水产养殖弧菌的处理精选(九篇)

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第1篇：水产养殖弧菌的处理范文

（广东海洋大学水产学院，广东 湛江 524088）

摘要：研究葡萄糖的不同添加量（1.25～5×10-3 g/L）对对虾养殖水体水质指标（氨氮、活性磷）和微生物数量（总异养菌、弧菌）的影响。结果显示，与对照组相比，水体中添加葡萄糖能明显提高异养菌、弧菌密度（P＜0.05），显著降低养殖水体中氨氮、活性磷浓度（P＜0.05）。且在一定浓度范围内，葡萄糖浓度越高，氨氮、活性磷浓度越低，异养菌、弧菌密度越高。

关键词 ：碳源；凡纳滨对虾；水质

中图分类号：S942

近年来，对虾养殖业已成为我国主要的养殖业之一，其养殖产量占了全球对虾养殖产量的1/3。但是，随着养殖技术的发展，集约化、高密度、高产量的养殖方式导致水体污染日趋严重，甚至病害发生日益频繁。水体中污染因素主要是养殖生物的排泄物、残饵以及有机碎屑等，这些物质不断被氧化分解，导致氨氮等有害物质的积累，可造成养殖生物中毒[1]。养殖水体的水质调控已经成为对虾养殖者和科研工作者最关注的问题之一，去除氨氮等有害物质常用的方法有换水、添加化学试剂和生物修复等。频繁换水容易导致水资源浪费，人为添加化学试剂造成药物残留，污染海区，所以生物修复技术成为当今水产养殖水处理的研究热点。生物修复，即通过生物-生态措施，修复受损的池塘生态系统，加速生态系统的物质循环和能量循环，增加水体溶氧，改善水质和池塘自净能力[2]。主要有向水体中投加有益微生物[3]，或定向培育有益微藻[4]等措施，加强对有机污染物的分解和提高池塘的自净能力。但是水体中微藻的密度受天气等各方面因素的影响，难以控制数量，如果微藻数量过大，而天气连续阴雨，容易造成微藻大量死亡，败坏水质。向水体中投加有益微生物改善水质，有其优势，容易大量培养，可操作性强，受到养殖户的青睐，在水产养殖中应用广泛。但是微生物在水体中能否生存与繁殖，受到环境条件的限制。有研究表明，加入碳类物质可以增加养殖系统中细菌生物量[5]，且在高碳氮比的情况下，异养菌所具有的优势更加明显[6]，从而水体中的氮也消耗更多。近年来，少数研究者向养殖水体或富营养化水体中加入碳源，达到降低水体中的氨氮的目的[7-11]。

葡萄糖是多糖最基本的组成单位，因此研究葡萄糖在废水净化中的作用就显得更加重要[12]。李洪鹏等[12]等认为葡萄糖添加量在一定范围内，氨氮等污染物的去除率均随添加量的增加而升高，当葡萄糖添加量高于某一临界值时，去除率将随葡萄糖的增加而下降。关于向对虾养殖水体中添加不同浓度的葡萄糖进行水质净化的研究未见有报道。本文旨在研究葡萄糖的不同添加量对凡纳滨对虾（Litopeneaus vannamei）养殖水体水质和微生物数量的影响，探讨葡萄糖的添加量与水体中氨氮、活性磷浓度和微生物数量的关系，以期为对虾养殖过程中的水质调控提供理论参考。 1材料与方法

1.1实验动物

养殖对象为健康的凡纳滨对虾，平均质量6 g。对虾饲料为粤海牌2#对虾料。葡萄糖为广东光华科技有限公司生产。

1.2细菌培养基

异养菌培养基（2216E）：蛋白胨5.0 g，酵母膏1.0 g，磷酸铁0.01 g，琼脂16.0 g，陈海水1 000 mL，调pH 至7.6～7.8。

弧菌培养基（TCBS）：北京陆桥技术有限责任公司生产。

1.3养殖管理

养殖容器为玻璃钢桶，养殖水体100 L。养殖期间，连续充氧，保证水体中氧气的充足，为防止充气过大而将对虾残饵或粪便打散，造成实验误差，气石的摆放位置为养殖桶的边缘。每天按8%的量投喂饵料，每天投喂时间8:00，12:00，17:00，22:00。每天每个桶吸污1次，吸污量为10 L。水温（28±1） ℃，pH 8.0±0.2。

1.4实验方案

实验分为5个组，每组3个平行，每个实验桶放凡纳滨对虾40尾。每天早上投料后投放不同浓度的葡萄糖。葡萄糖的投放量根据投饵量确定（葡萄糖投放量见表1）。

每隔48 h检测氨氮和活性磷一次。氨氮采用纳氏试剂法[13]，活性磷采用磷鉬蓝法[13]。每96 h检测总异养菌和弧菌数量一次。

2结果与分析

2.1添加不同浓度的葡萄糖对对虾养殖水体总细菌的影响

在实验期间，所有实验组水体中总异养菌的数量随养殖时间的延长呈上升趋势，说明添加葡萄糖有利于养殖水体中异养菌的增殖。在12 d时，组3、组4和组5的养殖水体中总异养菌的数量都显著高于对照组（P＜0.05）。在16 d时，组5的养殖水体中的总异养菌的数量出现明显下降，且低于对照组，但其余各组的养殖水体中的总异养菌的数量仍高于对照组。组5的细菌密度前期高而后期突然降低的原因，是由于实验开始时组5的外加碳源最多，细菌量因营养丰富而迅速增加，同时营养物质也因细菌量增加而消耗更多，但实验期间水体中的碳源不再补充浓度不断降低，氮的来源还是与其他组一样来自残饵和粪便，导致实验后期细菌密度下降较快，见表2。

2.2添加不同浓度的葡萄糖对对虾养殖水体弧菌的影响

在实验期间，所有实验组水体中弧菌的数量随养殖时间的延长也有所上升。从实验结果来看，添加葡萄糖也会导致养殖水体中弧菌的数量的上升。组5在加入葡萄糖后的各个时间点养殖水体中弧菌的数量都显著高于对照组（P＜0?05），见表3。

2.3添加不同浓度的葡萄糖对对虾养殖水体氨氮的影响

如图1所示，由于养殖期间水体中残饵和对虾粪便的积累，在实验前期对照组和处理组的氨氮含量均呈上升趋势；但添加葡萄糖后的8 d以后，对照组的氨氮含量继续呈上升趋势，而各处理组的呈下降趋势，其中葡萄糖浓度高的组4、组5下降最明显；第14 d的检测结果显示，组4、组5的氨氮含量显著低于对照组（p＜0.05）。笔者认为，葡萄糖的添加加速了水体中异养菌的繁殖和生长，消耗了大量的氮源，从而氨氮含量下降，且葡萄糖浓度越高的组，氨氮浓度下降越明显。

2.4添加不同浓度的葡萄糖对对虾养殖水体活性磷的影响

海水养殖的生态系统中，磷是物质循环的重要组成成分，也是细菌的重要生长因子，其存在形式和多寡，能促进或限制生态系统的能量转化，是影响养殖水环境的重要因素。如图2所示，由于饵料的添加，实验早期（6 d以内）各组的养殖水体中活性磷的含量均呈上升趋势，各组间差异不显著；第6 d以后，对照组、组2和组3的活性磷含量继续上升，而组4、组5的活性磷含量比较平稳；第14 d检测结果显示，组2、组3的活性磷含量与对照组差异不显著，组4、组5显著低于对照组（p＜0.05）。说明在水体中添加葡萄糖后，葡萄糖浓度高的组水体中异养菌大量生长和繁殖，明显消耗大量的活性磷。

3讨论

3.1对虾养殖水体的水质调控

在水产养殖过程中，水质的好坏直接影响养殖生物的生长与存活，从而影响养殖效益。随着高产、高密度的对虾养殖业的发展，养殖水体中常因池中残饵、水生生物排泄物及尸体等的腐败、分解，引起水质恶化，使水中营养元素N、P等发生非正常变化并产生有害物质[14]。这些有害物质被海水溶解或经过微生物的分解和矿化作用产生可溶性营养物质进入养殖水体，一部分被浮游植物利用，一部分通过换水进入海区，还有一部分会在养殖水体中积累，在水体中积累到一定浓度后，将对养殖生物产生一定的毒害作用。杨世平等[14]通过对对虾高密度养殖池中水质的连续监测，认为养殖水体的污染主要是含氮废物的污染，在高密度养殖池养殖后期，水体中氨氮首先达到峰值2.32 mg/L，随后亚硝酸盐的含量也迅速达到峰值0.773 mg/L，在高密度养殖池中活性磷的含量也较高。Li等[15]认为，水体中氨氮含量将随着饵料中蛋白质含量和蛋白质投喂量的增加而增加。饵料在水中的降解过程中不断的释放氨氮和有机碳。潘云峰等[16]认为水体中的氨氮有三个阶段动态的变化阶段：第一阶段微生物对氨氮的利用小于饵料降解的氨氮，造成氨氮不断升高，第二阶段微生物对氨氮的利用和饵料降解的氨氮相等，造成氨氮在水中残留达到最大值，第三阶段微生物对氨氮的利用大于饵料降解的氨氮，造成氨氮降低。本实验结果也显示，实验早期氨氮含量呈上升趋势，浓度上升到一定高时开始降低。

针对对虾养殖水体的水质污染，利用可控的人工措施，采用物理、化学或生物等方法调控水质，改善养殖水体环境。常用物理方法包括物理过滤、沉淀、泡沫分离等，物理方法净化水体的优点在于无二次污染，但费时费力。常见的化学方法包括络合、氧化还原、臭氧消毒等，消毒效果不错，但使用不当可能会对养殖水体造成二次污染。生物方法是利用微生物或自养性植物(如绿色藻类、高等水生植物)改良水质，其原理是这些微生物和植物可以吸收利用水体中的营养物质(残饵及水产养殖动物的代谢产物)，有助于防止残饵与代谢产物积累所引起的水质败坏[17]。由于生物方法处理水质具有成本低、无污染等特点，近年来越来越受到人们的青睐，人们在处理对虾养殖水体时，常引入细菌[18]或微藻[4,19]改善水质。但是池塘中微藻的密度受天气等各方面因素的影响，难以控制数量，藻种供应商品化程度较低，相对而言细菌具有可操作性的特点，生产、储存和运输都不存在问题，所以生产上应用最多。但是，在实际操作过程中被投入到养殖水体的细菌能否存活和生长，受到水体环境的影响，将直接影响水质处理效果。人们发现在水体修复过程中，水体中可被生物利用有机物含量较低或缺乏氮、磷元素时，修复效果较差，添加某种营养物质可以加强生物修复[20]。

3.2养殖水体中添加碳源对水质的影响

细菌所需要的营养物质与其细胞的化学构成大致相同，大致有5 类：碳源、氮源、磷源、无机盐和生长因子[10]。水体中氨氮的去除，主要是通过细菌固定和转化，但对于细菌来讲，养殖池一般是属于氮源过剩，而碳源缺乏的环境，经常限制细菌生长的是碳源[21]。故添加一定的碳源才有利于细菌对氨氮的转化。近年来，许多研究者为降低水体中的氮污染，而向水体中添加碳源，取得了较好的效果。如李彦等[5]研究发现，向罗非鱼养殖池塘添加碳源可以降低池塘水体氨态氮含量，赵志刚等也研究发现，定期向松浦镜鲤养殖池塘添加碳源可显著降低池塘水体氨态氮含量[8]。Hari[11]等研究碳源对对虾养殖水体水质的影响，也认为添加碳源可以显著降低水体中氨氮浓度。常用的外加碳源有甲醇、乙醇、乙酸、乙酸钠和葡萄糖等[10]。其中葡萄糖是多糖最基本的组成单位，是一种重要的简单碳水化合物，它在主要的生化途径中有重要作用。有研究已证明葡萄糖在水质处理方面效果较好，如李洪鹏等[12]报道证实添加葡萄糖能提高原生态复合菌的净化能力，张海杰等[22]研究证实葡萄糖作为外加碳源时微生物的硝化率最高。本实验中对照组的氨氮含量一直呈上升趋势，而处理组由于添加了葡萄糖作为细菌的碳源，氨氮因被细菌利用而含量出现不同程度的下降，且碳源浓度投放量高的处理组（组4、组5）氨氮浓度下降最为明显。

向水体中添加葡萄糖等碳源后，水体中的氨氮浓度降低，氮源被细菌所利用变成细菌菌体的一部分，但是并没有直接离开水体。那么，氮源会随着细菌的代谢和死亡重新回到水体中吗？有研究认为细菌在生长过程中会分泌多糖、多肽、蛋白质、脂类及其复合物等胞外产物，与水中的一些悬浮物质通过微生物分泌的胞外产物产生正负电荷吸引中和会形成絮凝体[23]，絮凝体容易被过滤或沉淀而离开养殖水体。而且形成的絮凝体还可能被鱼类、虾类重新摄食，提高饵料的利用率和净化水质[16]。所以向对虾养殖水体中添加适量的葡萄糖等碳源有利于水质净化和对虾健康养殖。

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第2篇：水产养殖弧菌的处理范文

1益生菌群的作用

1．1益生菌群是水体物质循环的推动者

1．2益生菌群在水体污染中的指示作用

1．3益生菌可以净化水体

1．4益生菌群作为饵料的作用

1．5益生菌群能防止病害

1．6益生菌群可以刺激提高免疫力

2益生菌的研究现状

国内对于水产动物病害的研究起步较晚。于占国等在论述异养菌于对虾病的关系的研究时特别指明：弧菌喜欢在富营养环境生长，并已经成为虾池中的优势菌属。它的数量与对虾发病有着密切的关系。薛清刚还指出：在全世界主要对虾养殖区，弧菌病到目前为止仍时对虾危害最大、造成损失最严重的疾病之一，它影响着所有种类对虾的几乎所有发育期，在养殖条件下容易爆发性流行，且流行范围已遍及全球。如不及时采取妥善治疗措施，其危害后果是在短时间内死亡率为100％，即使采取一些控制措施，也仍有很高的死亡率。许兵等（1993）曾对中国对虾病原菌及其致病机理作过探讨。孟庆显在其论著中也记述了弧菌的危害。供给养殖生物一个包括有益微生物群落在内的健康环境是很重要的。从养殖环境中除去细菌或使用抗微生物药物控制细菌种群将会使生态平衡遭到破坏，因此，使用益生菌将具有很大的潜力。但在水产养殖过程中有效使用益生菌的证据还比较缺乏，而且其准确的作用机理方式也不十分清楚，尤其是菌株体外抑菌物质的产生或是竞争营养与其体内益生菌效果的关系。益生菌在水生动物体内与其他菌群的相互作用仍然需要阐明，益生菌的免疫刺激效果也值得进一步研究。为了益生菌能应用于水产养殖，必须对其大规模生产条件下的生产工艺流程、多种菌的生产、保藏及确保其质量方面进行深入地研究。

3水生环境微生物的分离和鉴别

海洋细菌中普遍都存在着抗菌性。许多海洋抗菌微生物属于假单胞菌或者是弧菌。淡水微生物群中也普遍存在着抗菌活性。某些乳酸菌也对鱼类的病原菌有抵抗能力。在许多体外实验中，致病的弧菌和气单胞菌都会被抑制。而且一些细菌对于滤过性细菌也具有一定的抵抗能力，因此它们可以作为滤过性细菌的生物防治剂。值得注意的是不但抗菌素具有抑制微生物病原菌的能力，其它一些物质也具有相同的作用，如有机酸，过氧化氢，含铁细胞等。这些物质的抗菌能力很大程度上依赖于实验条件，而这些对于体内和体外是不同的。因此，这些抗菌性菌株的在体外的实验是不足以作为筛选候选益生菌的唯一标准，也不能仅仅凭此来进行菌株的筛选。在鱼的幼苗和甲壳类动物中，通过解剖分开胃和肠道可以从消化系统分离出不同的微生物群。附着在上皮细胞上的微生物可以从其附着部分的黏液中分离得到。这种分离方法不适用于幼虫状态和活着的养殖饵料，但是可以用0.1％苯甲铵氯化物的盐溶液来冲洗鱼幼苗的外表来分离附着在表面的微生物，这些微生物也来自于通过它们肠道内的排泄物。多数微生物可以用选择性培养基进行分离筛选。然后可以通过一些常规方法对它们进行鉴别。

4益生菌在水产动物中的应用情况

益生菌的概念是在应与于陆地生物的过程中发展起来的，对于水生生物却还是有许多的不同之处，最基本的问题是益生菌在水体养殖环境中的应用。人类和陆地生物经历了一个在胞衣中由胚胎发育的过程，然而大多数的鱼和贝类在最初的个体发育阶段都是在外部环境中进行的。因为它们的幼虫在消化系统还没有完全发育好，而且免疫系统还不完善，此时就开始喂食，它们肠道内相关微生物菌群混乱的情况会很大。因此，在幼虫阶段特别需要使用益生菌。在人类和陆地养殖动物的肠道微生物菌群中，格兰氏阳性专一性活兼性厌氧性微生物占有优势地位。在人类排泄物中，主要的微生物群是类杆菌，格兰氏阳性厌氧球菌，真菌和双歧杆菌，而在猪的排泄物中其主要的微生物菌群是]链球菌和乳酸菌。大部分益生菌都属于这些微生物群中的主要或者次主要种属，如双歧杆菌，乳酸菌和链球菌。在鱼和贝类的消化道里格兰氏阴性兼性厌氧菌占主要，而在某些食草的热带鱼中，共生的厌氧菌占主导。弧菌和假单胞菌在甲壳类生物，海鱼和双壳类生物中很普遍。在淡水鱼中，气单胞菌和肠杆菌占有优势。水体微生物群特性的一系列结果说明可以有效应用于水产养殖的益生菌与来自于陆地的种类有些不同。在人类和陆地家畜的肠道为生长于其中的微生物创造了一个公平稳定的居住环境，它们由此受益。然而，在水生动物中，大部分的微生物群都是暂时的。这些动物都是变温的，它们相关的微生物群会随着温度的变化而改变。盐度的变化也会影响微生物群，而海鱼不得不经常的喝水以补充身体水分的损失。持续的水的进入增强了周围环境的影响能力，同时，根据观察一些滤食动物如双壳类，虾幼虫及其食物，我们也发现了这一点。对于幼虫来说，由于缺少胃的保护作用，这些影响是很重要的。所以，水生动物肠道内的微生物群会因为来自于水和食物的微生物群而发生很快的改变。在双壳类生物中，其相关的微生物群和那些海水和沉淀物中的非常相似。在Penaeusjaponicus对虾的内脏和海水中也发现了相同的细菌，但是微生物群中正常的种群是通过食物引入的。在鱼的幼虫和幼苗阶段，食物的影响是决定性的。而且，在第一次的喂食中，通过活的食物带入的细菌的影响是非常显著的。第一次用于水产养殖的益生菌本来是设计给陆地动物使用的。一株分离自土壤的细菌孢子可以降低因感染爱德华氏菌日本鳗鲡的死亡率，相同的饲料添加物可以提高鲱鱼的生长率。孢子可以很容易的混在复合食物中，但是还没有有关它们在鱼的消化道中生长繁殖的实验方面的报道。对于孢子在肠道内的生长情况取决于停留的时间和养殖的温度，这一点是值得去研究的。Kozasa使用的菌株在轮虫中进行了试验，可以提高大比目鱼的生长速率，但是在其幼苗阶段和轮虫中都没有发现这种微生物群。稍后，另一组实验使用了含有杆菌IP5832孢子的饲料添加物，通过计数和鉴别与用孢子饲养的轮虫和大比目鱼相关的细菌的特征来检验其效果。实验表明，当把孢子加入到水中一小时之后，其可以生长的菌株的数目急剧下降，大部分的杆菌孢子在不到一个半小时内滤过吸收。这些孢子因此可以在轮虫中复活生长，但是这段时间可能太短以至于益生菌还来不及发挥其作用。许多细菌可以产生抗生素，特别是在孢子形成阶段，通过植物细胞的蛋白质水解也可以生产抗生素。当轮虫用孢子饲养时，其弧菌的数目会降低，这可能是由于杆菌中产生了的抗菌素的缘故。以用孢子处理过的轮虫为饲料发现大比目鱼体中几乎没有可以复活的细菌。尽管这种处理方式增强了大比目鱼幼苗对于病原菌的抵抗力，但是还不能说这就是使用了益生菌的直接作用的结果。在成品使用中，活的乳酸菌也被加入到比目鱼幼苗的饵料中。通过这种方法，增加了轮虫的产量和提高了大比目鱼和日本比目鱼的生长速度。某些乳酸菌的使用也限制了轮虫中细菌的增殖，但是在这些研究中并没有说明乳酸菌的生长情况]。其他一些链球菌制品可以提高以色列鲤鱼的生长速度和饲料利用率。当在鲤鱼养殖中使用益生菌制品十四天后，埃希氏菌属的大肠杆菌完全从其消化道微生物群中消失了。其开发者宣称这种制品对鲤鱼消化道中的上皮细胞具有很高的附着能力。对于陆生动物使用益生菌的实验显示了其在水产养殖饲料中的使用微生物添加剂的重要性，但是，在水生动物肠道内可以存活的微生物群还不是太确定。现在的研究主要着重于从水生动物中寻找其自身的可以作为益生菌的微生物。

5结论

5．1可以在水产养殖中使用益生菌，但是还需要更努力的研究。第一个问题就是益生菌在养殖水体和水生动物肠道中的生长繁殖的情况并不是太清楚，这一点在很多情况下都没有得到解答。随着免疫和分子探针的出现，这将为追踪益生菌细胞提供一种有利的工具。对于益生菌的最好使用方式和最佳的剂量还需要进一步的调查研究，同时也要解决一些技术问题，特别是要保持干药球中益生菌的活力。

5．2细菌的孢子很容易添加到干燥的饵料中，这也是这些可能的候选益生菌的另一种优势。乳酸菌和酵母都是很好的选择对象，应该对它们进行深入的研究。我们应该进行长期的调查研究以确认这些细菌是无害的，而且不会出现任何可能有害的变异这种风险。

第3篇：水产养殖弧菌的处理范文

关键词: 副溶血性弧菌; 检测; 基因; PCR技术

中图分类号: S944.4 文献标识码: A 文章编号:1009-8631(2010)04-0192-02

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP) 是革兰氏阴性嗜盐细菌, 隶属弧菌科中的弧菌属的一种人畜共患病菌。最早由Fujino等在1950年从日本1例食物中毒患者排泄物中初次分离得到,本菌呈弧型、杆型、丝状等多形态,菌体一端有单鞭毛,营养要求不高。副溶血性弧菌主要存在于近海岸的海水、海底沉积物和鱼虾、贝类等海产品中,是引起食源性疾病的主要病原之一。污染了大量该菌而又未经良好加工处理的海产品被人类食用后, 会引发人突发性食物中毒,可导致患者出现腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。副溶血性弧菌还可导致海鲷、九孔鲍、斑节虾、对虾、牙鲆及文蛤等水产动物致病,间接影响人类的健康。

副溶血性弧菌在含3.5% NaCl培养基中最为适宜,无盐则不能生长,但当NaCl浓度高于8%时也不能生长。在盐浓度不适宜的培养基中,细菌呈长杆状或球杆状等多形态,无盐蛋白胨水中生长很差或不生长。在硫代硫酸钠柠檬酸胆盐蔗糖培养基(thiosulfate-citrate-bile saltssucrose,TCBS)上副溶血性弧菌形成绿色菌落,能发酵葡萄糖、甘露醇产酸不产气,不发酵蔗糖和乳糖,分解色氨酸产生靛基质,神奈川试验(kanawaga phenomenen,KP)阳性。该菌不耐酸,不耐热,在1%醋酸或50%食醋中1min死亡,90℃1 min即被杀死。在淡水中存活不超过2d,在海水中可存活50d。副溶血性弧菌在普通血平板(含羊、兔或马等血液)上不溶血或只产生β-溶血。目前研究认为与副溶血性弧菌致病力相关的主要毒力因子为溶血素类,包括耐热直接溶血素(Thermostable Direct Hemolysin,TDH)、TDH-相关溶血素(TDH-related Hemolysin,TRH)和不耐热直接溶血素(Thermolabile Hemolysin,TLH)。国家食源性疾病监测网数据显示,我国微生物性食物中毒的病原分布发生了显著变化,特别是在沿海省份,副溶血性弧菌引起的食物中毒在发生规模及人群暴露规模呈明显上升趋势,已经高居微生物性食物中毒首位。副溶血性弧菌检测在水产养殖疾病临床诊断、流行病学调查、食品中微生物检测、水产品进出口检测及医院感染监控等方面有着重要的作用。文章综述了副溶血性弧菌的各种检测技术手段。

一、常规方法

副溶血性弧菌的常规检测方法是传统的培养和生化鉴定方法。该方法也是目前食品中副溶血性弧菌检测的国家标准(GB/T 4789.7-2003)及行业标准。该方法是通过细菌形态特征、培养特性、生理生化特征来鉴定,包括培养增菌、分离提纯、镜检和生化试验及副溶血性弧菌的特有生化试验KP现象。具体的是采用氯化钠结晶紫增菌液进行增菌后、接种于氯化钠蔗糖琼脂和选择性琼脂平板使包括副溶血性弧菌在内的嗜盐性弧菌得以分离,可疑菌落经氯化钠三糖铁斜面、革兰氏染色和嗜盐性实验进行初步判定,最后经生化试验以及动物试验进行确定其是否为副溶血性弧菌,此方法只能定性不能定量。目前广泛使用的定量检测方法是FDA细菌分析手册中的最大可能数方法(Most Probable Number,MPN)。该方法将样品匀浆后在碱性蛋白胨盐增菌液(Alkaline peptone water,APW)增菌后,接种于TCBS分离该菌。但是最近Raghunath报道将以前方法改进后用牛磺胆酸钠培养(Sodium taurocholate,ST broth)检测海产品中的副溶血性弧菌优于APW法[1]。该方法耗时长,周期需要3~5d左右,操作繁琐、工作量大、人力物力花费大,给副溶血性弧菌的检测、研究、进出口贸易带来不便,不能满足食品卫生快速反应体系的需要。

二、免疫学检测技术

(一)免疫酶技术

将抗原抗体的特异性反应与酶的高效催化反应有机结合起来,通过酶降解底物呈现的颜色反应来指示特异性抗体的存在,根据反应颜色的深浅指示抗原量的多少。在多种免疫酶技术中以间接ELISA、双抗体ELISA以及Dot-ELISA法最为常用。酶联免疫吸附法(ELISA)与其他检测方法相比,具有特异性强、敏感性高、检测时间短、对设备的要求较低等优点,可以在短时间内准确地将副溶血性弧菌检测出来。已有类似报道集中在实验室方法探索上,余俊红等[2]建立间接EI1SA技术快速检测花鲈的病原菌,用此方法对花鲈组织样品,包括肌肉、鳃、肠、肝、肾等组织的检测表明,阳性检出率为76.1%,特异性较高。窦勇等[3]2008年报道利用间接竞争ELISA法检测几种水产动物中副溶血性弧菌,检测下限为104 cfu/mL,与常规生化培养检测法对比,常规生化培养无法检测出的而ELISA 却可以将其检测出,检测时间为8h。对鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及志贺氏菌等几种常见食品致病菌菌株无交叉反应。李国等[4]将ELISA法应用于文蛤副溶血性弧菌检测中。但是,若能进一步优化各项反应条件,制备成快速检测试剂盒,具有较高的实用和推广价值,必将在水产养殖大量样品的检测中发挥重要作用。

(二)免疫荧光技术

免疫荧光技术(Immunofluorescence technique),又称为荧光抗体技术,是利用某些荧光素通过化学方法与特异性抗体结合制成荧光抗体,荧光抗体与被检抗原特异性结合后,形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光,借助荧光显微镜可检测或定位被检抗原。所用的荧光素标记抗体称为荧光抗体,常用的荧光素如,异硫氰基荧光素(FITC)、罗丹明(RB200)、绿色荧光蛋白(GFP)等。免疫荧光技术是将免疫化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微术的高度精确性相结合,在水产副溶血性弧菌检测上有大量的研究报道[5]。

免疫荧光技术的主要特点是:特异性强、速度快、灵敏度高。但也存在缺点: 如非所以特异性染色问题难以完全解决;操作程序较繁琐;需要特殊的昂贵仪器(荧光显微镜);染色标本不能长期保存等。

(三)免疫印迹技术

免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting),是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后,通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面,然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如,将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后,膜用封闭液处理,然后与第一抗体反应,膜经漂洗后再与偶联辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应,加人生色底物反应之后,即可显示出目标蛋白的位置。张晓华等利用Western 印迹法对13 株不同来源的副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性进行了比较研究,发现它们有相似的SDS-PAGE图谱,其中一条44ku的免疫反应带几乎是所有副溶血弧菌菌株共有的,推测极有可能与副溶血弧菌抗原的特异性有关。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性,其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较,故广泛应用于分子生物学等领域,成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。

三、PCR检测技术

聚合酶链式反应(PCR)技术是美国Cetus公司的科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。目前,国内外学者已广泛使用PCR技术研究食品中副溶血性弧菌的快速分型与检测。PCR技术由于其高度的特异性、敏感性及快速、稳定性好、检测耗时短等特点在食品中副溶血性弧菌快速检测方面展现了巨大的潜力。但其缺点是程序复杂,需要精密仪器设备,价格昂贵,不利于在基层推广应用,且可能出现非特异性扩增产物,假阳性结果。

1999 年,Yamaichi等[6]已经完成副溶血性弧菌的基因组测序,VP的毒力基因序列得到进一步确定。TRH、TDH、TLH及尿素酶是副溶血性弧菌的主要毒力因子,其中TDH是绝大多数副溶血性弧菌具有致病能力的毒力因子,TRH和尿素酶是少数临床菌株特别是KP-菌株的毒力因子,TRH的毒力与尿素酶的活性有关。TRH与TDH的氨基酸序列有70%同源,编码这2种毒素的基因trh和tdh的同源性为68.1 %,TRH与TDH的抗原性有部分交叉,两者免疫原性相似。trh基因据其核酸序列的变化又可分为2 个亚组:trhl和trh2基因,两者同源性为84%,分别编码蛋白TRH1和TRH2。目前,建立的副溶血性PCR检测技术是基于gyrase基因[7]、toxR基因[8,9] 、TLH和TDH[10,11]为靶基因设计引物探针进行检测。副溶血性弧菌PCR检测技术有:随机扩增多态性DNA分析技术、重复序列PCR技术、扩增片段长度多态性分析技术、多重PCR技术、实时PCR(real-time PCR,RT- PCR)等,其中RT- PCR技术近年来在副溶血性弧菌检测上进行了大量的研究。覃倚莹等以 toxR基因为靶基因, 通过优化反应条件建立了快速检测副溶血弧菌的TaqMan实时荧光PCR方法。灵敏度试验表明, 该方法最少可检测到25 个拷贝的toxR基因重组质粒, 对纯培养物和模拟食品样品直接检测的灵敏度分别为21 cfu/mL和210 cfu/g;特异性试验表明, 该方法能选择性检测副溶血弧菌, 而与金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单增李斯特杆菌等多种常见的食源性病原菌没有交叉反应;重复性试验表明同一样品于试验内及试验间的变异系数分别为0.9%和1.3%;结果表明TaqMan实时荧光PCR方法具有特异性好、灵敏度高、重复性好的特点, 能进行定量检测, 而且检测时间从核酸抽提到出实验结果仅需要3h, 是快速检测副溶血弧菌的有效手段。Tyagi等用SYBR荧光染料建立了热带贝类实时荧光PCR方法,最小检测范围可以达到0.1 pg副溶血弧菌DNA。Kim等也建立了牡蛎实时荧光PCR方法。

四、小结

除了以上方法外,还有研究报道将核酸分子杂交、变性高效液相色谱技术(DHPLC)、胶体金免疫层析技术、基因芯片技术[16]等技术应用于副溶血性弧菌检测中。虽然许多学者研究了多种副溶血弧菌检测技术,但是笔者认为副溶血弧菌检测产品市场化方面的研究还比较欠缺,许多成果仅停留在实验室研究阶段。目前市场上应用的副溶血性弧菌(VP)核酸扩增检测试剂盒仅能应用于进出口检疫、实验室研究和实验设备先进的单位,基层养殖户由于缺乏PCR仪和分子生物学技术无法此法进行检测。只有研究出适合于基层养殖场的快速粗略仅能定性的检测试纸条,适用于中层检测机构效果好交叉反应小的ELISA试剂盒和适用于进出口和实验设备好的,以中国流行的致病性副溶血弧菌为主的核酸扩增检测试剂盒才能真正的解决我国副溶血性弧菌检测市场化问题。

参考文献:

[1] Raghunath P, Karunasagar I, Karunasagar I. Improved isolation and detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus from seafood using a new enrichment broth[J]. Int J Food Microbiol,2009,129(2):200-203.

[2] 余俊红,姚斐,王宝坤等.应用间接ELISA技术快速检测花鲈病原菌鳗弧菌[J].高技术通讯,2001.7:22-27.

[3] 窦勇,胡佩红,副溶血弧菌间接ELISA快速检测法的建立[J].现代食品科技,2008.24(6):598-602.

[4] 李国,闫茂仓,常维山,等.文蛤副溶血弧菌间接ELISA检测技术的研究[J].海洋通报,2008.27(5):85-90.

[5] 鄢庆枇,邹文政,纪荣兴等.应用荧光抗体技术检测牙鲆体内的河流弧菌[J].海洋科学,2006.30(4):16-19.

[6] Yamaichi Y,Iida T,Park KS,et al. Physical and genetic map of the genme of vibrio parahaemolyticus:presence of two chromosomes in vibrio species[J].J Mol Microbiol,1999.31:1513-1521.

[7] 翁文川,焦红,王方金等.食品中副溶血弧菌荧光定量PCR方法快速检测[J].中国公共卫生,2005.21(11):1359-1361.

[8] 覃倚莹,吴晖,肖性龙等.toxR基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测副溶血弧菌[J].2008,24(10):1837-1842.

[9] Rosec JP,Simon M,Causse V,et al. Detection of total and pathogenic Vibrio parahaemolyticus in shellfish: comparison of PCR protocols using pR72H or toxR targets with a culture method[J]. Int J Food Microbiol,2009.129(2):136-145.

第4篇：水产养殖弧菌的处理范文

1.合理和节约用水，保障重点水面用水。

（1）科学调度渔业用水，协调解决各行业用水矛盾。对于兼有灌溉功能的池塘和小型水库，要积极协调好渔业生产和农业生产的关系，制定科学的用水调度方案，必要时确定最低水位线，避免多重损失；有条件的地区，可采取“过塘水”，即先水过塘、再灌溉农田的办法，科学调配、充分利用有效的水资源。

（2）加强养殖用水调剂，保障生产正常开展。

干旱引发池塘水体蒸发，造成养殖密度增大，水质恶化，给养殖生产带来严重影响。一是要保障养殖用水。采取筑坝蓄水、疏浚沟渠、引水灌溉、泵站提水、打井抽水等有效办法，最大限度地调度渔业生产用水，满足养殖需要。在有条件的地方要大力推行“一塘一井”办法，保证渔业生产正常进行。

（3）本着科学合理用水，节约用水的原则，适当减少换水频率，提高水的利用率。对水源条件较好的养殖地段，做好池塘蓄水工作，保持较大的水容量。

（4）搞好池塘、养鱼稻田的渗漏检查和维修工作，发现渗漏情况及时进行修闸堵漏，减少水的浪费。

（5）修复、添置提灌设施，确保必要供水顺畅。

（6）要优先保证亲鱼和鱼种池塘的用水。旱情严重的地方，应采取并塘或转移的方法，保存亲鱼和鱼种。并塘或转移时，要注意操作方法，尽可能减轻对鱼体的损伤。运输时，尽量选择在傍晚进行。

2.想方设法增加池塘蓄水量，保障养殖生产。

（1）有条件的地方还需要采取临时性打小型机井提水，组织排灌机械，加注新水，缓解供水矛盾。

（2）加深池塘水位，以改善水质、降低水温与水体载鱼量。

（3）如不能加水，则协调养殖户之间的关系，对即将干枯的池塘，将苗种集中转移到水源较好的池塘暂养，待旱情解除后再放回原塘饲养。

（4）网箱养殖区将网箱移至较深水域。

3.充分利用有限水资源，加强水质调控。

（1）控制水位。高温季节易出现水温分层、水质恶化现象。故要将水位控制在1.2-1.5米，既有合适的水温，又可稳定水质。

（2）干旱时期，旱灾未解除前，减少投喂量，及时清除残饵、杂物，保持养殖水体环境良好，减少施肥量，保持良好的水质。

（3）干旱期要清除池内漂浮物，将未腐烂的杂质捞起，以免引起水质恶化。

（4）切忌池塘内堆积绿肥和施用人畜粪尿、各种饼肥等高效有机肥。

（5）随着气温逐渐升高，池水的蒸发严重，所以应保证池水溶氧充足，及时开启增氧机。遇阵雨或闷热天气适当延长开机增氧时间，防止发生泛塘。

（6）采用生石灰调节和改善水质。可每隔10-15天，每亩每米水深用生石灰15公斤，化水全池泼洒。

（7）采用微生物制剂调节和改善水质。条件好的地方，可施用EM菌、活水宝、光合细菌、底改净等有益微生物制剂和底质改良剂来改善水质及底质。

（8）采用生物方法净化水质和降低水温。外来水源有限的池塘，在保证基本养殖水位的前提下，可利用池塘面积的10%左右的水面设置浮床，移植种植红菱、水浮莲、水葫芦、空心菜等浮性植物，以净化水质和降低池水温度。

（9）备好增氧粉等急救物资，可以在发生严重缺氧浮头、意外停电等情况使用。

（10）加强夜间的巡塘观察，注意天气变化，特别是雷阵雨强降温、强对流可能对养殖鱼类引起泛池要做好充分准备。

二、科学投喂技术

在水产养殖生产中，养殖效益的高低，饵料系数是关键因素之一。在水产养殖过程中，饲料的费用约占养殖成本的60%以上。饲料的正确使用及效果，将在水产品养殖的过程中起到举足轻重的作用。只有充分发挥饲料的利用率，降低使用饲料的成本，以较低的饵料系数取得较高的产量，才能取得良好的经济效益。 针对今年干旱的反常气候，许多地方缺少水源，鱼类食欲减退，生长缓慢。因此我们应加强饲养管理，合理投喂饲料，减少不必要的浪费， 主要采取的措施如下：

1.选择优质饲料

投喂高质量稳定性好的配合饲料，不投劣质和冰鲜饲料；饲料营养要全面，满足能量、蛋白质、脂肪、碳水化合物、必需氨基酸、必需脂肪酸、粗纤维及各种矿物质和维生素等需要。特别注重蛋白质营养，对于配合饲料来说，蛋白质是鱼类生长所必需的最主要营养物质，蛋白质含量也是鱼饲料质量的主要指标。应适当降低放养密度，适当投喂精料，增加蛋白质营养。

2. 合理投饲

旱灾未解除前，减少投喂量，加强有氧投喂策略，干旱期间的日投喂量应为正常投喂的70%-80%左右；调整投喂技术，做到早晚各投喂一次，并采用8分饱食投喂方法，减少饲料的浪费和因饲料浪费造成水质污染，保持水质清洁；养殖过程中应及时清除残饵，保持养殖水体环境良好。

3.加强饲养管理

要坚持“定时、定位、定质、定量”的“四定”原则，要坚持“看水温、看水质、看大气、看摄食”的“四看”投饵方法，加强饲养管理。

一是掌握投喂标准，高温期，日投喂量占鱼类总体重的2％～4％，但应防止剩料。

二是区别养殖种类。 合理放养密度，不同种类的鱼，在干旱期间其潜在生长能力及生长所需营养要求各不相同，因此其投喂量与投饵料品种也应有区别。

三是把握吃食时间。干旱期间原则上以喂七成饱为佳。选择定点投喂观察，一般以投喂后1小时～2小时吃食情况而定。1小时内吃完表明要加料，2小时还没吃完，要适当减量。如果经过较长时间正规投喂，鱼类吃食时间突然减短至2小时，说明鱼体已增重，应调整投喂标准。

四是观看池塘水色。一般肥水呈油绿色或黄褐色，上午水色较淡，下午渐浓。水的透明度在30厘米左右，表明肥度适中，可进行正常投喂；透明度大于40厘米时，水质太瘦应增加投饲量；透明度小于20厘米时，水质过肥，应停止或减少投饵。水质偏酸（pH值在6 . 5以下）应酌量少投饲， 同时每亩水面用2 0 千克生石灰化水全塘泼洒， 将偏酸水质调到微碱性（pH值在7以上）。

五是注意合理操作。投喂注意不可将饲料一次性倒入池中，以免营养成分溶解散失而造成浪费或败坏水质。投喂饲料及驯化时应把握“慢－快－慢”的节奏和“少－多－少”的投喂量，少量多次，以提高投喂效果。在阴天及梅雨季节等低溶氧时期尽量少投喂或不投喂，以防止泛塘或浪费饲料。

六是注意天气变化。鱼类饲料投喂也应随天气的变化而变化。在鱼类生长期内天气正常，每日投喂两次，一般是上午8-9时， 下午4-5时各投喂一次；天气晴好，应多投饲，阴雨天少投，大暴雨时不投，天气闷热、气压低及雷电大雨时不投。

七是加强巡塘，观察鱼体生长情况。在每天早晚巡塘时， 要仔细观察鱼类活动情况，如有轻微浮头，应减少投饲量；如严重浮头，应停止投喂并及时采取加注新水和增氧措施。定期检查鱼类生长情况调整投饲数量，发现鱼类生长没有达到应有的规格或则个体悬殊较大，应及时调整增加投喂量，补充营养确保其正常生长。

三、病害防控技术

由于今年干旱，造成养殖池塘水位低，养殖品种密度加大，鱼类相互之间相互感染病原的机率增加，就会引起鱼类抗应激能力下降，造成鱼类抗病能力降低，一旦发生病害，传染速度就会加快，因此要特别防止爆发性鱼病的发生。现在的鱼病工作一定要贯彻“全面预防，积极治疗”的正确方针，采取“无病先防，有病早治”的积极方法，才能达到减少或避免鱼类因病死亡，保证养殖鱼类的单位面积产量和质量。而且鱼病的发生不是一个孤立的原因，它是鱼体、病原体和生活环境三者相互作用、错综复杂的体现，因此预防鱼病不能只从某一方面考虑，而要从三方面着手，既要注意消灭传染病的来源，尽可能切断传染和侵袭途径，又要提高鱼体的抗病力，还要改善生活环境，采取综合性的预防措施，才能达到预期的防病效果。因此，在鱼类养殖过程中，必需创造一个适宜的生态环境，并实施营养素（含营养素药物）和有益微生物成为优势种群的调控技术管理，才能使之有利于增强鱼类的抗病力而健康成长，而不利于病原微生物的增殖，才能达到病害防控、严防病害爆发的技术要求。

1.加强日常管理

干旱期间，是鱼类病害高发期，各养殖户要坚持每日数次巡塘，注重日常管理，密切观察养殖品种的变化，发现问题，正确应对，巧妙渡过干旱高温期，减少旱灾损失。在每日巡塘中应注意观察鱼群的活动和吃食情况，发现异常现象及时进行鱼病检查和相应的治疗。同时，必须贯彻“以防为主，防重于治”的方针，定期对养殖水体泼洒生石灰、微生物水质改良剂，增强鱼类抗应激能力，使用刺激性小的消毒剂对水体进行消毒，避免造成养殖水体不稳定，对养殖鱼类造成新的应激。

2.加强应激管理

应激（胁迫、紧迫）管理本身是健康养成最核心的技术，在干旱期间更应加强应激管理。爆发性鱼类疾病一般都出现在环境恶变，出现应激之后，特别是水质不稳定（水质发生变化）、气候环境很差、酸碱度变化大及温差大等应激强度较大时，养殖鱼类最容易感染病患。其具体方法可全池泼洒三宝高稳VC（150-250克/亩）、葡萄糖（2-3公斤/亩。米水深）、黄芪多糖（100克/亩），以增强养殖鱼类的抗应激能力。并在泼洒这些后4-6小时，应用刺激性小的消毒剂进行消毒（需注意消毒剂的选择和使用问题），扑杀细菌和病毒，双管齐下方能最有效控制水产养殖鱼类疾病的爆发。

3.加强增氧措施

随着养殖时间的增加，污物积累使池塘底部异养菌成为优势菌群，引起池塘底部严重缺氧，进而造成亚硝酸盐、氨氮因氧化不完全而蓄积（发生中毒），二是池底缺氧最严重的后果是致病菌-嗜水气单胞菌的恶性增殖，兼之缺氧已经显着降低了养殖鱼类的免疫力，这样就极容易爆发疾病。为了把底部污物存量降至最低，溶氧必须达到足够高，以实现驱除、氧化分解，并为生物降解污物提供广泛接触的条件，其中采取最有效的手段就是改善水体循环，消除底部缺氧，其方法是使用底层增氧机和在天气闷热、下雨天及平时晚上12-1点全池泼洒以过碳酸钠为主要成分的片状增氧剂200-300克/亩。

4.干旱期间在鱼类养殖过程中应加强危机管理

在干旱期间养殖鱼类的养殖过程中，必须实施危机管理，以创造一个良好的生态环境，并实施营养素（含营养素药物）和有益微生物成为优势种群的调控技术，使之有利于增强养殖鱼类体质的抗病力而健康成长，而不利于病原微生物的增殖。

环境恶变是养殖业最危险的敌人，通常在气候变化特别是干旱季节池塘最容易缺氧引起致病菌的大量增殖而爆发疾病。对于病原体（细菌、病毒）爆发的条件是缺氧（低溶氧）和底质污物蓄积（提供病原体营养和病原体），水体载菌（毒）量偏高，对养殖鱼类产生应激引起低抗力下降。对于这些因素我们应根据天气情况和养殖经验，提前实施危机管理，采取应对措施：

（1）拌喂优质稳定VC（1-2克/公斤饲料），增强养殖鱼类抗病和抗应激能力；

（2）增加池底溶氧（半夜使用以过碳酸钠为主要成分增氧剂200-250克/亩），利于增强养殖鱼类活力，不利于细菌（如弧菌、嗜水气单胞菌等）增殖；

（3）使用刺激性小的消毒剂以杀灭细菌和病毒，有利于保持水质稳定，这是养殖过程中最重要的一点；

（4）降低投饵量，减少残饵和污物，降低病原菌的营养供给；

（5）若养殖鱼类发生病害应立即全池泼洒三宝高稳VC（200克/亩），以提高养殖鱼类的抗应激能力，有利于养殖鱼类的健康恢复和发挥消毒剂的消毒效果；

（6）如果使用好氧的有益微生物（如硝化细菌、芽孢杆菌等）改良水质，需注意在使用微生物制剂前天晚上每亩用过碳酸钠为主要成分的片状增氧剂，并在使用前3-4小时使用一次快速增氧剂并持续开动增氧机，有利于发挥好氧微生物制剂的功效，达到改良养殖水质的效果。

四、苗种补放技术

苗种是水产养殖的基础，持续干旱影响水产亲本和苗种生产，造成苗种供应不足和质量下降，严重影响渔业生产，主要表现在如下方面：

1.干旱困扰苗种生产，种苗供应不足。春季是苗种繁殖的季节，由于早春缺水，亲鱼培育过程中水质条件较差，亲鱼未经过流水刺激，导致亲鱼性腺成熟差，怀卵质量下降，繁殖过程中产卵率、受精率、孵化率均呈下降。一些苗种场因缺水处于半生产或未生产状态，使得部分地区的苗种供应告急。

2.干旱制约种苗投放，养殖周期缩短。冬春季节是渔业干塘整修、水利整险加固和农业生产用水高峰期，干旱造成湖泊水位低，沟渠和塘堰长时间干旱，水源异常紧张，许多地区水产养殖已无水可调，池塘无水或者蓄水严重不足，导致不能及时投放鱼种，错过了最佳放养季节，同时也缩短了养殖周期，部分鱼池甚至至今都无法投放种苗。

为了应对干旱灾害，可从调配亲本和苗种资源、合理补充放养、异地或不同品种间的调配、提高生产技术等方面着手，减少灾害造成的损失。苗种生产应对干旱灾害的技术措施如下：

1.做好亲本调配和培育，确保苗种生产供应

（1）查清亲本存量。及时查清亲本损失数量，根据亲本标准及苗种生产计划，及时补充、调运亲本。

（2）强化亲本培育。加强亲本饲养管理，加强营养，补充能量，促进亲本正常发育，确保用于繁育生产的亲本数量和质量。

（3）亲本异地培育。如果持续干旱导致亲本培育水面严重萎缩，对于一些能进行转移的亲本，可进行异地租赁水面进行培育，将干旱地区的亲本转移至非干旱地区进行保护和培育，来年再运回当地进行苗种生产。

（4）野生优质亲本的利用。对于四大家鱼、虾类等以野生种为主要亲本来源的种类，可以从当地或异地湖泊、河流甚至沟渠等野外水域中收集野生亲本，进行一定时间的驯养和培育后用于苗种繁殖。

2.做好苗种繁育工作。

（1）改善池塘育苗硬件设施：加固池埂减少渗水量和渗水的重复利用：新开池塘和塌陷严重的池埂，渗透水量相对较多，需加宽池埂，并在池埂适当部位开挖深沟，重新填埋泥土，堵住渗水。渗水比较分散的池埂，在池埂外侧开挖浅沟，收集池埂渗水。收集的渗水可以用氯制剂消毒后重新注入池塘。水位降低后，叶轮式、水车式增氧机的增氧效果下降，要注意增加开机时间，或配备底层管道增氧设施，达到增加水体溶氧量的目的。

（2）组织专业技术人员，对苗种生产单位和个人，进行育苗技术集中培训和现场指导，提高苗种繁育技术水平，提高苗种质量，弥补苗种供应不足。

（3）苗种异地培育。对于一些能进行转移的亲本，可进行异地租赁水面进行培育，可将干旱地区的成熟亲本转移至非干旱地区进行苗种繁育， 苗种育成后再运回当地进行放养。

（4）改进苗种捕捞方式，节约用水。有些种类苗种捕捞时，部分传统的方法是放水收集，水资源浪费大。面对干旱，可改进捕捞方式，尽量以拉网等方式进行，节约用水。

3.做好亲本和苗种调剂，补充放养以保证养殖生产需求。

有关管理部分可组织苗种生产单位做好亲本和苗种的调剂、调运工作，从异地调运部分苗种补充放养，有些品种也可捕捞部分野生苗种补充放养，抓好苗种的调剂，互通有无，互补不足，以最大限度满足灾后养殖户对苗种的需求，使广大养殖户能够在灾后及时补充投放苗种，将干旱对渔业生产的影响降低到最低限度。

五、抗旱管理技术

1.及时掌握旱情，早安排，早部署。密切注意气象部门的旱情预报，提前作好应急预案，准备抗旱物资，全面安排部署水产养殖抗旱救灾工作。

2.成立技术服务专家组，主动做好技术帮扶工作。也可将专家组成员名单、联络方法通过各种方式告之养殖户，保证养殖户得到及时的技术指导。

3.增强水产品质量安全意识，从水域环境监控、产地环境、投入品、生产过程、市场准入等环节加大水产品质量安全监管力度。建立《水产养殖生产记录》《水产养殖用药记录》和《水产品销售记录》，加强水产投入品监管和水产品检疫，严禁使用违禁药物，确保水产品质量安全。

4.加强生产管理，适当减少养殖密度，科学投喂。旱情严重的地方，应及时将商品鱼捕捞上市或采取并塘、转移等措施，降低养殖密度，缓解水体溶氧压力。并塘或转移时，要注意操作方法，尽可能减轻对鱼体的损伤，尽量选择在傍晚进行。对于不能上市的鱼种作好并塘或囤积处理，确保不能上市的鱼种安全度过干旱。适当减少每天投喂次数和投喂总量，尽量不施有机肥、少施无机肥。

5.加强水质调控和疫病防控，确保水产品质量安全。要求每天增加巡塘次数，注意日常管理，密切养殖品种的变化。干旱期要经常清除池塘内的漂浮物，将未腐烂的杂质捞掉，以免引起水质恶化。加强病害监测，加大疫病防治，指导渔民科学用药，发现问题，及时应对。

6.及时修复养殖设施，做好苗种准备工作。对已干枯的池塘，及时清除淤泥、消毒塘体，修补塘埂和沟渠，做好旱情缓解后恢复生产准备工作。做好苗种储备供应和信息调度，组织干旱程度较轻的地区加大水产苗种生产力度，及时水产苗种供需信息，为恢复生产做好准备。

第5篇：水产养殖弧菌的处理范文

通讯作者：李伟，男，教授，Tel: 0411-84763553；E-mail: aisingioro@hotmail.com。

韩欢，徐婧，孔亮，李伟*，董美玲，刘琪，王春龙

（大连海洋大学，辽宁 大连 116023）

摘要：对水产品等食品中磺胺类抗生素常用的分析方法和预处理方法进行了综述，归纳和比较了毛细管电泳法、微生物方法、液相色谱-质谱法、免疫法、气相色谱法、分光光度法、高效液相色谱法等特点。其中高效液相色谱法由于操作简便、快速、灵敏、准确的特点，是当前检测磺胺类抗生素的主要方法。同时，对包括固相萃取、分子印迹等预处理方法进行了综述。

关键词 ：磺胺类抗生素；抗生素残留分析；高效液相色谱法；分子印迹。

早在人类出现之前，细菌已经在不同的生态位发挥着重要的作用。在细菌中有相当小的比例是致病菌，它们能够给人类和动物的健康带来灾难性的影响。在治疗细菌感染的历史过程中，人类就发现了细菌和植物种类中有益的抗菌性，并开始利用具有抗菌活性的化合物来抑制细菌感染，而这些化合物大多是来自自然界。1929年，弗莱明在实验中偶然发现了青霉素，并且在牛津大学病理学教授弗洛里的进一步系统研究之后，抗生素的发展得到了大力推动[1]。青霉素在首次临床试验中，疗效效果十分惊人，从此抗生素进行大规模生产及商品化使用，并且在畜牧、水产品养殖等行业大面积使用。但随着抗生素商品化及平民化使用，过度及搭配不当地使用抗生素反而会危及人及动物的生命安全，同时也会造成环境污染。如：产生毒副作用[2]、致病菌产生耐药性[3]、继发性感染[4]、动物源性耐药菌对人类的危害[5]、影响环境微生物[6]、食品安全[7]。

1磺胺类药物残留的检测分析方法

磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）是比较常见的合成抗菌剂，普遍用于渔业养殖生产，主要有：磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SM1）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SM2）、磺胺甲基异恶唑（Sulfamethoxazole，SMZ）等。它们主要用于治疗鱼类的赤皮病、肠炎、链球菌病、弧菌病、细菌性竖鳞病、赤鳍病、烂鳃病、鞭毛虫病、弧菌病、肠炎等等[8-9]。SAs的广泛应用，使鱼病的感染和传染方面得到了有效的控制。但是人们在享受着抗生素带给人们方便的同时，许多新的问题也伴随而来。像毒性反应、二重感染以及细菌产生耐药性等，尤其是在滥用的情况下能够产生排尿和造血紊乱等副作用[10]。因此大多数国家包括我国农业部、日本、欧盟、欧美和国际食品法典委员会（CAC）等都陆续规定了食品以及饲料中SAs的最大残留限量标准[11-12]。其中日本规定SM1为0.02 mg/kg，磺胺二甲氧嘧啶（Sulfadimethoxine，SDM）为0.04 mg/kg，SM2为0.01 mg/kg，其它按一律标准为0.01 mg/kg[13]。联合国食品法典委员会（CAC）、欧盟和欧美等国家规定水产品中磺胺类药物残留量不得超过0.1 mg/kg[14]。 我国农业行业标准《NY 5070—无公害食品水产品中渔 药残留限量》中规定，SAs在水产品组织中的最高残留总量限量为100 μg/kg。另外我国检测SAs标准还有SN0221-92，SN0208-93，GB/T20759-2006等。

目前，SAs残留的检测方法很多，主要有微生物方法、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳法、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、免疫法、气相色谱法（GC）、分光光度法等。其中高效液相色谱法简便、快速、灵敏、准确的特点是当前检测SAs的主要方法。表1为近年来常用的抗生素分析方法。

1.1微生物方法

微生物方法是应用较为广泛的一种检测方法，尤其是在牛乳中抗生素残留的检测。微生物检测方法分为纸片法、亮黑还原法、TTC法、CHARM抑制法等[15]。该方法具有可直观、仪器设备成本和检测成本较低，但该方法的灵敏度和特异性与其它方法对比相对较低。其中酶标抗体检测法是目前一种趋向灵敏、准确、快速的新型微生物检测方法[16]。

1.2高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography, HPLC）

高效液相色谱法（HPLC）是色谱法中一个重要的分支，也是目前应用最广泛的检测抗生素的方法。HPLC因载液流速快，固定相和流动相可以自主选择，所以具有分析速度快、分离效率高的特点，可以检测近70%的化合物。抗生素残留在色谱分析时最常用的检测方式有紫外-可见检测器（UV-Vis）电化学检测器（ECD）、荧光检测器（FLD）和二极管阵列全波长检测器（DAD）等。如刘勇[17]、ayas-Blanco[18]、Kunihiro Kishida[19]、方炳虎[20]等分别应用反相高效液相色谱法检测分析牛奶中SAs的残留，并采用乙腈提取SAs残留，获得了良好的分析效果。刘振伟等[21]以乙腈进行提取，HLB小柱净化，采用紫外-可见检测器在270 nm处进行检测，检测低限能够达到5 μg/kg，线性在25～300 μg/kg范围内良好。该类方法具有准确度高、精密度好、检测限低的特点。

1.3毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE）

毛细管电泳法也是一种液相分离的技术，再用紫外-可见检测器扫描成电泳谱图，相对于高效液相色谱来说，CE的柱效更高，对于离子型化合物具有很好的分离效果，并提高了样品检测的分辨率。目前由于毛细管电泳和高灵敏度检测器的联用，灵敏度有了极大的提高[22-25]。如Ackermans等建立了毛细管带电泳法检测磺胺噻唑（Sulfathiazole，ST）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMO）等15种SAs的残留分析方法[26]。但CE最大的不足是进样量过低，造成分析误差升高，并且进样的待测物受到限制，很难应用于痕量分析。

1.4液相色谱-质谱法(HPLC-MS)

液相色谱-质谱法是液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统的一种结合方法。液质联用技术是色谱和质谱优势的互补，提高了对复杂样品的分离分析能力。HPLC-MS有如下几个特点：（1）分析范围广泛，可以检测绝大多数的化合物；（2）分离能力强，通过MS，能够按照特征离子质量可以将色谱中没有彻底分开的混合物进一步进行分离，并可以定性、定量分析；（3）检测限低；（4）分析时间快；（5）自动化程度高。如Casetta等建立了HPLC-MS/MS法测定了蜂蜜中SAs的方法[27]。

1.5免疫学方法

免疫分析方法包括放射免疫分析法（Radioimmunoassay，RIA）、酶联免疫分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）、固相免疫传感器、免疫亲和色谱（Immunoaffinity Chromatography，ICA）等。免疫学方法具有操作简便、分析成本低、灵敏度极高等优点。其中酶联免疫分析法更是由于特异性强、操作简便的特点使其成为最为常用的方法之一[28-30]。但由于免疫测定法大多数是以生物物质作为分子检测识别原件，这些物质不易长期保存，并且操作稳定性差，容易出现假阳性，因此不适合作为确证试验。

1.6气相色谱法（Gas Chromatography，GC）

气相色谱在早期SAs分析中应用较多。GC可以使用的检测器通常有火焰电离检测器（FID）、电子捕获检测器（ECD）、热导检测器（TCD）等。其中FID、TCD检测的范围广泛，其它的检测器因检测化合物的范围较窄而鲜有应用。GC具有分析速度快、效率高、操作简单、选择性较好、低检测限等优点。由于GC/ECD可以作为GC/MS的补充可以测定动物性食品等样品[31]，所以分析SAs时气相色谱法主要为GC/ECD。但同时GC只能适用于低沸点、易挥发但不分解的物质进行定性和定量分析，因此在很多实际分析检测中，GC受到了一定的限制，需要对样品预处理、色谱条件、流动相的选择进行改善等优化。

1.7分光光度法

分光光度法有紫外可见分光光度计、原子荧光分光光度计和原子吸收分光光度计，同样它们在食品领域中已经得到了广泛的应用[32-33]。虽然常规的光谱学仪器应用广泛、操作简便等优点，但受到线性范围、准确度及精密性等性能参数的制约，从而影响到解决食品中实际样品检测问题。Gala B等建立了停止与流动技术与T型荧光分光法结合的方法同时测定出牛奶中氨苄青霉素和四环素[34]。

表1常用的抗生素分析方法

2针对抗生素分析的样品预处理方法

由于食品中富含脂肪、蛋白质、糖、维生素及氨基酸等基质，而且食品中存在大量的干扰物质，待测物含量非常低，规定的浓度量级基本为mg/kg、μg/kg、ng/kg，甚至更低。因此在检测食品样品中需要大量而且细致的分离纯化和富集过程。样品预处理是其中必不可少的步骤，也是最关键的步骤。由于样品预处理可以减少杂质对目标物的干扰程度，以及可以对试样中的痕量组分进行预富集，所以是整个检测分析过程中误差的主要来源和分析时间快慢的决定步骤[35]。预富集能力越强、富集成分越单一，检测灵敏度就越高。而且无论是HPLC还是GC等的检测方法通常是需要对样品中的抗生素残留进行预处理，如分离、纯化等步骤。因此，发展新型快速的样品预处理方法对于建立食品中抗生素的检测方法也是非常重要的。目前磺胺类抗生素检测分析样品预处理方法主要有液-液萃取法、固相萃取法、微波辅助萃取法、超临界流体萃取、分子印记法等。表2为近年来常用的抗生素分析的样品预处理方法。

2.1液-液萃取

液-液萃取是SAs残留分析中的一种常用的经典提取方法，是早期样品净化方法中最常用的方法，一般应用于样品中被测物质与基质的分离。其原理是根据组分在溶剂中的不同溶解度而达到分离或提取目标化合物的目的。张伟红等先将水产品酸化处理，再用乙腈做萃取溶剂，经正己烷脱脂后，蒸发浓缩，最后用HPLC-MS/MS内标法测定了水产品中18种SAs残留量[36]。液-液萃取方法虽然操作简便，但是存在处理过程引起的误差较大、可控性较差等不足，除杂效果有限。

2.2固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）

固相萃取主要应用于样品的分离、浓缩和纯化。固相萃取方法具有如下优点：(1) 富集倍数高，由于使用的是固相萃取柱富集样品，所以富集倍数可以高达数十倍，甚至是数百倍；(2) 分离杂质效率高，固相萃取可以有针对性地选择SPE吸附剂，从而有效地分离干扰组分；(3) 有机溶剂消耗量低，仅需少量的洗脱剂就能把待测分析组分洗脱下来；(4)易于收集、操作快捷方便等优点，因此目前广泛应用于食品化学成分、农兽药残留、环境污染物等方面的检测。

SPE可以根据抗生素化学性质采用不同类型的SPE柱进行固相萃取。其中，用于分析动物源性食品中SAs的SPE柱主要分以下几种：(1) C18 SPE柱；包艳萍等采用C18 SPE柱净化蔬菜中SAs，净化效果良好，回收率为50.80%～98?90%[37]。(2) 碱性氧化铝SPE柱；王钦晖等、李俊锁等分别在测定蜂蜜、鸡肝组织中SAs残留量时，采用碱性氧化铝SPE-Pak柱净化样品，样品用乙腈淋洗后售价并分析，结果表明干扰被测样品中的杂质能够被去除，该方法操作简单[31,38]。 (3) Oasis HLB SPE柱；李存等将样品加入到Oasis HLB SPE柱中进行分离预处理，结果表明，该预处理方法去除杂质效果较好，定量曲线线性良好[39]。(4) Oasis MCX SPE柱；熊芳等采用Oasis MCX SPE柱对动物肝脏中的4种SAs进行萃取[40]。该方法操作简便，净化效果好，能够满足分析的需要。(5) 硅胶SPE柱；董丹等采用硅胶SPE柱对鸡肉中的17种SAs进行净化，方法回收率为52.30%～124.90%，提高了样品中被测物质的检测灵敏度[41]。(6) DVB型全自动固相萃取小柱；何桂花等运用全自动固相萃取小柱富集净化动物脏器组织中的SAs。使用二氯甲烷提取，正己烷除脂。萃取柱经甲醇和5%的乙酸溶液处理活化，然后上样，采用5%的乙酸-甲醇(1:1, v/v)进行洗脱收集后进行分析，结果表明处理效果较好[42]。由于SPE具有效率高、重复性好、处理速度快等特点，目前已经成为抗生素残留分析预处理方法的一个发展方向。

2.3微波辅助萃取（Microwave Aided Extraction，MAE）

MAE具有回收率高、萃取时间较短等优点，其具体表现为：不仅可以加快样品中基质、大分子物质的分离，还可以通过添加极性溶剂吸收微波能来提高溶剂的提取效能；MAE能够在高温和高压下加快分子运动速度，继而提高了微波萃取的速率。曾庆磊建立了微波辅助水蒸气萃取的方法提取动物饲料中磺胺类抗生素，能够快速、高效率地提取饲料中磺胺类抗生素，并减少了样品中其他杂质的提取，达到了较高的回收率[43]。

2.4超临界流体萃取（Supercritical Fluid Extraction，SFE）

当某一物质高于本身的临界温度和压力后，该物质物理状态处于既不会是液体也不是气体的状态，我们称之为超临界流体（Supercritical Fluid，SF）。SF由于其独特的性质而能够溶解很多物质，SFE正式利用这一超临界流体作为溶剂，因此压力和温度都会对流体的溶解能力产生很大的影响。并且SF的表面张力较小，使其能够快速渗透到样品中，因此其萃取速度要比普通溶剂的萃取速度快很多。由于这些性质使超SFE要比溶液萃取的效果好得多[44]。SFE具有广泛的实用性、萃取效率高，尤其是不产生污染、节省能源等优点，特别适合于热敏性天然产物和生理活性物质的萃取分离[45]。

2.5免疫亲和色谱法（Immunoaffinity chromatography，IAC）

免疫亲和色谱法是一种操作简便、分离效果理想且精密度高的样品前处理中方法。IAC有可以对复杂基质中痕量组分进行选择性吸附和富集的特点，检测线非常低，而且免疫吸附柱经适当处理后可以重复使用，目前是残留分析中比较有效的净化方法之一，已经被应用于多种药物残留的测定。李俊锁等、Sheth H B等分别建立了免疫亲和色谱法测定兽药和蜂蜜中SAs的残留[46-47]。

2.6分子印迹法（Molecular Imprinting）

表2抗生素分析中常用的样品预处理方法

分子印迹技术最早是由Pauling提出以抗原为模板合成抗体的理论为启发[48]，直到1972年由德国Wulff等研究小组才人工合成出对糖类化合物具有较高选择的共价型分子印迹聚合物[49]。到1993年Mosbach等在Nature上发表了非共价型分子印迹聚合物合成及其仿生免疫分析应用的文章后[50]，分子印迹技术得到了迅猛发展。分子印迹技术通常来讲是指通过加入模板分子能够形成对某一特定的分子具有特异性选择的聚合物，并且当模板分子去除后，聚合物中形成与模板分子空间结构相匹配的空穴，从而这个空穴对模板分子具有高度的选择识别性。分子印迹技术具有构效预定性（predetermination）、特异识别性（specific recognition）、广泛实用性（practicability）、稳定性好、使用寿命长等特点[51]。在以磺胺类作为模板分子的整体柱报道中，刘祥军等以SMO作为模板分子，四乙烯基吡啶（4-vinyl pyridine，4-Vpy）为功能单体，采用了原位聚合法在色谱柱中直接制备了SMO分子印迹整体柱，并显示出良好的识别能力。

中国加入世界贸易组织之后，各国政府使用贸易保护政策来维护本国的经济利益，而食品安全问题已经成为影响贸易的关键因素，各国对食品中SAs的残留量制定了严格的控制标准。近年来，由于水产养殖病害多发，不规范用药情况依然存在。另外，由于水产养殖的集约化，饲料药物添加剂和亚治疗量的各类抗生素在生产中广泛应用，以及不合理用药等因素，使水产品药物残留问题日益突出。我国由于出口产品SAs残留超标，造成了外贸受阻，给我国的经济和形象带来了严重影响。因此无论是从产品的本身需求方面，还是为相关法规和标准的执行提供科学技术依据，提高并完善检测包括水产品在内的食品中SAs残留的技术都是至关重要的。

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第6篇：水产养殖弧菌的处理范文

关键词：寡糖；提取；纯化；应用

中图分类号：S646.099文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）07-0141-05

寡糖又称低聚糖，由不同的五碳糖和六碳糖通过糖苷键连接形成。科学界对“寡”的数目并没有严格的规定。1959年，Jhone建议将9个以下的单糖残基低聚物称为寡糖[1]。寡糖及其衍生物是一类重要的生物活性物质，能促进双歧杆菌生长，激活植物的自我防卫系统，还具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用。寡糖类物质可通过天然提取、降解和人工合成等方法获得，其中天然提取的方法具有方法简单、能耗小、污染低等优点。玄参科、菊科植物和食药用菌因其含有较多的功能性寡糖和未知寡糖，已成为天然寡糖的主要研究对象。食药用菌含有的聚糖类物质尤为丰富，继活性多糖后食药用菌寡糖的研究将成为糖工程研究的又一热点。

1寡糖的分布

寡糖类物质的分布广泛，多数植物的根茎、果实和种子中均含量丰富。王照波等[2]、王江浪等[3]从雪莲果、苹果中提取出大量寡糖类物质，陈[4]采用水提醇沉去多糖法从洋根中提取的低聚果糖含量高达53.72%。生地黄中已知的寡糖种类有水苏糖、棉子糖、甘露三糖、毛蕊四糖等[5，6]。据报道，营养丰富的食药用菌也富含寡糖类物质。姜瑞芝等[7，8]从猴头菌浸膏中分离得到猴头菌二糖、三糖和四糖。马红霞等[9]从树舌灵芝中分离得到了非还原性二糖。此外，也有从藻类、菊芋、大豆等[10～12]植物中获得寡糖类物质的报道。

2寡糖的分类

到目前为止已确定的寡糖有上千种。寡糖的分类有以下3种方法[13]：①根据寡糖的单糖组成可分为同寡糖和杂寡糖；②根据寡糖分子中是否存在游离的半缩醛羟基，分为还原性寡糖和非还原性寡糖；③根据生物学功能可分为普通寡糖和功能性寡糖，前者可被机体消化吸收，产生能量，后者具有特殊的生理学功能但不被肠道吸收。此外，寡糖还存在许多经过化学基团修饰生成的衍生物，如糖醛酸、胺基糖、脱氧糖、糖醇等[14]。

3天然寡糖的提取方法

天然提取寡糖与降解或合成寡糖的方法相比，虽不易扩大到工业化生产，但工艺简便，涉及化学药品少，对寡糖的结构及生物学活性影响小，有利于研究未曾发现或认知的新型寡糖。常见的提取方法有以下几种：

3.1水提法

水提法是自天然材料中提取糖类物质的常用方法。为了减少杂质，可先用低极性溶剂去除亲脂性的成分，然后再用水浸提。赵贵兴等[12]以脱脂豆粕为原料，采用水提法制备大豆低聚糖浆，为大豆的综合利用提供了新途径。

3.2有机溶剂抽提法

糖类是多羟基的化合物，极性大，易溶于极性溶剂，因此，可利用相似相容原理，选择合适极性的溶剂反复抽提。赵益斌等[15]对青阳参乙酸乙酯提取物进行研究，分离得到4种新寡糖。信维平[16]分析了乙醇甲醇法和乙醇法两种提取方法对胡萝卜寡糖提取率的影响并确定了最佳提取工艺。

3.3微波提取法

近几年来，微波提取法已广泛应用于药用植物化学成分提取方面。其原理[18，19]是利用微波能的加热效应加速对目标化合物的提取，并利用空间电场和磁场的高频振荡，加速目标化合物的扩散速率，从而提高提取效率。王章存等[19]利用500 W的微波在近中性的条件下处理30 min，可显著提高大豆低聚糖的含量且更利于脱盐。

3.4射频法

与微波加热同属介电加热的射频技术，射频频率在10～300 MHz，由于其波长最多可达微波波长的360倍，穿透深度（几十厘米）远远超过微波[20]。同时由于射频的能量更加集中，不像微波是漫散射，因此设备放大后也不存在泄露问题。高虹等[21]探讨了射频技术在香菇多糖提取中的应用，优化了射频辅助提取工艺，与传统方法相比得率有较大提高。

3.5超声波提取法

超声波法提取糖类化合物的主要原理是由于超声波产生的空化效应能产生强大的冲击波，促使细胞内含物释放到溶剂中，从而加速了整个萃取过程[22]。刘立洋等[23]探究了超声波技术在提取大豆低聚糖工艺中的应用效果，并摸索出一整套提取、检测的方法。

4寡糖的分离和纯化

寡糖的分离和纯化是寡糖研究的关键步骤，是指将不同种类寡糖进行分离，得到单一寡糖的过程。目前，常用的分离技术有以下几种：

4.1层析技术

4.1.1薄层层析薄层层析是在纸层析的基础上发展起来的，在玻璃板上涂一层支持剂，通过流动剂的推动使一端样品得到分离的物理方法。常用的支持剂有硅胶G、氧化铝、纤维素、硅藻土、交联葡聚糖凝胶等[24]。此方法优点是分辨效率高，简便易行，可同时分析多个样品。Betty等[25，26]确定了壳寡糖的薄层色谱分析条件：乙酸乙酯∶乙醇∶水∶氨水（V/V）=5∶4∶4∶0.3，壳寡糖溶液上行展距为8 cm。

4.1.2色谱柱分离法色谱柱分离法是一种便于工业化生产、操作简单的方法。当样品溶液通过色谱柱中的固定相后，不同组分即可得到分离。色谱柱中的填充料以离子交换树脂、大孔树脂和聚酰胺为主。下面简单介绍几种色谱柱分离方法：

①活性炭柱层析：活性炭柱层析是利用样品中各组分在活性炭上的吸附能力不同来进行分离的。活性炭比表面积大，吸附量大，分离效果较高，与等量的天然硅藻土混合使用，是分离寡糖液常用的填充材料。活性炭柱层析方法的优点是分离容量大，分离效率高，适用范围广，并不受洗脱液组成、糖液浓度改变（1%～10%）或无机盐存在的影响[27]。车今智等[28]采用活性炭柱层析对芙蓉菊寡糖进行分离，获得了不同分子量的寡糖片段。

②凝胶柱层析法：凝胶柱层析法已广泛应用在寡糖的分离与纯化过程中，其优点是高效、易操作、重复性好。主要原理是利用立体网状结构的多孔性凝胶作为筛子，如葡聚糖凝胶（商品名为Sephadex G）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-Gel P系列）等。当糖溶液流经凝胶柱后，洗脱时不同相对分子质量的糖可以得到分离。小分子糖易于扩散，洗脱时路径长，后被洗下。郝林华[29]采用SePhadexG-50葡聚糖凝胶柱层析分离纯化牛蒡寡糖，得率为77.12%。Harry等[30]采用Bio-Gel P-2凝胶柱层析技术分离得到带阿拉伯糖基的低聚木糖。

③离子交换色谱法：在纤维素层析成功分离糖类的基础上，人们将纤维素改性，使离子交换与纤维素层析结合制成一系列的离子交换纤维素，应用于糖类的分离并取得了较满意的效果。常见的阳离子交换纤维素有CM-Cellulose、P-Cellulose等；阴离子纤维素有DEAE- Cellulose、ECTEOLA- Cellulose等，可以分离酸性、中性多糖和黏多糖。用离子交换树脂分离糖类，可有效地除去样液中的酸、碱成分及无机离子，但应注意不宜用强碱性与强酸性树脂[1]。刘元召[31]在研究真菌壁寡糖的过程中，采用强阳离子交换层析介质分离寡糖、蛋白及肽类物质。

4.2膜分离技术

膜分离是利用半透膜作为选择障碍层，依据膜孔径大小达到分离目的的一门新技术，其优点是操作简便、产物活性高和生产过程无污染等。膜分离技术可分为以下几种：反渗透、透析、电渗析、纳滤、超滤、微滤等，其中反渗透和纳膜过滤最有望用于分离纯化功能性寡糖[32]。杜昱光等[33]建立了一种酶解壳聚糖与膜分离偶合生产壳寡糖的方法。陈勉等[34]采用超滤的方法制备出聚合度为6～8的壳寡糖。

4.3其它分离方法

纸色谱、纸电泳、气相色谱、石墨化碳柱高压液相色谱[35]、高效毛细管电泳法[36]等技术也常用于检测和分离寡糖。随着各项分离、分析检测技术的日趋成熟，各种方法间的混合使用已成为研究寡糖的最新趋势。

5寡糖生物活性的应用

5.1寡糖在农作物抗病方面的应用

寡糖既可自身抑菌抗病，又可作为诱导子诱导植物体提高抗病性，与此同时还可作为营养成分调节作物生长发育[37]，从而提高农作物的产量及商品性状。许多报道显示，寡糖类物质对多种真菌性病害均有很好的防治作用[38～42]。徐大明等[43]发现壳寡糖液浓度在0.5×10-5μg/ml以内时，对烟草花叶病毒（TMV）有明显的钝化作用。

5.2寡糖在饲料业中的应用

寡糖类物质具有调节肠道微生态、促进双歧杆菌生长、提高动物的免疫能力及生产性能、避免耐药性等功效[44，45]。凭借独特的生物学活性，寡糖类物质已成为新型饲料添加剂研发的热点。邢广林、李启琳等[46，47]的研究结果显示甘露寡糖能够代替抗生素药物添加到饲料中，提高肉鸡抗氧化能力、成活率和日增重，降低料重比。王彬等[48]研究显示，育肥期基础日粮添加0.1%的半乳甘露寡糖，可以显著促进育肥猪的生长，减少育肥猪的采食量，增强机体的免疫力。陈丽等[49]研究发现褐藻寡糖对嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、白色念珠菌（Candida albicans）和鳗弧菌（Vibrio anguillarum）3种水产致病菌有很好的抗性，是一种高效、无毒副作用的水产养殖用饲料添加剂。

5.3寡糖在医疗保健方面的应用

5.3.1降血糖、血脂作用寡糖降血糖、血脂的生物活性已成为研发的新方向。据报道[50，51]，地黄寡糖具有降低ALX糖尿病大鼠血糖、增加血清胰岛素浓度及肝糖原含量的作用，昆布寡糖对2型糖尿病大鼠具有明显的治疗作用。张婷婷等[52]试验发现，5～10 ku的甲壳低聚糖对油脂、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠和胆固醇的吸附率分别为5.3%、90.0%、71.1%和87.5%。

5.3.2提高免疫能力寡糖可通过多种途径提高生物体免疫力，如促进细胞免疫和体液免疫。据报道[53，54]，甘露寡糖能够提高大西洋鲇嗜中性粒细胞的吞噬活性，对环磷酰胺制造的免疫低下小鼠也有较好的提高免疫力功效。此外，许多寡糖还具有增强造血功能、抗肿瘤、抗抑郁、治疗心血管疾病的功效[55～57]。

5.4寡糖在果蔬保鲜方面的应用

寡糖类物质在果蔬保鲜上的应用近几年屡见不鲜[58，59]，其主要的作用机理有以下几点：①在果蔬外形成半透膜，减少蒸腾作用造成的水分损失；②起到类似于气调包装的效果，维持较高的CO2、较低的O2和乙烯浓度；③阻止存储果蔬期间糖分和含酸量的下降；④降低存储期间果实的脂氧合酶（LDX）的活力，防止细胞的脂膜过氧化及内容物的渗漏；⑤通过提高果蔬中超氧化物歧化酶（SOD）的活力，延缓细胞衰老；⑥通过诱导一系列防御反应机制阻碍病原菌侵袭，如堵塞皮孔、产生植保素、果实细胞壁加厚等。邓丽莉等[60]研究发现1.5%壳寡糖处理可以有效延长柑桔贮藏时间。

5.5寡糖在食品加工方面的应用

某些寡糖具有低甜度、较好的水活性、保湿性、稳定性以及黏度等特点，已被广泛应用于食品和饮料加工。李晓东等[61]研究表明添加大豆低聚糖可延长点心面包的保质期。金桥等[62]研究发现在传统酸菜腌渍过程中添加壳寡糖可以有效抑制发酵初期腐败菌的生长并且还能提高酸菜的感官质量。此外，寡糖类物质应用于乳品、新鲜奶酪及保健饮料中的报道也不少[63～65]。

6结论与展望

随着人们对寡糖各方面性质和生理功能的不断认识，寡糖的应用已在食品、医药、农业等领域取得了一些成绩。食药用菌卓越的保健功效与其含有丰富的聚糖类物质是分不开的。目前，食药用菌多聚糖已开展了广泛研究，但在寡糖类物质上的研究，尤其是天然寡糖的提取研究还较少。因此食药用菌寡聚糖的研究开发对进一步提高食药用菌的综合开发价值有着重要意义。随着各种自动化分析仪器、现代医学与糖化学研究的紧密结合，寡糖类物质的研究开发具有广阔的前景。

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