公务员期刊网 精选范文 表观遗传学的定义范文

表观遗传学的定义精选(九篇)

前言:一篇好文章的诞生,需要你不断地搜集资料、整理思路,本站小编为你收集了丰富的表观遗传学的定义主题范文,仅供参考,欢迎阅读并收藏。

表观遗传学的定义

第1篇:表观遗传学的定义范文

【关键词】同性恋;基因;表观遗传

【Abstract】The reasons of homosexuality are complex. With the development of science and technology, the reasons of homosexuality are increasingly clearly understood, which mainly involve in physiological factors and social psychological factors. This paper reviews the reasons of homosexuality, like genetic factor, biological factor, endocrine factor, Social psychological factors, as well as the recent research achievement of epigenetic factors.

【Key words】Homosexuality; Genetic; Epigenetic

【中图分类号】C913.14【文献标志码】A

自同性恋产生以来人们就没有停止对其成因的探究,随着科学技术的快速发展,生物医学和分子流行病学的不断进步,以及生理学和心理学的发展都对探究工作提供了更多的理论依据,人们对同性恋有了更清晰的认识。男男者已成为我国艾滋病流行的三大高危人群之一,同时也是性病的高危人群。其形成原因是十分复杂的,涉及生物、遗传、心理、社会文化等多重因素。本文就针对男性同性恋成因的研究进行综述。

同性恋又称同,是人际间性取向的一种。性取向指个体或群体的持续地指向何方。同性恋现象自古就有, 并一直存在, 在任何历史时期,任何文化背景下,不管社会主流支持还是反对,它都在人类社会中保持相当的比例。同性恋 ( homosexuality) 一词最早是由一名德国医生Benkert Kertbeny于1869年提出的。这个词的意思是指对异性不能做出性反应,却被同性别的人所吸引[1,2]。《生命伦理学百科全书》对同性恋的描述为:同性恋者是一个有着持久、显著、唯一的受同性性别吸引,对同性有性渴望和性反应,寻求同性并从中得到性满足的人。我国有学者将同性恋定义为:这种关系可存在于内在的心理上或外在的行为之中,如果某个人一生或一生中大部分时间都和同性别的人建立心理或者行为上的这种关系,就可称为同性恋者。男性同性恋或称男男者(men who have sex with men,MSM)指性取向为男性,且生理性别为男性者。

近年来,对于男男者的形成有先天说(生物因素)和后天说(环境因素)两种说法,前者称为素质性同性恋,后者称为境遇性同性恋[3]。但更普遍认为是由生物因素和环境因素共同决定的。其中生物因素的研究主要集中在与遗传学、神经生物学及性激素水平的相关范畴。环境因素主要在社会因素和心理因素两方面。最近,有学者还提出了同性恋的表观遗传学说,研究显示表观遗传学可能是导致同性恋的一个关键因素,从而扩大了同性恋成因的研究范围。

加州大学圣巴巴拉分校进化遗传学家William Rice[4,5]认为,同性恋会随后代遗传,这必然存在某种原因。研究估计有8%的人群是同性恋,且众所周知同性恋在家族中流行。如果一对双胞胎中有一人是同性恋者,另一个有20%的概率也是同性恋。

Mustanski等[6]利用10cm距离上的403个微卫星标记测定其基因型,分别计算母系的、父系的和联合遗传的最大可能连锁值,发现了连锁值最高的3个区域:7q36、8p12和母源的10q26。而另一项针对男同性恋全基因组扫描的分析也发现这3个区域与性取向的联系,并且发现了1个新的可能与MSM行为发生相关的14q32区[7]。

Camperio-Ciani等[8]比较了男性同性恋者和异性恋者的家系,结果显示同性恋者母系女性亲属的生育能力显著偏高,平均多生育33%的子女,父系女性亲属却没有,提示人类性取向相关的遗传因素有可能位于X染色体上,这些遗传因素未被逐步消除的原因在于携带该基因的女性生育能力较强。此外,男性同性恋的母系亲属中同性恋数目多于父系亲属,而且男性同性恋者多不是长子,有较多的哥哥或姐姐。其他几位学者的研究也报道多项家族性研究均证实男性同性恋具有遗传特征,且其相关影响因素可能位于X染色体上[9-11]。携带有同性恋基因的个体细胞,在适宜的条件下,易于发展成同性恋细胞。这就说明,同性恋的性取向有70% 是遗传基因所产生的结果[12]。Hamer等[13]对114个家庭中男性同性恋者的舅舅和表兄弟的性取向进行家系和连锁分析,并通过DNA连锁分析了兄弟均为同性恋的40个家庭的X染色体的基因多态性,发现Xq28区域可能有决定性取向的基因。

“男性基因”SRY(性别决定基因)的发现也从另外一个角度佐证了男性同性恋和变性者的生物医学基础。SRY基因在哺乳动物性别决定中起关键作用,它是决定因子( TDF),启动分化, 是发育负调节的抑制因子[13]。表现为XY的男性核型却在性染色体中查不到SRY,或SRY发生了突变, 因此可能表现为女性化,即所谓“性反转”[14]。迄今为止还没有明确证据证实染色体上某一区域或基因与男性性取向相关,但似乎可以推测遗传基因在性取向的决定上具有重要的作用,这还有待于进一步的研究。

澳大利亚学者对112 名男性同性恋和258 名男性异性恋的基因进行了比对,发现554%的男性同性恋的雄激素受体基因较长,476%的男性异性恋雄激素受体基因较长。研究人员说,雄激素受体基因较长可能导致激素信号传输弱,而激素是决定早期发育过程中大脑性别认知雄性化的关键因素。该研究认为,激素水平较低可能导致男性在大脑发育期时雄性化的过程不完整,造成性别认知方面倾向于女性[15]。

瑞典研究人员发现,男性同性恋者和女性异性恋者的大脑结构上存在某些相似特点,他们对一些志愿者进行了对比试验,脑部核磁共振成像显示,女性同性恋者和男性异性恋者都拥有不对称的大脑,左侧脑半球比右侧脑半球略小;而男性同性恋者和女性异性恋者的左右脑半球是对称的。研究人员还应用相关检测设备对志愿者脑部杏仁核区域做了分析,结果显示,男性同性恋者和女性异性恋者的杏仁核结构存在着相似性,而男性异性恋者和女性同性恋者的杏仁核结构更为相似。

科学家从脑和内分泌的研究出发,认为下丘脑是大脑负责调节包括性活动在内的身体功能的器官,同性恋可能与下丘脑有关。发现同性恋男性的下丘脑前部神经元的密度只是异性恋男性的一半,而下丘脑前角是大脑中能影响的部分,提出同性恋男性下丘脑前核神经元解剖学的差异可能导致促性腺激素释放激素释放频率的改变,这可能会成为性倾向起因的生物学基础。另外,Levay等比较了同性恋男性和异性恋男性的4种下丘脑前部间质核(interstitial nuclei of the anterior hypothalamus,INAH)的数量,其中INAHl-3是决定人类性别二态性的主要区域,结果显示异性恋男性INAH-3的数量是男性同性恋者的两倍。人体解剖发现男性同性恋INAH-3的体积与男性异性恋相比较小,但女性中却未显示出这种差异,提示了INAH-3与男性性取向的关系[16]。但目前尚未找到造成同性恋者大脑具有独特性的原因,要深入了解与同性恋相关的神经生物学机制需要进行更大规模的研究。

一些研究者考虑到激素可能会导致同性恋。胎儿的大脑受何种性激素的影响,决定了个体细胞未来的性取向。如果男性胎儿未得到激素的影响,而是受到母亲卵巢的雌激素影响,男性胎儿大脑就会女性化;女性胎儿如果受到激素的影响,女性胎儿大脑就会雄性化[13]。有学者推测异性性取向的男性的雄激素暴露水平在一个很小的范围内,不足或超过此范围都可能增加男性成为同性恋的可能性 [17]。也有学者研究发现孕期暴露于乙醇与压力应激的联合作用引发导致雄性后代的性取向的改变[18]。

一直以来也没有任何的“同性恋基因”(gay genes)被确定。根据最新的一种假说,答案或许并不在于DNA本身,而是,随着胚胎发育,子宫中母亲和胎儿两者生成的激素水平发生波动,性相关基因对此做出了反应性开启和关闭。这样的调节机制可使未出生的胎儿受益,即便是在激素处于顶峰时,也可以维持稳定的雄性或雌性发育。然而如果到孩子出生或孩子拥有自己的表观遗传学标记时,这些所谓的表观遗传改变仍然存留,那些后代其中的一些人就可能变成同性恋。在Rice[4,5]的研究中,显示男性和女性胎儿对于它们周围的激素反应并不相同,甚至当一种激素暂时性增高时,这种差异并非是基因的结构,而是基因激活的程度,以及蛋白修饰的方式及程度,如DNA甲基化与剪切、多聚尾修饰等。如在睾酮对胎儿发挥作用的信号通路中,几个关键点的表观遗传改变有可能根据需要钝化或增进了激素的活性。研究中还提到,这些表观遗传学变化在父母处于早期发育时保护了他们,而早期对父母有利的表观遗传改变可解释同性恋在进化中遗留下来。Rice等[19]最近还建立并发表了针对同性恋发展的表观模型,该模型是基于胚胎干细胞的XX与XY核型的表观遗传标记。这些标记提高了XY胎儿中睾酮的灵敏度,降低了XX胎儿睾酮的灵敏度,从而性发展得以进行。该模型预测,这些表观遗传标记的子集进行了跨代遗传,建立了同性恋的表型。Ngun TC等[20]综合相关证据认为性取向是生物学的基础并且认为涉及表观遗传学机制,最近的研究表明,性倾向在同卵双胞胎中比在异卵双胞胎中更为一致,因此认为,男性的性倾向与基因组中的一些区域相关联,该研究惊喜的发现性取向与表观遗传机制有着重要的联系。值得一提的是,在一些先天性肾上腺增生的女性病例中,由于其子宫内高水平的睾酮激素以至于其后代中非异性恋的比例高于哪些非先天性肾上腺增生的女性。同时动物模型研究有力的证明,激素暴露的长期效应是由表观遗传机制介导的,该文章通过描述的假说框架得出结论,遗传和表观遗传共同解释了性取向的有关成因问题并愈发的接近事实,但有关性取向的研究还仍然面临很多挑战。

到目前还没有有力的证据能说明同性恋是由于生理因素导致的,而对于同性恋的形成机制的第二方面,主要包括社会因素和心理因素,其中比较有影响力的观点主要有精神分析学说和行为主义学说。

关于童年早期性心理发展,弗洛伊德认为个体在幼儿时都具有两性素质及双性恋特性,到底发展成同性恋还是异性恋是与个体在成长中的个人经历有关的。他认为在人的个体发展过程当中,4 至6 岁是儿童性别认同、性别角色发展的关键时期,在此期间儿童有着强烈的“恋父情结”或“恋母情结”,对异性的父母有着本能、强烈的依恋情感,而对同性别的父母则产生敌对情绪。父母如果在此期间对儿童的这种性本能不过分刺激也不过分抑制,儿童就会顺利通过这一时期而随后逐渐对同性父母认同。反之,如果在此期间儿童遭受心理创伤,就可能隐藏在潜意识里,并且在青春期时表现出来,可能发展为同性恋[21]。家庭环境对MSM的影响很大,1962 年,贝博提出的“家庭动力是同性恋主因”认为同性恋根源于早期家庭经验。他们大多数来自单亲家庭,从小缺乏父母一方的关爱;或是父母关系很差,经常争吵,长期分居两地;还有的是个体所处的家庭结构是由他/她和多个异性姐妹组成的,或者个体从小被父母当女儿养,从小和女孩子一起玩,产生了性倒错[21,22],将会导致个体对其性别的自我认同产生影响, 并影响以后所形成的性取向。在家庭关系中,通常是母亲的形象和影响远远大过父亲,所以儿子在青春期后会寻找一个具有父亲身上没有的“男性力量”的人作为伴侣。

行为主义者认为,同性恋由环境影响形成。一个人在青少年时期如果在与异往中受挫或有过不快的经历,异性情感没得到正常的发展而与此同时又受到了同性方面的引诱,就可能产生同性恋倾向[23,24],特别的,第一次性经历对个体性取向的影响很大,许多同性恋者第一次受人引诱或者在其他情况下发生同性,从而“欲罢不能”。有学者认为同性恋的形成是极度压抑的结果,如果一个人对性的需求无法通过正常的异性途径获得满足,便会压抑它,压抑的结果便是性需求更大,而为了消除性需求所带来的压抑,个体就会另寻出路去放松这种压抑,一旦个体以同性的方式缓解了压力,就有可能经过多次该行为的强化而形成同性恋。

学校是儿童接受教育的地方,同时也是孩子的主要活动场所,孩子的大部分时间都要在学校这个微缩型社会环境中度过,尤其是初中和高中正值学生性心理迅速发展成熟的时期,其间发生的任何事情如学校和老师对学生的性教育方式和力度、关切程度,以及同伴之间的相互影响等都会给孩子造成很大的影响。

李玉玲等[25]提出同性恋发生的原因在于性情绪的作用,男女同性恋的发生原因是相同的,同性恋与异性恋发生的原因也是相同的,都是由于性情绪的作用。当个体在中体验到喜欢、兴奋、冲动、渴望等积极情绪时,则将带来这些体验的人当恋对象。若此人为同性,则产生同性恋;反之则为异性恋。此外,恋母情结对同性恋者的情绪的产生也有重要作用,有研究表明,同性恋者的父母不鼓励男孩表现出男性特征,有统治欲的母亲不允许儿子对除她自己之外的异性产生兴趣[26],因此产生变得胆小,甚至产生恐惧、偏执的心态,从而影响其未来性取向。

此外,从中医的阴阳角度来看,人体内阴阳互藏,阴阳转化。若男子,阳火不生,或阳刚之气受挫,众阴聚合,则易变主动为主静。阳中阴气愈聚,阴阳失调,则为男子中的女性。相对而言,男子中的女性,为阴,而男子为阳,阴阳的相吸作用,促使他们的自然吸引从而在一起,使得他们相互补足依靠,相互需要,从对方身上获得快乐,实现阴阳的互根交感作用[27]。

社会学的研究个案表明,同性恋个体之间在成因上是不完全相同的,单纯从一种理论出发分析他们的成因是不科学的。比如说素质性的同性恋即绝对同性恋和境遇性同性恋的成因有可能不同。境遇性同性恋更多地受环境的影响,如单性性环境的军队、监狱等,他们中有些人在改变了环境之后,又恢复到异性恋的状态。

综上所述,目前研究男性同性恋成因的领域主要包括社会学、心理学、医学、法学、哲学等多个不同的学科,男性同性恋成因十分复杂,主要涉及遗传因素、表观遗传学、神经生物因素、发育及内分泌因素、社会及心理因素等诸多方面,彼此之间的因果关系不明,尽管相关方面研究均取得了一定的进展,但尚待解决。探索男性同性恋形成原因的道路还很长,但是意义重大。

参考文献

[1]伍传仁.中国男男同性恋的研究现状. 实用预防医学, 2009, 16(3): 985-987.

[2]余放争,杨国纲,余翔.同性恋国内研究概述. 医学信息, 2006, 18(12): 1758-1761.

[3]熊明洲,韩雪,刘爱忠,等.男同性恋性取向成因影响因素Delphi法分析. http:///kcms/detail/211234R.201402081036007html.

[4]Rice WR, Friberg U, Gavrilets S. Homosexuality as a consequence of epigenetically canalized sexual development. The Quarterly review of biology, 2012, 87(4): 343-368.

[5]Bailey JM, Dunne MP, Martin NG. Genetic and environmental influences on sexual orientation and its correlates in an Australian twin sample. Journal of personality and social psychology, 2000, 78(3): 52-54.

[6]Mustanski BS, DuPree MG, Nievergelt CM, et al. A genomewide scan of male sexual orientation. Human genetics, 2005, 116(4): 272-278.

[7]Ramagopalan SV, Dyment DA, Handunnetthi L, et a1 genome-wide scan of male sexoal orientation. J Hum Genet, 2010(55): 131-132.

[8]Camperio-Ciani A, Corna F, Capiluppi C. Evidence for maternally inherited factors favouring male homosexuality and promoting female fecundity. Proceedings of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences, 2004, 271(1554): 2217-2221.

[9]Blanchard R. Quantitative and theoretical analyses of the relation between older brothers and homosexuality in men. Journal of Theoretical Biology, 2004, 230(2): 173-187.

[10]Ciani AC, Iemmola F, Blecher SR. Genetic factors increase fecundity in female maternal relatives of bisexual men as in homosexuals. The Journal of Sexual Medicine, 2009, 6(2): 449-455.

[11]Iemmola F, Ciani AC. New evidence of genetic factors influencing sexual orientation in men: Female fecundity increase in the maternal line. Archives of Sexual Behavior, 2009, 38(3): 393-399.

[12]佚名. 同性恋是怎样形成的. 科学大观园, 2007 (23): 47.

[13]Hamer DH, Hu S, Magnuson VL, et al. A linkage between DNA markers on the X chromosome and male sexual orientation. Science, 1993, 261(5119): 321-327.

[14]姜明子. SRY 基因的研究进展. 中国优生与遗传杂志, 2007, 15(5): 119-120.

[15]研究认为同性恋可能与基因有关. 中华中医药学刊, 2011, 29(5): 1124.

[16]于微, 冯铁建. 男性同性恋生物学成因的研究进展. 中华医学遗传学杂志, 2012, 29(002): 172-175.

[17]Rahman Q. The neurodevelopment of human sexual orientation. Neuroscience & Biobehavioral Reviews, 2005, 29(7): 1057-1066.

[18]Popova NK, Morozova MV, Naumenko VS. Ameliorative effect of BDNF on prenatal ethanol and stress exposure-induced behavioral disorders. Neuroscience Letters,2011,505(2):82-86.

[19]Rice WR, Friberg U, Gavrilets S. Homosexuality via canalized sexual development: a testing protocol for a new epigenetic model. Bioessays,2013,35(9):764-770.

[20]Ngun TC, Vilain E. The biological basis of human sexual orientation: is there a role for epigenetics. Advances in Genetics,2014,86(1):167-184.

[21]李阳, 张延华, 张海霞. 同性恋形成机制探析. 医学与哲学: 人文社会医学版, 2007, 28(6): 50-51.

[22]吴天亮, 张健, 陈国永, 等. 男男同性恋常见精神健康问题及成因探析. 中国性科学, 2013,22(9): 85-87.

[23]马文靖. 浅析同性恋成因中的心理、社会因素. 科技信息 (学术研究), 2008(11): 156-157.

[24]高淑艳, 贾晓明. 近15年来国内同性恋的研究概况. 中国健康心理学杂志, 2008 ,16(4):461-463.

[25]李玉玲. 同性恋是怎样发生的. 中国性科学, 2006, 15(3): 32-35.

[26]杨扬, 岳文静, 朱振菁. 同性恋的心理社会成因. 学理论, 2012 (15): 63-64.

第2篇:表观遗传学的定义范文

【关键词】 杀伤细胞抑制性受体 基因表达调控 DNA甲基 组蛋白乙酰化

HLA半相合异基因造血干细胞移植具有广泛的临床应用前景, 但伴随的问题是移植物抗宿主病发生率高, 免疫重建缓慢, 感染机会增加, 如何克服这些问题是目前造血干细胞移植领域的研究热点。近年来一系列重要的临床研究发现, 在去除T细胞的HLA半相合异基因造血干细胞移植中, 杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immnoglobulinlike receptor, KIR)表型不合(移植物抗宿主方向)是对预后有利的因素[1-4]。KIR基因家族是表达在人自然杀伤(nature killer, NK)细胞和部分T细胞表面的具有调节功能的细胞表面分子家族, 它通过与靶细胞表面相应的HLA I类分子结合, 传导激活或抑制信号, 调节NK细胞功能[5]。KIR基因在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达模式, 由此形成了多种多样的能够特异性的识别、 清除异常细胞的NK细胞群[6]。因此, 只有了解KIR基因表达调控机制, 才能进一步明确NK细胞的生物学特性, 才能使人为调控NK细胞活性为临床应用成为可能。但是, 目前关于KIR的表达调控机制尚不完全清楚。本研究旨在从表观遗传学的角度对KIR3DL1基因的表达调控机制进行深入研究。

1 材料和方法

1.1 材料 人NK细胞系NK92MI购自美国ATCC细胞库; 5氮胞苷(5azacytidine, Aza)、 曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)、 肌醇、 巯基乙醇、 叶酸均购自Sigma公司; 氢醌和亚硫酸氢钠由上海生化试剂公司生产; αMEM培养基、 TRIzol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司; 马血清、 胎牛血清购自Hyclone公司; DNA提取试剂盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)、 MMLV逆转录酶、 dNTPs、 oligo(dT)18、 pGEMT easy载体、 T4 DNA连接酶、 感受态大肠杆菌JM109均购自Promega公司; Taq酶购自TaKaRa公司; PCR产物回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)购自Qiagen公司; PCR引物合成及测序均由北京奥科生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 NK92MI细胞用含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、 1.5 g/L NaHCO3、 0.2 mmol/L肌醇、 0.1 mmol/L巯基乙醇、 0.02 mmol/L叶酸、 125 mL/L马血清、 125 mL/L胎牛血清的αMEM培养基, 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养、 传代。

1.2.2 总RNA及DNA的提取 采用TRIzol RNA提取试剂盒按说明书步骤提取细胞总RNA, 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit按说明书步骤提取细胞基因组DNA, 紫外分光光度计定量。

1.2.3 DNA的亚硫酸氢盐修饰 参照文献[7]的方法, 取1 μg经1 mL注射器抽吸剪切后的基因组DNA, 加入去离子水稀释至50 μL, 向其中加入3 mol/L NaOH 5 μL, 37℃孵育25 min使DNA解开双链; 然后加入新鲜配制的10 mmol/L氢醌30 μL及3 mol/L亚硫酸氢钠520 μL(其内已加3 mol/L NaOH 370 μL), 混匀后于50℃孵育16 h; 用QIAquick Gel Extraction Kit纯化修饰后的DNA, 加入3 mol/L NaOH 5 μL, 37℃孵育20 min终止硫化修饰, 最后经3倍体积的无水乙醇沉淀后溶于20 μL去离子水, 修饰后的DNA于-20℃贮存备用。

1.2.4 PCR扩增及测序检测启动子甲基化状态 按照完全修饰后的KIR3DL1基因DNA序列设计特异性引物, 采用半巢式PCR扩增KIR3DL1基因启动子。第1轮PCR反应的上游引物: 5′GAAGAAGAGTTTGAATTTTAG3′, 下游引物: 5′CCATATCTTTACCTCCAAATC3′。以经亚硫酸氢钠修饰后的DNA为模板, 采用25μL的体系行PCR扩增, 体系包含2.5μL 10×PCR缓冲液、 1.5 mmol/L MgCl2、 200 μmol/L dNTPs、 上下游引物各10 pmol/L和1.25 U Taq酶。扩增条件: 95℃预变性10 min, 然后95℃ 90 s, 48℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共34个循环, 循环结束后继续于72℃延伸10 min。将扩增产物经20倍稀释后取1 μL作为模板进行第2轮扩增, PCR条件同前,上 游引物: 5′GTTAGTATAGATTTTAGGTATTT3′, 下游引物序列同前, 扩增产物长度397 bp。PCR产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 将PCR产物切胶回收后用T4 DNA连接酶与pGEMT Easy载体相连,连接反应体系: PCR产物与pGEMT Easy载体比例为3∶1, 2×连接反应缓冲液 5 μL, T4 DNA连接酶1 μL, 用去离子水补至10 μL, 4℃孵育过夜。取5 μL连接反应产物转化感受态大肠杆菌JM109, 将PCR初步鉴定阳性的克隆送测序鉴定。

1.2.5 甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂处理NK92MI细胞 实验前1 d将NK92MI细胞传代, 实验当天将细胞接种在 35 mm细胞培养皿中, 每个培养皿的细胞数为2×106个, 用2 mL完全培养基培养。实验孔加入终浓度依次为1 μmol/L、 2.5 μmol/L、 5 μmol/L的Aza, 或同时加入2.5 μmol/L的Aza和50 nmol/L的TSA, 或仅加入50 nmol/L的TSA, 对照孔加入等量PBS缓冲液, 细胞继续置于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度孵箱中培养。每隔24 h更换新鲜培养液及相同浓度的药物, 于处理72 h后收获细胞, 检测基因表达。每组实验重复3次。

1.2.6 RTPCR检测KIR3DL1基因表达 在20 μL逆转录体系中加3 μg RNA, 42℃水浴1 h, 95℃ 5 min灭活逆转录酶后, 取1 μL逆转录反应液为模板行PCR扩增。根据文献[8]合成引物, KIR3DL1上游引物: 5′ACATCGTGGTCACAGGTCC3′, 下游引物: 5′ACAACTTTGGATCTGGGCTT3′, 产物长度为682 bp; 内参照βactin上游引物: 5′CGCGAGAAGATGACCCAGATC3′, 下游引物: 5′TTGCTGATCCACATCTGCTGG3′, 产物长度为734 bp。PCR体系同上。扩增条件: 94℃预变性5 min后, 94℃ 1 min, 61℃ 1 min, 72℃ 45 s, 共5个循环, 然后94℃ 30 s, 60℃ 45 s, 72℃ 45 s, 共30个循环, 循环结束后继续于72℃延伸10 min。PCR产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 紫外凝胶成像仪扫描分析, 以KIR3DL1/βactin光密度比值作为KIR3DL1 mRNA水平相对值。

1.2.7 统计学处理 数据以x±s表示, 采用SPSS10.0统计软件包行t检验, 检验水准以P

2 结果

2.1 NK92MI细胞中KIR3DL1启动子区甲基化模式 CpG二核苷酸在KIR基因转录起始区域密度增加, 其出现率(观测值与期望值的比率)≥0.6, 符合CpG岛的定义[9], 因此, 本研究将KIR3DL1基因自转录起始位点上游-270 bp至下游+69 bp之间的这段长339 bp的序列定义为CpG岛, 为便于分析说明, 将这段序列内的全部19个CpG二核苷酸位点以转录起始位点编号, 上游为“-”, 下游为“+”。NK92MI细胞基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后, 采用PCR扩增KIR3DL1基因启动子序列, 将扩增产物连接到T载体, 转化感受态大肠杆菌, PCR初步鉴定阳性重组子, 随机挑取10个克隆行初步PCR鉴定, 均可扩增出与预期大小相一致的目的片段(图1)。阳性克隆进一步测序, 结果与GenBank数据库中KIR3DL1基因启动子序列(基因号NM_013289)比对, 除第1、 4、 5号克隆序列错误外, 得到7条正确的序列。亚硫酸氢盐修饰可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变, 以第10号克隆测序结果为例, 可见全部19个CpG二核苷酸位点由于被甲基化, CpG二核苷酸中的胞嘧啶保持不变, 其他部位的“C”全部发生改变(图2)。综合分析所得7条正确序列测序结果, NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子CpG二核苷酸位点甲基化频率在70%~100%之间, 因此, KIR3DL1基因启动子处于高度甲基化状态(图3)。

图1PCR方法鉴定含KIR3DL1启动子pGEMT easy载体的克隆(略)

Fig 1 Identification of clones containing KIR3DL1 promoterpGEMT easy vector by PCR amplification

M: DNA marker; 1-10: PCR products of clone 1 to 10.

图2 经硫化修饰后的KIR3DL1启动子部分测序结果(略)

Fig 2 Partial result of DNA sequencing of bisulfiteconverted KIR3DL1 promoter

图3 NK92MI细胞系中KIR3DL1启动子各CpG位点的甲基化频率(略)

Fig 3 Methylation frequency at inpidual CpG positions of KIR3DL1 promoter in NK92MI cell line

2.2 去甲基化诱导NK92MI细胞KIR3DL1表达增加 为进一步分析KIR3DL1基因启动子甲基化与基因表达的关系, 采用不同浓度的去甲基化药物Aza处理NK92MI细胞, 结果显示, 终浓度为1 μmol/L的Aza作用72 h, NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比无明显增加(t=0.632, P=0.562), 而2.5 μmol/L和5 μmol/L的Aza可以使KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比分别增加66.6%和114.6%(统计分析结果分别为: t=3.411, P=0.027; t=6.454, P=0.003), 说明去甲基化药物Aza可以诱导NK92MI细胞中KIR3DL1表达, 随药物浓度增加, 这一诱导作用逐渐增强(图4A); 单用50 nmol/L的TSA处理NK92MI细胞72 h, KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比无统计学意义(t=0.203, P=0.852), 将50 nmol/L的TSA与2.5 μmol/L Aza联用处理NK92MI细胞72 h, KIR3DL1 mRNA表达量与单用Aza组相比也无统计学意义(t=1.840, P=0.140), 说明单用TSA不能诱导KIR3DL1表达, 其与Aza联用后也没有协同作用(图4B)。

图4 RTPCR方法检测经5氮胞苷和曲古抑菌素A处理的NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达(略)

Fig 4 Detection of KIR3DL1 mRNA levels in 5azacytidine and trichostatin Atreated NK92MI cells by RTPCR

A: NK92MI cells were treated with different final concentrations of 5azacytidine (1 μmol/L, 2.5 μmol/L and 5 μmol/L) for 72 h; B: NK92MI cells were treated with 2.5 μmol/L of 5azacytidine and (or) 50 nmol/L of trichostatin A for 72 h. aP

3 讨论

KIR基因家族位于人染色体19q13.4, 目前发现有17个成员。KIR基因家族的特点是各成员在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达, 每个NK细胞只表达KIR基因家族部分成员, 一种KIR分子的表达不依赖于其他KIR分子, 从而形成了表达多种多样KIR分子的NK细胞群[5]。KIR基因的这一特有的表达模式对NK细胞特异性识别和清除异常细胞非常重要。在异基因造血干细胞移植中由于供受者之间KIR不相容引发的异源反应性NK细胞活性有利于增强移植物抗白血病作用、 抑制移植物被排斥和移植物抗宿主病、 促进造血干细胞植入, 延长患者生存期, 因此, 明确KIR表达调控机制, 调节NK细胞活性, 对改善造血干细胞移植预后具有重要临床意义, KIR基因表达调控机制已成为近年来的研究热点[10]。KIR3DL1基因与KIR家族其他成员的5′侧翼区序列同源性高达91.1%~99.6%, 在NK细胞表面呈多样性表达[11]。本研究组的前期实验证实KIR3DL1基因启动子在没有内源性KIR3DL1基因表达的K562细胞中具有活性(结果未显示); Stewart等[12]的研究也证实, KIR3DL1基因启动子不仅在有KIR3DL1基因表达的NK细胞系YTIndy中有活性, 并且在没有KIR3DL1基因表达的T细胞系Jurkat中也具有活性。可见KIR3DL1基因转录激活所需的反式作用因子在不同细胞系中广泛分布, 提示表观遗传机制可能在调控KIR3DL1基因表达中发挥重要作用。为此, 本研究首先采用亚硫酸氢盐测序法对NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子甲基化状态进行了检测, 证实KIR3DL1基因启动子存在高甲基化, 然后用去甲基化药物处理NK92MI细胞, 研究启动子甲基化与KIR3DL1基因表达的关系, 以确定KIR3DL1基因的表达是否受甲基化调控。

大量研究已证实DNA甲基化可以调控基因表达[13], 启动子甲基化, 基因转录活性被抑制; 去甲基化, 这一抑制作用被取消。DNA甲基化介导转录抑制的机制可能包括以下三方面: 其一, DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位点相结合, 抑制基因转录; 其二, 通过在甲基化DNA上结合特异的转录阻遏物(如甲基胞嘧啶结合蛋白1, 2), 这种蛋白质可以和转录因子竞争性地与甲基化DNA的结合位点结合, 抑制基因转录; 其三, 甲基化改变了蛋白质与DNA的相互作用, 导致染色质结构的改变,抑制基因转录。Aza是一种常用的甲基化抑制剂, 它通过与DNA甲基化酶共价结合, 降低其生物活性,从而逆转DNA甲基化。本研究证实Aza能够诱导NK92MI细胞KIR3DL1基因表达增加, 由此可以推断KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。

组蛋白乙酰化是表观遗传调控的另外一个重要方面[14], 组蛋白乙酰化由乙酰基转移酶催化完成, 此时染色质呈疏松状态, 有利于基因的表达; 相反, 组蛋白去乙酰化由去乙酰基转移酶催化完成, 此时染色质呈压缩状态, 不利于基因的表达。组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂TSA通过提高组蛋白乙酰化水平, 活化基因转录。但本研究应用TSA处理NK92MI细胞, 未见KIR3DL1基因表达增加, 也没有观察到其与Aza的协同作用; 本研究的前期结果显示, 即使用300 nmol/L的TSA也不能明显增加KIR3DL1基因转录(结果未显示); Santourlidis等[15]的研究也发现, 用25 nmol/L的TSA处理NKL细胞系不能诱导KIR3DL1基因转录增加。由此推测组蛋白乙酰化可能在KIR3DL1基因表达调控中作用不大。

综上所述, 通过检测NK92MI细胞KIR3DL1基因启动子区甲基化模式, 证实NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子存在高甲基化, 去甲基化处理能够诱导NK92MI细胞表达KIR3DL1基因, 因此, NK92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。

参考文献

[1] Bethge WA, Haegele M, Faul C, et al. Haploidentical allogeneic hematopoietic cell transplantation in adults with reducedintensity conditioning and CD3/CD19 depletion: fast engraftment and low toxicity[J]. Exp Hematol, 2006, 34(12): 1746-1752.

[2] Ruggeri L, Capanni M, Casucci M, et al. Role of natural killer cell alloreactivity in HLAmismatched hematopoietic stem cell transplantation[J]. Blood, 1999, 94(1): 333-339.

[3] Ruggeri L, Mancusi A, Burchielli E, et al. Natural killer cell recognition of missing self and haploidentical hematopoietic transplantation[J]. Semin Cancer Biol, 2006, 16(5): 404-411.

[4] Ruggeri L, Mancusi A, Capanni M, et al. Donor natural killer cell allorecognition of missing self in haploidentical hematopoietic transplantation for acute myeloid leukemia: challenging its predictive value[J]. Blood, 2007, 110(1): 433-440.

[5] Husain Z, Alper CA, Yunis EJ, et al. Complex expression of natural killer receptor genes in single natural killer cells[J]. Immunology, 2002, 106(3): 373-380.

[6] Marsh SG, Parham P, Dupont B, et al. Killercell immunoglobulinlike receptor (KIR) nomenclature report, 2002[J]. Eur J Immunogenet, 2003, 30(3): 229-234.

[7] Frommer M, McDonald LE, Millar DS, et al. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5methylcytosine residues in inpidual DNA strands[J]. Proc Nati Acad Sci USA, 1992, 89(5): 1827-1831.

[8] Thompson A, van der Slik AR, Koning F, et al. An improved RTPCR method for the detection of killercell immunoglobulinlike receptor (KIR) transcripts[J]. Immunogenetics, 2006, 58(11): 865-872.

[9] GardinerGarden M, Frommer M. CpG islands in vertebrate genomes[J]. Mol Biol, 1987, 196(2): 261-282.

[10] 高晓宁, 于 力. NK细胞KIR基因表达调控机制研究进展[J]. 国际输血及血液学杂志, 2007, 30(2): 157-159.

[11] van Bergen J, Stewart CA, van den Elsen PJ, et al. Structural and functional differences between the promoters of independently expressed killer cell Iglike receptors[J]. Eur J Immunol, 2005, 35(7): 2191-2199.

[12] Stewart CA, van Bergen J, Trowsdale J. Different and pergent regulation of the KIR2DL4 and KIR3DL1 promoters[J]. J Immunol, 2003, 170(12): 6073-6081.

[13] Jones PA, Takai D. The role of DNA methylation in mammalian epigenetics[J]. Science, 2001, 293(5532): 1068-1070.