

图3 凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳（略）

2.4 细胞凋亡的检测 凋亡细胞在流式细胞仪直方图上可出现特征性的亚二倍体峰（sub―G1 peak）。由表1可见， 随着天花粉蛋白药物浓度的增大及作用时间的延长，凋亡细胞的比例增加，表明TCS诱导Hela细胞凋亡具有时间和剂量依赖性。

表1 凋亡细胞在各组标本中所占的百分比时间（略）

3 讨论

细胞凋亡是细胞生长、发育过程中发生的一种复杂的生理过程。Dunne等［4］发现肿瘤的发生与细胞凋亡的调节紊乱密切相关。有资料表明，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡而达到治疗的目的，有效的诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的新的手段之一［5］。天花粉蛋白(TCS)是一种有效并具有专一性的抗肿瘤药物，与一般化疗药物造成的肿瘤细胞和正常细胞两败俱伤的作用不同，它对人的外周血淋巴细胞、T细胞和羊膜细胞等正常体细胞影响极小［6］，具有显著优势。天花粉蛋白是Ⅰ型单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein ， RIP)，能进入细胞内直接使核糖体失活。TCS能够使绒毛癌细胞发生凋亡，其诱导凋亡的作用与胞内的Ca2+浓度升高和活性氧基团(reactiveoxygenspecies，ROS)的产生有关［7～8］。本实验将天花粉蛋白处理HeLa细胞后，HeLa细胞的生长受到明显抑制，出现凋亡的特征性改变：染色体凝聚、核碎裂等形态改变，凝胶电泳呈现典型的梯级（ladder）格局，流式结果可见特征性的亚二倍体峰，且凋亡细胞的比例随药物浓度的增高及作用时间的延长而增高。这些结果表明TCS对Hela细胞具有良好的抑制作用和明显的诱导凋亡效应，并具有浓度和时间依赖性，初步显示了良好的药物开发前景。对其抗癌机理进行深入研究，有望应用于宫颈癌等肿瘤的临床治疗。

参考文献：

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第8篇：单细胞研究范文

关键词 树突状细胞 流式细胞术 混合淋巴细胞反应

AbstractObjective:To induce and culture purity dendritic cells（DCs） of different maturation phase from human peripheral blood monocytes in vitro.Methods:The peripheral blood mononuclear cells were isolated from human peripheral blood with density gradient centrifugation.The first step was to work on a 7-day culture of monocytes in medium supplement with 100ng/ml rhGM-CSF and 5ng/ml rhIL-4,and the cells were actually immature.In the second step,the cells were cultured in the medium supplement with GM-CSF and TNF-α,and cultured until the 14th day.Mature DCs were obtained.Cells harvested were identified for their morphology by microscope,properties of DCs detected by FCM,function with MLR method.Results:Immature dendritic cells expressed CD1a molecules and costimulating molecules in middle level,HLA-DR in high level.In maturation phase DCs expressed costimulating molecules,HLA-DR molecules,CD83,and CD11c highly.These DCs could stimulate proliferation of allogenic T lymphocytes.Conclusion:The method to obtain DCs of different maturation phases from human peripheral blood monocytes is successfully set up.A number of DCs with high purity are obtained.

KeyWordsdendritic cells;flow cytometry;mixed lymphocyte reaction（MLR）

树突状细胞（dendritic cells，DCs）是沟通天然免疫和获得性免疫的桥梁，对于免疫反应的启动、进展以及免疫耐受的诱导至关重要［1，2］。很多学者应用体外大量扩增DCs，然后用肿瘤抗原冲击后回输患者治疗肿瘤，取得一定效果［3］。然而外周血中的含量也仅占单个核细胞总量的0.5%～1.0%，难以分离和纯化。本研究采用细胞因子（GM-CSF、IL-4、TNF-α）联合培养，在促成熟期不再加入IL-4的方法，获得成熟DCs。

资料与方法

一般资料：外周血：健康男性成人献血者，晨起空腹抽取肘静脉血。

主要试剂：重组人白细胞介素4（rh IL-4，Peprotech公司）；重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF，厦门特宝生物公司）；CD1α-FITC、CD80-FITC等单克隆抗体（BD公司）；DMSO（Sigma公司）。

方法：①DC的诱导培养：在离心管内加入体积比为1:1.5的淋巴细胞分离液和肝素化的新鲜稀释血液，离心25分钟，吸取界面层单个核细胞，用生理盐水洗涤2次，弃上清获得人外周血单个核细胞。将获得的单个核细胞用含10%自体血清的RPMI1640完全培养基将所得细胞重悬，混匀，调整细胞浓度为（2～3）×106个/ml，以1ml/孔加入24孔培养板中。将培养板置入37℃、5%CO2培养箱中，孵育6小时后，吸弃培养上清，祛除非贴壁细胞，即可获得贴壁的DC前体细胞。将获得的贴壁细胞用每孔加入含rhGM-CSF（100ng/ml）和rhIL-4（5ng/ml）的RPMI1640完全培养基1ml，隔天半量换液，A组培养至7天收集细胞，B组培养至7天换培养液即含rhGM-CSF（100ng/ml）和TNF-α（10ng/ml）的RPMI1640完全培养基1ml，隔天半量换液，培养至14天收集成熟DC细胞。培养期间用倒置相差显微镜下动态观察细胞形态变化和细胞生长趋势。②DCs表面相关表型的检测：将不同时期的DCs用PBS调至106/ml，加入离心管，每管20μl/106个细胞，加FITC标记的CD80、CD86、CD1a和PE标记的CD83、HLA-DR及APC标记的CD11c单抗，4℃冰箱避光孵育30～60分钟，PBS洗涤，用600μl PBS重悬细胞待测。③混合淋巴细胞反应：效应细胞制备，取异体的健康人外周静脉血，经上述方法获得PBMC，贴壁法获得非贴壁细胞，即为同种异体淋巴细胞。刺激细胞制备，培养7天和14天的DCs组，按刺激细胞:应答细胞（DCs:同种异体淋巴细胞）1:10、1:100及1:1000的比例加入96孔培养板，各100μl，每个样品设3个复孔，混合培养4天后，1000r/分，离心5分钟，弃去上清120μl，每孔加入5g/L的MTT 20μl，37℃、5% CO2条件下孵育4小时，1000r/分，离心5分钟，弃去全部上清，每孔加入DMSO 100μl，微型振荡10分钟，酶标仪490nm处测各孔吸光度（A）值，结果以3个复孔的均值表示。

统计学方法：使用SPSS统计学软件进行方差分析，以X±S表示。

结 果

DCs形态学观察：PBMC经2小时贴壁后，有部分细胞悬浮，多为B淋巴细胞和外周血DCs；当加入GM-CSF、IL-4过夜培养后，贴壁细胞数量较少，体积小；诱导2天，贴壁细胞伸展，呈高度多形性；培养5天，细胞形态不规则，粗细不等的毛刺多而密，呈现典型的DCs形态；第7天时正常组DC表面突起更加明显；当加入TNF-α后，成簇现象明显增多，并且大量突起交织；但随着时间的延长，梭形细胞减少，个别细胞开始增大变圆，在培养14天，几乎所有DCs均逐渐增大变圆，出现悬浮趋势。对于在7天之后未加TNF-α的A组细胞未出现B组细胞的成熟现象。结果见图1、2。

图1 第7天

流式细胞术检测细胞表面标志结果：按DCs常规培养7天后，再次检测DCs的特异标记，达到成熟水平；诱导14天后，DCs的成熟标记的表达量均高于7天组的表达量（P＜0.05），而DCs的CD1a标记的表达量两组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

混合淋巴细胞反应：7天组的DCs由于没有完全成熟，促进T细胞增殖的作用不明显，但经过促成熟因子TNF-α刺激后的DCs，达到完全成熟后，DCs明显促进同种淋巴细胞增殖（P＜0.05），并且随着DCs浓度的下降增殖效果减弱。见表2。

讨 论

本实验利用其外周血取材简单方便的优点，从中获得PBMC，在反复实验的过程中发现单核细胞属于贴壁细胞，然而在隔天换液的时候仍有较多的悬浮细胞，这些悬浮的细胞大多是B淋巴细胞，因此经长时间的贴壁培养加上在换液时将悬浮细胞祛除，便得到较多的纯度较高的单个核细胞分化而来的DCs。经过GM-CSF、IL-4联合诱导后，可以从每100ml外周血中获得9×106个未成熟的树突状细胞。由于IL-4在诱导过程中主要抑制培养体系中中性粒细胞和巨噬细胞生长，并维持DCs的未成熟状态。因此，在培养7天后本实验就用GM-CSF和TNF-α联合在诱导7天至其成熟，这样既节省了培养成本，又能获得成熟的DCs。

本实验结果表明人外周血诱导获得的DCs在形态学上完全符合不成熟、成熟的典型形态即树突样的突起以及后期变大变圆；表面分子的表达情况，在未成熟期时，DCs中度表达CD1a、CD80、CD86、CD83、CD11c、及HLA-DR；经过TNF-α诱导后，DCs成熟后，高表达CD80、CD86、CD83、HLA-DR及CD11c，对于树突状细胞表面表达的CD1a分子，在培养体系中加入TNF-α前后，期表达量变化不明显，可与其他表面分子共同作为区分未成熟DCs与成熟DCs表面标志物；通过混合淋巴细胞反应进一步验证了未成熟DCs只有较弱的激活T细胞的能力，经TNF-α诱导后变为成熟DCs就具有了强大的激活初始型T细胞的能力。

DCs的来源成为很多研究的瓶颈，本实验从简单方便的外周血中用细胞因子诱导出大量功能性的成熟DCs，为研究DCs的作用以及临床应用奠定了基础。

图2 第14天

参考文献

1 Casas R,Skarsvik S,Lindstr？m A,et al.Impaired maturation of monocyte-derived dendritic cells from birch allergic individuals in association with birch-specific immune responses［J］.Scand J Immunol,2007,66（5）:591-598.

第9篇：单细胞研究范文

【关键词】 缺血再灌注；凋亡；丹参；中药；综述

在肝、肾、脑等器官缺血再灌注损伤(Ischimia reperfusion injury,IRI)造成的细胞死亡形式中，凋亡也是一种常见而重要的形式[1-4]。组织细胞一旦坏死，目前人们尚无办法干预；但细胞凋亡是受一系列程序控制的过程，人们有可能通过干预死亡程序加以挽救。丹参经现代实验技术证实，对IRI时细胞过度凋亡有抑制作用，本文就此方面的内容予以综述。

1 丹参对IRI时细胞凋亡的抑制作用

Wu.W等[5]利用原位细胞凋亡标记(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated uridine nucleotide end labeling,TUNEL)实验观察到：左大脑中动脉结扎后24 h大鼠大脑皮层、尾状核、豆状核缺血区出现大量凋亡细胞，24~48 h达到高峰；预先给予丹参则在相应部位只见到少量凋亡细胞；且与对照组比较，24 h时间段组织损伤明显减轻。提示丹参可能通过减少神经细胞凋亡对脑IRI发挥保护作用。丹参是否对其他器官也有类似作用目前尚未明了。

2 丹参抑制IRI时细胞凋亡的作用机制

2．1 减少蛋白酶表达

细胞发生凋亡的中心环节是激活以蛋白酶-白介素-1转化酶(interleukin-1β-converting enzyme,ICE)组成的级联反应。ICE可在天冬氨酸残基之后将33KD的IL-1前体裂解为17．5KD的IL-1β，属于ICE蛋白酶超家族。

目前已发现13个成员，根据其序列同源性分为3个亚家族：ICE-样、ICE-1样和CPP32样蛋白酶。它们具有保守的底物结合和酶促序列，在天冬氨酸后将底物降解，故该酶现被称为半胱天冬蛋白酶(cysteine apartate-specific proteinase,caspase)，并把上述三个亚家族分别称为caspase-1、caspase-2和caspase-3亚家族。它们的过度表达将导致细胞凋亡的发生[6]。

张金涛等[7]利用S-P免疫组化法发现，前脑IRI后1 d，大鼠海马CA1、CA4区出现明显的ICE免疫阳性反应，第3天达高峰，第5天后明显减少；脑皮质也呈现出与海马区类似的现象，ICE免疫阳性反应细胞散在分布。与此相反，丹参组ICE的表达明显减少，特别是大脑皮层区和海马CA1区。因此，作者认为ICE在脑缺血中可能发挥重要的凋亡调节作用；丹参能下调脑缺血区ICE表达，从而发挥其神经保护作用。

2．2 阻断诱导细胞凋亡的信号转导

大多数情况下，来自于细胞外的诱导因素，如自由基、细菌、病毒等作用于细胞后转化为细胞凋亡信号，并通过胞内不同的信号转导途径最终激活细胞死亡程序，导致细胞凋亡。因此，凋亡信号转导系统是连接凋亡诱导因素与核DN段化断裂及细胞结构蛋白降解的中间环节[6]。丹参经实验证实，可干预下列已知的凋亡相关信号转导通路，从而实现其抗凋亡作用。

2．2．1 死亡因子及其受体介导的信号转导

肿瘤坏死因子(TNF)家族中的TNF、Fas 配体、TNF-相关凋亡诱导性配体(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL或 Apo2L)和Apo3L能诱导细胞凋亡，因此被称为死亡因子[6]。介导它们诱导凋亡的受体为死亡受体。在体内，TNF主要由巨噬细胞(Mφ)分泌。大量体内外实验证明，丹参不仅可有效抑制Mφ分泌TNF-α，还可以在基因水平抑制TNF-α在肝、肾、心等组织中的蛋白表达[8,9,10,18]。所以，丹参可能通过抑制TNF-α的生成和释放，减少IRI时细胞凋亡。但其具体受体后途径是抑制NF-κB还是JNF/AP-1则目前尚无文献报道。

2．2．2 第二信使钙诱导的凋亡

Ca2+是细胞凋亡发生过程中重要的信息分子。［Ca2+］i持续升高可使核酸内切酶激活，DN段化。应用膜联蛋白荧光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)双标记及流式细胞术、全细胞膜片钳放大系统显微荧光测定术同步观察H2O2诱导人类肝细胞(LO2细胞)、内皮细胞(EVC304)凋亡时不同时限Ca2+流变化和丹参提取物Rxa的影响时发现：①H2O2作用后0．5 h即出现Ca2+跃升现象；当［Ca2+］i>400 nmol/L后1 h出现典型的细胞凋亡膜翻转现象，即磷脂酰丝氨酸从细胞膜内层转移到外层；此后，［Ca2+］i持续升高，早期凋亡细胞(Annexia-V+)、死亡细胞(PI+)指数均上升；荧光显微镜下出现大量绿色荧光的早期凋亡细胞和胞浆或胞核红染的死亡细胞。同时［Ca2+］i上升了一个数量级；②在Rax处理组H2O2作用8 h后［Ca2+］i尚未超过400 nmol/L，与对照组比较差异显著(P400 nmol/L很可能是细胞凋亡启动的早期信号。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜转运，由此可能减少其在核内促进凋亡基因信号传递中的作用及其后引起的细胞凋亡，减轻细胞损伤。分析其机理可能是：①作为咖啡酰缩酚酸衍生物之一的Rax富含酚羟基，可和H2O2发生氧化反应，接受O-生成羧基-COOH，从而直接减轻H2O2对细胞膜及细胞器膜的损伤，减少Ca2+经细胞膜和内质网渗漏入细胞内；②因肝细胞Ca2+内流由钙-钙调蛋白复合物和IP3敏感钙池共同调节。故Rax对LO2极显著的Ca2+阻滞作用可能是直接作用于钙-钙调节蛋白受体，阻止受体操纵性钙通道开放所致[11]。

2．2．3 由线粒体损伤后启动的细胞凋亡 新近的研究证实，由活性氧(ROS)、细胞内Ca2+超载或缺血缺氧等病理因素也是诱发细胞凋亡的重要触发机制[11,12]。当这些死亡信号到达线粒体后，首先引起线粒体渗透性转换并释放凋亡相关蛋白，包括细胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后参与激活凋亡激活因子与caspase-9的结合及caspase-9的激活，后者继而激活caspase-3，从而导致细胞凋亡。IRI时ROS生成过多，细胞内Ca2+超载，线粒体受损，诱导细胞过度凋亡[6]。丹参具有强大的清除自由基、减轻钙超载、保护线粒体结构和功能的完整等作用，因而可切断上述诱导因素的产生，阻断了此通路启动的细胞凋亡[13-15,17]。

2．3 调节凋亡相关基因表达

细胞凋亡是级联式基因表达的结果。目前已知细胞凋亡相关基因多达数十种，根据功能不同分为三类：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl-2，其中对Bcl-2的研究最为详细而系统；促进凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；双向调控基因，如J-myc、Bcl k等。正常情况下，促进凋亡基因与抑制凋亡基因处于协调的对立统一状态，IRI时这种平衡被打破，组织细胞凋亡增多[2]。

张金涛等[7]报道BcL-2在前脑缺血2 h就有表达，于6 h达高峰，其后减少。此变化以海马CA1区最为显著。说明BcI-2主要在细胞凋亡早期发挥作用。丹参在缺血30 min给予后，BcL-2的表达明显增加。赵明中等[15]采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫组化法进一步证实复方丹参滴丸不仅可以使BcL-2蛋白的阳性表达数(PEI)明显增加，还可使心肌细胞凋亡指数及Fas蛋白PEI下降。且随着复方丹参滴丸的剂量加大而进一步降低(P

综上所述，丹参作用广泛，对IRI细胞凋亡各环节都有调节作用，从细胞、分子及基因水平阻断了IRI发生发展过程中因细胞凋亡引起的一系列“恶性循环”，从而表现出对IRI显著的保护作用。因此，丹参对减轻IRI来说是一种十分理想的药物，在临床上具有广阔的应用前景；同时丹参的抗凋亡作用也为临床上治疗因凋亡过度引起的疾病提供了一条新思路。

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