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【关键词】整体分析;思维判断;代表性
通常在医学临床上由于患有低镁血症而使患儿出现惊厥症状的并不常见,极其罕见,所以很容易引起误诊,对于这个情况,在我院新生儿科室误诊的惊厥案例8例,分析如下:
1 临床资料
误诊为是低钙惊厥的有3例,低血糖2例,病脑1例,肠炎合并低钠血症1例,癫痫1例。一般资料8例中男婴5例,女婴3例,年龄最小的3天,最大的28天,其中多见于15天左右的新生儿。误诊一般为1-24小时,平均6小时。
1.1 临床表现 在8例临床表现中,发热2例,呕吐2例,纳差1例,夜间多汗、体检可见枕秃1例,腹泻1例,中度脱水1例。在8例惊厥的中,每天惊厥都在5到10次左右的就有5例,1到5次的也有3例,惊厥的时间程度不同。其中六例的就维持在10秒左右,3分钟左右的案例有2例;惊厥的表现方式也不一样,如双眼凝视4例,眼球震颤2例,全身抽搐1例,阵发性屏气发作1例。
1.2 实验室检查 新生儿低镁血症的案例在治疗效果不明显的时候,实验室里检查血清镁仍少于0.36mg/ml.
1.3 新生儿如被确定为是低镁血症引起的惊厥原因时,患儿要及时用镁盐治疗,可注射静脉浓度为3mL/kg+5%的葡萄糖液或注射浓度为25%到肌肉的硫酸镁,一天2次;患儿症状缓解后则用口服10%硫酸镁,一天3次,新生儿用药后病情基本上能处于稳定状态。
2 讨论
2.1 众所周知人体有很多重要的元素,而镁则是对人体最重要的功能之一,它在身体内的含量排在钠、钾、钙之后,占第四位。而在细胞中,重要性则排在钾之后,仅次于第二位。在人体内,大约有325种酶的活化过程中需要通过镁的作用。特别是与ATP代谢有关的酶。因为人体内有很多生物在过程中都需要ATP协助,所以镁就占据人体中非常重要的因素。
2.2误诊原因分析
2.2.1 对低镁血症的认识不够深入 到至今为止,很多医学书籍和儿科专业书籍都没有把低镁血症放入专提结构进行讲解传授,而且很多临床报道也对低镁血症普遍偏少,导致对这方面没有经验的医生对病的了解不够,深入不够,所以误诊为其他病症的可能性更高。
2.2.2 整体缺乏分析,思维考虑主观 医生在给患儿诊断时的思维和方法普遍存在偏离和限制,常把常见病和多发病视为重要因素,忽略了未知的病。在给患儿就诊中,对患儿的病因不够了解的细致,单依靠较少病症的症状以及患儿出现的身体特征来做出的判断而导致的对低镁血病症的误诊,可以看出对专业临床上的表现缺乏整体综合分析。
2.2.3 临床表现无代表性 低镁血病症在临床上没有特别意义上的表现,与新生儿其他疾病极为相似,因为低镁血病症一般都是在其他病发前或者之后才出现的,所以误诊的可能性更高,对病的准确性越低。譬如因为长时间口服钙剂从而影响了镁的吸收的大部分佝偻患儿,然而发生了低镁惊厥的症状,所以很多就诊的医生误以为是佝偻病导致的低钙惊厥症状。
2.2.4 对临床习惯的误导导致思维的判断 当患儿就诊时,医生通常会把两种同时存在的疾病合并为一种疾病而没有考虑到另一种已经发生的病症放在内。在本文中,有3例是惊厥患儿查出血钙低于正常的范围而被误诊为低钙惊厥病症;1例为惊厥的新生儿被查出血糖偏低而被误诊为低血糖惊厥症状;1例为腹泻的新生儿查出血纳则少于正常范围被误诊为肠炎合并低钠血症,对患儿分别使用了补钙、补糖、补钠等药物,但仍不见患儿有所转机,查出含镁低于0·6 mmol/L的患儿,后用给患儿添加了镁的剂量后则惊厥慢慢停止,后见好转。还有1例则是婴儿痉挛症的患儿通过口服糖皮质激素和其他抗癫痫的药物,癫痫的病症将近4个月没有再次发生,这次发生惊厥的时候医生查看脑电波图,发现图中有癫痫波形,错误的认为是新生儿是再一次发作的痉挛症,然而在治疗的效果都不明显的情况后查出原来是血镁太低,患儿则低于0·6 mmol/L,在发现少镁后,及时补救的情况下惊厥才停止没有再次发作。
2.2.5 缺乏对病情的分析和临床观察 当患儿在刚住进医院时,往往先是诊断出患有某种病症,但随着对该病的进一步治疗可能会引起另一种疾病的出现,但其经常会被医生忽略掉,之前提到的患有迁延性腹泻的2例患儿,起初在入院时做了检查,发现其钙、钠检测都比正常值低,血镁的检测属于正常,所以在对其的治疗过程中会补充钙盐和钠,但是随后患儿出现了全身抽搐的现象,此时医生往往会忽略其真正的病因而是主观上断定患儿抽搐是由于补充的钙、钠不足,而没有想到是由于低镁血症而引起的。因为低镁血症很多情况是出现在钙、钾、钠偏低症状治愈之后的,所以病人在初期的血镁可能是正常的,但当治疗时间一长,或是患儿出项脱水症状后就该注意患儿的血镁情况是否还在正常值范围,所以在对于某些病症的治疗中要注意让其补充镁剂。
3 小结
3.1 医院在对疑似患有低镁血症的患儿做检查时要特别谨慎、仔细,因为患有低酶血症致惊厥的病患在临床上的并没有十分显著的病症,所以除了细致的检查外还要仔细询问病人的病史,及时检查患儿的血液镁含量,以便更准确的判断病人的病情。如果遇到有些医院的检查设备有限,只是怀疑患病却不能明确诊断时,可以对患儿进行适当的镁盐补充,如果患儿之后有所好转或是得到基本控制,也可以考虑其可能患低镁血症。
3.2 在对镁剂的增加问题上,轻度的患儿可选择进行深部的肌肉注射,而对于那些重度的患儿可以在静脉注射镁盐,要求必须要谨慎、缓慢,特别是对于那些患有肾功能障碍的患儿来说,要注意防止高镁血症的患病可能,由于高镁血症极易导致患儿的血压降低,阻碍房室的传导,严重的甚至会引起心脏骤停,所以要特别谨慎注意。
参考文献
【关键词】生物信息学;医药基因;应用
中图分类号:R9
文献标识码:A
文章编号:1006-0278(2015)02-119-01
当前,生物信息学是自然科学以及生命科学等前沿领域,集合了多种学科,是21世纪研究自然科学的核心和基础。
一、药物设计与发展
(一)传统药物研发
药物研究和开发的传统方法就是从动物器官、组织或者细胞中筛选出符合要求的药理模型,或者从植物、动物以及天然矿物质入手,又或者在确定候选药物的过程中以化学合成为基本形式,并进一步优化先导物,一切工作准备就绪以后即可将候选药物推入临床使用,观测其使用效果,合格以后投入市场。这种方法简单有效,但是费用和时间都相对花费较多。据不完全统计,在未诞生生物信息学以前新药的研究开发需要历经十年时间,其所花费的费用总额约为5-10亿美元;此外,传统的新药研究方法存在一定的缺陷和不足,筛选合成物的过程较为繁琐,新药开发效率极低。
(二)计算机辅助药物设计
白上世界70年代开始,美国麻省理工学院霍恩贝尔教授率先提出了分子设计,白此之后,药物分子设计逐渐被应用到新药研究中;而随着计算机技术的进一步普及和推广,药物分子设计的基础就是计算机辅助药物设计方法,即CADD。计算机辅助药物设计的一般原理就是:第一步,在X单晶衍射等技术的支撑下获取完整的大分子结构,并在相关软件的支持下分析具体的化学性质;第二步,充分发挥全新药物分子设计技术以及数据库搜寻的优势,寻找理化性质与分子形状与受体作用位点相一致的分子,测试并合成分子生物活性,在循环几次以后,就能顺利得到新的先导化合物。当前,主要有二种计算机辅助药物设计方法:其一,药效基团模型方法、定量构效方法等基于小分子的药物分子设计方法;其二,计算组合方法;其二,分子对接法等基于受体结构的药物分子设计方法。
二、生物信息学在药物设计中的应用
1.生物信息学的研究领域较广,涉及的内容较多,主要包括非编码区功能研究、蛋白质谱技术和蛋白质组研究、基于完整基因组数据的生物进化研究、生物大分子结构模拟和药物设计、基因表达调控网络的研究、大规模基因组测序中的信息分析、生物信息的收集、存储、管理与提供以及启动子、外显子、内含子的识别等。近年来,新的高效实验技术不断发展,这就要求生物信息学不断扩展研究领域。生物信息学的出现和推广,为药物设计和开发提供了新的路径和方法,推动着药物设计向理性化和专业化的方向发展,这大大减少了新药的研究费用和开发时间。蛋白质序列和核酸序列的功能和结构信息是生物信息学的主要研究对象,这为药物设计提供了坚实的理论支撑,大大缩短了药物开发使用的时间。当前,大量的生物大分子二维结构已经被成功测定,依据大分子和药物分子相互作用的原理,可以在研究受体结构的基础上科学设计药物分子。所以,药物设计的一种重要手段就是充分发挥生物信息学的优势,寻找出合适的先导化合物。全新药物分子设计、分子对接以及二维结构搜索是目前较为普遍的几种方法。
2.物信息学的发展切实改变了药物研究和开发的模式。传统的药物研发模式就是筛选并选择出合适的药理模型先导物,并将先导物进行优化,评价合格以后投入市场使用。在基因组计划大力实施的今天,DNA自动测序大规模完成,序列数据急剧增加,生物信息学在对数据进行加工、整理的过程中会发现药物的新靶点,然后对其进行计算和建模,确保药物设计的顺利进行,这在一定意义上开创了药物研究和开发的新模式,有利于增强新药研发的有效性和针对性,大大缩减了药物设计和研发的时间,节省了人力、物力、财力投入。
3.生物信息学参与新药推向市场。在研制新药并临床适用通过以后,就要将其推广到市场,这时,首要的就是收集和整理该药所治疗的疾病患者的地区分布、市场需求以及年龄结构等情况,从而制定出市场价格、专利申请保护等切实可行的市场开发战略,为新药注入持续不断的发展活力。但是这些信息较为分散,收集难度较大,这时就要充分发挥生物信息学的优势,对网络数据库中的信息进行分析和整理,减少开发过程中的盲目性,大大提升新药的开发效率,减少物力、财力等资源消耗。
三、结语
当前,生物信息学逐渐成为现代药物开发和研究的重要工具,而且药物设计与生物信息学有着更加紧密的联系;与此同时,药物设计的不断发展也要求生物信息学进一步拓宽研究领域和范围,生物信息学的发展会在一定程度上推动药物设计的发展和进步。
参考文献:
[1]张建华,张士金生物信息学能否推动现代中医药研究的发展[J]医学争鸣,2012(5).
[论文摘要]生物信息学是80年代以来新兴的一门边缘学科,信息在其中具有广阔的前景。伴随着人类基因组计划的胜利完成与生物信息学的发展有着密不可分的联系,生物信息学的发展为生命科学的发展为生命科学的研究带来了诸多的便利,对此作了简单的分析。
一、生物信息学的产生
21世纪是生命科学的世纪,伴随着人类基因组计划的胜利完成,与此同时,诸如大肠杆菌、结核杆菌、啤酒酵母、线虫、果蝇、小鼠、拟南芥、水稻、玉米等等其它一些模式生物的基因组计划也都相继完成或正在顺利进行。人类基因组以及其它模式生物基因组计划的全面实施,使分子生物数据以爆炸性速度增长。在计算机科学领域,按照摩尔定律飞速前进的计算机硬件,以及逐步受到各国政府重视的信息高速公路计划的实施,为生物信息资源的研究和应用带来了福音。及时、充分、有效地利用网络上不断增长的生物信息数据库资源,已经成为生命科学和生物技术研究开发的必要手段,从而诞生了生物信息学。
二、生物信息学研究内容
(一)序列比对
比较两个或两个以上符号序列的相似性或不相似性。序列比对是生物信息学的基础。两个序列的比对现在已有较成熟的动态规划算法,以及在此基础上编写的比对软件包BALST和FASTA,可以免费下载使用。这些软件在数据库查询和搜索中有重要的应用。有时两个序列总体并不很相似,但某些局部片断相似性很高。Smith-Waterman算法是解决局部比对的好算法,缺点是速度较慢。两个以上序列的多重序列比对目前还缺乏快速而又十分有效的算法。
(二)结构比对
比较两个或两个以上蛋白质分子空间结构的相似性或不相似性。
(三)蛋白质结构预测
从方法上来看有演绎法和归纳法两种途径。前者主要是从一些基本原理或假设出发来预测和研究蛋白质的结构和折叠过程。分子力学和分子动力学属这一范畴。后者主要是从观察和总结已知结构的蛋白质结构规律出发来预测未知蛋白质的结构。同源模建和指认(Threading)方法属于这一范畴。虽然经过30余年的努力,蛋白结构预测研究现状远远不能满足实际需要。
(四)计算机辅助基因识别
给定基因组序列后,正确识别基因的范围和在基因组序列中的精确位置.这是最重要的课题之一,而且越来越重要。经过20余年的努力,提出了数十种算法,有十种左右重要的算法和相应软件上网提供免费服务。原核生物计算机辅助基因识别相对容易些,结果好一些。从具有较多内含子的真核生物基因组序列中正确识别出起始密码子、剪切位点和终止密码子,是个相当困难的问题,研究现状不能令人满意,仍有大量的工作要做。
(五)非编码区分析和DNA语言研究
在人类基因组中,编码部分进展总序列的3-5%,其它通常称为“垃圾”DNA,其实一点也不是垃圾,只是我们暂时还不知道其重要的功能。分析非编码区DNA序列需要大胆的想象和崭新的研究思路和方法。DNA序列作为一种遗传语言,不仅体现在编码序列之中,而且隐含在非编码序列之中。
三、生物信息学的新技术
(一)Lipshutz(Affymetrix,Santa clara,CA,USA)
描述了一种利用DNA探针阵列进行基因组研究的方法,其原理是通过更有效有作图、表达检测和多态性筛选方法,可以实现对人类基因组的测序。光介导的化学合成法被应用于制造小型化的高密度寡核苷酸探针的阵列,这种通过软件包件设计的寡核苷酸探针阵列可用于多态性筛查、基因分型和表达检测。然后这些阵列就可以直接用于并行DNA杂交分析,以获得序列、表达和基因分型信息。Milosavljevic(CuraGen, Branford, CT, USA)介绍了一种新的基于专用定量表达分析方法的基因表达检测系统,以及一种发现基因的系统GeneScape。为了有效地抽样表达,特意制作片段模式以了解特定基因的子序列的发生和冗余程度。他在酵母差异基因表达的大规模研究中对该技术的性能进行了验证,并论述了技术在基因的表达、生物学功能以及疾病的基础研究中的应用。
(二)基因的功能分析
Overton(University of Pennsylvania School of Medicine,Philadelphia,PA,USA)论述了人类基因组计划的下一阶段的任务基因组水平的基因功能分析。这一阶段产生的数据的分析、管理和可视性将毫无疑问地比第一阶段更为复杂。他介绍了一种用于脊椎动物造血系统红系发生的功能分析的原型系统E-poDB,它包括了用于集成数据资源的Kleisli系统和建立internet或intranet上视觉化工具的bioWidget图形用户界面。EpoDB有可能指导实验人员发现不可能用传统实验方法得到的红系发育的新的药物靶,制药业所感兴趣的是全新的药物靶,EpoDB提供了这样一个机会,这可能是它最令人激动的地方。
Babbitt(University of California,San Francisco,CA,USA)讨论了通过数据库搜索来识别远缘蛋白质的方法。对蛋白质超家族的结构和功能的相互依赖性的理解,要求了解自然所塑造的一个特定结构模板的隐含限制。蛋白质结构之间的最有趣的关系经常在分歧的序列中得以表现,因而区分得分低(low-scoring)但生物学关系显著的序列与得分高而生物学关系较不显著的序列 是重要的。Babbit证明了通过使用BLAST检索,可以在数据库搜索所得的低得分区识别远缘关系(distant relationship)。Levitt(Stanford univeersity,Palo Alto,CA,USA)讨论了蛋白质结构预测和一种仅从序列数据对功能自动模建的方法。基因功能取决于基因编码的蛋白质的三级结构,但数据库中蛋白质序列的数目每18个月翻一番。为了确定这些序列的功能,结构必须确定。同源模建和从头折叠(ab initio folding)方法是两种现有的互为补充的蛋白质结构预测方法;同源模建是通过片段匹配(segment matching)来完成的,计算机程弃SegMod就是基于同源模建方法的。
(三)新的数据工具
Letovsky(Johns hopkins University,Baltimore,MD,USA)介绍了GDB数据库,它由每条人类染色体的许多不同图谱组成,包括细胞遗传学、遗传学、放射杂交和序列标签位点(STS)的内容,以及由不同研究者用同种方法得到的图谱。就位置查询而言,如果不论其类型(type)和来源(source),或者是否它们正好包含用以批定感兴趣的区域的标志(markers),能够搜索所有图谱是有用的。为此目的,该数据库使用了一种公用坐标系统(common coordinate system)来排列这些图谱。数据库还提供了一张高分辨率的和与其他图谱共享许多标志的图谱作为标准。共享标志的标之间的对应性容许同等于所有其它图谱的标准图谱的分配。
Candlin(PE applied Biosystems,Foster City,CA,USA)介绍了一种新的存储直接来自ABⅠPrism dNA测序仪的数据的关系数据库系统BioLIMS。该系统可以与其它测序仪的数据集成,并可方便地与其它软件包自动调用,为测序仪与序列数据的集成提供了一种开放的、可扩展的生物信息学平台。
参考文献
[关键词] 基因芯片;子宫内膜异位症;生物信息学分析;靶基因;microRNA
[中图分类号] R711.710.46 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210(2017)04(a)-0012-05
[Abstract] Objective To analyze and predict the expression of endometriosis (EMs) genes by bioinformatics methods, in order to provide a new basis for revealing the essence of EMs at the gene level and developing new treatment drugs. Methods Download gene dates which were related to EMs in Gene Expression Omnibus(GEO), were mined and analyzed by a series of bioinformatics tools, such as protparam, MotiScan, SignalP 4.0, NetPhos 2.0, TMHMM, GO, KEGG, STRING, BRB-Array Tools. Results 91 EMs related genes and 54 microRNA had been found in this study. These genes mainly involved in the process of cell proliferation regulation, cell apoptosis regulation and chemotaxis. Protein interaction network predicted 19 important EMs-related protein targets. Combined with target gene data mining, 134 EMs-related target genes were found. Conclusion Using bioinformatics method to analyze gene microarray data can acquire inner information of organisms, and provide new diagnostic markers and diagnostic thoughts for the early diagnosis of EMs.
[Key words] Microarray; Endometriosis; Bioinformatics; Target gene; MicroRNA
子m内膜异位症(endometriosis,EMs)是一种常见的慢性妇科疾病,在女性人群中,发病率为10%~15%[1],其临床表现为不孕、痛经、慢性盆腔痛、痛等[2],给年轻的女性带来巨大的痛苦和经济负担。EMs是在子宫腔外部出现经过增殖、出血和再生的子宫内膜样组织,其发病机制尚不清楚[3-4]。由于EMs病因复杂,目前主要治疗手段是手术和激素治疗,但该病的复发率高,达40%~50%[5]。因此,亟需新的有效的EMs治疗方法。
基因调控在EMs的发展中起重要作用[6]。研究EMs患者的基因特征是开发新疗法的有效步骤[7-8],基因芯片数据能够大规模地揭示基因遗传背景。根据基因芯片数据可以发现,免疫内分泌的功能障碍是影响子宫内膜异位的重要因素[9]。生物信息学被应用于整理基因表达、基因功能、基因产物以及细胞功能相关的大量信息,来鉴定发病过程中的关键因子,预测合适的治疗靶标[10]。目前这种方法已被用于改进肝细胞癌[11]、淋巴瘤[12]和口腔癌的诊断[13]。基因芯片技术与生物信息学分析的结合能够为疾病的分子生物学研究提供新的研究视角。
本研究应用基因芯片分析软件BRB-Array Tools对基因芯片公共数据库的EMs相关基因和microRNA进行数据挖掘,并进行microRNA的靶基因预测。用生物信息学的方法对EMs的相关基因进行通路和功能的分析,找出EMs相关蛋白质相互作用的网络调控的关键靶标,研究EMs的发病机制,为进一步在基因水平上揭示EMs的本质和发现药物治疗靶点、开发治疗新药提供新的依据。
1 材料与方法
1.1 材料
从美国国立生物信息技术中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的公共基因芯片数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)[14]下载与EMs相关的基因和microRNA。
1.2 方法
①把EMs相关基因上传到String(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes)数据库在线分析工具(http://)[15-16]可获得EMs相关基因蛋白-蛋白相互作用的网络,筛选节点(Hub)蛋白。
②把EMs相关基因上传到DAVID(Database for Annotation,Visualization,and Integrated Discovery)[17],用功能注释工具(Functional Annotation Tool),研究EMs相关基因参与FOTERM_MF_5以及GOTERM_BP_5基因本体数据库(Gene Ontology,GO)[18]的分子功能和生物过程,分析EMs相关基因参与的PANTHER-PATHWAY和KEGG-PATHWAY数据库中的生物学通路。
③应用PicTar2005[19]、TargetScan 5.1[20]、miRanda V5[21]3种软件预测靶基因,有两种或两种以上的软件同时预测到的结果则认为可靠。
2 结果
2.1 EMs相关基因的筛选
从公共基因芯片数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)下载与EMs相关的基因,共得到91个相关基因,结果见表1。
2.2 EMs相关基因的分析
对91个EMs相关基因编码的蛋白进行蛋白-蛋白的相互作用网络分析显示,处于网络节点的蛋白质有19个基因与之对应,分别是EGF、RELA、VEGFA、PCNA、PTEN、PIKCA、MDM2、MMP9、MMP1、NGF、PGR、PTGS2、IL11B、IL6、IL10、CD44、TP53、TNF、FOXO1,f明它们可能在致病中发挥着重要作用。GO富集分析结果显示,EMs相关基因主要涉及细胞增殖、细胞凋亡、细胞代谢、信号转导、趋化作用等反应过程(图1)。生物学通路分析表明,EMs相关基因主要参与细胞因子受体互作、肿瘤通路、造血细胞系、Jak-STAT信号等生物学的通路(图2)。
2.3 microRNA的靶基因预测
在PubMed数据库中检测到54个EMs相关的microRNA,联合靶基因的数据挖掘和预测,共得到134个EMs的相关基因。
3 讨论
EMs给社会和妇女带来了严重的临床上和经济上的负担,因此,需要将研究和资源的效用最大化来提高对疾病的了解,以便发展新的有效的治疗方法。随着近几年生物信息学技术的兴起,基因芯片技术已经成为生物医学研究的基本方法。基因芯片是一种大规模高效率获取生物信息的新型技术,能够检测分析各个组织内的表达基因的差异,随着计算机技术的快速提高和生物数据的急剧增长,生物信息学这一刚刚兴起的学科得到了前所未有的迅速发展[22],尤其是应用生物信息学方法发现新基因和基因芯片,利用已知的核酸序列作为探针,与互补的靶核苷酸序列相互杂交,再进行信号的监测,最终完成定量或者定性的分析,在预防和新药开发、辅助诊断疾病方面有广阔的前景。生物信息学是涉及应用物理学、数学、生物学、化学、计算机等交叉学科的一门新兴学科,应用现有的分析软件和公共数据库,可以探索生物分子结构和功能特性,为后续研究提供新的研究思路和方向。EMs的生物学过程复杂,决定了从基因组水平筛选与转移相关表型的功能基因成为EMs治疗研究的重要方向[23]。
本研究发现,EGF、RELA、VEGFA、PCNA、PTEN、PRKCA、MDM2、MMP9、MMP1、NGF、PGR、PTGS2、IL11B、IL6、IL10、CD44、TP53、TNF、FOXO1在EMs相关基因编码蛋白-蛋白的作用网络中起到节点蛋白的作用,推测这些基因对EMs的发病起重要作用。本研究通过GO富集分析和通路分析发现,EMs相关基因主要与细胞增殖调控、细胞凋亡调控、趋化作用有关。
综上所述,本文应用生物信息学的方法对基于基因芯片数据库挖掘的EMs基因及蛋白进行分析,为揭示EMs相关基因及microRNA的结构、功能、蛋白的相互作用提供了重要依据,发现了关键基因在EMs发生发展过程中可能起到重要的作用,为日后进一步研究EMs的发病机制、发现药物治疗的靶点,及为临床治疗和预防提供了新的切入点。
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关键词:铁皮石斛,RCA2基因,克隆,生物信息学分析
中图分类号:Q949.71
文献标识码:A
铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)属于兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)多年生的草本植物,铁皮石斛含石斛多糖、石斛碱、双苄酚类、菲酚类等多种药效成分,是石斛属药用植物中最为珍稀名贵的种,具有滋阴清热、润肺止咳、益胃生津、明目强身等作用(Zhangetal,2000)。核酮糖1,5二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose1,5bisphosphatecarboxylase/oxygenase,Rubisco)是存在于叶绿体内的一个双功能酶,同时催化卡尔文循环中最初固定CO2的反应以及光呼吸作用中的第一步反应,该酶处于光合碳还原和碳氧化两个方向相反但又相互关联的循环交叉点上,对净光合速率起着決定性的影响,因此提高Rubisco活力是提高光合作用的重要途径(潘瑞炽等,2004)。因铁皮石斛原生地的生境破坏和常年的滥采乱挖,野生资源遭到严重的破坏,濒临灭绝,已列入中国珍稀濒危保护植物的名录。由于石斛不能够栽培在土壤里,北方地区必须栽培在树皮、木块、锯末等做的栽培床或者是石头上,冬天多数需要盖温棚等设施,投资较大,加上石斛种植的技术要求高,目前市场尚未完全打开,发展速度还不是很快(张明等,2010)。
随着生物技术的发展,许多粮食作物如大麦(Rundle&Zielinski,1991)、水稻(Toetal,1999)、大豆(Yinetal,2014)等植物的RCA基因被克隆,但目前报道的RCA基因很少有涉及药用观赏植物,最近有朱明库等(2013)对羽衣甘蓝Rubisco活化酶基因BoRCA的克隆、生物信息学及表达分析的研究;袁秀云等(2016)对蝴蝶兰Rubisco活化酶基因PhRCAα的序列特征及在低温胁迫下的表达分析的研究;祝钦泷等(2011)对彩叶草Rubisco活化酶基因SsRCA进行了组织表达特异性和光诱导表达特性研究;曾淑华等(2012)已从铁皮石斛中克隆了光合碳途径关键酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因。因此,开展铁皮石斛RCA基因研究显得尤为必要。本研究为了提高石斛的质量,提高石斛光合效率,揭示铁皮石斛光合作用机理自然成了铁皮石斛研究领域的重要问题,该研究利用RACE技术克隆出铁皮石斛RCA2全长基因,并进行生物信息学分析,为进一步研究铁皮石斛光合作用调节机理奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
铁皮石斛原产地为贵州,现在种植于河南省郑州市郑州师范学院兰花工程技术研究中心智能日光温室,植物材料为一年生铁皮石斛。
1.2方法
1.2.1RNA提取选取一年生铁皮石斛叶片,液氮速冻,保存于-80℃冰箱备用。叶片总RNA提取采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Tiangen公司);采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性;采用QuawellQ5000微量紫外可见分光光度计测定其A260/A280值及其浓度。
1.2.2RCA2基因全长的克隆以提取的叶片总RNA为模板,用反转录试剂盒合成单链cDNA。根据GENBANK上已知植物的RCA保守区,利用DNAMAN和Primer5.0生物軟件设计兼并引物(表1),扩增RCA保守片段。PCR反应体系为20.0μL:10×PCRbuffer2.0μL、dNTPMix2.0μL、上游引物RCAF1(10μmol·L1)1.0μL、下游引物RCAR1(10μmol·L1)1.0μL、模板cDNA1.0μL、rTaq酶(5U·μL1)0.2μL,加灭菌双蒸水至总体积20.0μL;反应程序为94℃预变性5min;94℃变性40s,56℃退火40s,72℃延伸40s,35个循环;最后72℃延伸10min。切胶回收目的片段,连接pGEMTEasy载体,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆送至上海英潍捷基生物技术公司测序,获得RCA基因的保守区序列。再根据获得的保守区序列,分别设计5′端和3′端特异性巢式引物(表1),以叶cDNA为模板,用巢式PCR方式分别扩增RCA的5′端和3′端序列,按Clontech公司SMARTerTMRACE扩增试剂盒操作说明进行反应,回收扩增目的产物,克隆到pGEMTEasy载体上,转入大肠杆菌DH5α菌株,进行测序和拼接。
1.2.3ORF的扩增根据DNAMAN软件拼接得到RCA基因序列全长,利用Premier5.0设计1对特异引物RCAF2和RCAR2(表1),用于完整开放阅读框(ORF)的扩增。PCR扩增程序为94℃预变性5min,94℃变性45s,58℃退火45s,72℃延伸1min,进行35个循环,72℃延伸15min。ORF片段连接到pGEMTEasy载体上,转化大肠杆菌DH5α,测序进行ORF序列验证。
1.2.4生物信息学分析利用ORFfinder进行开放阅读框的预测;利用NCBI上的BLAST进行基因相似性的分析(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast/);利用DNAMAN进行氨基酸序列比对分析;利用ProtScale程序(http://expasy.org/tools/protscale.html)分析蛋白质亲疏水性;利用TargetP软件(UsingPLANTnetworks)和PSORTll(http://psort.hgc.jp/form.html)进行亚细胞定位的分析;利用Protfun(http://cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)分析预测RCA2蛋白质结构功能和功能分类;利用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测;利用ExPASy网站上的SWISSMODEL进行蛋白质三级结构的预测分析。
2结果与分析
2.1RCA2基因全长克隆
叶片总RNA提取后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性,检测结果显示,28S和18S条带清晰,A260/A280值1.96,浓度为210.56ng·μL1。
以铁皮石斛叶片总RNA反转录的cDNA为模板,以兼并引物RCAF1和RCAR2进行保守区片段PCR扩增,得到一个503bp保守片段(图1:B),根据设计的3′端和5′端特异引物,采用RACE技术,扩增获得3′端目的片段(图1:D)和5′端目的片段(图1:C)。利用生物软件DNAMAN进行序列拼接得到该基因的全长为1730bp,利用ORFfinder分析,共有9个ORF,该基因最长的ORF共计1323bp,包含81bp的5′UTR、326bp的3′UTR,编码440个氨基酸,将该基因命名为RCA2,GenBank登陆号为KT205842。利用引物RCAF2和RCAR2扩增获得1323bpORF片段(图1:A),连接到pGEMTEasy载体上测序验证,得到的阳性质粒命名为pGEMRCA2。
2.2RCA2基因全长的生物信息学分析
2.2.1RCA2核苷酸及编码蛋白序列的理化性质利用blastp和DNAMAN对RCA2氨基酸序列进行比对分析,发现该基因包含PloopNTPaseSuperfamily结构域,分别为“WGGKGQGKS”(A区)和“GKMCCLFINDLD”(B区),属于PloopNTPase超家族基因(图2)。理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53kDa,等电点为6.19。将该基因全长核苷酸序列在NCBI上进行blastn相似性比较,结果表明基因均为RCA基因,且与蝴蝶兰(Phalaenopsis)的相似性高达87%。氨基酸序列比对分析,发现其氨基酸序列与蝴蝶兰、葡萄、荷花的相似性分别为89%、84%、85%(图3)。
2.2.2RCA2编码蛋白质的亲疏水性分析利用ProtScale分析蛋白的亲疏水性发现,RCA2蛋白质序列具有较高的亲水性,其中第69位的Thr亲水性最强(-3.078),第162位Leu的疏水性最强(2.122)(图4)。
2.2.3RCA2编码蛋白质的亚细胞定位蛋白的亚细胞定位与该蛋白所执行的功能是密切相关的,用TargetP和PSORTII软件进行亚细胞定位分析,TargetP预测结果显示RCA2蛋白定位于叶绿体基质,可信度为3(图5:A),用PSORTII预测蛋白显示,RCA2蛋白定位于叶绿体基质、线粒体基质间隙、叶绿体类囊体膜、叶绿体类囊体腔,RCA2蛋白主要存在于叶绿体基质(图5:B)。
2.2.4RCA2编码蛋白质的功能预测与分析利用ProtfunsoftwareofCBS分析预测RCA2蛋白质结构功能和功能分类,可能有意义的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等,他们的几率分别是5.484、4.387、4.048、3.639、3.098。这表明RCA2在中间代谢起到了一个非常重要的角色,在脂肪酸代谢、翻译中起到了重要作用,在辅酶因子的生物合成和能量代谢中也起到了关键作用。
2.2.5RCA2编码蛋白质的二级、三级结构预测采用ExPASy网站上的GOR进行蛋白质二级结构预测,结果表明,α螺旋占30.68%,延伸链占25.45%,不规则折叠占43.86%(图6)。用ExPASy网站上的SWISSMODELWorkspace预测蛋白质的三维结构以4w5w.1.A(SMTLid)为模板进行建模,该模板以XRAY2.90方法产生,与RCA2蛋白一致性为86.02%(图7)。
3讨论与结论
该研究通过RTPCR和RACE技术方法,成功克隆了铁皮石斛RCA2基因(GenBank登录号KT205842)全长1730bp,开放阅读框1323bp,编码440个氨基酸;核苷酸序列分析结果表明,RCA2核苷酸序列与蝴蝶兰(Phalaenopsis)的相似性高达87%,其编码蛋白属于PloopNTPaseSuperfamily家族基因。蛋白理化性质分析该蛋白的分子质量为48.53kDa,等电点为6.19,为亲水性蛋白,RCA2编码蛋白质的亚细胞定位于叶绿体基质;编码蛋白质的功能包括中间代谢、脂肪酸代谢、翻译、辅酶因子的生物合成和能量代谢等,蛋白质三级结构预测模型与RCA2蛋白一致性为86.02%,这些生物学参数为进一步研究RCA2蛋白的酶学性质及其在铁皮石斛中的光合作用机理奠定了理论基础。
【关键词】生物电子学;研究生选修课;教学探索
Postgraduate Course of Bioelectronics Opened and Teaching
SU Shao
(School of Materials Science and Engineering, Nanjing University of Posts & Telecommunications, Nanjing Jiangsu 210023, China)
【Abstract】“Bioelectronics” is a newly elective course, which has opened for different postgraduates. Bioelectronic is an emerging and fascinating interdisciplinary, covering many areas of research, has become a research hotspot. This elective course aims to broaden graduate research horizons, learn about the latest frontior research and develop students' innovative spirit and overall quality. In this paper, we discuss the experiences of the research fields of bioelectronics, reference books, teaching object, course content and teaching methods and prospect the future development of the electives course.
【Key words】Bioelectronics; Postgraduate elective course; Teaching explore
0 前沿
生物电子学(Bioelectronics)是以生物学和电子学为代表但又涉及化学、物理、材料及信息技术等许多学科和高新技术相结合的一门新兴交叉学科。电子信息科学技术和生物科学(含医学科学)是十分重要的两个学科领域,它们对科学技术进步和经济发展,乃至于对人类的社会生活方式都将产生深刻而重要的影响。生物电子学的发展充分体现了上述两个学科的相互依赖和和相互促进的关系。生物电子学自20世纪50 年代诞生以来,发展迅速,领域不断拓宽,地位日益重要,已经展示了广阔的发展前景[1-2]。子学的研究领域大致可以包括如下7个方面:(1)生物信息检测;(2)生物医学信息处理;(3)生物系统建模和仿真;(4)场与生物物质的作用;(5)分子和生物分子电子学;(6)生物信息学;(7)生物医学仪器。近20年来,随着各种新原理、新技术和新方法不断地应用到生物电子学的研究中,生物电子学的发展日新月异,目前越来越的科研工作者聚集生物电子学方面的研究。
1 研究领域
生物电子学作为新兴的交叉学科,发展迅猛,涉及多个研究领域。国外的大学很早就开展生物电子学的相关研究。如英国的克兰菲尔德大学,其生物电子学方面的研究就包括生物信息学、生物传感器与生物诊断、环境与健康、环境与自然、环境与安全、智能材料和转化医学等。我国在1985年,由韦钰院士创立了分子与生物分子电子学实验室,通过20年的发展,2002年,东南大学生物电子学国家重点实验室开始建设。目前,该重点实验室的发展目标是瞄准生物电子学的国际发展前沿,开展应用基础研究,侧重综合应用信息科学领域的最新成果,发展生物领域研究的新方法和新技术,并用于探究生命过程的本质,揭示重大疾病的机制,为医学发展开辟新途径。该国家重点实验室以生物信息材料与器件、生物信息获取和传感、生物信息系统和应用为主要研究方向,研究内容涉及分子(纳米)有序材料及其制备、分子有序结构的组装与表征、分子/纳米器件、生物/纳米材料及其应用、植入式电子器件、单分子与单细胞检测、生物传感器、微阵列芯片技术、微流体生物芯片、生物信息学、仿生信息处理系统及应用、脑信息系统的建模和应用等。
2 教材选择
本课程是专业选修课,开设对象是低年级的硕士研究生和博士研究生。相对于本科生,研究生具有良好的自学能力和独立思考能力,因此,如何选择实用、全面和专业的参考教材尤其重要。目前,国内还没有《生物电子学》课程的材,很多医学专业的高等院校选用的是生物电子医学方面的教材,并不能很好的满足普通高校本科生或者研究生的课程需要。因此,在依据本学校和本学院的专业设置(材料物理、材料科学和信息显示等专业),以及本学院教师的科研方向,选用了以色列著名科学家Itamar Willner为主编,汇集了众多在生物电子学方面的专家编著的《Bioelectronics》[3]教材,从生物电子学的定义,生物电子学的发展和研究领域等方面,并结合当前热门生物电子学方面的科研资料和科研文献,多方位、多角度的向研究生展示生物电子学的研究内容、研究方向、研究前沿和研究热点。这样的安排,让研究生从一开始就接触科学前沿,开阔了眼界,更好的领悟科学的真谛。
3 授课对象
《生物电子学》是硕士和博士研究生的专业选修课程,目前选修本门课程的学生的专业跨度很大,有材料化学、材料物理和高分子材料与工程等不同专业。我们开设本门课程的宗旨是让不同学生都了解什么是生物电子学、当前生物电子学发展到怎样的阶段和生物电子学涉及的研究领域。通过对这些方面的学习,结合各自的研究背景,将生物电子学领域的研究内容糅合到各自的科学研究中,实现科学创新,更好更快的进行科学研究。
4 授课形式和课程内容
本门课程为研究生专业选修课,在授课形式和课程内容上有别于本科生的专业必修课。在充分考虑研究生具有良好的自学能力和理解能力的基础上,我们决定将本门课程的课时设置为32学时,分8次课完成。课题上以授课和讨论两种主要形式进行,设为8个不同的生物电子学版块,以讲座形式进行教学,并同时让研究生依据各自的研究背景,以每次课所要将的内容为主线,做好课下准备,带着问题有针对性的进行实时讨论。本着“科学性、系统性、实用性”的原则,我们确立了具体的授课内容,主要包括以下内容:概论部分、生物传感器、生物芯片、活体生物发光和荧光成像技术、微流控芯片体外诊断、临床即时检测仪器和DNA纳米技术等。在讲授这些专题的同时,结合大量的最新科研的前沿和热点文献,循序渐进,生动直观的介绍生物电子学方面的知识,使课堂教学更为生动、丰富。
5 教学方法
为了使研究生能在有限的课时内掌握老师所教授的内容,并能学以致用,就必须要运用灵活多样的教学方式,如:多媒体教学、互动式教学、理论联系实际等方法。由于生物电子学涉及多个研究领域,书本上的基础知识往往较为枯燥、抽象,不能很好的吸引研究生的求知欲望。因此,本门课程主要以多媒体教学为主,辅以互动式教学。在讲解科学前沿和热点时,利用多媒体技术在功能上、空间上及时间上交互的便利性,直观生动的将各种原理示意图、实验结果甚至影像资料展示给研究生,将抽象、枯燥的科研问题直观、形象又深入浅出的解释给学生,激发学生的学习兴趣。
为了提高研究生的学习主动性,让研究生参与到整(下转第24页)(上接第16页)个教学环节中,此时教师与学生不再说简单的传授与接受的关系,而是双边的互动关系。在课堂上除了老师有针对性地向学生提问外,学生也可以随时向老师发问,通过互动式教学,使学生最大限度地参与教学活动,积极思维,培养了主动探索、勇于创新的意识。
6 结语
目前《生物电子学》这门研究生选修课程还处于不断探索和改革阶段,作为专业教师,责任任重而道远,今后除了要不断提高自身的业务素质,不断实践、不断总结,还要依据不断变化的科研环境和教学环境,及时与学生沟通,把《生物电子学》课程的教学工作开展的更有深度、更有效果、更受研究生喜爱,为研究生开拓眼界、提升创新思维作出贡献。
【参考文献】
[1]韦钰.电子科技导报[N].1998,11,1-4.
关键词:控制科学与工程;学科体系;学科建设
中图分类号:G642.0 文献标志码:A 文章编号:1674-9324(2013)46-0216-02
自动化是一门涉及学科较多、应用广泛的综合性科学技术。在我国研究生培养体系中,自动化对应的一级学科“控制科学与工程”下属有七个二级学科:“控制理论与控制工程”、“检测技术与自动装置”、“系统工程”、“模式识别与智能系统”、“导航、制导与控制”、“企业信息化系统与工程”和“生物信息学”。控制科学与工程对相关学科的发展起到了有力的推动作用,并在学科交叉与渗透中表现出突出的活力。例如:它与信息科学和计算机科学的结合开拓了知识工程和智能机器人领域。同时,相邻学科如计算机、通信、微电子学和认知科学的发展也促进了控制科学与工程的新发展,使控制科学与工程学科所涉及的研究领域不断扩大。
一、我国控制科学与工程学科的现状
控制科学与工程学科经过几十年的发展,在诸多方面取得了一些重要的进步。控制理论以动态系统为主要研究对象。20世纪80年代以来,计算机、网络和通信等信息技术的发展为现有的控制理论提供了广泛的应用空间,同时也带来了巨大的挑战,促使控制理论自身的发展,也催生出新的学科增长点。控制理论方面,在鲁棒控制、非线性控制、离散事件动态系统、量子控制等方面都取得了重要进展。随着20世纪40年代计算机的出现以及50年代人工智能的兴起,人们当然也希望能用计算机来代替或扩展人类的部分脑力劳动。模式识别在20世纪60年代初迅速发展并成为一门新学科。在生物信息学方面,在高通量组学数据的处理、计算基因组学的研究、医学群体遗传学中的生物信息学、蛋白质功能结构与亚细胞定位上、生物分子网络的构建与分析等方面有了重要进展。机器学习与数据挖掘方面,研究涉及提高学习系统泛化能力、样本标记问题、降维与度量学习、数据挖掘、在视频与图像分析方面的应用。脑-机接口就是要实现生物脑与电脑之间的直接对话。基础理论研究与实验研究并重是脑-机接口研究的重要特点。脑-机接口研究是一个全新的领域,许多方面的问题还有待于深入地研究。在医学信息学、分子影像方面,多模态分子影像成像理论方法与关键技术、分子探针与药物研发、分子影像验证与应用是现在的研究热点。导航、制导与控制学科一直突出为国防、航天服务的特色,注重理论与工程实际的结合,重视高素质人才的培养,建立起一支梯队结构合理、学术方向稳定、能打“硬仗”的科研队伍。半个世纪里,导航、制导与控制学科先后开辟出导航技术、飞行控制、精确制导等研究方向。以自动化、电子、计算机、控制工程、信息处理为研究对象,以现代控制理论、传感技术与应用、计算机控制等为技术基础,以检测技术、测控系统设计、人工智能、工业计算机集散控制系统等技术为专业基础,同时与自动化、计算机、控制工程、电子与信息、机械等学科相互渗透,主要从事以检测技术与自动化装置研究领域为主体的、与控制、信息科学、机械等领域相关的理论与技术方面的研究。检测技术与自动化装置的应用基础是扎实的理论基础以及科研和工程实践过程中不断积累的新技术使用技能和知识;随着自动化系统规模和新技术应用范围的不断扩大,加上学科基础理论和光、机、电结合新技术的迅速发展,越来越促进了检测技术与自动化装置学科的迅速发展。
二、控制科学与工程学科建设的探索与实践
1.创新发展,凝练学科方向,加强基础研究力度。对于国家及国防的重大项目,立足现有的具有优势的学科建设方向,以现有国际国内领先的研究成果为基础,进一步突出研究的特色和水平。针对具有良好发展前景的一些学科方向,予以优先支持,培育发展新的学科增长点。近些年来,控制科学与工程学科的基础研究领域已经取得了很大的进步和发展,在此基础上,应培养一批具有较强科研能力的专职科研岗教师安心进行基础科研研究,并注重与实际应用的联系,循序渐进,逐步形成“基础理论研究、应用技术研究和型号任务”良性发展的科学研究格局。
2.勇于探索,拓展学术交流途径,促进新学科有新发展。在校园网上,加强办公系统网站建设,及时更新国际学术会议信息,及时通知与本学科相关的学术活动通知,使得教师和研究生能及时准确地获取学术交流的信息,参与各类学术活动。鼓励教师以及研究生参加国内外举办的高水平的国际会议,加大资金投入,通过在高水平的国际会议上进行大会报告和与参会代表的互动交流,加强与国际国内先进学科带头人的学术交流,提高学科的学术影响力。鼓励教师联系国外知名大学做访问学者,通过学术访问,开拓科研思路,拓宽学术视野,提高学术水平。推荐有一定学术影响力的骨干教师参加学术团体活动,参与学术期刊编委工作以及各种专家组评审工作,提高骨干教师的知名度和在该学科领域的知名度。
3.后发优势,优化人才培养体系,促进学科良性发展。建立完善的人才培养机制,激励与约束相协调,加大力度建设科研团队。对于科研团队给予一定的政策倾斜,为教师创造良好的科研条件,发挥教师的科研积极性。加大优秀领军人才的引进力度,高薪聘请国内外知名学者来我校做客座教授,定期来学校讲学、做讲座、设课,合作科研。与国内外知名企业共建实验室。
三、控制科学与工程学科发展的措施和建议
1.人才的培养和支持。由于我国控制科学与工程专业的毕业生长期以来供不应求,目前,设置该专业的院校逐渐递增。要注重培养学生的动手能力,多和实践结合,走出应试教育的桎梏。需要有人才成长的土壤,尽可能为科研人员提供良好的科研条件。需要加大国内外交流,提供交流的机会。总之,需要为人才的培养创造全方位立体的支持环境。
2.加大基础理论投入。我国自动化学科的发展的劣势主要是基础理论投入不足,要想改进这一点,需要从国家层次上进行引导,制定相关政策,鼓励科研院所和高校加大基础理论研究,经济允许的情况下加大资金投入,协调各个科研机构,发挥各单位优势,争取在基础理论上取得重大突破。
3.提高科研人员的社会地位。一个行业只有得到社会的认同和尊重才能够吸引优秀人才的加入。首先科研人员要加强学习和完善,提高综合素质,培养竞争意识,增强科研奉献精神;其次,国家和社会要为科研人员提供各种发展机会和条件,保障科研人员应有的地位和角色,才能逐渐提高科研队伍的质量,才能形成一种良性循环,促进我国科研的发展。
参考文献:
[1]中国科学技术协会.“控制科学与工程学科发展报告”[M].北京:中国科学技术出版社,2011.
[2]吴美平.“一流控制科学与工程学科的思考”[J].高等教育研究学报,2008.
生物化学工程(又叫生化工程或生物化工)是化学工程与生物技术相结合的产物。生物化工是生物技术的重要分支。与传统化学工业相比,生物化工有某些突出特点:①主要以可再生资源作原料;②反应条件温和,多为常温、常压、能耗低、选择性好、效率高的生产过程;③环境污染较少;④投资较小;⑤能生产目前不能生产的或用化学法生产较困难的性能优异的产品。由于这些特点,生物化工已成为化工领域重点发展的行业。
1.世界生物化工行业的现状
生物化工发展至今已经历了半个多世纪,最早主要是生产抗生素;随后,是为氨基酸发酵、舀体激素的生物转化、维生素的生物法生产、单细胞蛋白生产及淀粉糖生产等工业化服务。自20世纪80年代起,随着现代生物技术的兴起,生物化工又利用重组微生物、动植物细胞大规模培养等手段生产药用多肽、蛋白、疫苗、干扰素等。而且,生物化工的应用已涉及到人民生活的方方面面,包括农业生产、化轻原料生产、医药卫生、食品、环境保护、资源和能源的开发等各领域。随着生物化工上游技术——生物工程技术的进步以及化学工程、信息技术(IT)和生物信息学(bioinformatics)等学科技术的发展,生物化工将迎来又一个崭新的发展时期。
生物化工行业经过50多年的发展,已形成了一个完整的工业体系,整个行业也出现了一些新的发展态势。下面简要描述生物化工行业的现状。
1.1工业结构
由于生物化工涉及面广,涉及的行业多,所以从事生物化工的企业较多。据报道,90年代中期,美国生物化工企业有:000多家,西欧有580多家,日本有300多家。近年来,虽然由于行业竞争日趋激烈,生物化工企业有较大幅度减少,但与生命科学(主要指医药和农业生化技术)诸侯割据的局面相比,生物化工行业依然是百花齐放,百家争鸣。既有象诺华、捷利康等从事生命科学的世界性大公司,也有象DSM、诺和诺德等大型的精细化工公司,当然也有在某一方面有专长的小公司如Altus等。而且,由于世界大公司正把注意力向生命科学部分转移,生物化工行业百花齐放的局面在很长一段时间内不会有什么改变。
1.2产品结构
传统的生物化工行业主要是指抗生素(如青霉素等)、食品(如酒精、味精等)等行业,而在目前,它已几乎渗透到人民生活的各方面如医药、保健、农业、环境、能源、材料等。同时,生物化工产品也得到了极大的拓展:医药方面有各种新型抗生素、干扰素、胰岛素、生长激素、各种生长因子、疫苗等;氨基酸和多肽方面有赖氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸等以及各种多肽;酶制剂有160多种,主要有糖化酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、青霉素酶、过氧化氢酶等;生物农药有Bt、春日霉素、多氧霉素、井岗霉素等;有机酸有柠檬酸、乳酸、苹果酸、衣康酸、延胡索酸、已二酸、脂肪酸、卜酮戊二酸、l亚麻酸、透明质酸等。还有微生物法1,3.丙二醇、丙烯酞胺等。
目前,全球生物化工年销售额在400亿美元左右,每年约以7%~8%的速率增长。从产品结构来看,生物化工领域生产规模范围极广,市场年需求量仅为千克级的干扰素、促红细胞生长素等昂贵产品(价格可达数万美元/g)与年需求量逾万吨的抗生素、酶、食品与饲料添加剂、日用与农业生化制品等低价位产品(部分价格不到:美元/g)几乎平分秋色。高价位的产品市场份额在50%~60%,低价位的产品市场份额在40%~50%。而且,根据近年来生物化工的发展趋势及人们对医药卫生的重视来看,高价位产品的发展速率高于低价位产品。
1.3技术水平
生物化工经过80年代以后的蓬勃发展,不仅整个行业技术水平有大幅度提高,而且许多新技术也得到广泛应用。
1.3.1发酵工程技术已见成效
据估计,全球发酵产品的市场有120~130亿美元,其中抗生素占46%,氨基酸占16.3%,有机酸占13.2%,酶占10%,其它占14.5%。发酵产品市场的增大与发酵技术的进步分不开。现代生物技术的进展推动了发酵工业的发展,发酵工业的收率和纯度都比过去有了极大的提高。目前世界最大的串联发酵装置已达75m\许多公司对发酵工艺进行了调整,从而降低了生产成本。如ADM(ArcherDanie1sMid1and)和Cargill公司在20世纪90年代初对其发酵装置进行改造,将以碳水化合物为原料的生产工艺改为以玉米粉为原料,从而降低了生产成本,ADM公司生产的赖氨酸成本比原先降低了一半。
1.3.2酶工程技术有了长足的进步
酶工程技术包括酶源开发、酶制剂生产、酶分离提纯和固定化技术、酶反应器与酶的应用。目前世界酶制剂从酶源开发到酶的应用都已进入了良性发展阶段,各阶段生产企业和用户关系密切,合作广泛。据报道,1998年全球工业酶制剂的销售额为13亿美元,预计到2010年将增长到30亿美元,每年以6.5%的速率增长。其中食用酶占40%,洗涤用酶占33%,其它(主要是纺织、造纸和饲料等用酶)占27%。
1.3.3分离与纯化技术也有很大进步
影响生化产品价格的因素,首当其冲的是分离与纯化过程,其费用通常占生产成本的50%~70%,有的甚至高达90%。分离步骤多、耗时长,往往成为制约生产的“瓶颈”。寻求经济适用的分离纯化技术,已成为生物化工领域的热点。已大规模应用的分离纯化技术有:双水相革取、新型电泳分离、大规模制备色谱、膜分离等。
1.3.4上游技术广泛应用于下游生产
利用基因工程技术,不但成倍地提高了酶的活力,而且还可以将生物酶基因克隆到微生物中,构建基因菌产生酶。利用基因工程,使多种淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、氨基酸合成途径的关键酶得到改造、克隆,使酶的催化活性、稳定性得到提高,氨基酸合成的代谢流得以拓宽,产量提高。随着基因重组技术的发展,被称为第二代基因工程的蛋白质工程发展迅速,显示出巨大潜力和光辉前景。利用蛋白质工程,将可以生产具有特定氨基酸顺序、高级结构、理化性质和生理功能的新型蛋白质,可以定向改造酶的性能,从而生产出新型生化产品。
1.3.5新技术在生物化工中也得到了极大的应用
比如,在超临界液体状态下进行酶反应,从而大大降低酶反应过程的传质阻力,提高酶反应速率。超临界C02无毒、不可燃、化学情性、易与反应底物分离。利用超临界CO2取代有机溶剂进行酶反应,具有极大的发展潜力。又比如,微胶羹技术已被广泛用于动物细胞的大规模培养、细胞和酶的固定化以及蛋白质等物质的分离方面。
2.世界生物化工行业的发展趋势
2.1工业结构
行业与行业间的划分将日趋模糊,企业间的合作将加大。目前,许多从事医药、农业、环境、能源等方面生产的企业,正在从事生物化工生产。特别是某些从事传统化工行业的生产厂家,也纷纷涉足生物化工领域。如杜邦公司,长期以来主要从事有机化工和聚合材料的生产,现在正加大生物化工的开发力度,已开发成功了生物法生产1,3-丙二醇工艺,并正在开发用改性大肠杆菌生产己二酸工艺。DSM公司以前主要从事抗菌素方面的生产,现也加大了生物化工的投资力度。
由于生物化工涉及面广,许多生化公司都有自己的专长,它们之间为了商业利益的合作也非常活跃。此外,随着从事传统行业的生产厂家的加入,由于技术与生产方面的原因,它们与从事生物化工开发与生产的企业合作也很频繁。所有这一切,都使生物化工行业的合作越来越广泛。如杜邦公司与杰宁科乐公司合作开发用生物法生产1,)丙二醇,进一步生产PTT树脂。荷兰的Purac公司与美国Cagill公司合资建设年产3.4万tL。乳酸装置,并计划进一步发展到6.8万V入DSM公司与美国Maxygen公司签定了三年的研究合同,以利用Maxygen的
DNA重排和分子培养技术,开发在7一ADCA和其它青霉素生产中使用的酶和菌种。
2.2产品结构
生物化工产品正向专业化、高科技含量、高附加值方向发展。传统的低价位产品受到冷落,而高价位产品如生化药物、保健品、生化催化剂等则备受青睐。许多公司为了追求较高利润,都将低附加值的产品剥离。如日本武田药品工业公司不再生产味精,转而生产其它高附加值的调味品如肌甘酸二钠(IMP)和鸟甘酸二钠(GwtP)。另外,生物化工将涉足它以前很少涉足的领域如高分子材料和表面活性剂等。
生化药物由于附加值高而成为今后生物化工领域发展的重点。1997年生化药物市场销售额达130亿美元,其中细胞分裂素80亿美元,激素30亿美元,其它20亿美元;就具体药物而论,促红细胞生长素35亿美元,人胰岛素18亿美元,粒性白细胞克隆刺激因子16亿美元,人生长激素15亿美元,小干扰素11亿美元。预计今后其市场销售额还将以8%的速率增长。
在氨基酸方面,虽然用于药物合成氨基酸的量相对较小,但其发展潜力很大。据报道,500种主要药物中,有18%含有氨基酸或其衍生物的合成。在药物合成中,使用最广泛的是L。脯氨酸、r苯甘氨酸和r对羟基苯甘氨酸。L。脯氨酸用于血管紧张素转化酶(ACE)的合成,匹苯甘氨酸和r对羟基苯甘氨酸用于抗生素的合成。另外,多肽也是今后的发展重点之一。多肽是指有2以上氨基酸用肽键组成的化合物,在临床上使用非常广泛,主要用于治疗癌症、HIV病毒和兔疫系统功能减退、对传统抗生素产生抗体的感染以及疫苗等。全球合成多肽原药的产量在100kg左右,但销售额达2.5亿~3亿美元,而做成制剂的销售额则达25亿~30亿美元。多肽原药需求量的年增长率在10%以上。
碳水化合物方面,用于临床的碳水化合物受到人们越来越多的关注。但是,用于临床的碳水化合物结构复杂,如一对单糖,其不同的化学键就多达22种。因此,用化学法合成复杂的碳水化合物比较困难,难以实现工业化,而用酶法合成则是一条切实可行的途径。
作为生化催化剂的酶,也将是今后发展的重点。1997年,生化用催化剂销售额约1.3亿美元,在过去的3~5年间,每年增长速率在8%~9%,预计在未来的3~5年间,将以同样速度增长。生化催化剂主要用于手性药物的合成。当前,手性药物已成为国际新药研究与开发的新方向之一。
1997年手性药物制剂世界市场的销售额为879亿美元,占药品市场的28.3%,到2000年将达到900亿美元。在未来的25年内,约有一半的手性药物要通过生化催化合成,因此,生化催化剂无论从需求量和需求种类来看,都具有很大的发展潜力。
生化表面活性剂由于具有无毒、生物降解性好等优点,今后可能成为表面活性剂的升级换代产品,但目前还处于探索阶段。
生物化工在高分子材料、特殊化学品、生物晶片、环保等方面也将有极大的发展潜力。
2.3技术水平
不断提高菌株活力、发酵水平、生化反应过程、分离纯化水平,依然是生物化工面临的课题。
在菌种开发方面,由于从20世纪70年代以来从自然界中筛选菌种以获得新的代谢产物的机会明显减少,人们便考虑利用已知菌种经适当改变其代谢特性后生产新的产品。如日本协和发酵公司已成功地把生产谷氨酸的菌种改为生产色氨酸。
在生化反应器方面,反应器放大一直是一个老大难的问题。因此,利用计算机技术对整个生化反应过程进行数字化处理,从而优化反应过程,是今后的发展方向之一。
在分离纯化方面,亲和层析受到广泛重视,并有人研制了一种综合专家系统软件包,可在几分钟内告知对方被分离物系的分离方法和顺序,以便根据产品所需进行取舍。
另外,在生化过程的在线检测和控制方面,利用生物传感器和计算机监控,依然是今后的发展方向。
在酶催化反应中将发展有机溶剂中的催化反应。
生物上游技术的发展,将对生物化工产生深远影响。人们对从病毒、细菌、植物、动物到人类基因组顺序测定工作十分重视,并在此基础上形成了基因许多产品一哄而上,盲目上马,遍地开花,最终形成恶性竞争,许多企业破产倒闭。在竞争中生存下来的企业,也是元气大伤,难以进一步组织技术改造。如仅江苏省停产的发酵生产线就多达上百条。另外,行业内企业间的生产水平相差悬殊,企业技术装备水平达到20世纪80年代以后国际先进水平的仅占20%~30%,多数处于20世纪60~70年代水平。
二是产品结构不合理,品种单一,低档次产品重复生产,不能适应需求。在我国高档的医药生化产品如激素、生长因子、干扰素、药用多肽等,有的产量很小,有的没有生产,因此每年都需进口。
三是在生产技术上,工艺、设备不配套,上下游技术不配套,产物的收得率低。我国虽然某些产品如柠檬酸、乳酸等发酵水平较高,但大多数产品的收率都低于国外,酶制剂的活力也明显低于国外,生化反应器和分离纯化技术更是落后国外15~20年。每年都要花费大量资金从国外进口生物反应器、细胞破碎机、分离纯化设备及分离介质、生物传感器和计算机监控设备。
四是有些产品投入产出比达15/=以上,造成严重的资源浪费和环境污染。
五是基础研究薄弱,技术创新能力不强,企业的技术开发、技术吸收能力差,生产发展多数依靠传统的夕蜒型、粗放型扩大投资的增长模式,效益低、市场竞争力低。
3.2建议针对我国生物化工行业存在的问题,笔者有以下建议:
3.2.1扩大经济规模,提高竞争力要鼓励建设大型的生物化工企业集团公司,使之集科研、开发、生产、销售干一体。尤其要培育一批科技创新型企业。同时,也要鼓励在某些方面有一定特色的小型技术创新型生化公司的发展,并淘汰一批生产规模小、生产技术落后、没有市场竞争力的企业,从整体上优化我国生物化工的产业结构。
3.2.2调整产品结构要发展高档产品,如高档医药生化产品、功能性食品及添加剂(主要有低热值、低胆固醇、低脂肪、提高免疫功能、抗炎、抗癌等产品)、生化催化剂等。另外,也应发展众多精细化工产品及用化学法无法生产或很难生产的产品,如微生物多糖、生物色素、工业酶制剂、甜味剂、表面活性剂、高分子材料等。
3.2.3节约有限资源,强化环境保护在生化生产组学(genomics)。近年来又在信息学(informatics)的基础上建立了生物信息学(bioinformatics)。信息学的内容包括信息科学十生物技术十生物工程十生物动力学等的综合信息系统。可以预见,基因组学和生物信息学在生物化工中应用的商业前景极为可观。
另外,其它行业的新技术如分子蒸馏技术、组合化学(combinatoricalchemistry)等,也将在生物化工中得到应用。
3.我国生物化工的发层现状及建议
3.1发展现状
我国生物化工行业经过长期发展,已有一定基础。特别是改革开放以后,生物化工的发展进入了一个崭新的阶段。目前生物化工产品也涉及医药、保健、农药、食品与饲料、有机酸等各个方面。
在医药方面,抗生素得到迅猛发展61998年我国抗生素的产量达到33486h青霉素的产量居世界首位。其它生化药物中,初步形成产业化规模的有干扰素、白细胞介素。2、乙型肝炎工程疫苗。
在农药方面,生物农药品种达12种,主要有苏云金杆菌、井岗霉素、赤霉素等。其中,井岗霉素的产量居世界第一位。
在食品与饲料方面,作为三大发酵制品的味精、柠檬酸、酶制剂的产量也有很大的增加/1998年味精产量从1990年的22.3万、增加到56.4万一柠檬酸产量从1990年的6.13万、增加到56.4万一酶制剂从1990年的8.5万t增加到24万t。酵母及淀粉糖的产量也有明显增加。我国的味精生产和消费居世界第一,柠檬酸的生产和出口也居世界第一。另外,1998年乳酸的产量在1.5万t左右,赖氨酸的产量在2万t左右,卜苹果酸的产量在6000t。
在有机酸方面,衣康酸的产量达5000乙我国开发的生物法长链二元酸工艺居世界领先地位,目前生产能力达500Va以上,并有数家企业有建设长链二元酸生产装置的意向。
在保健品方面,我国已能用生物法生产多种氨基酸、维生素和核酸等。另外,我国生物法丙烯酞胺的生产能力达到2万V山与日本同处于世界领先地位。
但是与发达国家相比,我国生物化工行业存在着许多问题:
一是我国的生物化工产业主要以医药、轻工、食品业为主。部分企业对生物化工产品大都是精细化工产品这一点了解不够,加之行业规范也不够,导致过程中,应选择合适的原料,以降低成本与消耗,并加强废物处理,减少环境污染。
3.2.4提高生产技术水平,特别是下游技术水平因为我国生物技术上游技术水平与国外相差仅3~5年,而下游技术水平则比国外相差15年以上,改造传统发酵产品生产技术,不断提高发酵法产品的生产技术水平,开发生物反应器,提高我国生物化工产品分离和提纯技术,大规模开发生物化工装备等应首先提上议事日程。另外,还应积极采用微生物法代替化学法,开发基础化工新产品的工业化生产技术。
3.2.5加强产学研结合,注重上下游结合国内生物化工技术力量分散,为了做到优势互补,应加强产学研结合。另外在生物化工生产过程中遇到的很多问题,都是由于上、下游结合不够紧密而影响技术经济指标。因此,在人力和财力的投入上,应考虑上下游结合,以加快生物化工产业的发展。
【关键词】生物制药;西药制药;车间
药品是保证人们身体健康的基础,是人类关心的问题。尤其是在近年来,伴随着社会经济的飞速发展和人类生活水平的提升,人们在日常生活中对于药物也提出了新要求,各种安全、绿色、环保、高质的药品在人类生产和生活中所发挥的作用越来越突出,由此引发了人们对制药工艺的研究和探索。西药作为现代化医药体系中最为重要的一类,由于它本身是一种化学生产工艺,为此在加工与生产当中各技术环节与工艺要求都极为严格,无论是工程技术手段还是工程管理策略,都必须要给予应有重视。
一、西药工程概述
我国是当今世界上人口最多的国家,健康问题已成为我国当今社会发展中最为关心的问题,也是影响我国经济发展的主要因素之一。伴随社会经济的飞速发展和人民生活水平的提升,人们在生活中对于自身的健康也提出了新要求,对于保障健康的药物也给予了新看法。在这种社会背景下,西药制药工程迎来了发展的黄金时期,其应用前景日益深入,应用技术措施十分的严格。
1、西药工程概况
一般来说,西药制药主要指的是通过化学反应的方式来消融原材料,使得其中杂质、污物和不良成分及时的去除,生成一种新物质,是应用现代化科学技术手段和理念进行可靠操作和制作的一个综合性生产工艺。在当今的临床诊疗和救治中,西药的应用范围极为广泛,它在研制的过程中是从西药物质基础的角度出发进行的,是通过解决当今存在的化学稳定性问题和药效问题来进行优化的。在工作的过程中,也就是说西药制药工艺的开展主要需要解决的重点在于怎么样在工作中应用快速、安全的技术手段来生产出可靠的药物成分,为医疗工作的开展和人类健康提供物质保障。近年来,随着科学技术的飞速发展,以现代化计算机技术、遥控技术和自动化技术为主的新技术体系在制药工艺中得到广泛的应用,这使得整个制药流程变的更加的精确化、完善化,其整个功能得到了有效的发挥。
2、西药制药工程的发展前景
近些年来,需要制药工程的发展得到了前所未有的进步,但是就整体发展现状而言还不甚理想。尤其是在近些年来,各种药物安全问题时有发生,给整个制药行业的发展带来严峻挑战,同时也可为给制药工艺的引用提供了新的机遇。目前国内不断推出的各种只要政策很适合我国制药行业的发展,这使得整个行业迎来了发展的新机遇。尤其是在西药制取工艺当中,我国的设计能力、技术能力以及设备都得到了进一步的提升,逐渐缩小了与西方国家之间的差异,为我国制药工程的发展打下了坚实的理论基础。
二、常见的西药制药工艺
我国是当今世界上人口最多的国家,同样也是一个用药量极多的国家之一。但是因为我国的社会经济影响,使得我国的药品安全问题一直都未曾得到有效的解决,就整体趋势而言还存在着严重的不足和缺陷。就我国的西药生产工艺进行分析,无论是在技术、设备还是理念上,都与西方法多发国家存在着严重的差异,技术落后、生产观念不严谨、生产方式不科学等问题时有发生,这使得整个药物生产存在着严重的影响。基于这种社会背景下,以现代化科学技术应用为基础的制药新工艺逐渐受到人们的重视,也得到人们的认可,它在整个制药领域中发挥出重要的作用和意义。就当今常见的西药制药工艺进行分析,其主要的工艺如下:
1、生物制药技术分析
在现代化西药制药生产当中,生物制药技术的应用最为常见,它是基于现代化生物学理论基础上形成的一种制药新技术和新工艺。所谓的生物制药技术或称生物药物(biopharmaceutics)是集生物学、医学、药学的先进技术为一体,以组合化学、药学基因(功能抗原学、生物信息学等高技术为依托,以分子遗传学、分子生物、生物物理等基础学科的突破为后盾形成的产业。现在,世界生物制药技术的产业化已进入投资收获期,生物技术药品已应用和渗透到医药、保健食品和日化产品等各个领域,尤其在新药研究、开发、生产和改造传统制药工业中得到日益广泛的应用,生物制药产业已成为最活跃、进展最快的产业之一。
生物学的革命不仅依赖于生物科学和生物技术的自身发展,而且依赖于很多相关领域的技术走向,例如微机电系统、材料科学、图像处理、传感器和信息技术等。尽管生物技术的高速发展使人们难以作出准确的预测,但是基因组图谱、克隆技术、遗传修改技术、生物医学工程、疾病疗法和药物开发方面的进展正在加快。
除了遗传学之外,生物技术还可以继续改进预防和治疗疾病的疗法。这些新疗法可以封锁病原体进入人体并进行传播的能力,使病原体变得更加脆弱并且使人的免疫功能对新的病原体作出反应。这些方法可以克服病原体对抗生素的耐受性越来越强的不良趋势,对感染形成新的攻势。
除了解决传统的细菌和病毒问题之外,人们正在开发解决化学不平衡和化学成分积累的新疗法。例如,正在开发之中的抗体可以攻击体内的可卡因,将来可以用于治疗成瘾问题。这种方法不仅有助于改善瘾君子的状况,而且对于解决全球性非法贸易问题具有重大影响。
2、径向膜层析技术
传统的层析技术往往采用长轴流向设计,虽然为广大的科技工作者运用,但依然存在许多缺点: (1) 流速较慢,层析耗时长效率低;(2) 层析过程中压降较大,增加了对设备的要求;(3) 层析条件不易放大,若想放大规模,需重新摸索分离条件,为重组蛋白的大规模分离纯化提出了难题。80年代中期国际上提出了一种称为径向层析(Radial Flow Chromatography)的新技术。80年代后期,径向层析又结合膜分离处理量大的优点,发展成径向膜层析技术,在原理上解决了上述问题。径向膜层析柱常采用螺旋卷式膜组件结构,流动的方向是从层析柱的圆周流向柱的圆心,即径向流动。由于这一原理,与传统的轴向层析柱相比,径向层析有以下几个优点: (1) 流向的截面积加大,即使在流速高时压降仍很低,因而纯化速度快处理量大。(2) 保持柱径不变,无需改变其它分离条件,仅增加柱长就可以增加上样量,因而有利于放大生产。
三、小结
西药制药技术的提高是综合当前的生物技术、基因技术为一体的生产模式,各个生产企业和单位在制药的过程中结合科学技术综合分析与利用是保证当前易学发展的关键,更是为西药制药提出良好发展前景的基础。
参考文献