基因多态性的概念精选(九篇)
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第1篇：基因多态性的概念范文
【关键词】 多态性，单核苷酸；出生体重；胰岛素；敏感性与特异性；双生研究
【中图分类号】 R 179 R 339.3+5 Q 987 【文献标识码】 A 【文章编号】 1000-9817(2008)03-0238-03
A Twin Study on Association of SHP Polymorphisms with Birth Weight and Insulin Sensitivity/CHEN Tian-jiao, JI Cheng-ye, WANG Ying, et al. Institute of Child and Adolescent Health, Peking University, Beijing (100083), China
【Abstract】 Objective To study the effect of SHP (small heterodimer partner gene) polymorphisms on birth weight and insulin resistance, and to detect the SHP rs7504 polymorphisms. Methods DNA microstatellite polymorphism was used to diagnose zygosity of 393 twin pairs (MZ 256, DZ 137). Birth weight was gained by questionnaire and insulin sensitivity was estimated with logarithm transformed homeostasis model assessment (HOMA). PCR-RFLP analysis was performed to detect the SHP rs7504 polymorphisms. Identity by state (IBS) of non-Parametric Linkage Analysis Methods was used to analyze the association of polymorphisms with birth weight and insulin sensitivity. Results The genotype frequencies of TT, TC and CC were 84.9%, 14.1% and 1.0%. The interclass co-twin correlations of blood glucose, and HOMA-IR of those twin pairs sharing 2 alleles of IBS were greater than those sharing 0-1 alleles of IBS. BMI, blood glucose and birth weight of those carrying the mutant C allele were higher, but the differences had no statistical significance. Conclusion SHP polymorphisms might be associated with insulin resistance and birth weight, further studies are necessary to confirm the results.
【Key words】 Polymorphism, single nucleotide; Birth weight; Insulin; Sensitivity and specificity; Twin studies
胰岛素抵抗和高胰岛素血症是代谢综合征的基础［1］，并被认为是联系肥胖与冠心病、高血压、糖尿病的中心环节。儿童和青少年虽很少发生上述明显的疾病，但是其潜在危险(糖、脂代谢异常和高血压倾向)却普遍存在［2］。近年来越来越多的流行病学研究显示，低出生体重与青少年及成年期的胰岛素抵抗综合征的发生密切相关，发生机制尚不明确，可能是由于早期营养不良导致的程序化，也可能是由于共同的遗传基因作用。
双生子研究是研究遗传和环境影响的重要手段。双生子又是研究基因多态性与功能关系的特殊人群，双生子同胞年龄相同，宫内环境及早期生活环境相似，在研究基因和表型之间的相关性时可以更好地控制混杂因素，在验证胎源性假说时有特殊意义［3-4］。
微小异源二聚体伙伴基因(small heterodimer partner gene，SHP) 编码的蛋白产物是核受体超家族的成员之一，与其他多种激素受体相互作用，同时能增强过氧化物酶体增强激活受体（PPAR) 的转录活性，参与胆固醇代谢。有研究发现，SHP基因与日本人轻、中度肥胖及出生体重增加有关，提示SHP基因可能参与胎儿宫内发育的调节［5］。笔者的研究目的是检测SHP基因的SNP 位点rs7504多态性。
1 对象与方法
1.1 对象 依据山东省青岛市双生子登记系统，收集5～18岁双生子393对,其中单卵双生子（MZ）256对，二卵双生子（DZ）137对；平均年龄(12.0±3.5)岁。同一对双生子在同一天受检，并取得家长及本人的知情同意。经严格体检和问卷询问，排除影响血糖或胰岛素疾病者、各类继发性肥胖及1个月内服用减肥、降糖降脂等药物者。
1.2 方法
1.2.1 卵型鉴定 卵型鉴定应用DNA短串联重复序列（STR）进行。酚氯仿法提取血凝块中DNA，PCR复合扩增4个多态性位点D16S539, D7S820, D13S317, D5S818（美国Promega公司试剂盒），荧光标记引物，产物经垂直凝胶电泳和激光扫描后，比较4个位点的一致性以鉴别卵型，可靠性达99.6%以上。该项工作在北京法医鉴定中心生物物证室完成。
1.2.2 测量指标 包括身高（cm）、体重（kg）、体质指数（BMI，kg/m2）、腰臀围比（WHR）、血糖（GLU，mmol/L）、胰岛素（INS，mU/L）、出生体重（g）。出生体重由问卷询问得到；身高及体重测量按《中国学生体质健康状况调研细则》进行；体质量指数计算为体重（kg）/身高2（m2）。受检双生子于清晨空腹采血（禁食至少8 h），同一对双生子间隔采血时间小于5 min；葡萄糖氧化酶法测定血糖，放射免疫法测定血胰岛素（中国原子能科学研究所）。现场和实验室质控均符合要求。胰岛素敏感性评估采用稳态模型胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment insulin resistance index,HOMA-IR）：HOMA-IR =FPG×FINS/22.5（FPG为空腹血糖，FINS为空腹胰岛素），模型建立基于血糖和胰岛素在不同器官的相互影响，反映机体的胰岛素抵抗。
1.2.3 基因多态性检测 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测SHP rs7504多态性。PCR上游引物为：5'-GGACCTCTTCTTTCGCCCTATC-3'；下游引物为：5'-TGGTCCAATAAGCAGCCTAAGC-3'（北京奥科公司合成）。25 μL的PCR反应体系中，模板DNA 100 ng，Tag酶0.5 IU。反应条件为：(1)预变性94℃，5 min；(2)35个循环，每个循环94℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1 min；(3)终末延伸72℃，5 min。PCR反应产物以BsiHKA-Ⅰ(NEB)酶切，65℃水浴16 h。2.5%琼脂糖凝胶电泳，150 V，25 min，紫外灯下读取基因型。共3种SHP基因型：TT(363 bp) ，TC(101 bp，262 bp，363 bp)，CC(101 bp，262 bp)。
1.2.4 统计分析 在基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡的双生子人群中进行如下分析。
比较具有相同等位基因的二卵双生子同胞对内变量的相关，采用非参数连锁分析方法，以基因多态性为标记，分别比较当状态一致(identity by state，IBS)为0，1和2时双生子同胞间各性状指标差值平方的大小及双生子组内相关系数。W检验分布正态性，HOMA-IR为偏态分布，统计分析时经自然对数转换。正态资料比较采用配对t检验，非正态资料采用配对的非参数检验（Wilcoxon Matched-Pairs，Signed-Ranks Test）。调整性别和年龄。分析采用SPSS 13.0软件完成。
2 结果
2.1 基因多态性结果 SHP基因多态性鉴定结果如图1。TT,TC和CC基因型频率分别为84.9%，14.1%和1.0%。T，C等位基因频率分别为92.0%和8.0%。χ2检验显示，该双生子人群基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡，说明该群体基因已达到遗传平衡，具有代表性。
2.2 基因多态性与各性状水平的关系 随机抽取双生子对中的一个，分析基因型和各性状水平的关系。将CC与TC合并在一起，双生子分为未携带突变等位基因的野生型（TT）和携带突变等位基因的突变型（TC，CC）进行分析，发现突变者BMI、血糖和出生体重与未突变者差异无统计学意义(表1)。SHP基因野生型和突变型对象出生体重与各性状指标关系的比较显示，野生型和突变型中BMI均与出生体重正相关，血糖均与出生体重负相关；而对于胰岛素抵抗指数，野生型与出生体重负相关，突变型为弱正相关。见表2。提示野生型出生体重越低，胰岛素抵抗指数越高；而突变型似乎对此有保护作用。
2.3 双生子同胞间IBS不同时各指标的组内相关系数 单卵双生子中，以SHP基因多态性为Marker，比较当IBS为0，1和2时双生子同胞间各性状指标的差异及组内相关系数，见表3。
SHP位点双生子同胞间IBS为0，1，2的双生子分别有1，18，118对。因IBS为0的双生子对数太少，将其放入IBS为1组参加分析。见图2，3。
IBS为1时，有WHR和GLU双生子对内差异大于IBS为2时，但差异无统计学意义。IBS为2时，血糖和反映胰岛素敏感性的HOMA-IR在双生子两者间的相关系数较大，而血糖在IBS为1时相关系数很低，且差异无统计学意义；IBS为2时组内相关系数有显著性。提示这些指标与SHP的多态性有关。其余各指标相关系数在IBS为1时稍大于IBS为2时，可能与IBS为2时双生子对数较多有关，提示其与SHP的多态性关系不大。
3 讨论
本研究双生子人群TT，TC和CC基因型频率分别为84.9%，14.1%和1.0%；T，C等位基因频率分别为92.0%和8.0%。与国内某研究结果相似，但与白种人明显不同，与美国印第安人相近［6］。
本研究采用源于患病同胞对分析的IBS概念，分析基因多态性与各性状指标的关系。IBS为2时双生子同胞间血糖和HOMA-IR组内相关系数大于IBS为1时，说明SHP基因多态性与血糖和胰岛素敏感性有某种程度的关联。而比较当未携带C（TT）和携带C（TC，CC）基因时各指标的均值发现，突变者BMI，血糖和出生体重高于未突变者，但差异无统计学意义。与突变者出生体重更高且有统计学意义的结果不一致，这可能是由于双生子人群较为特殊，平均出生体重较低，难于发现区别；或SHP基因多态性并非是胰岛素抵抗或者出生体重的主要遗传因素，也可能是衡量胰岛素敏感性的指标不够精确引起［6］。比较野生型和突变型对象出生体重与各性状指标关系发现，野生型和突变型中出生体重越低，BMI越低，血糖越高。对于胰岛素抵抗指数，野生型出生体重越低，胰岛素抵抗指数越高；而突变型却相反，似乎对此有保护作用。某大型双生子研究结果显示，低出生体重和糖尿病可能存在由宫内环境引起的程序化影响，不排除有共同遗传因素作用［7］。笔者认为二者之间也存在相互作用。
有研究认为，SHP基因突变导致其抑制HNF-4а转录活性的功能下降,从而HNF2-а的活性增强，导致胰岛素分泌增加［5］。胎儿胰岛素增加致使胎儿生长加速，出生体重增加，为日后肥胖奠定基础。另外，SHP基因突变可能增强脂肪合成中起重要作用的PPARs的转录活性［8］，可能与脂肪细胞分化和肥胖有关。本研究中突变与BMI、血糖和出生体重的关系似乎也从一方面支持以上结果，但仍需进一步扩大样本研究。笔者本次也检测了双生子中PPARγ2的Pro12Ala基因多态性，结果发现，这2个基因可能对BMI、腰臀围比、血糖、胰岛素、HOMA-IR等指标有联合作用［9］。
SHP基因多态性可能与血糖、胰岛素敏感性及出生体重有关，但仍有待于进一步研究。
4 参考文献
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第2篇：基因多态性的概念范文
关键词：分子标记；药用植物；简单序列重复（SSR）；扩增片段长度多态性（AFLP）；单核苷酸多态性分析技术（SNPs）
中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）13-2401-05
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.13.001
Progress and Application of Molecular Marker Technology in Medicinal Plants
CHEN Hong-boa， YU Jin-ruib， YANG Chun-xianb， QIAN Ganga
（a.Department of Cell Biology and Genetics； b.School of Dentistry， Zunyi Medical College， Zunyi 563003， Guizhou， China）
Abstract： By summarizing the principle and technical characteristics of the commonly used molecular marker technology in recent years and its application in the field of medicinal plant research，this paper provides a reference for the development and evaluation of medicinal plant resources， and further provides ideas for the screening and verification of functional gene of medicinal plants.
Key words： molecular marker； medicinal plants； simple sequence repeat（SSR）； amplified fragment length polymorphisms（AFLP）； single nucleotide polymorphisms（SNPs）
中是野生中药材资源最为丰富的国家，目前已识别有11 000多种，无论其种类或数量均列世界之首[1]，为中国中药文化产业的国际化创造了丰富的资源条件。但近年来，随着人们对养生、保健等意识的不断提高，导致中药材的市场需求极度扩增，一些以野生种质消耗为主的名贵中药材正面临濒危甚至灭绝。传统的研究利用方法在药用植物识别、开发、利用以及保护等方面都相对落后。然而近些年，以RFLP[2]为代表的DNA分子标记技术的兴起，为实现当代药用植物研究的现代化提供了现实手段与条件。分子标记技术（亦或分子鉴别技术或DNA分子标记技术）[3，4]，是一种基于遗传物质的研究方式，这使其具备了不受生长环境的影响、检验精度高及重现性好等优点。随着DNA分子标记技术的不断运用与革新，以分子杂交为基础的第一代标记技术，由于操作过程复杂、周期长等原因，正逐渐退出分子研究领域。而围绕PCR技术为核心的新型分子标记技术正广为使用，并日臻成熟。
1 常用分子标记技术的原理及特点
1.1 简单序列重复（Simple sequence repeat，SSR）
SSR亦称为微卫星DNA，它由2-5个碱基组成，如（GA）n、（TG）n、（GAC）n等，其中最常见为二核苷酸重复形式。SSR序列的长度在不同基因组间由于重复次数以及程度的不同具有高度的变异性，而展现出较高的多态性。SSR标记原理是根据其两端的保守序列设计特异性引物，经过PCR扩增后，再利用变性或者非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对扩增产物进行分离，继而体现不同样本基因组DNA的多态性。
简单重复序列具有较多优点，其共显性可区分纯合型与杂合型，以及还有灵敏度高、稳定性好以及操作简便等优点。但目前SSR获得的方式参差不齐，前提都是要提前知道目的基因的序列信息。
1.1.1 简单重复区间序列（Inter-simple sequence repeat，ISSR） ISSR是Zietkiewicz等[5]于1994年发展起来的一种加锚SSR技术。它的原理是在SSR引物的5′或3′端锚定2个或以上的SSR碱基，引起特定位点退火，从而提高扩增专一性，得到的特异性片段再通过变性或非变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离，最后根据不同的多态性条带分析多态性。
其优点在于无需提前知道样品基因序列，ISSR可为研究者快速高效地提供基因组信息；引物序列相对较长，通过提高退火温度进而保证了结果的可靠性；样本DNA质量要求不高，且所需量少；引物的通用性广，不具种属特异性。但在实际应用中也存在一定缺陷，如：稳定的实验体系条件需要探索构建，且显性标记亦不能区分纯合型和杂合型。
1.1.2 表达序列标签（Expressed sequence tags，ESTs） 表达序列标签是基于EST数据库或cDNA文库的一种标记技术，是一种能快速、高效地揭示基因容量的标记方法，由1989年Venter首次提出。它能特异地展示出基因某一位点的表达情况，能够直接反映出功能基因的生物信息[6]，同时也为地道药用植物的鉴别、开发利用提供了新的候选基因。因此，基于ESTs开发的SSR技术（即EST-SSR）是一种稳定、可靠的分子标记技术[7]，可直接用于基因作图[8]，从而指导功能基因的预测。
EST-SSR与传统SSR技术相比较，无需构建DNA文库而节约了实验成本。而且，在功能基因研究方面，EST-SSR更接近功能基因组；表达序列标签直接来源于编码序列，从而为基因组比较学以及同源基因的研究提供更可靠的途径。但也有不足之处：与SSR相比，多态性较低；同时，ESTs只代表了基因组DNA的一部分，所包含的信息不够全面，且现行的一些序列拼接软件也存在一定的局限性，分析过程中也可能丢失一些重要的基因组信息。
1.2 扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphisms，AFLP）
AFLP是1992年荷兰科学家Zabeau和Vos发明的一项新专利[9]。其原理是植物基因组DNA经过限制性内切酶酶切后（通常采用双酶切），与特定的接头相结合而得到带有特定接头的特异性片段，这些片段再与PCR引物的3′端识别后进行特异性扩增，最后再将扩增产物通过聚丙烯酰氨凝z电泳筛选，进而分析其多态性。
AFLP是RFLP技术与PCR技术的结合，其具备了高多态性、操作简易、可以同时处理大量样品等优点。近年来，AFLP已广泛应用于药用植物遗传图谱的绘制、物种遗传多样性分析及分类研究、辅助育种、功能基因定位等多方向的研究[10，11]，且AFLP目前已被公认为构建DNA指纹图谱最可靠的分子标记。其缺点主要是对样品DNA的质量要求较高，实验成本也较昂贵，扩增所得结果的分析也相对困难。
1.3 DNA条形码技术
2003年Guelph大学的Hebert等首次提出DNA条形码的概念。它是以足够变异且相对较短的DNA序列为标准，建立的一种新的生物身份鉴别系统，从而实现对物种快速、精准地识别和鉴定，其类似于超市使用条形码鉴别不同商品。通过特异DNA的比对，对于新种和隐种的发现也具有现实性的帮助[12]。Lahaye等[13]通过单独使用matK基因对1 000多种兰科植物进行系统分析，结果证明单独使用matK基因能够发现兰科隐种并证明了DNA条形码分析的可行性；Newmaster等[14]运用DNA条形码技术发现了感应草属的3个隐种以及草沙蚕属的1个新种。在2008年召开的植物无国界会议上提出了“超级条形码”技术[15]，决定将叶绿体全基因组序列作为条形码序列应用在植物物种的鉴别上。Shinozaki等[16]第一次完成了单一物种叶绿体全基因组的测序；2008年Diekmann等[17]又提出了一套较为标准的叶绿体DNA提取方法。Parks等[18]通过对松属37个样本进行叶绿体全基因组测序分析，验证了叶绿体基因组可以作为植物物种水平上的条形码。近年来，DNA条形码技术在药用植物研究中的报道也逐渐增多，对于加快中国生物进化研究的步伐具有重要意义[19，20]。
1.4 基因芯片技术
基因芯片又称DNA芯片或寡核苷酸阵列，它是将大量已知的探针固定在支持物上[21，22]，通过核酸杂交，再利用激光扫描及分析，来实现对目的基因表达水平或多态性的分析。其高通量、自动化的优势使其广泛用于基因的定位、药物的靶向分析及新药研发中。Schena于1995年第一次在论文中发表了DNA chip相关研究，Fodor又于第二年年底研制出了第一块DNA芯片[23]。
基因芯片技术目前主要应用于一些新药的研发[24，25]、药物靶向研究以及疾病的诊断等方面。Watanabe等[26]采用高密度基因芯片技术，对经 Egb761处理的小鼠的皮层和海马细胞的基因表达进行了研究，分析得出其具有拮抗神经病变的药理作用。李美德[27]应用全基因组表达芯片来检测从黄芩根中分离出的汉黄芩素作用于肝癌细胞后的基因表达情况，结果发现406个差异明显的表达基因，通过差异基因的筛选和分析，从而确定了汉黄芩素抗肝癌的分子机制，对药物靶向基因的确定，以及抗癌药物的开发提供了新的依据。郭旭东[28]通过基因芯片技术对急性心肌梗死（AMI）患者和健康者外周血的RNA进行差异分析，发现其中的差异基因CYP4F3和USP25可能为AMI诊断的基因标记。张玉金等[29]通过利用从中国2010年版药典中筛选出的基原植物以及从NCBI数据库中下载的相应序列进行分析，得到13 814条特异性探针，为中国药典中基原植物检测芯片的建立做出了重要贡献。近年来，不同领域的实用芯片陆续都有报道，且基因芯片技术目前已是高通量药物筛选的主要途径，同时也是中药活性成分筛选的重要手段。
1.5 单核苷酸多态性分析技术（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）
SNPs是等位基因之间的单个核苷酸差异，如单个核苷酸的缺失、插入或者是突变等[30]。SNPs标记技术相比微卫星技术而言，SNPs描述的是一种双等位基因的多态性，而SSR则是多位点等位基因之间的多态性，故SNPs在数量上远远超过SSR，因此具有更高的多态性。在人的基因组中，大概1 000 bp就会出现一个SNP，因此可以其作为DNA的一种特异性标记[31]。Xu等[32]通过对水稻亲本9 311的SNP检测，得到了768万个多态位点，从而绘制了1张高密度的Bin图谱并成功定位了1个QTL。目前，由于SNP技术主要依靠于基因组DNA的大量测序或者是基因芯片技术，且技术要求高以及实验成本大等原因，导致在药用植物方面的研究也相对匮乏。
2 DNA分子标记技术在药用植物中的研究应用
2.1 中药材种质资源的鉴定、评价及道地性研究
种质资源是指亲本遗传给子代的遗传物质，其包括“道地性”种质资源、新种及重要培育品系等。徐蕾等[33]通过运用SSR标记技术在铁皮石斛种群遗传多样性的研究，证实了铁皮石斛具有较高的遗传多态性，并顺利将36份铁皮石斛材料分成了3个类别。Shen等[34]利用筛选出的ISSR引物准确地鉴别出了8个野生种石斛药品。李永清等[35]利用ISSR技术成功将36份铁皮石斛材料划分为6个类群。赵香妍等[36]通过ISSR标记技术在北京地区野生柴胡种质资源中的研究，得出北京地区野生柴胡具有一定的地域性分布特征，应加以保护及推广种植。
2.2 中药材真伪的鉴别及品种鉴定
随着中药材市场需求的不断扩大，中药材市场鱼目混珠的情况时有发生，同类药材由于道地性等导致药效也相差甚远，而常规的检测方式却很难区别。但现行的DNA分子鉴别技术基于高稳定性、不受环境因素及个体发育影响等优点，可以保证鉴定结果的准确性。马晓冲等[37]通过研究证明基于SNP的分子标记技术能够稳定地鉴别中药材泽泻。滕艳芬等[38]利用matK基因已成功将正品与混淆产品鉴别开来。
2.3 遗传多样性及种属亲缘关系的研究
药用植物遗传多样性及亲缘关系的研究，对于认识物种的进化历程、遗传育种及物种改良等均具有重要意义。传统的研究方法均是基于对表达产物的研究探索，但药用植物的化学成分及其含量、外部形态等均会由于生长环境及其他因素影响而有所差别。因此，从传统研究的角度探索药用植物的遗传多样性就存在很大的局限性，而从分子角度出发的分子标记技术能有效地揭示物N进化演变过程中遗传物质流动的真实本质，从而使得分子标记技术能够阐明物种进化、遗传背景以及种内或种间遗传关系，为中国珍贵及濒危中药材的开发、利用和资源保护提供真实依据。
近年来，随着分子标记技术的不断应用与发展，已有多种DNA标记技术成功运用于中药材遗传多样性研究及亲缘性分析中。YANG等[39]运用SSR分子标记技术对吉林省5个不同产地的人参材料进行分析，得出不同产地的人参在遗传物质上呈现出较高的多态性。Li等[40]于2013年利用SSR标记法对洋玉兰叶绿体全基因组进行近缘物种比对分析，结果显示洋玉兰叶绿体基因组的重复序列保守性相对较高。2014年，Galina等[41]又运用SSR标记技术对俄罗斯濒临灭绝的人参进行了种群遗传性状的分析。朱田田等[42]利用ISSR对甘肃不同产地中麻黄的遗传关系进行了分析，得出中麻黄遗传距离跟地理距离有一定的关系。黄颖桢等[43]通过使用ISS标记技术对金线莲遗传多样性进行分析，得出在野生种质资源间金线莲具有丰富的遗传多样性。叶炜等[44]通过利用ISSR对金线兰及其近缘物种的遗传多样性进行研究，得出种群间可能存在基因的交流。唐晓清等[45]利用AFLP技术对不同农家栽培类型的丹参进行分析，结果表明AFLP技术可以作为识别丹参不同栽培类型间遗传差异的手段。李勇等[46]利用AFLP技术通过对金莲花遗传多样性的研究，得出地理位置较近的种质遗传相似度较高。唐美琼等[47]利用AFLP技术对广西草珊瑚遗传性状进行研究分析，结果显示广西草珊瑚遗传多样性偏低，须尽快采取相应措施。沈亮等[48]通过AFLP技术分析梭梭遗传多态性得知该物种种内丰度较高，各地区之间的分化较小。李永清等[49]通过ISSR在37份药用石斛亲缘关系研究中的应用，得出ISSR分子标记技术完全可以应用于石斛物种亲缘关系的分析。朱田田等[50]通过对不同黄芪和党参栽培品种遗传关系的ISSR分析，得出不同品种的黄芪和党参拥有较高的遗传多样性，而且种间差异较大。蒋雨晗等[51]利用ISSR分子技术对14份不同来源的白芍进行研究分析，证明了4个栽培种跟野生种之间有一定的遗传差异性，而且可以从基因水平把外型相似的白芍栽培品种区别开来。
2.4 DNA遗传图谱的构建及数量控制基因定位
DNA遗传图谱也称基因遗传图谱或连锁图谱，系指基因在染色体上相对应的位置。自从第一张遗传图谱的构建以来，越来越多关于药用植物DNA图谱的构建也相继报道。周志勇等[52]首次用AFLP技术构建了人参和西洋参的DNA指纹图谱，这对人参的鉴别提供了非常有效的工具。虞泓等[53]利用AFLP对石斛4个内种和1个外群种进行DNA多态性分析，用筛选得到的引物构建了5个种的DNA图谱，并应用bootstrap进行了检验，该研究证明了AFLP标记技术可用于构建石斛基因组指纹图谱。赵红燕[54]则利用EST-SSR、ISSR、RAPD、SRAP等4种分子标记技术成功构建了浙江铁皮石斛563个遗传连锁。郑伟耀等[55]运用SSR标记天麻基因组DNA，分析得出扩增位点与天麻素含量有关。巫桂芬等[56]通过黄麻基因DNA分子指纹图谱的构建，得出每一种被识别出的物种均有其特有的分子“身份证”。
3 展望
中国药用植物种质资源非常丰富，但是近年来由于气候的变化以及过度的开采，使得一些稀少的野生药材资源更是急剧减少，市场也相对混乱，因此从生物本质出发的DNA分子标记技术对于中国药用植物的鉴定、保护、开采、利用及改造就显得格外重要。目前，分子标记技术在药用植物中的研究主要体现在遗传多样性研究、种质鉴别及评价、DNA指纹图谱构建以及基因定位几个方面。
目前在药用植物研究应用中的DNA分子标记技术尚存在以下几个问题：DNA标记技术在中药材研究中的应用较少，而且存在方向聚集现象，近年关于药用植物亲缘性的研究越来越多，然而在其他一些领域，如药材活性成分分离与提取以及相关成分控制基因定位等方面的研究却少有报道，研究范围不够全面和深入。另外，每一种分子标记技术都有其各自的优缺点，实验结果具有一定片面性，而标记技术的联合应用也处于相对空白状态；技术要求高，技术培训相对缺乏。因此，需要加大分子标记技术的研究应用，以便增加其在药用植物研究中的实用性和可靠性，通过以不同分子技术的研究为基础，可达到明确中药材有效药用成分的基因构成，以及各种药用植物基因的调控原理及产物的靶向作用原理，以便对中国中药品种的保护利用及产业化做出更大的贡献，以此实现中国中药文化的规范化、产业化以及国际化。
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第3篇：基因多态性的概念范文
提要 寻找与高血压以及血压调节有关的基因，已成为当前心血管领域的研究焦点之一，一些属于单基因遗传病的继发性高血压的致病基因已被识别。原发性高血压是一种多基因遗传病，其发病系遗传与环境因素共同作用的结果，这为高血压易感基因研究带来很大困难。迄今大多用候选基因法进行高血压相关基因研究。在人和动物模型的研究中，有关高血压候选基因多态性的报道已有四十多种，但各家结果不一致。近年来用微卫星标记进行全基因组扫描和连锁分析，它已成功地用于多基因病相关基因的定位克隆研究。应用该技术对原发性高血压易感基因的定位研究正在进行中。
Gene studies in hypertension:State-of-art
Abstract The search for genes influencing blood pressure or hypertension has become one of the focal point of cardiovascular research. A few disease genes causing secondly hypertension，as a result of a single gene defect， have been identified. However，essential hypertension is a polygenic disease and both genetic and environmental factors play important roles in its development. This fact makes the identification of its susceptibility genes more difficult. So far most studies to reveal the genes related to essential hypertension have employed a candidate gene approach.Using this strategy，the associations between polymorphisms of over forty genes with essential hypertension have been reported in human or in animal models.However，the results are not consistent .Recently，a genome－wide scan and linkage analysis using microsatellite markers becomes a useful approach in the positional cloning of genes in polygenic diseases.Its application for mapping susceptibility genes of hypertension is ongoing.
Key words essential hypertension;gene;candidate gene approach;genome－wide scan
和平利用原子能、登月和人类基因组计划（HGP）是本世纪最重要的三大科技成就。1990年启动的美国HGP的研究目标是在2005年最终阐明人类基因组DNA的全序列、发现所有人类基因、完成它们在染色体上的定位。目前人类基因组遗传图和物理图已经完成，大规模测序技术和生物信息学获得迅速发展，提前达到HGP研究目标已成定局。在“结构基因组学”获得巨大进展的推动下，一个以破译基因功能信息为目标的“功能基因组学”已应运而生。为应对激烈的国际竞争和日新月异的科技进步，我国科学家率先提出了“疾病基因组学”这一新概念，从而确立了我国人类基因组研究的重点和特色。在“863”计划等相关项目的研究基础上，集合了国内一批一流研究单位，一项以创立“疾病基因组学”理论和技术体系为目标和“国家重点基础研究发展规划”研究项目，已于今年初正式启动，这标志着我国疾病基因研究已经跨入积极参与大规模国际竞争的时代。
1 继发性高血压基因研究现状与展望
在高血压基因研究方面，迄今已有10多种属于单基因遗传病性质的继发性高血压的致病基因已被定位或克隆。它们是：与肾上腺皮质激素代谢有关的基因：如醛固酮合成酶基因与11β羟化酶基因形成嵌合基因，导致糖皮质激素可抑制性醛固酮增多症；与离子转运有关的基因：如已查明Liddle综合征系上皮细胞钠通道β.γ亚单位突变所致；一些因儿茶酚胺产生过量导致高血压的常染色体显性遗传疾病，它们的致病基因已被识别。此外，某此类型的多囊肾致病基因也已被定位。需要指出单基因性质的高血压基因研究
并未结束，可能还有一些尚未认识的新病种有待发掘，如在土耳其发现一种以严重高血压伴短指畸形为特征的常染色体显性遗传病，新近其基因已被定位。此外，阐明致病基因在高血压发病中的分子生物学和病理生理机制、探索基因治疗等方面有待进一步研究。
2 原发性高血压基因研究现状与展望
单基因病致病基因的识别，犹如池塘中的鱼已钓一个少一个；而多基因病易感基因却似深海中的鱼，若隐若现、深不可测。当前疾病基因的研究重点从单基因病转向多基因病已成趋势，但难度也越来越大。原发性高血压（EHT）是一多基因遗传病，其发病率高、危害性大、家系样本收集相对比较容易，因此已成为当前多基因病研究的重点和热点之一。
EHT发病是遗传因素与环境因素共同作用的结果，一般认为，人群中血压变异的30％～60％是由遗传因素决定的。遗传因素赋予个体对于EHT的易感程度，因此与EHT发病相关的基因称为易感基因而不是致病基因。
自90年代起识别EHT相关基因的研究开展得十分活跃，目前最常用的方法为候选基因法，其基本策略和步骤为：以参与血压调节机制的蛋白为对象，确定候选基因；进行遗传连锁分析，确定该候选基因座位与高血压是否连锁；筛查该候选基因的各种突变体；基因多态性与高血压间的关联研究，以确定该基因突变体是否与EHT相关。相关基因识别后到最终确定为EHT易感基因还有很多工作要做。
在已研究过的所有EHT候选基因中，以血管紧张素原（AGT）基因的研究最为深入。多数报道指出AGT基因与EHT相连锁，不少研究发现AGT基因的M235T变异体（即基因突变导致AGT第235号氨基酸由甲硫氨酸转变为苏氨酸）与高血压相关联，235T纯合个体的血浆AGT水平显著高于235M纯合个体。但也有一些研究无法证实AGT基因M235T多态性与高血压有关。血管紧张素转化酶（ACE）基因存在插入型（Insertion，I）或缺失型（Deletion，D）多态性。目前一般认为ACE基因这一多态性与高血压关系不大，但似与心、脑、肾等靶器官损害有关。尽管荟萃分析结果支持这一观点，但ACE基因的DD基因型是否为心脑血管病的危险因子，需待前瞻性研究加以证实。一组意大利学者对α－adducin基因与高血压关系进行过系列研究，提出α－adducin基因突变是盐敏感性高血压的遗传基础之一，从而引起广泛重视，但目前多数报道不能证实这一结果。目前已经研究过的EHT候选基因不下四、五十个，不能一一介绍。但迄今为止用这一方法未能肯定哪个基因与EHT相关。尽管如此EHT候选基因对象仍在扩大，对于已研究过的候选基因寻找新的变异体，并探索它们与EHT间的关系还将继续。另一方面，候选基因多态性的民族和地区差异的研究，尤其对于基因多态性分型用于指导临床的可能性探讨正越来越受到重视。
近年来应用微卫星引物进行基因组扫描的技术已经成熟，多色荧光标记的微卫星DNA引物已经商品化。用300多对覆盖整个基因组的微卫星引物，选择大样本的EHT家系或同胞对进行连锁分析，有可能将EHT相关基因位点定位到某一染色体区域内，分辨率可达10cM。进一步用区域内DNA多态标记进行精细定位，如能将范围缩小到1cM以内，便可直接大规模DNA测序，分离并克隆出EHT相关基因。全基因组扫描的应用，在个别多基因遗传病基因定位中已有成功报道。目前国内外一些实验室正采用此技术进行EHT相关基因的染色体定位研究，但迄今尚未见正式报道。
患者对药物的反应、药物副作用以及药物在体内的代谢，都存在明显的个体差异，这种差异都有一定的遗传背景。如能在基因水平上阐明有关机制，将有可能通过检测某个或某一组基因的多态性，预测药物疗效、减轻甚至避免副作用。“药物基因组学”的出现为实现高血压个体化治疗带来了希望。
第4篇：基因多态性的概念范文
橄榄(CanariumalbumL.)为橄榄科(Burseraceae)橄榄属植物，是中国南方特有的亚热带水果。据不完全统计，目前在我国主要分布和种植的橄榄品种(系)共180多个［1－2］，其中广东有80多个，福建有70多个，四川、浙江、广西和云南也有少量分布。粤东地区作为橄榄的主产区至今仍保存着众多优质橄榄资源。但是，由于农业栽培的选择性种植以及粗放的管理模式，导致橄榄的遗传多样性正在遭受破坏。因此，亟待利用现代科学方法对橄榄遗传多样性进行保护。遗传资源的数量是相关育种和研究的基础，然而大量的遗传资源也给种质资源的研究、保存和开发利用带来困难。1984年Frankel［3－4］提出核心种质(Corecollection)的概念，为种质资源保存和研究开创了新的方向。目前，国内外对核心种质构建方法的研究多是依据表型形状或农艺形状［5－6］。目前，以分子标记数据为基础构建核心种质的研究也有一些报道［7－16］，但仍然不够深入。通常核心种质的构建是根据一定的原则将相似的种质材料归为一组，再以一定的取样策略选择优先保存的种质材料构成核心种质。胡晋等［17］提出了多次聚类的核心种质构建方法，其优点是能保存原有种质的遗传变异模式。该方法是依据聚类结果，随机选取最低分类水平内的一个种质材料进入下一轮聚类分析，如组内只有一份材料，则直接进入下一轮聚类分析;对剩余的材料再次聚类、取样，直至所取种质材料量达到设定的要求，即构成核心种质。此方法已用于山茱萸(Cornusofficinalis)［13］和柚类(Citrussp.)［18］等的核心种质构建。橄榄作为我国南方的特色植物资源，一直以来缺乏相应的研究。虽然目前在广东和福建均建有种质资源苗圃，但以资源收集为主，还未有核心种质构建的研究报道。本研究主要探讨利用分子标记数据构建橄榄核心种质的取样方案，从而为橄榄种质资源的保存、管理和开发利用提供指导，也可为其它地方特色植物种质资源的研究提供借鉴。
1材料和方法
1．1材料和处理供试的64份橄榄(CanariumalbumL.)种质材料分别来自广东省东部地区的汕头市、潮州市、揭阳市和梅州市(表1)。ISSR-PCR反应体系为前期优化的20μL反应体系，包括2μL10×PCRbuffer，Mg2+3.0mmol/L，dNTP0.225mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，模板DNA80ng和引物0.25μmol/L。扩增程序为:94℃预变性4min;每个循环94℃变性1min，49℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环;72℃延伸8min;于4℃保存［19］。从48个ISSR引物中筛选8个多态性强、重复性好的引物，对64份材料进行PCR扩增，对扩增产物的电泳图谱进行0或1计数获得ISSR分子标记数据。
1．2橄榄核心种质构建方法利用ISSR分析数据，分别依据Nei&Li和SM计算遗传距离，采用UPGMA法进行聚类分析。根据聚类分析结果，在不同分组的情况下采用多次聚类随机取样法构建核心种质。具体方法为:采用P策略(proportionalstrategy)、L策略(logarithmicstrategy)、S策略(squarerootstrategy)和G策略(geneticdiversitydependentstrategy)等取样策略确定各个分类亚组的取样比例［20］;组内取样利用多次聚类随机取样的方法逐步删减达到目标数量;如果组内仅有1份材料，直接选取构成核心种质。依据上述方法共确定8种取样方案，代号分别为:P-SM、L-SM、S-SM、G-SM、P-Nei&Li、L-Nei&Li、S-Nei&Li、G-Nei&Li;每种方案分别抽取32、29、26、23、19、16、13、10和6个样品组成样品群，并比较各个样品群的遗传多样性指数。
1．3橄榄样品群数据分析利用各个样品群的原始数据，通过PopGen32软件计算各样品群的观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei's遗传多样性指数(H)、Shannon's信息指数(I)、多态性位点数和多态性位点百分率等遗传多样性参数，并利用SPSS统计软件对相应数据进行t检验，进而对其代表性进行检验。
2结果和分析
2．1样品群遗传多样性比较分析比较各样品群的遗传多样性指数，从图1可见，不同取样策略获取的样品群，其观测等位基因数、多态性位点数和多态性比率等指数均随取样量的减少呈递减趋势(图1:A、B、C)。然而Ne、H、I等基本上是随取样量的减少先上升后下降(图1:D、E、F)，且它们的最大值一般都出现在样品数为16或13时。考虑到取样量问题，应将16份样品作为核心种质的取样量，不同取样方案所筛选的核心种质如表2所示。同时，结果也表明以Nei&Li法计算遗传距离并采用G策略取样，在样品数为16时上述3个指数均为所有取样方案的最大值(表3)。因此，将该方法获得的16份材料:果树所1号、果树所4号、马岗3号、黄都、青皮、鸡心、三棱Ⅰ、甜种、小黄仔、细粒、普宁甜种榄、铁节榄、盐埕赤榄、麒麟纳种、车酸1号、东联香榄确定为粤东橄榄种质资源的核心种质。
2．2初始种质与核心种质的比较从表4可看出,该核心种质保留了初始种质25%的样品,核心种质的多态性位点和多态性位点百分率保留率分别达到了92.93%和98.31%，而观测Na、Ne、H、I等的保留率分别为99.26%、102.56%、107.39%、106.29%。这说明该种质库最大量的保存了原有种质库的基因资源。利用SPSS统计软件对初始种质和核心种质的Ne、H、I分别作t检验，结果见表5。由t检验结果可知，上述遗传多样性指数核心种质与初始种质均未有显著性差异，因此核心种质能很好的代表初始种质。
2．3核心种质与保留种质的比较保留种质是指除去核心种质之后剩下的种质资源，可以作为核心种质的后备资源。利用PopGen32软件计算保留种质的各项遗传多样性参数并与核心种质进行比较，结果见表6和表7。可以看出，保留种质除了种质数量以及多态性位点外，Na、Ne、H、I、多态性位点数和多态性位点百分率等均小于核心种质。此外，保留种质的Ne、H、I等指数和核心种质的并没有显著差异。因此，虽然本研究中筛选出的核心种质可以有效地代表原有种质，但是依然不可忽视保留种质，当核心种质中无法获得所需性状时，可以从保留种质中筛选。
3讨论
3．1核心种质的有效性核心种质的有效性，是指核心种质代表原种质资源遗传多样性的程度或者是要选择具有代表性、异质性和多样性的样品构建核心种质。本研究中构成核心种质的16份材料中有7份来自潮州，5份来自揭阳，3份来自汕头和1份来自梅州，表明材料能较好地代表粤东地区橄榄品种资源的地域分布。同时，构成核心种质的材料按照果实用途可分为鲜食类型(马岗3号、青皮、三棱Ⅰ、甜种、麒麟纳种、车酸1号、东联香榄、普宁甜种榄)、加工类型(果树所1号、果树所4号、鸡心、细粒、铁节榄、盐埕赤榄、小黄仔)和鲜食兼加工类型(黄都)。核心种质与初始种质的有效等位基因数(Ne)、Nei's遗传多样性指数(H)、Shannon's信息指数(I)等遗传指数经t检验均差异不显著。并且，核心种质的Ne、H、I均高于初始种质和保留种质，因此该核心种质较好地保留了原有种质资源的遗传多样性。
第5篇：基因多态性的概念范文
1基因突变与健康
一个基因内部可遗传的结构的改变称为基因突变或基因变异（gene mutation）或更广的概念基因损伤（gene damage）。人类基因组中的变异有许多类型，主要有：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）重复序列的不同数目和基因结构的交替[1]，DN段范围从千碱基（kilobases，Kb）至百万碱基（megabases，Mb）规模的一类丰富的亚微观变异，DN段的缺失（delations）、嵌入（insertions）、复制（duplicaltion）和复合多位点变异（complex multisite variation）即拷贝数变异（copy number variation，CNVs ）或拷贝数多态性（copy number poly morphismsm，CNPs）等[2，3]。
基因的突变和各类基因变异将影响健康，甚至诱发相关的疾病如早衰、局部出血、老年痴呆症及癌症等，所以，基因突变和基因损伤与健康和疾病密切相关。
2氧化应激及其对基因变异和健康的影响
在人类生活过程中，紫外线、电离辐射，环境、水和食品污染，亚硝酸盐和亚硝胺，代谢产生的活性物质如活性氧（reactive oxygen species，ROS）等易引起基因突变或损伤，从而有害健康。
对紫外线、电离辐射，环境、水、食品污染以及亚硝酸盐和亚硝胺等可以从生活方式和饮食中加以避免，而代谢产生的ROS则难以避免。现代生物医学研究表明，代谢产生的ROS包括超氧自由基(Oˉ)、羟自由基（OHˉ)、脂质过氧化自由基(ROOˉ)等，过量ROS导致氧化应激（oxygen stress），是造成基因突变或损伤的重要因素之一[4]。
3个性化健康食谱
2000年提出的新的营养理论――基因营养学，从基因的分子水平选择健康食品制定食谱补充特定的营养成分，以弥补由于基因突变或损伤造成对健康的影响，有的还可能防止基因突变或损伤，提高有关基因的活性，促进健康[5]。
亚健康是国际医学界20世纪80年代后期的医学新思维，消除亚健康是世界卫生组织（WHO）的一项预防性的健康策略，也是21世纪医学与健康的热点之一。进入21世纪以来，随着基因营养学的发展，对消除亚健康有了更新的认识。
个性化健康食谱是针对易患某种疾病人群的预防或某病患者康复的个性化基因营养食谱。
对亚健康的中老年人群和防止有关基因由于氧化应激所致的突变或损伤的体弱人群，拟选择或多食用富含抗氧化活性成分的食物。蔬菜如：藕、油菜、豇豆、菠菜、花椰菜（西兰花）、番茄、胡萝卜、卷心菜等；水果如：山楂、冬枣、番石榴、猕猴桃、葡萄、草莓、青皮橘子、橙、红蕉苹果及菠萝等。此外，可以适当补充服用可强力清除活性氧自由基的健康饮食补充剂，如含原花青素（procyanidins）及白藜芦醇（resveratrol）等成分的葡萄皮及籽的提取物，番茄红素（lycopene）等。
对防止基因变异导致的老年痴呆症或痴呆症患者，可以促进脑细胞代谢的，营养食谱主要有：（1）首乌粥何首乌50 g洗净水煮煎，去渣取浓汁与洗净的大米加水煮粥；（2）蘑菇鹌鹑蛋；（3）蒸青鱼。应多食用富含大豆磷脂和叶酸的食物。研究表明：叶酸缺乏引起血浆中的高半胱氨酸水平升高导致脑内β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积，补充富含叶酸的食物如红苋菜、菠菜、芦笋、花椰菜等，可降低高半胱氨酸水平，防止老年痴呆或延缓老年痴呆的发展。同时应适当食用含有神经营养成分的猴头菇，其活性成分可以刺激神经生长因子（NGF）的合成和分泌[5]。已经证实NGF不仅是脑正常发育所必需的，也是脑的保养和功能所需，NGF有可能具有中止各种进行性痴呆症甚至逆转认知功能下降的作用[6] 。
帕金森病（Parkinsom’s disease，PD）患者的营养食谱主要有：银耳莲子汤（适用于震颤伴随低热、口干、消瘦患者）、红枣糯米粥（适用于震颤伴随便泌、肢体乏力的患者）和桂圆赤豆饮（适用于震颤兼贫血、心悸、多梦的患者）。
近年来对于PD的病因虽然已有了新的发现[7]，但目前尚无预防良策。2008年芬兰赫尔辛基国家公共卫生研究所科学家们在《神经病学》上报道了他们的一项研究成果：年龄在24~54岁的人，高胆固醇水平的人群会增加患PD的风险，患PD的可能性会增加86％。所以，补充富含降血脂降胆固醇活性成分的水果，如富含金丝桃苷的山楂、富含维生素C及果胶的草莓和红苹果，不但可预防心脑血管疾病而且可以降低患PD的风险。
胃癌患者的营养食谱主要有：陈皮肉末粥。将陈皮小枣煮粥至熟，去陈皮加入瘦肉末，煮烂即可食用，可通气，健脾，适合于腹部胀痛和呕吐症状的患者。乳腺癌患者可食用蘑菇小米粥。对于癌症预防的基因营养拟多食用富含抗氧化活性成分的蔬菜和水果。
近年来随着人们生活水平的提高和基因营养学的深入研究，个性化基因营养的健康饮食受到了越来越多人的重视。我们相信，对生命过程的不同阶段和不同个人具有特定生物效应的健康饮食的发展，将使医学保健提高到一个新的水平。
参考文献
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第6篇：基因多态性的概念范文
关键词：遗传标记 遗传学实验 SSR 枣树 分子遗传
Application and practice of SSR marker in the teaching of genetics experiment
Pang Xiaoming， Li Yingyue
Beijing forestry university， Beijing， 100083， China
Abstract： The well-designed experiment is a successful case of making full use of scientific research achievements in the teaching of genetic experiment， which includes the experiment of DNA fingerprinting construction and paternity analysis of the seedlings. Through the experiment， the students will have the experience of PCR technology， DNA isolation and the separation of DNA by different methods. Furthermore， the involvement in the experiment will help to strengthen several important concepts in the genetics including gene locus/allele， heterozygosity/homozygosity， diploid/triploid， the Mendelian inheritance laws and DNA fingerprinting etc. Taken together， the experiment will be important to invoke the interest to learn the course for the students.
Key words： genetic marker； genetic experiment； SSR； jujube； molecular genetics
“DNA指纹”是指可以利用DNA差异来进行与传统指纹相似的个体身份识别。DNA指纹是以DNA的多态性为基础。SSR（Simple sequence repeat，简单重复序列），又称微卫星DNA，一般是由2～6个核苷酸碱基组成的基序并串联而成的DNA序列，在真核生物基因组中广泛存在。SSR标记具有多态性高、实验操作简单、稳定性好、可重复性高、对DNA模板质量和数量要求均较低的共显性标记，现广泛应用于亲本分析、遗传多样性研究、指纹图谱和遗传图谱构建等方面，是一种目前发展较为成熟的分子标记技术[1]。
在植物的遗传及育种试验和实践中（如实生选种中），获得的子代苗母本来源是确切知道的，但经常缺乏父本信息。利用共显性分子标记技术结合统计分析方法可以帮助我们寻找可能的父本来源。父本分析（Paternity analysis）对了解群体间或世代间的基因流动及性别选择适合度有重要的理论意义[2]。SSR的高分辨力及其共显性遗传特点使其成为杂交种亲本鉴定使用最多的标记。
常用的父本分析方法包括排除分析法、最大似然性分析法和父性拆分法等，在植物群体中利用亲本排除法进行父本分析的例子较多[2]。排除分析法根据孟德尔遗传规律检测母本与可疑父本基因型组合能否产生子代基因型，否则排除相应可疑父本。另外，也可以利用软件Cervus 3.0进行分析。Cervus 3.0是一款使用共显性标记的软件，是Marshall于1998年开发的，这款软件可以鉴定单亲本未知或双亲本未知的情况，基于最大似然法进行亲本分析，通过等位基因频率来计算各个非排除父本作为亲生父本的概率，进而确定最大可能的父本。用LOD值来进行结果分析。由于便于操作，是目前最普遍应用的亲本分析软件[3]。
该实验是体现遗传学原理和技术在生产和生活中应用的例子，可达到巩固和学习如下重要知识点的目的：（1）通过提取枣树DNA，熟悉植物DNA的提取步骤；（2）巩固分离定律和自由组合定律的学习；（3）巩固PCR技术原理；（4）通过SSR标记的检测，掌握SSR标记的原理、检测技术和应用；（5）通过二倍体和多倍体基因型差异，巩固复等位基因和基因座等概念；（6）学习利用SSR标记进行亲子鉴定的原理和技术。学生通过实验了解到遗传学技术和理论知识可解决生产生活中的具体问题，可有效调动学生学习遗传学知识和技术的兴趣和热情，有助于消除科学研究高不可攀的心理，激发学生对基本实验和科学研究的兴趣，增强学生分析问题和解决问题的能力。
1 实验材料及试剂
1.1 实验材料
冬枣、映山红、赞皇大枣（3n）、梨枣、柿饼枣和辣椒枣及6个不同的杂交后代基因型（已知母本为冬枣，假定父本未知）共12个基因型的植物材料。
1.2 实验试剂
PCR MIX（北京博迈德科技发展有限公司），6～8对SSR引物，琼脂糖，DNA分子量标准，ddH2O，溴酚蓝加样缓冲液，5×TBE浓贮液〔称取27.5 g硼酸与54 g Tris碱，称量20 ml EDTA（0.5 mol/L），加入蒸馏水定容至1 000 mL，待溶解后室温保存待用〕，使用时稀释为0.5×TBE，Goldviewer II（染液）等。
2 实验方法
2.1 实验仪器
微量移液器，小型离心机，恒温水浴锅，PCR仪，电泳仪，紫外透射仪，照相机或（国产凝胶成像系统），枪头和离心管（使用前高温灭菌）。
2.2 实验步骤
（1）DNA提取：从我校实验苗圃采集各植物材料叶片，对各样品进行准确编号记录，应用CTAB法或试剂盒法提取总DNA。
（2）DNA质量检测：取5μL DNA样品混合1μL 6×Loading Buffer，用0.5×TBE液配制0.8%琼脂糖凝胶对总DNA进行电泳质量检测；取3 μLDNA样品液，在超微量紫外分光光度计上测量其DNA含量（μg/mL）、A260 nm/A280 nm的值及其在260 nm处的吸收峰，检测DNA的纯度，对DNA进行稀释，直至工作浓度10 ng/μL。
（3）SSR-PCR扩增：应用6对SSR引物（见表1）进行PCR反应[4]，引物由北京金唯智生物公司合成。荧光引物为M13（-21）-ROX：TGTAAA ACGACGGCCAGT。
表1 SSR引物信息表
20.0 μL PCR反应体系包括：2×PCR MIX（10 μL）、DNA模板（1.0 μL），1?M上游引物（1.0 ul），1?M下游引物（1.0 μL）和ddH2O（7.0 μL）。如果采用毛细管测序电泳检测，则体系中加入1 ?M的M13引物3.2 μL。按上述体系混合好后，PCR程序设置如下：94℃ 5min；94℃ 30s-55℃（相应退火温度）30s-72℃ 45s，30个循环；94℃ 30s-53℃ 30s-72℃ 30s，8个循环；72℃ 10min；4℃ forever。
（4）扩增产物检测：扩增结果按照公司提供的手册进行ABI Prism 3730XL型测序仪测序检测，所得数据利用GeneMarker V1.75软件进行读取。或者采用4%琼脂糖凝胶电泳进行检测：用1×TBE液配制70 mL+3.5 μL Goldviewer II；每管加入5 μL溴酚蓝上样缓冲液，瞬时离心取10 μL扩增产物上样；稳压100V，电泳1～1.5 h；UVP凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。
2.3 分析结果
图示各品种的基因型，计算相关指标或采用软件分析确定子代的未知父本；当用于检验的位点间非连锁遗传时，每一个位点可以计算出一个父权指数PI（paternity index）值（疑似父亲获得父权的可能性与失去父权可能性的比值，也称为非父排除率），多位点的累积PI值（CPI）等于各位点PI值的乘积，计算公式为：CPI=PI1×PI2×PI3×…×PIn（1，2，3…n代表第1，2，3…n个位点的PI值）。由PI值得到的相对亲权概率RCP=[CPI/（CPI+1）]×100%≥99.73%时，可认为疑似亲本得到父权，RCP
3 实验结果
微卫星位点BFU0277的基因分型峰图如图1所示。分型结果理想，可以较为准确地判断等位基因大小。由图1可知赞皇大枣含三等位基因，验证的基三倍体的特点，其余样品为二倍体。二倍体样品中除梨枣是纯合体以外，其他样品为杂合体。对除赞皇大枣以外的其他个体共分析了8对SSR引物，每个个体的基因型见表2。从表2可以看出，11个个体在这8个基因座的基因型是不一样的，这也构成了区分这11个样品的SSR指纹图谱。
图1 12个样品在BFU0277号引物中的毛细管电泳检测图
表2 11个样品在8个基因座的SSR基因型
子代1～5的母本为冬枣，通过排除分析法，子代1～4不可能以柿饼枣、辣椒枣或梨枣为父本，因为SSR等位基因遗传违反孟德尔遗传规律，子代出现与这几个疑似亲本完全不同的等位基因位点，排除它们之间有亲缘关系。而映山红不能排除为父本。按照方法中所述公式计算CPI和RCP，结果见表3，可推测映山红为子代1～4的父本。对于子代5，所有的可能父本都被排除，因此在供选材料中没有子代5的父本。而子代6为双亲都未知的个体，通过排除法发现，供选亲本中没有合适的样本可能为其父母本。
表3 4个子代的父本分析指标
由Cervus 3.0软件分析发现，子代1～4的父本为映山红的LOD值见表3，4个LOD值都大于零，与RCP计算结果相一致。对于子代5，所有的可能父本的LOD值都为负值；对于子代6，各种父母本组合的LOD值均为负值。因此，与排除法所得的结果相一致，疑似亲本中没有这两个个体的父（母）本。
4 结束语
本实验为基于课题组最新的科学研究成果设计成的学生容易操作的实验内容，把与实践挂钩的亲子鉴定内容设计到实验中，可以增加学生的学习兴趣[6]。根据实验结果我们看到，本实验涉及基因位点/等位基因、纯合体/杂合体、二倍体/三倍体、孟德尔遗传规律和DNA指纹图谱等多个（对）重要的遗传学概念，使学生能形象地掌握相关概念。
根据学生专业和课时长短的不同，教师可以对实验内容有选择地进行。生物科学和技术类专业课时较长，可以选择用常规的CTAB方法进行DNA提取；而农业和林业等应用性专业学时相对较短，可采用试剂盒进行DNA提取，以节省时间。如果时间和实验经费允许，SSR的产物检测可采用毛细管电泳的方法。而凝胶电泳的方法相对便宜，时间短，而且可以更好地锻炼学生的动手操作能力，有利于学生在实验过程中自信心的培养。
参考文献
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第7篇：基因多态性的概念范文
【摘要】
介绍了数据挖掘的意义和任务，综述了近几年来数据挖掘在中医各领域中的应用，分析了目前存在的问题，并探讨了今后的发展趋势。
【关键词】 数据挖掘 中医
随着计算机技术和网络技术的快速发展，在中医药的现代化过程中建立了很多的数据库。堆积在数据库中的信息呈超指数爆炸式增长。例如中医药科技信息数据库就有50个子数据库、110个表单及数百个自动生成的中间表、800余个著录项目，涵盖所有中医药有关医、药及学术的内容。而数据挖掘技术的发展使我们有可能从这些海量数据中发现新的知识，发现数据背后隐藏的关系和规则，还可以对未知的情况进行预测。多学科交叉目前正成为增强科技创新的重要途径，数据挖掘正是从统计学、数据库、机器学习等多门学科中发展起来的。
1 数据挖掘介绍
1.1 数据挖掘的定义
数据挖掘(datamining)也称为数据库知识发现，为解决上述矛盾提供了强有力的工具［1］。数据挖掘这一术语出现于1989年，其定义几经变动，本研究中引用Frayyad UM等提出的对数据挖掘的定义［2］。
数据挖掘是从数据库中识别出有效的、新颖的、潜在有用的并且最终可理解的模式的非平凡过程。其中：
① 有效性要求挖掘前要对被挖掘的数据进行仔细检查，具备该特性，才能保证挖掘出来信息的可靠性。
② 新颖性要求发现的模式应该是从前未知的，甚至是违背直觉的信息或知识，挖掘出的信息越是出乎意料，就可能越有价值。
③ 潜在有用性是指发现的知识将来有实际效用，即这些信息或知识对于所讨论的业务或研究领域是有效的、是有实用价值和可实现的，常识性的结论或已被人们掌握的事实或无法实现的推测都是没有意义的。
④ 最终可理解性要求发现的模式能被用户理解，目前它主要是体现在简洁性上。发现的知识要可接受、可理解、可运用，最好能用自然语言表达所发现的结果。实际上，所有发现的知识都是相对的，是有特定前提和约束条件，面向特定领域的。
⑤ 非平凡是一个数学概念，即数据挖掘既不是把数据全部抽取，也不是一点儿也不抽取，而是抽取出隐含的、未知的、可能的有用的信息。要有一定程度的智能性、自动性(仅仅给出所有数据的总和不能算作是一个发现过程)。
数据挖掘的结果通常表示为概念(concepts)、规则(rules)、规律(regularities)、模式(pattern)、约束(constraint)、可视化(visualization)等形式。这些知识可以直接提供给决策者，用于辅助决策过程；或者提供给领域专家，修正专家的已有的知识体系；也可以作为新的知识转存到应用系统中，作为实际事务处理中决策的依据［3］。
2 数据挖掘的任务
数据挖掘的任务主要是预测和描述。预测是指用一些变量或数据库的若干已知字段预测其他感兴趣的变量或字段的未知的或未来的值。描述是指找到描述数据的可理解模式。预测方法有统计分析、关联规则和决策树预测、回归树预测等。其中关联规则反映了一个事务与其他事务之间存在关联，那么就能根据其他已知事务预测到另一个事务。描述性方法主要有数据分类、回归分析、聚类、变化和偏差分析、模式发现等。
3 数据挖掘在中医药中的应用
中医药的发展也需要多门学科的交叉应用。数据挖掘最初在生物医学中的应用是在对基因组测序数据的分析，因为人类基因组计划研究中产生了数十亿的核苷酸和上百万的氨基酸，传统的统计方法无能为力。中医学具有系统性、整体性、复杂性、不确定性等特点，不适宜运用传统的还原论的方法研究，而适宜与数据挖掘类似的从整体观上入手的研究方法。数据挖掘可以从海量数据中挖掘出潜在的规律，数据挖掘的结果一部分可能与传统的诊疗规律相符，不符合的部分可能是潜在的新知，也可能是没有意义的，这都需要在相应目标领域专家的指导下进行解释和评价。将数据挖掘(DM)和知识发现(DMKD)应用于中医药领域的研究，是中医药现代化研究的重要组成部分［1］，必将促进中医药的发展。而数据挖掘在中药药谱研究和新药开发中取得了一定进展，本研究主要对其在中医以下领域的研究作一介绍。
3.1 证实质的研究
中医的“证”又称“证候”，是疾病在某一阶段病变的本质反映，是由一组能反映疾病本质的症状组成的，能揭示病因、病位、病性、病势，为论治提供依据。证候是中医诊断的核心概念和理论精髓，具有整体性、抽象性、时间性和相对稳定性的特点。现在对证实质的研究多从西医的生理理化指标来揭示证的实质，但实践中却发现缺少证的特异性指标。如果从分子生物学的角度，利用数据挖掘技术对中医证与相关基因的对应关系，可能取得更好的结果。通过研究“证”和基因多态性之间的内在联系，从基因多态性所带来的该基因功能上的变化，由此探寻“证”的相关基因表达谱。
3.2 中医诊断
中医诊断过程主要是对证的判定。而现在证的标准不太规范，缺乏定量的标准，而且其分类与描述也存在不同的观点。数据挖掘则可能完成证的规范化研究，也可辅助临床医生对病人进行证的判定。
陈明等［5］尝试运用关联规则发现诊断模式，他把《伤寒论》中的病名、症状、舌脉分别作为数据表建立数据库，挖掘得出规则：发热、恶寒、脉浮太阳病(支持度65%，置信度5%），可以认为发热，恶寒的确是太阳病的诊断依据。
秦中广等［6］运用粗糙集进行中医类风湿证候的诊断，共收集了224个病例，每个病例有81个属性，并从这224个病例中随机抽取学习样本180例，进行预测诊断44例。他们利用属性约简得到寒湿阻络、湿热阻络、痰阏阻络、气阴两虚、寒热错杂5种证的必定规则和可能规则。在44例预测诊断中诊断正确率达到90%以上，高于传统的模糊数学方法，并认为粗糙集有可能是中医诊断研究的动态理想工具。
刘晋平［7］运用数据挖掘的手段对中医脉象进行研究，并开发出初步的软件。以明清、近现代3000余例病案为研究分析对象，将病案分为病名、证型、脉象、舌象及症状几项，然后进行统一化及规范化处理，得出医案中细脉出现频率最高，占34.39%。其脉象软件可以进行脉象与病名，脉象与证型之间的相互关联分析，发现其内在的规律。
4 方剂配伍规律的研究
方剂配伍理论是中药方剂理论的核心，也是研究方剂的关键问题。采用数据挖掘技术进行基于中医药理论的方剂配伍规律研究，既能为中医新药的临床和实验研究提供目标和思路，减少盲目性，缩短研究周期；同时又为大量古今验方研究探索出一条有价值的研究途径和方法［8］。
何前锋等［9］运用高频集挖掘的方法，对中国方剂数据库、中药新药品种数据库、中药成方制剂标准数据库中各方剂药物组成数据进行了分析，分别得到3个库的前20味高频药，可以看出古今用药频率的变化。并把高频用药组合与经验药对进行比较分析，提示可能成为新药对的组合。
姚美村等［10］应用关联规则分析技术，以文献中收录的106个治疗消渴病的中药复方为对象，经解析后建立复方特征数据库，以数据挖掘系统Enterprise Miner为平台，关联规则分析为工具，在单味药层次上进行消渴病复方组成药味之间的关联模式研究。得到了药物与上中下三消的关联以及药物之间的关联，与中医专家对于消渴病的治疗在主要药物的配伍方面基本一致，这在一定程度上反映出历代中医在消渴病治疗方面认识和治疗的整体规律性。
陈波等［11］应用关联规则对李东垣的脾胃方从药物间关联、症状间关联、处方结构与症状关联进行分析，得出当出现当归、黄芪、升麻时，同时出现柴胡的次数为60次，支持度为10.91%，可信度为84.51%；当出现当归、黄芪、柴胡时，同时出现升麻的次数为60次，支持度为10.91%，可信度为84.51%。两者的支持度和可信度都较高，提示他们常共同使用。此反映出李东垣补气与升阳同用的学术思想，此药组也是补中益气汤的基本组成部分。
现在的研究中存在着方法比较简单，频繁模式、关联规则为其主要方法。方剂配伍不仅是各药味之间的组合，还包含着各药剂量比例的搭配，这也是临床组方的关键，但现在对其进行数据挖掘的研究还很少。
数据挖掘的方法不仅可以运用于中医基础理论中的伤寒、温病等研究，也可用于临床各科的研究。但高质量的数据挖掘不仅需要有被处理数据的质量，更要在中医药专业背景知识引导下，针对具体问题，选择合适的数据挖掘方法，利用各种工具的效能和应用的可能性，取长补短。
对中医药知识进行规范化、数字化、信息化是促进中医药国际化和现代化进程的重要内容［12］。通过数据挖掘，就可以对中医药发展过程中某些缺失的信息进行预测完善并可以避免主观性的干扰。数据挖掘还可以发现一些新的模式和规则，为中医药知识的创新和发展提供一条新途径。
参考文献
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11 陈波，蒋永光，胡波，等.东垣脾胃方配伍规律之关联分析评述.中医药学刊，2004，22(4)：611～612.
第8篇：基因多态性的概念范文
受体学的发展已近一个世纪的历史，历经四个发展阶段：第一阶段为受体概念的提出。1878年，Langley提出“接受物质(receptivesubstance)”及1900年Ehrlich提出“受体(receptor)”一词为代表，当时提出的受体的两个基本特征：结合、结合后引起生物效应，仍为我们现在延用的标准。第二阶段为药理学研究阶段。其代表为1937年Clark的工作。第三阶段为放射配体结合研究阶段。1962年Jensen和Jacobson首先用高放射比度的氚标雌二醇(3H-E2)证实大鼠子宫、阴道存在雌激素受体(ER)，该阶段最大贡献是可以将受体作为实体进行研究，这是受体的生化和临床研究的里程碑。目前该方法仍是我们研究受体的基本方法。第四阶段为分子生物学研究阶段。从N-乙酰胆碱受体的α-亚单位的核苷酸顺序推出该受体的α-亚单位的一级结构的氨基酸顺序，这一成果标志着受体研究进入分子生物学研究阶段。此后受体研究就有了突飞猛进的发展，已阐明数十种受体的一级结构和功能关系。在信号转导方面也取得重大进展。目前受体分子的三维结构的研究也已开始取得可喜的进展。
随着受体学的基础研究的深入，临床受体学的研究也不断深入，已发现了多种激素受体病，从而解释了为何该激素水平正常或升高，仍产生该激素缺乏的临床表现。如女性化综合征，睾酮水平正常，但雄性器官不发育，呈女性外表。研究结果发现由于雄激素受体(AR)基因突变，导致AR结构异常及功能丧失。国内有作者报告7例，其中2例基因突变点为国际上首先报告。关于激素及药物敏感性问题也是人们关心的问题，激素、药物敏感性及时辰差异也与受体改变有关。我们的研究发现糖皮质激素受体(GR)存在昼夜节律，峰值在6:00～8:00之间，谷值在0:00。合理解释了为何晨起一次服用糖皮质激素类药物疗效比分次服用更好。国外有报告褪黑素(M)傍晚应用对免疫系统有兴奋作用，晨起同样剂量则无此作用。有人发现褪黑素受体(MR)晚20:00明显高于晨8:00，由于MR昼夜节律导致机体对M反应性的时辰差异。Lipman报告用糖皮质激素治疗淋巴细胞性白血病，其疗效与GR有关，GR高糖皮质激素疗效佳；开始有效，后来无效，研究结果发现这时GR降低，停药待GR恢复后，又出现疗效，提示检测GR，可预测糖皮质激素疗效。相信随着受体学研究的深入及扩大，有越来越多的激素抵抗及敏感性改变的机制将被阐明。
受体与肿瘤关系的研究，也是受体学研究的一个热门课题。癌基因通过其编码的癌蛋白导致肿瘤的发生。癌蛋白可以是生长因子，也可是受体，目前已发现数种癌基因产物与受体有同源性。如细胞癌基因c-erb-A是编码甲状腺激素受体的基因。受体分子结构异常，如V-erb-B是c-erb-B〔原癌基因，为表皮生长因子受体(EGFR)〕的同源物，基因产物为一个去头去尾的EGFR(相当于EGFR557-1158肽链、含跨膜域及包括酪氨酚蛋白激酶(PTK)活性在内的细胞内区段，但缺少膜外的配体结合域及C端的自身磷酸化区段，这种转变使EGFR转变为组成性激活状态，导致红细胞增多症及肉瘤。在肿瘤组织中可使原有受体消失，可以发现一个新受体，这些变化的意义有待进一步研究。现发现某些肿瘤的发生、发展受某些内分泌激素调控，这种肿瘤称为内分泌激素依赖性肿瘤。从而应运而生的是继手术、化疗、放疗、生物制剂后出现的第五大治疗—内分泌治疗。据报告在欧美，有50%的女性癌和20%的男性癌，具有不同程度的激素依赖性，其中乳腺癌是最常见的激素依赖性肿瘤。可以应用雌激素拮抗剂治疗乳腺癌，用孕酮治疗子宫体癌及肾癌，糖皮质激素治疗淋巴细胞白血病及淋巴瘤。但该类激素疗效与其受体的结合量有关。随着研究深入，将发现越来越多的激素依赖性肿瘤，可通过内分泌治疗来提高这类肿瘤患者的存活率。
随着研究深入，人们发现大多数传染病发生的起始环节是病原体(包括细胞、病毒和原虫等)和宿主细胞的粘附。这种粘附首先依赖于相互识别和结合，因此这种结合有一定的特异性。病原体上识别宿主细胞的组分称为配体或粘附素。宿主细胞识别病原体的成分成为病原体受体。
由于病原体受体的研究，有助于认识为何同样接触一种病原体，在同样环境下，有人生病有人不生病，也就是说含有该病病原体受体才能生病。在研究病原体配体和病原体受体同时，人们又设计防治感染性疾病的措施。如病原体粘附及定位于宿主细胞是第一步，失去粘附能力则失去致病性，应用粘附素抗体或受体类似物阻断粘附素与受体的结合；也可采取相应措施使病原体粘附素分解，使病原体失去致病力，从而达到防治疾病的目的。
随着受体研究的深入，人们把目光又集中到受体后信号转导的过程。受体后信号转导异常与多种疾病有关。如肿瘤、糖尿病等。信号转导异常可以是遗传性的、自身免疫或继发性的。其中信息转导蛋白的基因突变与疾病关系是目前研究的热点之一。体细胞的基因突变可发生肿瘤。基因突变分为失活性突变和组成性激活突变，前者导致信号转导蛋白功能的减弱或消失，而后者导致信号转导蛋白持续激活。
由于信号转导通路中某一信号转导蛋白的缺失、减少或结构异常，可使该信号转导过程减弱，若无其它通路替代，就会使靶细胞对该信号不敏感，导致对配体(激素)的抵抗综合征，如胰岛素抵抗性糖尿病。某种信号转导蛋白的过度表达，或基因突变使其成为异常或持续激活状态，就可使细胞内信号转导失控，造成该信号的功能亢进性疾病。
第9篇：基因多态性的概念范文
关键词生物芯片技术;临床应用
AbstractThe chip biotechnology is the microanalysis and automation analytic method and has high flux level and quick parallelism year by years.It has become an important means of life and a tool to study disease at present.The paper was written to review the use of the technology for diagnosis of diseases.
Key wordsThe chip biotechnology;clinical
生物芯片(Biochip)SL称微阵列(Microarray)技术,是近年来生命科学与微电子学等学科相互交叉发展起来的一门高新技术,是随着人类基因组计划(HGP)的研究发展应运而生。90年代初,Fodor等发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法,并在此基础上于1993年设计了一种寡核苷酸生物芯片;1996年世界上第一块商品化的生物芯片问世。仅十余年,生物芯片技术在临床病原菌、毒力基因、抗药性基因、致病因子的快速检测等方面已取得了突破性进展,除此之外,该技术还应用于新药开发,食品与环境监督等众多领域而且提供了强有力的技术支持。生物芯片技术已日益成熟和完善,显示出诱人的应用前景。
1生物芯片技术的概述
1.1生物芯片技术原理
生物芯片技术的基本原理是分子杂交。类似于Southern和Northern印迹杂交技术。具体来讲,就是通过微加工工艺将大量生物识别分子,如核酸片段、多肽分子、甚至组织切片、细胞等[1-4]按照预先设置的排列方式 固定在厘米见方的芯片片基(基质或载体)上,利用生物分子之间特异性亲和反应,实现对基因、配体、抗原等生物活性物质的检测分析。
1.2根据探针分子种类划分
基因芯片(又称DNA芯片,DNA阵列,DNA微阵列,寡核苷酸阵列等) 探针分子为单链基因级DNA或mRNA反转录的cDNA,这种探针分子一般为某种病原体或组织所特有的。其具有稳定、点密度较高、探针分子对疾病的针对性强等特点[5-7]。
寡聚核苷酸芯片探针分子为寡聚核苷酸,主要用于病原体的分类、基因的突变检测。
肽、蛋白芯片 探针分子为多肽或蛋白包括酶、抗体、受体等。该方法不仅适用于抗原、抗体的筛选,同样也适用于受体配体的相互作用的研究。但其稳定性、重复性问题较突出[8-9]。
1.3根据支持介质划分
传统杂交分析技术以硝酸纤维素膜或尼龙膜为载体,杂交反应后经放射性自显影、生物素或地高新等方法进行检测。由于硝酸纤维素膜或尼龙膜等材料有渗透作用,易使被分析的材料扩散,因此生物芯片分析利用固相表面作为载体。固相表面无渗透渗透作用,少量的生化物质可准确地沉淀特定位置上;同时固相片基能够提供一个均匀的接触面,可以提高定量分析的质量。制作生物芯片的载体材料很多,大致可分为4类:无机材料、天然有机聚合物、人工合成的有机高分子聚合物和各种高分子聚合物制成的膜。目前,适用于制作生物芯片的载体材料只有少数几种,如:玻璃片、金属片、各种有机高分子制作的薄膜等。生物芯片按载体可分为:硅晶片芯片、玻璃芯片、塑料芯片和磁珠芯片等[10]。
1.4根据制备方法划分芯片制备的方法有“原位合成”和“合成点样”两种方法
原位合成指直接在芯片上用4种核苷酸合成所需探针的基因芯片制备技术,主要包括:原位光刻合成、原位喷印合成、分子印章多次压印合成。合成点样是指将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片片基上。主要包括:微型机械点样法、化学喷射法[11]。
2生物芯片技术在临床疾病诊断中的应用
2.1生物芯片技术在病原体检测中的应用
生物芯片在病毒检测中应用较为广泛。目前,全球每年艾滋病感染者急剧增加,80%集中在发展中国家。生物芯片在HIV检测及相关研究中发挥了一定的作用。1996年底Kozal等研制了一种DNA芯片,对HIV-1逆转录酶及蛋白酶基因突变进行筛查,他们提取了102个病人HIV-1的RNA,利用高密度寡核苷酸阵列进行测序,发现了167种序列。其后,Mfymetrix公司和Roche Molecular公司合作生产的新一代诊断试剂盒,利用RMS实验室的PCR扩增技术和DNA芯片技术结合检测艾滋病病人的HIV耐药反应。HIVPRT440也已广泛用于HIV-1病毒的测序、分型及多态性分析[12]。
生物芯片技术也能对所有肝炎病毒的分型、变异、突变和病毒核酸含量进行高通量、平行检测。该方法不仅简便易行,而且实验成本大为降低,为临床的准确诊断、合理用药、判定预后提供确实可靠的实验数据[13]。如对抗-HCV IgG进行c区,NS3、NS4、NS5不同区域检测和甲～庚型肝炎病毒的检测。Zhu等利用DNA芯片对人巨细胞病毒(HCMV)感染宿主引起的细胞基因表达改变进行了全面分析[14]。对约6600个人mRNA的表达进行监测,结果感染前后258种mRNA水平改变4倍以上,其中一些mRNA编码的基因产物在病毒致病性中起关键作用,值得进一步研究。生物芯片同样用于细菌检测中。1998年底,Troesch等[15]开始研制一种DNA芯片,针对分枝杆菌属感染的病人进行检测,部分病人对利福平产生耐药,设计研制此种DNA芯片可对耐药机制有进一步了解。De Saizieu等[16]用64OO0个寡核苷酸阵列来检测100个肺炎双球菌的基因,其敏感性比Northern印迹要好一些。他们测量了肺炎球菌在指数生长和静止期的基因表达差异。例如在静止期,多糖荚膜合成、长链脂肪酸合成、细胞分裂相关的酶的表达水平极低,这些与预期结果一致。
2.2在癌症方面的应用研究
由于肿瘤是对人类健康威胁最大的疾病之一,而且目前尚无有效的治疗方法,所以很多学者期望能够对肿瘤进行快速鉴定和分类,从而为早期诊断和治疗创造条件。生物芯片目前是一种广泛用于检测癌症的强大工具,并且可以基于共同的分子特征和临床表现有效区分癌症的亚型。斯坦福大学的Uma[17]是第一个使用DNA芯片研究包括癌症在内的多种疾病基因表达特征的人。乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤,全世界每年约有120万妇女发生乳腺癌,它对病人的健康和生命造成严重的威胁。维生素D受体(VitamiD Receptor,VDR)是维生素D通路上的重要调节因素,与乳腺癌发病有密切关系。Trabert[18]通过对人群进行病例一对照研究,进而发现VDR基因3'端的多态性(特别是BsmI和Poly A)和乳腺癌危险因素之间的关系,去除混杂因素后,结果表明,高加索人群中,绝经后女性的BsmI基因的bb基因型是乳腺癌发病的显著性危险因素(OR=1.53)。
急性淋巴性白血病是以母细胞失调和分化为特征的快速进展型白血病。Notch基因家族成员Notch在T细胞急性淋巴性白血病(T-cell acutelymphoblastic leukemia,T-ALL)发生中扮演着重要的角色,大约50%～60% 的T-ALL病人中都存在该基因的突变,使其成为T-ALL中最常见的活化癌基因[19]。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantarget of rapamycin,mTOR)的通路异常与遗传病、肿瘤等有关。在T-ALL细胞中,Notch可以调节mTOR通路的活性[20]。Steven[19]通过蛋白芯片技术研究13种人类T细胞白血病细胞株中,82种信号蛋白中的108抗原决定簇蛋白的磷酸化状态,结果表明,如果用小分子抑制剂同时阻断mTOR和Notch的通路可以协同抑制T-ALL的发展。
这种药物联合作用可能成为治疗“基于Notch肿瘤”的一种新型治疗方法。对于恶性肿瘤的早期发现、早期诊断和早期治疗是肿瘤患者获得长期生存的主要途径。肿瘤标志物的检测对于肿瘤的早期诊断,以及亚健康人群普查有很大价值。王江涛[21]采用蛋白芯片进行多种肿瘤标志物的检测,可同时检测肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌等12种常见肿瘤标志物。结果表明,通过蛋白芯片的检测结果与临床诊断基本吻合,从而充分说明多肿瘤标志物蛋白芯片在肿瘤的临床诊断中有较好的应用价值。
2.3 对自身免疫性疾病的应用研究
自身免疫性疾病是指由机体自身产生的抗体或致敏淋巴细胞破坏、损伤自身的组织和细胞成分,导致组织损害和器官功能障碍的原发性免疫性疾病。很多自身免疫性疾病以检测到特异性抗体为诊断依据,例如:系统性红斑狼疮中的抗双链DNA抗体和抗Smith抗体;多结缔组织疾病中的抗U1-snRNP抗体;Graves病中的抗甲状腺刺激激素受体抗体等。采用蛋白芯片可以在一张芯片上同时检测上百种自身抗体,对于初筛自身免疫性疾病具有很大价值[22]。
自身抗体的检测不仅可以提供诊断信息,还可以提示预后信息。例如系统性红斑狼疮中的抗双链DNA抗体和活动性肾炎有关;抗R0抗体和皮肤狼疮、光敏性皮炎及新生儿狼疮综合征等有关。临床医生可以根据这些信息预测病人的预后。Robinson实验室目前开发出了多种疾病特异性抗原蛋白芯片,其中包括多结缔组织疾病检测芯片(含来自多种风湿病人的200多种自身抗原);滑膜蛋白检测芯片,其中包括650种以上的自身抗原;髓磷脂蛋白检测芯片,其中包括500种以上的髓磷脂蛋白等[23]。
多发性硬化症是一种慢性神经脱髓鞘性疾病,最终会导致神经轴突的损伤。可以识别髓磷脂抗原的免疫细胞和抗体(例如伽玛干扰素、IL-17等)与发病有关。尚无公认的治疗方法,目前治疗的重点在于抑制或者耐受患者的抗原特异性自身免疫反应,可以通过编码一种或多种髓磷脂抗原的质粒DNA疫苗达到上述目的。Bar[24]研制了一种可以编码人类髓磷脂基础蛋白全长的,名为BHT-300的DNA疫苗,治疗了复发性和继发进行性多发性硬化症的3O个病人。结果表明,BHT-3009安全、药物反应易于被患者接受,并且可以有效改善患者的脑部核磁共振扫描结果。
2.4对遗传疾病的应用研究
老年黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是一种可遗传的视网膜退化病变,患者的黄斑点退化导致中央视觉受损,已成为老年人重要的致盲性眼病之一[25]。Haines[26]通过基因芯片技术,对2个独立的数据集(162个核心家庭关联数据集和399例病人、159例对照组成的病例一对照数据集)发现基因LRP6、基因VEGF和基因VLD.LR是产生AMD的危险因素。Leber遗传性视神经病变(Leber S hereditary opticneuropathy,LHON)是第一个被鉴定出与线粒体DNA点突变有关的母系遗传性致盲性视神经疾病。临床上以两侧连续急性或亚急性中央视力衰退为特征,主要累及男性青少年[27]。Danielson[28]通过基因芯片技术研究了LHON线粒体的基因表达变化,结果表明,醛糖还原酶在LHON的转线粒体细胞中具有较高的表达水平。醛糖还原酶的产物之一是山梨醇,此物质与视神经病变有关,而且在LHON转线粒体细胞中,山梨醇的水平较高。因此,初步推断醛糖还原酶抑制剂对LHON有一定治疗作用。
3结束语
生物芯片技术诞生至今已有十几年的历史了,其发展具有三个主要特点:①生物芯片的品种繁多,目前用于检测生物组分的技术如杂交、电泳、质普分析、荧光染色等,均被用于生物芯片技术的开发和应用,使得生物芯片技术呈现百花齐放,百家争鸣的格局;②生物芯片的发展方向是微缩芯片实验室,尽管生物芯片的种类繁多,各有优点。但各种芯片的最终发展目标是将样品制备和检测微缩成一体,即微缩芯片实验室;③生物芯片技术由实验研究走向临床应用,AtheNA Multi-Lyre芯片通过FDA 认证是生物芯片从实验室进入临床应用的标志。随着新材料、新技术的不断开发,生物芯片技术将得到进一步的完善和发展。相信不久的将来,包含所有步骤的缩微芯片实验室将不断涌现。
尽管生物芯片技术从产生到现在已显示出巨大的优势,发挥了一定潜力。但其技术仍有一些亟待解决的问题,如:① 提高生物芯片的特异性;② 简化样本制备和标记操作;③ 增加信号检测的灵敏度;④高度集成化样本制备、基因扩增、核酸标记及检测仪器的研制和开发等。但它的出现必将在人类疾病的诊断中发挥巨大的作用。可以预测,生物芯片技术带来了检测分析领域的一场革命。
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