细胞的生物学特性精选(九篇)
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第1篇：细胞的生物学特性范文
0.009）；单克隆p75NTR阳性细胞再培养2周后，p75NTR阳性细胞率分别降为14.5%（Tca-8113）和5.8%（Cal-27）；p75NTR阳性细胞体外增殖能力显著增强，且具有明显的侵袭迁移能力。结论 p75NTR阳性舌鳞状细胞癌细胞具有肿瘤干细胞的特性。
[关键词] 舌鳞状细胞癌； 肿瘤干细胞； p75神经营养蛋白受体
[中图分类号] R 739.86 [文献标志码] A [doi] 10.7518/hxkq.2014.01.005
Study of the biological characteristics of p75 neurotrophin receptor positive tongue squamous cell carcinoma cells Tong Dongdong1，2， Zhang Fenghe1，2， Yao Yao3， Zhang Zhaotao1，2， Wang Jinbing1，2， Li Qing1，2， Zhang Xinlian1，2. （1. Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Stomatology Hospital of Shandong University， Jinan 250012， China； 2. Shandong Provincial Key Labo-ratory of Oral Biomedicine， Jinan 250012， China； 3. Dept. of Stomatology， Anhui No.2 Provincial People’s Hospital， Anhui 230022， China）
[Abstract] Objective To study the biological characteristics of p75 neurotrophin receptor positive （p75NTR+） tongue squa-mous cell carcinoma cells which were separated by flow cytometry cell sorting. Methods To determine the biological cha-racteristics of p75NTR+ cells which were separated from Tca-8113 and Cal-27 tongue squamous cell carcinoma cells by flow cytometry cell sorting， including study the capacity of cloning， 3-（4，5）-demethylthiazo（z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide （MTT） assay， wound healing assay. p75NTR+ cells with non-sorted cells were as control group. Results In Tca-8ll3 and Cal-27 tongue squamous cell carcinoma cell lines， the percentage of p75NTR+ cells were 3.1% and 1.9%. Compared with p75NTR+ cells with non-sorted cells， p75NTR+ cells possess higher capacity of cloning （Tca-8113， P=0.024； Cal-27， P=0.009）. The per-centage of p75NTR+ cells of the progeny cells generated from monoclonal p75NTR+ cells decreased to 14.5% （Tca-8113） and 5.8% （Cal-27） after cultured two weeks. p75NTR+ cells possessed higher proliferation ability and higher metastasis ability than non-sorted cells. Conclusion p75NTR+ cells isolated from tongue squamous cell carcinoma have the characteristics of cancer stem cells.
[Key words] tongue squamous cell carcinoma； cancer stem cells； p75 neurotrophin receptor
肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSCs）是肿瘤组织中具有自我更新、多向分化及较强增殖能力的少量干细胞样癌细胞亚群，是肿瘤起源、生长、转移与复发的根源所在。近年来，寻找靶向杀死肿瘤干细胞的抗癌策略已成为研究的热点。其中，选择何种细胞表面标志物来证实舌癌中肿瘤干细胞的存在并完成对肿瘤干细胞的提取和鉴别是首要亟待解决的问题。研究发现p75神经营养蛋白受体（p75 neu-rotrophin receptor，p75NTR）的表达与多种肿瘤的发生和发展相关，并已证实其在全身多种肿瘤中可以作为一种肿瘤干细胞的表面标志物[1]。本实验采用p75NTR对舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113及Cal-27进行标记、检测、分选，并对分选后的p75NTR阳性细胞进行生物学特性研究，探讨p75NTR作为肿瘤干细胞标志物和预测口腔鳞状细胞癌愈后指标的可能性，为深入研究舌鳞状细胞癌的发病机理和寻找新的治疗靶点提供线索。
1 材料和方法
1.1 材料
Tca-8113、Cal-27细胞株来源于口腔舌鳞状细胞癌，由上海交通大学附属第九人民医院口腔颌面外科肿瘤生物实验室惠赠。Tca-8113细胞株用含10%FBS（杭州四季青生物工程材料研究所）的RPMI1640培养液培养。Cal-27细胞株用含10%FBS（GIBCO公司，美国）的高糖DMEM培养液培养。PE标记的鼠抗人p75NTR抗体及PE标记的小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ抗体均购自美国BD公司。
1.2 流式细胞仪检测p75NTR阳性细胞的表达
将生长状况良好并处于对数生长期的Tca-8113细胞制备成单细胞悬液，并且调整细胞密度为1.0×106个·mL-1 。实验分为2组，实验组加入100 μL PE标记小鼠抗人p75NTR抗体，对照组加入等量的PE标记小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ。放入冰里置于震荡箱中蔽光孵育半小时，1 000 r·min-1离心5 min，吸弃上清后Buffer I l mL冲洗吹打（反复冲洗、离心2次），重悬于400 μL PBS中。将加入等量PE标记小鼠骨髓瘤蛋白IgG1，κ的对照组先上机调节机器参数，然后取实验组上机检测细胞荧光值，分析p75NTR阳性细胞的百分含量，重复3次取平均值。同法处理Cal-27细胞。
1.3 p75NTR阳性细胞生物学特性检测
1.3.1 以p75NTR为标记分选阳性细胞作为实验组 将生长状况良好并处于对数生长期的较大数量的2种舌鳞状细胞癌细胞（约1.0×108个·mL-1）如上法处理后上机进行高速分选，获得p75NTR阳性细胞，作为实验组。为了保证分选后富集的p75NTR阳性细胞的纯度，分选时选取强阳性区域。重复上机一次，以避免标记物丢失造成的阳性率偏低。并取适量分选后的细胞上机检测p75NTR阳性细胞的纯度。
1.3.2 对照组处理 将同等条件培养的2种舌鳞状细胞癌细胞系细胞制备成单细胞悬液，加入PE标记小鼠抗人p75NTR抗体，放入冰里置于震荡箱中蔽光孵育半小时，再放入离心机离心5 min（1 000 r·min-1），弃上清后Buffer I l mL冲洗吹打（反复冲洗、离心2次），作为对照组备用。
1.3.3 单克隆培养 取对数生长期的2组细胞于超净台中常规消化制成单细胞悬液后，用有限稀释法接种于96孔板中。5%CO2、37 ℃饱和温度环境培养观察细胞贴壁情况，记录仅有一个细胞的孔，并做标记。2周后统计单克隆形成率。收集p75NTR阳性细胞形成的单克隆细胞，培养于培养瓶中，再培养2周后进行p75NTR的流式细胞检测。
1.3.4 四甲基偶氮唑盐比色法[（3-（4，5）-demethylthiazo
（z-y1）-3，5-diphenytetrazoliumromide，MTT]实验 收集2组细胞，分别接种于96孔细胞培养板中（每孔约4×103个细胞）（周边空不加），再各加入200 μL培养液（周边空不加，B3孔只加入PBS作为对照）。培养24 h后，换液，B3孔换200 μL PBS。每孔加入20 μL MTT溶液，培养4 h后吸出上清液，加入150 μL二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），置于摇床上低速震荡10 min。以B3孔为调零孔，上酶联免疫检测仪，以490 nm吸光度值量化活细胞数，每次检测一竖列的6个平行孔，每组所得数据取平均值，连续检测7 d。以生长时间为横坐标，以光密度（op-tical density，OD）值为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。
1.3.5 划痕实验 将2组细胞以每孔1×105个的密度接种于六孔板中，待细胞生长到80%～90%时，无菌条件下更换为无血清的培养基，继续培养12 h后，于超净台中用200 μL枪头在每个孔的中间划一条竖直的线，PBS冲洗3遍。每孔加入2 mL完全培养液，倒置显微镜下观察并拍照记录。之后每天换液，拍照，连续8 d。
1.4 统计学分析
采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。各组间的比较采用χ2检验进行分析，P
2 结果
2.1 流式细胞仪检测p75NTR阳性细胞的表达
舌鳞状细胞癌细胞株Tca-8113、Cal-27细胞中，p75NTR阳性细胞的比例分别为3.1%和1.9%。
2.2 流式细胞分选及纯度检测
分选后p75NTR阳性细胞的比例分别为98.1%（Tca-
8113）和97.4%（Cal-27）。这表明目的细胞阳性率比较高。
2.3 单克隆培养
2组单克隆形成能力的比较见表1。从表1可见，只有小部分细胞能持续分裂增殖。实验组的单克隆形成能力高于对照组（Tca-8113细胞，P=0.024；Cal-
27细胞，P=0.009）。这表明p75NTR阳性细胞具有自我更新和分化能力。单克隆细胞再培养2周后，Tca-
8113的p75NTR阳性细胞率降为14.5%，Cal-27的p75NTR阳性细胞率降为5.8%。
2.4 MTT实验
细胞生长曲线（图1、2）表明：2组细胞第1天生长情况无明显差异，从第3天之后实验组细胞较之对照组细胞体外增殖能力明显增强，第5天及第7天时更加显著（P
2.5 划痕实验
划痕后7 d，实验组较对照组具有明显的愈合能力（图3、4）。Tca-8113实验组到第8天已经基本被细胞长满，而对照组却仍有空白区域（图5），Cal-
27实验组到第5天已经基本长满划痕区域，完全长满需要7 d（图6）。这说明实验组具有明显的侵袭迁移能力。
图 1 2组Tca-8113细胞生长曲线（MTT实验）
Fig 1 Cells growth curve of Tca-8113 of two groups （MTT test）
图 2 2组Cal-27细胞生长曲线（MTT实验）
Fig 2 Cells growth curve of Cal-27 of two groups （MTT test）
图 5 2组Tca-8113细胞不同时间的划痕距离比较
Fig 5 The comparison of scratch distance in different times of Tca-
8113 of two groups
图 6 2组Cal-27细胞不同时间的划痕距离比较
Fig 6 The comparison of scratch distance in different times of Cal-
27 of two groups
3 讨论
肿瘤干细胞是肿瘤起源、生长、转移与复发的根源所在。近年来，通过对其生物学特性的研究，寻找靶向杀死肿瘤干细胞的抗癌策略成为研究的热点。p75NTR是一种神经营养因子的低亲和力受体，可通过不同的信号传导通路诱导细胞发生增殖、分化、迁移、凋亡等生物学行为。近年来，研究发现p75NTR的表达与胃癌[2] 、视网膜成神经细胞瘤[3]、前列腺癌[4]、胰腺癌[5]、黑色素瘤[6]等多种肿瘤的发生和发展相关，并已证实其在全身多种肿瘤中可作为一种肿瘤干细胞的表面标志物[1]。本实验检测发现p75NTR在舌鳞状细胞癌细胞系Tca-8113及Cal-27中都有阳性表达，且其阳性率分别为3.1%和1.9%。这与以往报道中肿瘤干细胞数量相当[7-8] 。
肿瘤细胞的克隆形成能力与其致瘤能力呈正相关[9]，并且只有肿瘤干细胞具有单克隆形成能力和强致瘤性[10-11]。本研究单克隆培养实验发现两个细胞株的p75NTR阳性细胞的体外单克隆形成能力相对于未分选的细胞均显著增强，符合其是具有自我更新能力的肿瘤干细胞的理论。同时，本实验利用流式细胞仪检测发现单克隆4周后的p75NTR阳性细胞的p75NTR阳性率明显下降，其分化产生了大量p75NTR阴性细胞，该结果说明p75NTR阳性细胞具有较强的克隆形成能力并具有一定的分化潜能。
本研究用MTT法对舌鳞状细胞癌细胞株Tca-8113和Cal-27中的p75NTR阳性细胞及未分选细胞的体外增殖能力进行测定，发现p75NTR阳性细胞的生长速度明显快于未分选的细胞，这也表明p75NTR阳性细胞具有较强的增殖能力，符合其作为肿瘤干细胞的特性。侵袭转移是恶性肿瘤最重要的生物学行为，是导致手术、放疗、化疗失败和患者死亡的主要原因。划痕实验证明p75NTR阳性细胞具有更强的迁移能力。由于2种细胞的生长速度差别较大，所以在划痕实验中没有做同期的横向比较。
综上，笔者认为p75NTR可作为舌鳞状细胞癌干细胞的一种表面标志物。由于本课题组前期实验发现p75NTR在正常舌组织中是阴性表达的[12]，那么针对p75NTR这个新的靶点对肿瘤进行的治疗就不会对正常舌干细胞构成伤害。当然，针对临床应用还需要更深入的研究，但是相信随着研究的不断进展，其将有望为舌癌的临床预防和诊治开辟新的思路和策略。
[参考文献]
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第2篇：细胞的生物学特性范文
【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞鉴定
【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0346-02
骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是来源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的优点，是理想的组织工程种子细胞［1］具有多向分化和自我复制潜能,易于自体采集、无免疫排斥反应、避免伦理学限制等优点,在细胞治疗方面得到了广泛的应用。但是BMSCs在骨髓微环境中所占比例极少,使用何种简单操作方法快速获取形态均一和纯度较高的BMSCs便成为该研究领域关注的焦点［2］。本实验采用全骨髓贴壁细胞培养法和密度梯度离心法相结合分离、纯化BMSCs，通过体外培养扩增，以及流式细胞术鉴定，建立稳定的BMSCs培养扩增方法。
1 材料与方法
1.1 实验动物：日本大耳白兔4只，4周龄，雌雄不限，体重250~300g，购于兰州生物制品研究所。
1.2 主要试剂及仪器：二氧化碳培养箱(BB16UV型,德国Heraeus公司)、超净工作台(VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司)、倒置相差显微镜、超声波清洗仪、纯净水系统、酸度计、台式高速离心机(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、低糖培养基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、流式细胞抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。
1.3 兔BMSCs的采集： 取4周龄日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空针空气栓子经耳缘静脉注入，待兔死亡后，将其全部浸泡于75%酒精溶液内8~10分钟，在无菌环境下切开前后肢皮肤，切下兔前后两肢，剃去覆盖于肱骨、胫骨及股骨上的肌肉组织，注意保留骨的完整性，用组织剪分离股骨、胫骨及肱骨，将其置于无菌培养皿中，纵向依次剪开各长骨两端，5ml注射器沿剪开的骨端注入L-DMEM冲洗3次，收集冲洗液约10ml，用筛网过滤冲洗液，加入完全低糖培养基重悬组织冲洗液，吸管反复吹打混匀，1000 r/ min ，4 ℃，离心 5 min ，弃去上清。再次加入适量完全低糖培养基，吹打混匀，分别加入一次性培养皿中，放入37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养（图1）。
1.4 兔 BMSCs 培养：1.4.1 原代 BMSCs 培养 向分离得到的细胞组织悬液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的 L-DMEM 培养基重悬细胞，并转移至中号塑料培养皿内。将培养皿置于37 ℃，体积分数为 5 %的 CO2孵箱中培养。培养 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培养基换液。原代培养 5-7 天后，细胞融合可达 80 %以上。将原代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成和细胞形态（图2）。
1.4.2 传代 BMSCs 培养 待原代细胞铺满培养瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化贴壁细胞，FBS 终止消化后将细胞悬液以 1:3 比例接种于新培养瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培养基 5ml 培养，每隔 2 天换液，约 3-4 天后细胞可铺满瓶底。将传代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞形态。以此方法，向后传至三代（图3、4）。
1.5 兔 BMSCs的鉴定
对干细胞的鉴定主要是建立在对细胞表面标记物的识别基础上，采用流式细胞仪特有的细胞分析技术，可在短时间内精确分析出细胞表型以及其所占有的比例，使用间接标记法标记 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重悬，PBS 洗涤细胞 3次，向细胞悬液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀释 1:100） 为一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗涤细胞 3 次后放入流式细胞仪中检测。记录数据（图5、6）。
2 讨论
BMSCs具有贴壁性、具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。
2.1更好地增加BMSCs的贴壁性： 在BMSCs培养中，细胞贴壁培养与传代成功与否是本实验的关键。其中存在很多问题，比如在细胞贴壁方面，用一次性塑料培养皿效果要优于可重复使用的玻璃培养瓶、培养皿。塑料培养皿内壁有一层鼠尾胶原，它可以更好地促使骨髓间充质干细胞贴壁。
2.2 培养基最佳的酸碱度： 培养基中加碳酸氢钠的目的，是为了在二氧化碳培养箱中平衡培养基中的PH值。对于GBICO的DMEM培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是2g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，液体中的二氧化碳会气体分压高于大气，因此会逐渐溢出，浓度逐渐降低，液体的PH值也逐渐升高，如果DMEM在空气中存放时间过长，它将有可能变成紫红色。一般新配置的颜色正常，在多次开盖，培养液接触空气的时间较长后，颜色会逐渐变成紫红色，笔者的做法是，配制培养液时加hepes，用小容量的分装瓶分装，及尽量减少培养液与空气的接触时间。配培养基时，将酸碱度调至6.9-7.0，过滤后酸碱度会适当增高。
2.3 传代的注意事项
2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化时间：具笔者在试验中的观察，在BMSCs传代过程中，根据培养瓶、培养皿或培养板中贴壁细胞的覆盖率确定，当BMSCs贴壁达到80%-90%就可以传代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差显微镜下观察，当细胞70%由原来的纺锤状、梭形变化为椭圆形时为最佳时间，一般为1至2分钟。
2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打时间与次数 ：加入EDTA-胰酶后，静置1分钟，在镜下观察细胞变椭圆或圆形，并有轻度漂浮时，用尖吸管轻轻吹打3-6次即可。
2.3.3 骨髓间充质干细胞特异性标志物： 虽然目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物，Pittenger等认为CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3为间充质干细胞的重要标志物［3］。
综上所述，对 BMSCs 的形态学观察和表型分子鉴定实验均证实培养传代的 BMSCs 的生物学特性并未发生明显改变，说明本实验的分离培养扩增方法安全有效。本实验成功的建立了一系列分离、体外培养和扩增兔 BMSCs 的实验方法，为进一步组织工程研究奠定了实验基础。
参考文献
［1］ 兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243
［2］骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 陈建梅姚荣伟 李勇 张馥敏 江苏医药2010年10月第36卷第19期2306-2308
第3篇：细胞的生物学特性范文
关键词：5-aza-dc；延边奶山羊；细胞活率；细胞形态；细胞凋亡
中图分类号：S827 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）12-2862-04
Effect of 5-aza-dc on the Biological Characteristics of Yanbian Dairy Goat Ear Fibroblast Cell
CAI Li-juan，YIN Duo，ZHUANG Li-li，FNAG Nan-zhu，LI Zhong-shu
（Animal Genetic and Breeding Reproduction Laboratory， Agricultural College， Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）
Abstract： To research the effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on biological characteristics of Yanbian dairy goat ear fibroblast cell， MTT method was used to determine the optimal action concentration and time of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cells. PI and Hochest33342 double staining， agarose gel electrophoresis were used to detect apoptosis of the cells； and karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes. The results showed low concentration（≤0.010 μmol/L） of 5-aza-dC treatment for 72 h had little effect on the cells. With the increasing of concentration， cell morphology， viability， apoptosis and chromosomes were all significantly affected. The best processing time of 5-aza-dc was 72 h， low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and karyotype change.
Key words： 5-aza-dc； Yanbian dairy goat； cell morphology； cell viability； cell apoptosis
体细胞核移植是哺乳动物胚胎工程的主要组成部分，也一直是研究的热点。然而核移植研究中仍然存在着许多问题，如核移植效率低、胚胎发育异常、流产、畸形等。大量研究表明，体细胞核移植所用的供体细胞（成纤维细胞、颗粒细胞等）都是高度分化的细胞，具有较高的甲基化水平，在与受体细胞融合时需要经过去甲基化才能维持胚胎正常发育，如果重构胚基因组DNA的甲基化模式存在异常，可引起特定基因转录模式发生改变，从而导致重构胚发育异常。因此，有必要寻找一种降低DNA甲基化水平，进而改善核移植效率的方法。5-氮-2′-脱氧胞嘧啶核苷（5-aza-dc）是一种DNA甲基转移酶抑制剂，为正常胞嘧啶核苷的类似物。在细胞内这种核苷类似物可以转化为脱氧核苷三磷酸，并在DNA复制的过程中替代正常的胞嘧啶核苷酸参与到延伸的DNA链中，一旦进入DNA双链后，它们所含有的修饰碱基——5-氮胞嘧啶可以与DNA甲基转移酶共价结合，使酶的活性降低，最终使处理细胞基因组DNA发生去甲基化；有研究表明DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-dc处理牛供体细胞，能有效降低其甲基化水平[1，2]。舒金辉[3]利用5-aza-dc（0.005～0.09 μmol/L）处理水牛成纤维细胞，显著降低了供体细胞的甲基化水平并提高了随后核移植的效率。延边奶山羊耳成纤维细胞作为延边奶山羊体细胞克隆的核供体有重要的研究意义。因此，本研究旨在探讨5-aza-dc对延边奶山羊体细胞克隆供体细胞的影响，为提高延边奶山羊体细胞克隆效率提供参考。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
1.1.1 试剂 DMEM、EDTA、DMSO、5-aza-dc（DMSO预融，超纯水配制成0.25 mg/mL的浓缩液备用）、PI、Hochest33342、MTT、Giemsa染液、胰蛋白酶及其他基础药类均购自SIGMA中国有限公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，DNA提取试剂盒购自宝生物（大连）有限公司。
1.1.2 材料 延边奶山羊耳部组织块。剪取奶山羊（母）耳部血管较少处组织，大约1.5×2.0 cm2。用PBS冲洗1次，75%酒精浸泡30 s，再用PBS冲洗3次，最后将组织块剪碎。经过3～5次PBS及胰蛋白酶洗涤后，均匀接种于25 cm2培养瓶中，5 h后加含15% 胎牛血清的DMEM培养液[4]。每3～5 d换液1次。当原代细胞汇合至80%时，消化传代，3代以后的成纤维细胞可用于试验。
1.2 试验方法
1.2.1 5-aza-dc处理延边奶山羊耳成纤维细胞 取3代以上的延边奶山羊耳成纤维细胞，消化传代，调整细胞密度为105个/mL，接种于24孔或96孔培养板，待细胞处于对数生长期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培养液分别培养。5-aza-dc的浓度设定为0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L。
1.2.2 5-aza-dc对细胞活率的影响 不同浓度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc各处理成纤维细胞24、48、72、96 h后，96孔板每孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，作用4 h 后，吸出培养液，每孔添加150 μL DMSO，振荡10 min，酶联反应仪测492 nm处的OD值。
1.2.3 5-aza-dc对细胞形态的影响 不同浓度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc处理成纤维细胞72 h后，显微镜下观察细胞形态。
1.2.4 5-aza-dc对细胞染色体的影响 不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72 h后，换液，每孔添加50 μL秋水仙素，2.5～3.0 h后，消化悬浮细胞，1 000 r/min 离心10 min，37 ℃预温的0.075 mol/L KCl低渗处理30 min后，用新鲜固定液（甲醛∶冰醋酸=18∶7，V/V）固定细胞2次，最后用0.5～1.0 mL固定液悬浮细胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油镜观察[5]。每组处理选取一定数量的清晰分裂相，记录变异的染色体数目。
1.2.5 5-aza-dc对细胞凋亡的影响
1）Hochest33342/PI双染法荧光显色法检测细胞凋亡。不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72 h后，消化悬浮细胞，调整细胞密度为106个/mL，加入5 μg/mL的Hochest33342荧光染色，37 ℃避光孵育10 min，离心去上清，用培养液悬浮，加入5 μg/mL的PI染色液，4 ℃冰箱孵育15 min，荧光显微镜下观察[6]。
2）琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡。不同浓度（同上）的5-aza-dc处理成纤维细胞72 h后，消化收集细胞于1.5 mL离心管中，5 000 r/min离心5 min，500 μL PBS悬浮细胞后，按DNA提取试剂盒步骤提取DNA，1.5%琼脂糖凝胶电泳。
1.3 数据分析
试验所得数据使用SPSS17.0进行分析，采用单因素方差分析（One-way ANOVA）的方法处理数据。
2 结果与分析
2.1 5-aza-dc对细胞活率的影响
由表1可知，不同浓度的5-aza-dc分别培养延边奶山羊耳成纤维细胞24、48、72、96 h后的细胞活率，比较可知72 h组效果较好，且与48 h、96 h组差异不显著，因此后续试验中细胞均处理72 h。
2.2 5-aza-dc对细胞形态的影响
由图1可知，未经5-aza-dc处理的细胞生长状态良好，接触紧密，细胞大小均一，生长速度较快。而经过5-aza-dc处理后的细胞随着5-aza-dc浓度的升高，细胞变得细长，生长缓慢，细胞间隙增大，形态不规则，甚至有的地方细胞大片脱壁死亡。
2.3 5-aza-dc对细胞染色体的影响
采用常规核型分析方法，分析不同浓度的5-aza-dc处理的延边奶山羊耳成纤维细胞，每个处理组选取50个分散较好的清晰分裂相，统计畸变染色体概率。由图2可知，当浓度≤0.010 μmol/L时，染色体畸变率对照组与其他两组差异不显著；当浓度≥0.030 μmol/L时染色体畸变率显著增加，出现多倍体（图3）。当浓度达到0.1 μmol/L时，染色体畸变率达到12%。
2.4 5-aza-dc对细胞凋亡的影响
2.4.1 Hochest33342/PI双染法荧光显色法检测细胞凋亡 Hochest33342/PI双染色后，在荧光显微镜下可见凋亡细胞呈强蓝色、弱红色荧光，坏死细胞呈强红色，而正常的细胞则呈弱蓝色荧光。当浓度为0、0.005、0.010 μmol/L时，凋亡细胞较少；浓度≥0.030 μmol/L时出现较多凋亡细胞；浓度为0.100 μmol/L时，细胞凋亡增加，死细胞数目也增多。如图4所示。
2.4.2 琼脂糖凝胶电泳法检测细胞凋亡 由图5可知，当浓度≤0.010 μmol/L时，细胞无拖带现象，说明无凋亡细胞；浓度≥0.030 μmol/L时开始出现拖带现象，说明出现凋亡细胞；浓度为0.050、0.100 μmol/L时，细胞大量凋亡，拖带现象明显。
3 讨论
3.1 5-aza-dc对细胞活率、细胞形态的影响
5-aza-dc是一种典型的DNA甲基转移酶抑制剂，为胞嘧啶核苷的类似物。Kumar等[7]利用0、0.5、1.0、2.0、3.0 μmol/L的5-aza-dc处理第五代猪胎儿成纤维细胞（PFF），发现不同浓度的5-aza-dc均抑制PFF的生长，较高浓度的5-aza-dc处理会导致细胞的形态和染色体的倍性发生改变。Enright等[8]对供体成纤维细胞进行5-aza-dc处理后发现高剂量5-aza-dc（0.08～0.31 μmol/L）可以降低细胞甲基化水平，其研究也发现5-aza-dc处理72 h为最佳处理时间。鉴于5-aza-dc对细胞的毒性作用，本试验采用较低浓度的5-aza-dc（0～0.100 μmol/L）处理延边奶山羊耳成纤维细胞。结果表明，经5-aza-dc处理后的细胞生长速度、形态等与对照组相比无明显差异，说明延边奶山羊耳成纤维细胞对5-aza-dc具有较强的耐受性。但是随着处理时间的延长，细胞形态改变、死亡数增多，逐渐出现脱壁等现象，这可能是与5-aza-dc对细胞的毒性有关。这与Kumar等[7]的试验结果一致。
3.2 5-aza-dc对细胞染色体的影响
有研究证明，供体细胞的培养环境以及药物等处理会导致其染色体异常，进而引起随后NT胚胎染色体异常，说明在核移植前首先检查供体细胞的染色体还是必要的[9]。本试验使用常规染色体核型分析方法，即经低渗、固定、Giemsa染色等步骤后，滴片制备染色体标本。结果表明，高浓度的5-aza-dc对细胞染色体有致畸作用，浓度越高染色体出现异常的几率越大；而低浓度（≤0.010 μmol/L）对染色体影响不大。通过琼脂糖凝胶电泳实验进一步验证高浓度的5-aza-dc对染色体的影响，可见明显的拖带现象，分析原因可能是染色体结构发生改变，如断裂等。
3.3 5-aza-dc对细胞凋亡的影响
PI、Hochest33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hochest33342则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期凋亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。本研究用5-aza-dc处理延边奶山羊耳成纤维细胞72 h后，观察不同的浓度对细胞凋亡的影响，采用Hochest33342和PI双染色法检测细胞凋亡，在荧光显微镜下可见凋亡细胞呈强蓝色、弱红色荧光，坏死细胞呈强红色，而正常的细胞则呈弱蓝色荧光。正常细胞和中早期凋亡细胞均可被Hochest33342着色，但是正常细胞核的Hochest33342着色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而凋亡细胞的核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状。细胞凋亡最明显的生化特征是Ca2+、Mg2+依赖的内源性核酸酶的激活，细胞核染色体从核小体间断裂成180～200 bp的寡核苷酸片段。针对这些片段应用琼脂糖凝胶电泳技术。凋亡细胞呈明显的梯状条带。本研究通过琼脂糖凝胶电泳结果可见，0～0.010 μmol/L几组都没有出现明显的拖带现象，而从0.030 μmol/L组就开始有拖带现象，0.050 μmol/L 和0.100 μmol/L浓度组与对照组相比细胞发生凋亡的比例显著增加。此结果进一步证明高浓度的5-aza-dc可以导致细胞凋亡。
5-aza-dc处理延边奶山羊成纤维细胞适宜时间为72 h，随着5-aza-dc处理浓度的升高，细胞形态有所改变，接触不紧密。当浓度升高到0.100 μmol/L时大片细胞脱壁死亡；当浓度≥0.030 μmol/L时，染色体畸变率显著增加，0.005 μmol/L和0.010 μmol/L组对染色体核型的影响与对照组相比差异不显著；琼脂糖凝胶电泳法检测经5-aza-dc处理的细胞凋亡情况，结果表明高浓度的5-aza-dc可以导致细胞凋亡，低浓度的5-aza-dc对细胞凋亡的影响较小。以上说明高浓度的5-aza-dc对细胞有一定毒性作用，但是低浓度对细胞影响较小，可以应用低浓度的5-aza-dc作为DNA甲基转移酶抑制剂处理供体成纤维细胞，尝试建立一种既不影响成纤维细胞生物学特性，又可以降低供体细胞核的甲基化状态的方法，从而提供一种提高体细胞核移植效率的方法。
参考文献：
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[6] 李凤珍. 5-氮-2′-脱氧胞苷对牛成纤维细胞周期、染色体和凋亡的影响 [D].武汉：华中农业大学，2009.
[7] KUMAR B M，JIN H F，KIM H J，et al.DNA methylation leves in porcine fetal fibroblasts indueed by an inhibitor of methylation 5-aza-dc[J].Cell Tissue Res，2006，325（3）：445-454.
第4篇：细胞的生物学特性范文
【关键词】中医；生物学；生物技术；研究
【中图分类号】Q81 【文献标识码】A 【文章编号】1008-6455（2010）11-0248-02
Study of TCM bioengineeing
Ouyang Xuejian
【Abstract】From angle of TCM bioengineering probe into TCM basic theory and way of study, to basis of TCM and clinical research mean much.
【Key words】traditional chinese medicine (TCM); biology; biotechnology; study
随着TCM的不断创新，用现代中医生物学的研究手段，完善TCM的基础理论是必经之路。
1生命之书
1960年首次被破译遗传密码，分子生物学家对复杂的细胞分子进行了分类。人类基因从远古到现代以密码的形式表达出来，展现在科学家面前。常有一种误解基因代表每个特性，这种误解并没有因基因测序而被消除，并被加强了这是因为单基因病被讨论[1]，事实上许多遗传性疾病是由多个基因以某种未知方式相互作用的结果。人类基因组的解译，象征着思想变革的始点走向未来。
2生物学革命
细胞生物学革命并不是基因组的解译，而是基因行为方式和序列间相互作用的发现，但必须通过实验才能得到体现, 即阅读细胞故事要归功于生物学-DNA芯片[2]。它能同时观测许多基因行为的是基因组测序。即一个细胞随时有数千个基因开启，它不仅开启一个或两个基因来完成任务，并在任务完成后再将它们关闭，但其理论的构建并不是轻易获得的。分子和细胞生物学[8]，简洁一流的理论很少见，蛋白质A开启了蛋白质B，然后激活蛋白质C，如果大家能理解将对研究很有帮助。生物学家并引入了物理学概念，寻找简洁一流理论，但是并不表明研究的系统是简洁的。物理学家设计的理论用于解释大量分子行为，如氧的弥散在介质的作用下，个体特性会淹没在团体行为的模式下。基因和蛋白质更具挑战性，因为它们不移动，不随机相互作用，但能选择性的参与某一功能性活动。化学提供了另一组工具，一些非生命系统中的化学过程与生物化学过程一样复杂混乱，但并不妨碍被计算机模型所获取，其结论是使复杂的模型简单化，原因是一些成分可以被忽略。
3计算机模拟艺术
它不仅分析数据也是一种重要工具。物理学家把其艺术带入到了精密状态，天体物理学家能模拟整个星系世界，生物学家就能模拟细胞的微观世界。计算机模拟复杂的真实细胞，预测基因活性与细胞功能变化的基因组，并建立了数据库。研究细胞中多种过程的比较模型，许多蛋白质能同时催化大范围化学反应，不同反应的相对重要性会因基因被激活而产生某种蛋白而再次关闭，来模拟整个细胞行为。工程学认为一个细胞事件不会简单的导致某一事件发生，有时一个过程会影响某个过程发生，用工程学术语描述就是反馈。即角加速时人体向一侧倾倒，此时膜半规管内淋巴液向相反方向流动刺壶腹嵴产生神经冲动，传至平衡中枢维持人体平衡，这就是人置与平衡中枢间的反馈，这种自我调节在工程学中十分常见。即可用“控制论”和“系统论”来描述它，生物学家已应用在细胞中。描述生物学功能包含扩大、改编、加强、绝缘、纠错和一致性检测等概念。描述新的生物学语言将来源于综合科学，即计算机科学或生物工程学等学科[3、4]。
4网络生物学
世界范围互联网中的信息总是最新的，那里有通信、高速公路、铁路、航运等，为网路提供能量、电流、水、物质、友谊等，细胞网络它们是如此相似。细胞中每一类分子都视为网络的组成部分，任何两个分子之间均有联系，共同参与生物化学反应，结论就是细胞网络与许多社会网络一样，有着相同的连通结构。这样的共性对于定义基因间的相互作用很有帮助，但并不是所有网络都相同[5、6]，有时几个连接破坏而迅速瓦解，有时即便有许多连接被破坏，任何两个节点间仍可保持通畅，细胞网络也是如此。理解了生物学网络的特点，为组建细胞自身系统对其研究奠定了基础。
5生物学模块
基因通常结队工作当细胞分解糖产生能量，激活一组基因来产生各自所需要的酶[7]。理论生物学家提示如果能够找出这类“联合作业”，并将其视为独立分子来理解细胞的复杂活动。即一部分制造蛋白质，一部分复制细胞分裂的DNA，其他部分对特殊的酶做出响应等等。但这些分子不是基因简单的组合,它们包括了蛋白质，RNA小信号分子和富含能量的分子，即酶等共同执行其功能, 蛋白质组学显示了它的特殊贡献。即细胞分裂模块包裹在膜内，如线粒体是能量的“工厂”。就像组建大楼一样，模块之间通过一类或几类介质分子相互联系，各部门备有“办公室备忘录”这就解决了每个突发件事的需要。可想象设计一种更精密的特定模块，其小部分分子间相互作用的模块延伸到整个细胞。模块的功能来自其他模块一部分输入，并产生输出影响其他模块。其集体行为的概念类似于生物物理学概念，能表现模块的特性。即模块大部分功能特征，来自于潜在成分的特征与它们之间相互作用集合的特征。这对于生物学家来说是陌生的，但将来会习惯这样的描述。
6TCM生物学
TCM生物学家用生物学微观实验手段，即分子与细胞生物学、网络工程、生物学工程、生物物理学等[8-11]，模拟与解释TCM的基本理论。需要生物工程、网络工程与程序工程等共同参与形成综合性科学。TCM把“天体”对生物体的影响都考虑进去了，在疾病诊治基本原则的基础上还考虑了季节变化。即冬天益气活血，温肾助阳；春天滋阴润肺，滋肾柔肝；夏天养心安神，清热解毒；秋天健脾温肾，滋阴补血。TCM早已认识到天体变化对人体的影响，并应用在临床实践中。至于经络到底是什么还没有谁在人体内剖析出来，但临床工作中银针证实了它的存在，并以唯物主义的客观事实传承下来，如何完善它是今后研究的方向。
7TCM诊疗技术
TCM的基础理论与临床诊疗技术是根本，特别是中草药、民间医学很多精髓尚未开发。如西医治疗感冒居高不下的体温(40℃)什么手段都用上了，TCM一付汤药就能控制体温即治愈。肿瘤压迫所致的面神经麻痹，TCM不用开刀减压针灸就能矫正，这说出来好象不可思议但TCM做到了，TCM就是这么神气有待进一步挖掘。TCM不仅应懂得自身的基础理论，并从生物学角度解释出来，让世人相信TCM接受TCM，让TCM走向世界。
参考文献
第5篇：细胞的生物学特性范文
关键词：神经生长因子受体；PRL瘤；生物学特性
PRL瘤是临床常见的具有高分泌功能的良性肿瘤，约占所有垂体腺瘤的40%～60%[1]，其主要临床表现为闭经、溢乳、不孕（育）、高泌乳素血症、垂体占位性病变。既往研究认为神经生长因子（NGF）对PRL瘤有负性调节作用[2]，本研究旨在探讨PRL瘤表达p75-NGFR与其生物学特性的关系。
1 资料与方法
1.1一般资料 选取2008年2月～2013年10月我院收治的82例PRL瘤患者作为研究对象，其中男性37例，女性45例；年龄19～65岁，平均（38.1±8.5）岁；术前泌乳素水平300～600 ng/ml 26例，100～300ng/ml 40例，50～100ng/ml 16例；肿瘤体积5.6～47.2 mm3，平均（16.7±7.5）mm3；肿瘤直径≤10 mm 27例，肿瘤直径>10 mm 55例；非侵袭性肿瘤45例，侵袭性肿瘤37例。
1.2方法
1.2.1 p75-NGFR表达检测 ①标本处理及免疫组化：PRL瘤组织标本均常规石蜡包埋，作5 mm连续切片，用抗生蛋白链菌素生物素复合体（SABC）法作免疫组化染色。以PBS代替一抗为阴性对照，用已知的阳性片为阳性对照。②计算标记指数：在光学显微镜400倍视野下，每张切片随机取10个高倍视野，每个视野计数100个细胞，总共计数1000个细胞。标记指数=（1000个细胞内染色为阳性的细胞数/1000）×100%。③结果判断：标记指数
1.2.2 PRL瘤侵袭性判断标准[3] 有下列情况之一者认为肿瘤具有侵袭性：①术前影像学检查显示肿瘤包绕单侧或双侧颈内动脉，或侵入海绵窦生长；②术中可见鞍底骨质破坏；③术后鞍底硬膜送检有肿瘤细胞浸润。
1.3统计学分析 采用SPSS17.0统计软件，计数资料用百分率（%）表示，计量资料用均数±标准差（MEAN±SD）表示。p75-NGFR表达阳性率比较采用四格表χ2检验，ALD比较采用成组设计t检验，P
2 结果
2.1 PRL瘤患者p75-NGFR表达阳性率 82例PRL瘤患者，32例p75-NGFR表达阳性，阳性率为39.0%。
2.2 p75-NGFR与PRL瘤生物学特性的关系 男性组与女性组p75-NGFR表达阳性率、ALD相比差异无统计学意义（P>0.05）；血清泌乳素≤300 ng/ml组p75-NGFR表达阳性率、ALD显著高于血清泌乳素>300 ng/ml组（P10mm组（P
3 讨论
垂体腺瘤是目前临床上常见的良性肿瘤，约占颅内肿瘤的10%，在颅内肿瘤中仅低于脑胶质细胞瘤与脑膜瘤[4]。根据细胞分泌功能分类法，垂体腺瘤可以分为PRL瘤、生长激素垂体腺瘤、促肾上腺皮质激素垂体腺瘤等，其中以PRL瘤最为常见。值得注意的是，临床上可见部分PRL瘤患者呈侵袭性生长且生长速度快，术后很快就出现复发，并且易并发垂体瘤卒中，但是其发生机制至今尚未完全明确[5]。
NGF是第一个发现的神经营养家族成员，它通过结合NGFR发挥维持与促进神经元细胞的存活、分化、成熟的作用。NGFR可以分为高亲和力受体、低亲和力受体两大类，本研究中p75-NGFR是一个分子量为75kD的跨膜糖蛋白，属于NGF的低亲和力受体，它可结合神经营养家族每一个成员，其主要作用是调节酪氨酸激酶活性，促进NGF结合高亲和力受体TrkA，诱导细胞凋亡等[6]。有研究认为PRL瘤表达p75-NGFR明显高于其他类型垂体腺瘤[7]，但有关PRL瘤表达p75-NGFR与其生物学特性关系的研究较少见。为此，本研究共分析82例PRL瘤患者，结果显示32例p75-NGFR表达阳性，阳性率为39.0%。通过进一步分组、对比分析，结果显示男性组与女性组p75-NGFR表达阳性率、ALD相比差异无统计学意义（P>0.05）；血清泌乳素≤300 ng/ml组p75-NGFR表达阳性率、ALD显著高于血清泌乳素>300 ng/ml组（P10mm组（P
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第6篇：细胞的生物学特性范文
《中国药典》（2010年版）三部收载的生物技术类制品包括：EPO、IFNα1b、IFNα2a、IFNα2b、IFNγ、白细胞介素-2、G-CSF、GM-CSF、牛碱性成纤维细胞生长因子（BFGF）、人表皮生长因子（EGF）、SK等[3]；生长激素，胰岛素、阿替普酶等品种由《中国药典（2010年版）二部》收载[4]。《欧洲药典》与《中国药典》的编制体例有所不同。针对生物技术类制品，《欧洲药典》制定了“重组技术制品总论”，阐述了生物技术类制品的定义、特性，并对生产工艺、过程控制提出了明确要求，是建立品种标准的基础和技术依托。在品种各论中，对产品的原液或原料药的质量标准制定了具体要求。《中国药典》则在“凡例”和“通则”中，对各类产品的共性技术要求进行统一规定，在产品各论中，分别从原液、中间品到成品的质量标准和检定进行了具体规定。结合我国生物技术类制品现状及研发趋势，有必要参照《欧洲药典》，制定“生物技术类制品总论”，并收载于2015年版《中国药典》。
生物技术类制品质量控制的主要因素
就生物技术类制品的质量控制而言，生物学活性测定、理化特性分析和标准物质的研究建立是十分重要的因素。生物学活性测定目前，生物技术类制品的生物学活性测定基本采用细胞增殖法。比较两部药典，最主要的差别在于检测结果的统计学分析，例如：可信限的设置。《中国药典》对此方面的规定尚不完善。生物检定是以药物的药理作用为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，在一定条件下比较供试品和标准品所产生的特定反应，通过等反应剂量间比例的运算或限制剂量引起的生物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或杂质引起的毒性[4]。由此可见，统计方法在生物学活性测定中的重要意义。《中国药典》（2015年版）三部拟收录“生物检定统计法”，进一步完善制品生物检定结果的统计学分析。理化特性分析《欧洲药典》对制品的理化特性分析得比较清晰明确，每个制品均标注了蛋白质一级序列、二硫键的具置以及化学结构式。蛋白质的理化特性分析一般包括含量测定、纯度分析、鉴别分析等项目。含量测定《中国药典》附录中规定的总蛋白检测的方法多采用Lowry法，以人或牛白蛋白为标准品。人或牛白蛋白标准品为非同质标准品，其氨基酸组成、化学结构均与供试品不同，测量中引入了系统误差，无法与同类进口产品的质量进行比对分析，不利于制品质量与国际接轨。《欧洲药典》一般采用紫外分光光度法和高效液相色谱法（HPLC），并采用同质标准品进行蛋白质含量测定。纯度分析纯度分析即用限量标准控制制品中非药效活性成分。《中国药典》主要以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳法、HPLC进行控制。纯度分析应尽量依据蛋白质不同的理化特性，选择分析原理不同的检测方法，二者相互补充。G-CSF、GM-CSF、BFGF、EGF、SK质量标准中采用分别基于蛋白质分子大小和疏水特性的SDS-PAGE电泳法、反相高效液相色谱法（RP-HPLC）进行分析；其余质量标准均以SDS-PAGE电泳和分子筛这两个基于一种分析原理的检测方法对纯度进行控制。《中国药典》对主药蛋白的含量作出了限值要求。《欧洲药典》对于制品的纯度分析较为详细，针对不同的分子采用不同的分析方法和具体的判定标准。以IFNγ1b为例，纯度分析包括了共价二聚体和低聚物、单体和多聚体、脱酰基和氧基化物、异质二聚体、正亮氨酸及其他杂质的限量要求；分别采用了分子排阻色谱法、离子交换色谱法、还原-非还原电泳法、高效液相氨基酸分析法。对于SDS-PAGE电泳等分辨率相对较低的方法，设立相应控制带以提高限量判定的准确度。《欧洲药典》纯度分析大致分为制品相关杂质、工艺相关杂质、相关物质分析。制品相关杂质产品相关杂质是在生产和/或贮存过程中产生的降解产物。其分子量、生物学活性、有效性和安全性均不同于主药蛋白[5]。工艺相关杂质工艺相关杂质是生产过程中产生的，可能源自工程菌/工程细胞（残余蛋白质、残余DNA）、培养基（诱导剂、抗生素、培养基成分）或者下游工艺（试剂、层析过程产生的杂质）[5]。同一制品的不同生产单位，由于其工艺、表达系统的差异，残余宿主细胞的DNA、蛋白无论从结构还是组成比例均会存在差异。因此，检测方法在标准物质的选择、抗原、抗体的制备方式均具有特异性。根据“质量源于设计”理念，采用生产单位根据工艺自行制备的标准物质和检测用试剂对工艺相关杂质进行控制，更为真实客观，对于工程控制也更有意义。制品相关物质制品相关物质是在生产或贮存过程中，产生的不同于主药蛋白的分子，其具有的生物学活性，对于制品的安全性和有效性没有影响。它们的特性与主药蛋白相似，不被认为是杂质[5]。鉴别分析在理化鉴别方面，《中国药典》与《欧洲药典》的差距主要是在理化对照品方面。《中国药典》收载的生物技术类制品标准尚未提供理化对照品。以肽图分析为例，肽图分析是国内外药典用于评价产品一致性和生产工艺稳定的技术手段。《欧洲药典》采用全面结构鉴定和理化分析的对照品作为鉴别判定依据，在仪器分析总体要求的基础上，《欧洲药典》对色谱柱粒径、长度、柱温，以及系统适用性中保留时间、分辨率等均有详尽的描述，并采用非线性色谱梯度分离。《中国药典（2010版）》也采用了酶切后RP-HPLC的方式，但尚未提供完成全面结构鉴定和理化分析的对照品，其次在方法要求细节与系统适用性方面也存在一定差距。2.3标准品的建立标准物质的研究和建立是药品质量控制的重要组成部分。《欧洲药典》收录药品标准的鉴别、理化特性分析、生物学活性测定中，绝大多数检验方法均有标准物质作为技术依托。然而，目前我国在相关生物技术类制品的质量控制中，仅可以提供生物学活性标准品，但在理化分析、含量测定方面的标准物质的研发还有待加强，在体制和机制上确保实物标准和文本标准同步发展与实施，完善标准物质国家数据库。
药典相关标准比较
仅以EPO、G-CSF原液（原料药）的质量标准为例，对照分析中外药典中相关检定项目的技术要求。《欧洲药典》收载的生物技术类制品原液按原料药管理，有批准文号。而在我国，原液是禁止在市场流通的。详见表（表略）
第7篇：细胞的生物学特性范文
方法：对289例胃癌根治术患者3年和5年生存率、复发原因进行对照分析。
结果：对高恶度胃癌扩大手术范围和提高预防性治疗级别，可提高治疗效果。
结论：
胃癌治疗应根据其生物学特性及病理学分型，采用合适的手术范围及术前、术中化疗等措施，可明显延长生存期，改善生存质量。
关键词：胃肿瘤胃癌生物学特性病理学分型化学疗法生存期
【中图分类号】R4【文献标识码】B【文章编号】1008-1879（2012）12-0186-02
胃癌的腹膜种植转移是胃癌根治术后复发的主要原因[1]，而胃癌的淋巴转移对胃癌的预后有一定的影响。作者对289例胃癌淋巴结转移情况和浆膜脱落细胞进行研究，扩大手术范围，采用术前、术中化疗，以探讨胃癌生物学特性与预后的关系，为预防术后复发、转移，延长生存期，提高生存质量提供理论依据。
1资料和方法
1.1一般资料。1990年―1999年我院共施行进展期胃癌手术289例，男210例，女79例。年龄40～77岁，平均65岁。
1.2方法。胃癌手术开腹后探查前用100～150ml生理盐水倒入腹腔上部或盆腔，轻轻搅动后收集冲洗液，离心沉淀，吸取有核细胞层涂片4～6张，以瑞氏法和苏木精-伊红染色镜下观察有无脱落细胞，并对冲洗液的有核细胞层悬液进行了台盼蓝染色观察。
1.3病理学分型及分组。根据病理学分型，分为高分化腺癌组（n=135）、中分化腺癌组（n=83），低分化腺癌组（n=51）和其他病理类型组（n=20），回顾性分析术后3年和5年生存率、复发及死亡原因。
1.4术式及化疗方案。根据肿瘤分期、部位、类型选择D2、D3、D4式手术。化疗方案：术前选用FAM方案，术中温生理盐水420ml+5-Fu500mg腹腔灌注冲洗。
1.5统计学处理。用SPSS12.0统计软件进行统计学分析，采用行×列表X2检验，P
2结果
2.13种分化胃腺癌患者不同术式及化疗方案5年生存率的比较组内与D2清除及D3、D4清除比较：P
2.2其他病理类型组生存情况其他3种类型胃癌病例较少，其中印戒细胞癌9例，黏液细胞癌7例，其他类型癌4例（包括未分化癌、不能分类的癌等）。这20例患者亦采用了以上几种手术方式，经统计，无论采用何种术式及术前、术中是否化疗，生存期均未超过1年。
2.3胃癌死亡原因本组死亡病例共84例，其中腹腔广泛种植转移52例，肝转移22例，其他原因10例。
3讨论
胃癌的发病率及死亡率始终居消化系统恶性肿瘤之前列。当今胃癌的淋巴结清除范围，应根据患者的胃癌病期和癌肿的生物学特性加以区别对待。在此原则下，应充分考虑到患者的诸多个体特点，优选出合理的手术方案。对胃癌应根据不同病理类型和不同的病期选择合理的治疗方案，术前对于病理类型的判断尤为重要。很多研究表明新辅助化疗可以提高进展期胃癌的手术切除率及改善预后，因而广受重视。本组结果显示，早期及高分化癌的手术根治率较高，行新辅助化疗的意义不大，中晚期及高恶度胃癌则明显可以看出其作用，故术前对患者进行肿瘤分期和明确病理类型极为重要。
许多文献表明新辅助化疗可以提高进展期胃癌的手术切除率及预后，因而广受重视。早、中期胃癌手术切除治疗率高，行新辅助化疗的意义不大。肿瘤腹腔广泛播散或远处转移者预后太差，也不应纳入其范畴内。所以准确的术前术中分期对病例的术式选择至关重要[2]。从本组可以看出，肿瘤细胞分化程度越低，淋巴结转移越多，腹膜种植转移概率越高，说明其浸润广泛，对术后5年生存率有明显的影响。胃癌新辅助化疗有几个优势：①可以杀灭术区以外的亚临床转移灶，预防医源性肿瘤播散。②杀灭癌细胞，降低临床分期，增加手术切除率或根治性切除的机会。③获得肿瘤的个体药敏资料，为术后选择辅助化疗提供依据。④肿瘤对化疗的效果是判断患者预后的指标之一。
腹膜种植转移是胃癌患者术后最常见的复发形式，由于其早期诊断有一定困难，目前腹膜种植转移复发患者尚无有效的治疗方法。从死因可以看出，患者术后复发主要为腹膜种植转移，术中预防医源性癌细胞脱落尤为重要。术中应注意无瘤操作技术，不用纱布擦拭手术野外的脏器，尽量减少暴露、擦拭、损伤腹膜，以免增加癌细胞的黏附因素；尽量防止血液流入腹腔，去除白细胞、血小板高黏附癌细胞的因素；同时腹腔灌注化疗必不可少，优点是腹腔内药物浓度高，可有效杀灭脱落的癌细胞。术前或术中证实有腹膜转移患者，除术中化疗以外，应于术后辅以腹腔灌注化疗及全身化疗，可望减少术后腹膜种植复发率。
手术范围的选择也极为重要。一些学者认为扩大胃周围淋巴结清除能够提高患者术后5年生存率，并且淋巴结清除及病理学检测对术后的正确分期判断预后、指导术后监测和选择术后治疗方案都有重要的价值。D3术式在高分化癌中，并不比D2能提高生存率，反而增加了手术风险，而对于低度分化癌中，D3术式则是明显提高了5年的生存率，故根据病理切片类型选择术式，对于胃癌的预后也有明显的影响。从本组结果可以看出：高中分化腺癌行D2术式已能完成患者的治疗，而D3术式并不比D2术式生存率高，术前化疗及术中的腹腔化疗并不能提高生存率，反而增加了患者的创伤。总之，在胃癌治疗过程中，应重视其生物学特性对预后的影响，结合病理诊断及其分期，采取不同的术式，术前术中采用不同的预防措施，可明显延长患者的生存期及改善生存质量。胃癌的治疗选择及预后取决于多种因素，本文仅从病理类型方面作了初步探讨，其他因素的影响还有待深入研究。
参考文献
第8篇：细胞的生物学特性范文
【Abstract】 AIM: To evaluate the biological safety of polypyrrole film electropolymerized on Tisubstrates for possible use as dental implant. METHODS: The biological safety was evaluated through the experiments including hemolysis test， shortterm systemic toxicity test， oral mucous membrane irritation test and cytotoxicity test (MTT test). RESULTS: The material had no hemolytic activities. The shortterm systemic toxicity test results showed that no histopathological changes were found in the vital organs such as heart， kidney and liver of tested animals. No local response was observed in the oral mucosa membrane irritation test. MTT revealed that L929 cells grew well in the extract and the grade of cytotoxicity was zero. CONCLUSION: The Tisubstrates coated with polypyrrole film have good biological safety.
【Keywords】 dental implants; polypyrrole; biological safety; biocompatible materials
【摘要】 目的： 评价纯钛表面聚吡咯涂层的生物安全性，为口腔种植体表面改性提供依据. 方法： 分别通过溶血试验、口腔黏膜刺激试验、细胞毒性试验（MTT法）和急性全身毒性试验，初步评价纯钛表面聚吡咯涂层的生物安全性. 结果： 纯钛表面聚吡咯涂层材料无溶血现象，不影响凝血功能；短期全身毒性实验的受试小鼠心、肾、肝的组织切片均未见病理变化；口腔黏膜刺激实验未见异常组织学反应；MTT试验显示L929细胞在涂层浸提液中生长良好，细胞毒性为0级. 结论： 纯钛表面聚吡咯涂层材料具有良好的生物安全性.
【关键词】 牙种植体，聚吡咯，生物安全性，生物相容性材料
口腔种植修复是目前最具前景的义齿修复手段，如何在种植创愈合初期，促进成骨细胞在种植体表面早期地附着生长，完善地表达其成骨功能是提高种植体与骨组织结合效率的关键. 在纯钛种植体表面固定生物活性大分子能够提高材料的生物相容性，使纯钛种植体既有骨传导作用，又具备骨诱导活性. 然而作为金属材料，纯钛表面不可能同高分子材料一样具有丰富的反应性功能基团来连接侧链、配基或生物活性分子，这成为了制约纯钛种植体表面生物有机修饰的瓶颈［1］. 聚吡咯(Polypyrrole， PPy)，是一种能够表现出半导体和导体的许多光、电、磁特性的导电高分子聚合物，能够在金属表面形成良好的结合［2-3］. 因此，在纯钛表面制备PPy涂层，有望增加其表面的有机修饰活性位点，提高口腔种植手术成功率. 我们利用对纯钛进行表面涂层改性，初步探索其生物安全性，为这一新型材料的后续应用研究奠定基础.
1材料和方法
1.1材料6 mo龄新西兰大耳白兔1只，雄性，体质量1.5 kg (第四军医大学实验动物中心)，昆明成年小白鼠16只，体质量18～22 g（第四军医大学实验动物中心），60～70 d金黄色地鼠10只，体质量140～160 g (西安交通大学动物实验中心)，小鼠结缔组织成纤维细胞L929 细胞株（第四军医大学口腔生物实验室），钛材TA2(Ti 西北有色金属研究院)，对甲苯磺酸钠(ToSNa，西安化学试剂厂)，Pyrrole(Py，美国Sigma公司)， 217型KCl饱和甘汞电极(上海化学试剂厂)，ZF5型恒电位仪(上海正方电子电器有限公司)，JSM840型扫描电镜(日本Jeol公司)，BX41型光学显微镜(日本 Olympus公司)，MPSUV260型紫外分光光度仪(日本 岛津公司)，酶联免疫检测仪（美国BioTek公司），DMEM培养液（美国Gibco BRL公司），胎牛血清（浙江金华清湖犊牛利用研究所），胰蛋白酶（上海浦东生化试剂厂），MTT（美国Sigma公司）.1.2方法
1.2.1纯Ti表面PPy涂层制备与表面形貌观察将TA2加工成直径18 mm，厚1 mm的圆型试件，金相砂纸从280#逐级打磨至800#. 激光焊接机将直径0.3 mm Ti丝焊接于圆型试件侧面，作为工作电极引线. 采用ZF5型恒电位仪在Ti试件表面恒电流电化学聚合PPy，聚合电流密度控制为1 mA/cm2. 电解液为0.1 mol/L对甲苯磺酸钠、0.1 mol/L Pyrrole水溶液，pH值为4.0左右. Ti试件为工作电极，铂片为对电极，217型KCl饱和甘汞电极为参比电极. 涂层厚度由聚合过程中通过的电量来计算. 每通过100 mC/cm2单位面积的电量大约生成0.28 μm厚度的PPy涂层［4］. PPy涂层厚度均控制为100 μm. 采用JSM840型扫描电镜进行表面形貌观察.
1.2.2溶血试验将10个Ti表面PPy涂层试件无菌试管完全浸没于20 mL DMEM培养液中，置于37℃培养箱中72 h，获得浸提液. 心脏穿刺抽取新西兰大耳白兔血10 mL，立即加入20 g/L的草酸钾0.5 mL，抗凝，取8 mL兔血加入10 mL生理盐水中稀释备用. 实验分为3组，每组平行3份试样. 阴性对照组： 0.2 mL稀释兔血加入10 mL生理盐水；阳性对照组：0.2 mL稀释兔血加入10 mL三蒸水；涂层实验组： 0.2 mL稀释兔血加入10 mL浸提液. 37℃水浴60 min，离心，取上清. 在MPSUV260型紫外分光光度仪上测A540 nm值. 溶血率计算公式为：溶血率（%）=（实验组A540 nm-阴性对照组A540 nm）/（阳性对照组A540 nm-阴性对照A540 nm）×100%. 溶血率大于5%则预示阳性结果.
1.2.3急性全身毒性试验将PPy涂层用锋利刀片从Ti表面刮下，研磨粉碎后高温高压消毒，无菌条件下配制成100 g/L生理盐水混悬液，使用前37℃下保持1 h. 选用昆明小鼠随机分配为Ti表面PPy涂层实验组和阴性对照组，每组各8只. 实验组采用胃内针给药，1 g/kg. 对照组给以等量的生理盐水. 连续给药7 d，停药后继续观察7 d. 每日检查动物的临床中毒体征，并予以记录. 停药7 d后，采用颈椎脱臼法将动物处死. 取动物心、肝和肾，多聚甲醛固定，常规HE染色后BX41型光学显微镜下观察.
1.2.4口腔黏膜刺激试验将金黄色地鼠腹腔注射10 g/L的戊巴比妥钠麻醉动物，消毒，铺巾. 用医用缝合线将试样穿颊黏膜缝合固定到颊囊黏膜上，每只固定经消毒备用的2个试样，左侧为实验组Ti表面PPy涂层试件，右侧为作为阴性对照的Ti试件. 术后每日观察黏膜组织反应及试样在位情况，即试片周围有无充血、糜烂、肿胀等. 术后14 d处死动物，取与材料接触的颊囊部全层组织，HE染色，BX41型光学显微镜进行观察.
1.2.5细胞毒性试验按照CB/T16886.52003 《医疗器械生物学评价》体外细胞学毒性试验的试验方法进行［5］. 选择L929细胞为受试细胞株，实验前用PBS新鲜配制MTT溶液，微孔滤器过滤除菌，4℃保存. 取对数生长期的细胞系，常规胰酶消化后制备成单细胞悬液，调整细胞密度为1×106 L，接种细胞于96孔培养板（100 μL/孔，n=5），置于5 mL/L CO2， 37℃培养箱中，在饱和湿度条件下培养48 h. 然后将浸提液加入各实验组（150 μL/孔）. 阴性对照为DMEM培养基，阳性对照为1 mL/L苯酚，常规培养. 培养12， 24， 48 h后酶联免疫检测仪测定A570 nm值，并计算出各组的A570 nm均值及细胞增殖百分率（P%）. P%=各浓度组A570 nm均值/阴性对照组A570 nm均值×100%. 按照CB/T16886.52003标准，P%可分为6级： >100%为0级；75%～100%为Ⅰ级；50%～74%为Ⅱ级；30%～49%为Ⅲ级；15%～29%为Ⅳ级；0～14%为Ⅴ级. 只有细胞毒性为I级或0级的生物材料才能用于体内实验.
2结果
2.1Ti表面PPy涂层扫描电镜观察高倍镜下可见PPy涂层呈现典型的菜花样、结节样颗粒. 颗粒大小为0.5～1.5 μm左右，颗粒间的孔径大多约在1～2 μm之间（图1）.
图1Ti表面聚吡咯涂层形貌SEM ×2000
2.2溶血试验各测试组光吸收度测定值见表1，以每组测定值的平均数计算溶血程度，溶血程度为1.49%，小于5%，即Ti表面PPy涂层无溶血反应.
2.3短期全身毒性试验所有小鼠在胃内灌入混悬液后2 wk内一般情况良好，活动、进食情况正常，体质量无下降，无步态不稳、惊厥、瘫痪、呼吸困难等不良反应，无死亡. 各组小鼠心、肾、肝的组织切片均未见细胞变性、坏死等病理变化，实验组与对照组无差异.表1各实验组光吸收度测定值 2.4口腔黏膜刺激试验各组金黄色地鼠进食、饮水正常，毛发光泽，反应灵活. 肉眼观察，材料接触处口腔黏膜表面未见明显充血、肿胀、糜烂或溃疡. 组织切片观察，Ti阴性对照组，颊黏膜的黏膜上皮排列整齐，细胞形态正常，较少量炎性细胞浸润，黏膜下结缔组织中有少量血管扩张和充血. Ti表面PPy涂层实验组颊黏膜各层细胞排列整齐，较少量炎性细胞浸润，黏膜下结缔组织中有少量血管扩张和充血（图2）. 实验组与阴性对照组的组织学观察结果相似，均未见明显异常反应.图2Ti表面聚吡咯涂层植入颊黏膜后组织反应×100
2.5细胞毒性实验结果各组A570 nm值，细胞增殖率及细胞毒性分级见表2. 倒置相差显微镜观察阳性对照组，正常细胞形态消失，核固缩或溶解，而实验组细胞形态良好，细胞折光性强，与阴性对照组相似，并可见多个分裂相细胞，表明细胞生长旺盛. 细胞毒性测试为0级，说明Ti表面PPy涂层对L929细胞无抑制作用.表2各实验组细胞增殖率及细胞毒性分级
3讨论
纯钛种植体在体内，直接也是最先与组织、细胞相接触的是材料的表面. 材料的表面性质影响细胞的吸附、增殖、分化等一系列反应. 学者们一直致力于将一些有生理功能的物质如蛋白质、多肽、酶和细胞生长因子等固定在纯钛种植体表面，充当邻近细胞、基质或可溶性因子的配基或受体. 这种在种植材料表面引入具有诱导骨组织再生的活性因子、细胞或活体组织的方法称为生物材料表面有机修饰. 它能够极大地改善材料的生物学性能，是实现材料良好生物诱导活性的根本途径［5-6］. 然而，金属材料表面与高分子材料完全不同的性质决定了其几乎不存在任何反应性功能基因来连接侧链、配基或生物活性分子，这是钛基金属表面生物有机修饰的技术难点.
长期以来，高分子一直被视为结构材料和绝缘材料. 1971年日本化学家白川英树在用齐格勒―纳塔催化剂合成聚乙炔时发现，当聚乙炔与I2，AsF5等反应之后，电导率达到1×102～1×103 S/cm. 传统意义上的绝缘体竟然表现出半导体和导体的许多光、电、磁特性，这对经典的材料分类法和导电理论是巨大的挑战和突破，也意味着新的一代功能高分子的诞生. 鉴于这类聚合物表现出的传统高分子材料所不具备的导体、半导体、铁磁体、发光体等的特性，这类功能高分子被称为导电聚合物（conducting polymers）或合成金属（synthetic metals）. PPy就是其中发现较早并经过系统研究的导电聚合物之一［7］. 因此，我们试图通过PPy的导体特性同钛金属基底形成良好的结合，同时又利用高分子材料表面反应性功能基因丰富的特性来进行生物材料表面有机修饰，从而增强钛种植体的生物活性.
对生物材料安全性的评价方法较多，国际标准化组织公布的医疗器械生物学评价试验指南(ISO标准，1997)中基本评价的生物学试验包括细胞毒性、致敏、刺激或皮内反应、全身急性毒性、亚慢性亚急性毒性、遗传毒性、植入、血液相容性等［8-9］. 我们选择了溶血实验、短期全身毒性实验、口腔黏膜刺激实验和细胞毒性试验4种较为常见的生物学试验方法. 其中细胞毒性检测采用MTT试验法，原理为MTT可被线粒体上的脱氢酶还原成蓝紫色结晶，经有机溶剂二甲基亚砜等溶解后可使用分光光度计测定MTT结晶物的染色浓度，从而评价细胞的增殖率和死亡率，操作简便、快速，能够灵敏反映细胞受损害的程度. 我们的结果表明纯钛表面聚吡咯涂层材料不引起溶血反应，不干扰细胞功能，对口腔黏膜显示无刺激性，无短期毒性作用，具有可靠的生物安全性，是一种具有良好生物相容性的材料，具有进一步应用于钛种植体材料表面改性研究的广阔前景.
【参考文献】
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第9篇：细胞的生物学特性范文
[关键词]外泌体;分离;鉴定;差速离心法
中图分类号：TU755 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0193-01
近年来，越来越多的证据表明外泌体对于细胞生物学以及医学研究方面具有重要的价值，而由于外泌体的体积结构方面的因素，其分离纯化还存在很大的困难，目前比较常用的分离方法有差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。
1.差速离心法
陈绍倩[1]等人以白血病细胞系K562细胞为材料，采用多步离心的方法成功地提取到了的外泌体。此种实验方法操作不是很复杂，实验设备要求相对简单，拥有超速离心机和细胞培养设备即可，是一种比较简便的提取外泌体的方法，基本可以满足实验研究的要求。但分离纯度不是很高，并且经过多次离心对外泌体的理化性质造成一定的影响。
2.密度梯度离心法
像所有的脂质小囊泡一样， 外泌体悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围从 1.13g/ml到1.210g/ml，将细胞混悬液或匀浆置于蔗糖介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离，从而将外泌体从混杂的物质如蛋白聚集物或细胞凋亡的核小体碎片等中分离出来[2]。崔焱[3]等人根据其这一特性，从大量培养的肿瘤细胞上清中分离纯化外泌体，并对此进行了电镜鉴定;在得到大量较高纯度的外泌体的基础上，将其加入含有白细胞介素-2（1L-2）的淋巴细胞培养体系中，观察其对淋巴细胞增殖的影响。
3.超滤离心法
王伟[4]等人以树突状细胞为实验材料，基于对外泌体物理特性，大小以及密度的了解，将超滤离心分离外泌体的方法与传统的分级离心法进行了比较，通过实验证明超滤离心法耗时少，产量和纯度都得到了很大程度的提高，是一种比较高效的制备外泌体的方法。
4.免疫磁珠法
将具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗体，细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性抗体结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与磁珠结合而不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。Richard Wubbolts[5]等人在对外泌体进行蛋白质组学和生化分析的过程中，将外泌体的标志性蛋白―抗MHCII抗体包被于磁珠表面，通过抗原抗体特异性识别的特性有效的将外泌体分离出来。
无论采用哪种方法进行分离，如果想对其进行系统的研究都必须首先确定分离得到的产物是不是外泌体，其次要鉴定外泌体是否达到实验所要求的纯度和数量。因此，外泌体的鉴定是必不可少的。目前，常用的鉴定方法主要有电子显微镜观察、动态光散射技术、Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术等。
其中电子显微镜观察法是从形态和大小上对外泌体进行鉴定，但由于电镜拍摄视野有限，因此这种方法只能对个别外泌体进行观察。而动态光散射技术则是从整体上对外泌体大小的分布情况进行检测，具有准确、快速、可重复性好等优点，但对于多分散的复杂外泌体样本的测量还存在一定的问题。Western blot则是通过抗原抗体特异性结合的原理，对外泌体中的标志蛋白进行检测，从蛋白质组学方面对外泌体进行鉴定。
随着科学技术的发展，纳米颗粒跟踪分析技术逐渐成为外泌体鉴定的新技术，不但可以实时对外泌体进行观测，同时还可以对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出外泌体半径和浓度。
外泌体作为细胞间物质信息的传递者，在细胞生物学以及分子生物学领域中，扮演着越来越重要的角色。因此，提高外泌体的分离纯度，改进外泌体的分离方法尤为重要。目前，虽然外泌体的分离与鉴定已经拥有系统的理论基础，但实际操作起来依然存在很多困难，无论是哪种方法，都有各自的优点和缺点，因此只有将各个方法有效的结合起来，例如差速离心法与免疫磁珠法、电镜法与Western blot结合使用，才能达到更好的分离鉴定效果。
参考文献：
[1] 陈绍倩，杜英，王 鑫，顾巧丽，黄玉敏，董子明.多步离心法提取K526细胞外泌体.郑州大学学报（医学版） ，2006，41（3）.
[2] Thery C，Zitvogel L，Amigorena S.Exosomes：composition，biogenesis and function.Nat Rev Immunol，2002，2：569-579.
[3] 崔焱，于津浦，李慧，杨莉莉，魏枫，安秀梅，任秀宝.肿瘤细胞来源胞外体的分离鉴定与功能检测.天津医药，2009，37（12）.
