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表观遗传学(epigenetics)是与遗传学(genetic)相对应的概念,是对经典遗传学的有益补充;其认为在不改变基因序列的条件下,生物体从基因到基因表型之间存在一种调控,这种机制即“表观遗传学”的含义。尽管已被提出70余年,但直到近10余年,随着科学家们对这种“获得性遗传”的进一步认识,才成为生命科学界最热门的研究之一。因此,研究者们转换思维,从表观遗传学角度对AD发病及治疗进行了研究,发现了一系列表观修饰的关键酶类,以及对这些酶类发挥影响的药物,从而为AD药物研发提供了新的思路和研究方向。本文拟就AD的表观遗传学治疗研究综述如下。
1阿尔茨海默病(AD)概况
阿尔茨海默病(AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。它是最常见的痴呆类型,西方国家[中50%?70%的痴呆属于AD。其病因及发病机制复杂,涵盖了遗传和环境的危险因素,涉及成千上万个基因表达的改变,以及多种信号途径的上调,如P淀粉样肽W-amyloidpeptide,Ap)的沉积、Tau蛋白过度磷酸化、炎症、氧化应激、能量代谢、血管因素及细胞凋亡周期异常等。ad的典型病理改变包括突触丧失、某些神经递质水平下降、神经元内异常物质沉积以及选择性脑神经细胞死亡,使大脑受累区域广泛萎缩,导致记忆力丧失伴行为改变和人格异常,严重者可影响工作及社会生活。受累区域常会出现A沉积、老年斑(senileplaques,SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)及Tau蛋白过度磷酸化等。疾病逐渐进展恶化,甚至累及生命。遗憾的是目前尚缺乏延缓或阻碍疾病进展的治疗手段。
在AD中,涉及神经元退行性改变的基因达200余个,越来越多的研究数据发现在没有基因序列改变的情况下,某些机制也可以决定致病基因何时或怎样表达,最终导致AD发病。因此,AD基因组并不能完全解释发病机制[14]。已知编码APP、PSEN1和PSEN2的基因仅可导致家族性早发型AD(early-onsetAD,EOAD);而大多数(约95%)AD均为晚发型AD(late-onsetAD,LOAD)或散发型。因此可以推断,表观遗传现象或环境因素参与了LOAD的致病。这就部分解释了为什么同一家族中有的家庭成员发病而另一些不发病;而且,在年轻的同卵双胞胎中基因组无实质上的差异,而在同一老年双胞胎中其基因表观遗传学上存在显著差异。
大量研究数据证实,基因-环境相互作用在AD的病理生理过程中发挥了关键作用营养物质、毒素、环境暴露及人的生活行为,都可以在不改变基因组序列的条件下使基因激活或沉默。目前已知的可调控基因转录和表达的表观遗传学机制主要分两大类:①基因选择性转录的调控:包括基因组DNA甲基化,多种组蛋白甲基化及乙酰化等修饰;②基因转录后的调控:包括微小RNA(microRNA,miRNA)和小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等非编码RNA的调节,以及沉默的核糖体RNA(ribosomalRNA,rRNA)基因。除此之外,染色体重塑、基因印记、X染色体失活也属于表观遗传学范畴。
2表观遗传学
表观遗传学的涵义即在DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达与功能发生改变,并产生可遗传的表型。基本机制即:通过多种基因修饰,影响基因转录和(或)表达,从而参与调控机体的生长、发育、衰老及病理过程。至此,表观遗传学的发现极大丰富了传统遗传学的内容,使人们认识到遗传信息可以有两种形式:即DNA序列编码的“遗传密码”和表观遗传学信息。它和DNA序列改变不同的是,许多表观遗传的基因转录和表达是可逆的,这就为许多疾病的治疗开创了乐观的前景。
2.1组蛋白修饰
组蛋白在DNA组装中发挥了关键作用,利用核心组蛋白的共价修饰传递表观遗传学信息。这些修饰主要包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化及特定氨基酸残基N-末端的SUMO化;其中组蛋白氨基末端上的赖氨酸、精氨酸残基是修饰的主要靶点,这些组蛋白翻译后修饰(post-translationalmodifications,PTMs)对基因特异性表达的调控,是其表观遗传学的重要标志。正常机体内,组蛋白修饰保持着可逆的动态平衡。一般而言,组蛋白乙酰化是在组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyl-transferase,HATs)的催化下,从乙酰辅酶A上转移乙酰基到组蛋白N-末端的赖氨酸残基上;由于乙酰化中和了组蛋白的正电荷,使组蛋白末端和相关DNA带负电荷磷酸基团之间的作用减弱,降低了组蛋白和DNA之间的亲和力,这种染色质构象的放宽有助于转录因子向靶基因片段聚集并利于转录的进行。而去乙酰化则是组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylases,HDACs)将乙酰基从乙酰化组蛋白转移到乙酰辅酶A上,形成了致密的染色质状态,从而使基因转录下降或沉默。
2.2DNA甲基化
DNA甲基化较组蛋白修饰更进一步,是表观遗传学的又一重要机制。DNA甲基化主要是在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase,DNMTs,包括DNMT1、2、3a/b和4)催化下,将同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)-甲硫氨酸循环中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)中的甲基,由四氢叶酸转移到胞嘧啶的第5位上形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)。其中,相邻的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸(CpGs)是最主要的甲基化位点。在人类基因组中,CpG以两种形式存在:一种分散存在于DNA中,其CpG70%?90%的位点是甲基化的;另一种CpG呈密集分布于一定区域,称之为“CpG岛”(CpGislands),通常位于或接近基因启动子区(promoterregions),在正常人体基因组中处于非甲基化状态。CpG岛中的胞嘧啶甲基化可以阻碍转录因子的结合,从而可致基因沉默。一般而言,高度甲基化的基因可致表达抑制,而低甲基化的基因可增强基因表达或过表达。
2.3非编码RNA
表观遗传学调控机制涉及RNA的主要包括:miRNA、siRNA以及维持细胞周期的沉默rRNA基因的一部分。
miRNA是较短的双链RNA分子,约有22个核苷酸,来源于机体自身基因即细胞核及细胞质中较大的RNA前体,有自己的启动子和调控元件。人类基因组中有约700?800个miRNA。这些小分子RNA在转录后通过绑定靶mRNA,从而抑制转录或诱导mRNA分裂降解。大多数miRNA具有高度保守性和组织特异性,可以调控机体中30%?50%的蛋白质编码基因。siRNA长短与miRNA相似,作用方式也有很多相同之处,区别在于siRNA可以体外合成,多由外源性导入或感染诱导产生。
重复rRNA基因的复制为真核生物核糖体提供了初始活性位点,在基因表达中是蛋白质合成的热点区。不同细胞类型可表现不同的活性rRNA比率,提示随着细胞发育分化,rRNA基因拷贝数比例会发生改变。沉默rRNA的表观遗传学方式在这个过程中发挥了重要作用,使活性和非活性rRNAs保持了动态平衡。
2.4染色质重塑、基因印记和X染色体失活
染色质重塑(chromatinremodeling)指基因复制、转录和重组等过程中,核小置和结构及其中的组蛋白发生变化,引起染色质改变的过程;主要机制即致密的染色质发生解压缩,暴露基因转录启动子区中的特定结合位点,使转录因子(transcriptionfactor,TF)更易与之结合。基因印记(geneticimprinting)指来自亲本的等位基因在发育过程中产生特异性的加工修饰,导致子代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达方式,即一个等位基因有表达活性,另一等位基因沉默。X染色体失活指雌性哺乳动物细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象,即X染色体被包装成异染色质,进而因功能受抑制而沉默化,使雌性不会因为拥有两个X染色体而产生两倍的基因产物。
3AD的表观遗传学3.1组蛋白修饰
研究显示,在AD中存在组蛋白的PTMs。组蛋白3(histone3,H3)磷酸化作为激活有丝分裂的关键步骤,可使AD海马神经元呈过磷酸化状态。对APP/PS1突变小鼠和野生型小鼠进行条件恐惧训练,结果显示前者乙酰化H4较野生小鼠组降低50%;之后对突变组进行HDAC抑制剂(histonedeacetylasesinhibitors,HDACIs)曲古抑菌素A的治疗,显示前者乙酰化H4水平出现了上升。在一项皮层神经元培养模型研究中,APP过度表达则可导致H3和H4乙酰化降低,以及c-AMP反应元件结合蛋白(cAMP-responseelementbindingprotein,CREB)水平下降;而CREB则是脑神经元中激活记忆相关基因,形成长期记忆的关键蛋白。总之,尽管在AD患者、AD动物模型及AD培养模型中,都出现了组蛋白修饰,但这个过程是极其复杂的,特异性位点会因功能状态不同而出现组蛋白乙酰化增加或减少。
3.2DNA甲基化
3.2.1相关基因的甲基化研究显示,尽管很难判
断AD中甲基化程度是升高还是下降,但12个甲基化的AD特异性基因表现出了显著的“表观偏移”;同时研究还发现,在DNMT1启动子内一些CpG位点也表现出年龄相关的表观偏移。研究还发现,叶酸、甲硫氨酸及Hcy代谢与DNA甲基化机制显著关联。例如,人类及动物模型叶酸缺乏将导致基因组整体低甲基化,而补充叶酸则可部分逆转甲基化程度。Smith等研究发现,衰老及AD人群中都出现了叶酸缺乏和甲硫氨酸-Hcy周期的改变。另一研究发现AD患者脑脊液(cerebro-spinalfluid,CSF)中叶酸显著下降,同样下降的还有CSF及脑组织中SAM。同时还观察到AD患者脑组织中S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)及血浆中Hcy的升高,后者可抑制DNA甲基化。
目前已知的AD相关基因主要包括:p淀粉样蛋白前体(APP)基因、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)基因、载脂蛋白E(ApoE)基因、p-分泌酶(BACE)基因、sortilin相关受体基因(sortilin-relatedreceptor1gene,SORL1)以及白介素1a(IL-1a)和白介素6(IL-6)基因等。其中,APP基因、BACE基因或PS1基因均存在可调控的CpG甲基化位点。有研究显示,一例AD尸检的大脑皮层中APP基因发生了完全去甲基化,而正常样本或匹克氏病(Pick’sdisease)患者样本则没有这种变化。实验发现,叶酸缺乏所致的BACE和PS1基因表达增强,可通过补充SAM而恢复正常。同样,体内实验发现,给予APP过度表达的转基因小鼠缺乏叶酸、B12及B6的饮食,可以使SAH升高并上调PS1和BACE的表达,以及促进A的沉积和出现认知障碍。在LOAD尸检标本中,研究者发现了著名的“年龄依赖的表观遗传学漂移”(age-dependentepigeneticdrift);对CpG岛异常的表观遗传学控制,可能促成了LOAD的病理变化,因此,“表观遗传学漂移”可能是LOAD个体易感的重要机制。
3.2.2Tau蛋白相关的甲基化Tau蛋白是一种微管结合蛋白(microtubulebindingprotein,MAP),它能与神经轴突内的微管结合,具有诱导与促进微管形成,防止微管解聚、维持微管功能稳定的功能。对记忆和正常大脑功能起重要作用。然而,在AD中,Tau蛋白不仅不再发挥正常功能,还会因异常磷酸化或糖基化等改变了Tau蛋白的构象,使神经元微管结构广泛破坏,形成以Tau蛋白为核心的NFT,最终导致神经元功能受损或神经元丢失。
人体在正常条件下,Tau蛋白启动子的AP2结合位点是非甲基化的,但SP1和GCF结合位点则被甲基化。而随着年龄的增加,SP1作为一种转录激活位点甲基化程度升高,GCF作为启动子抑制位点则逐渐去甲基化,因此总体而言Tau蛋白的基因表达是下调的。尤其在额叶及海马区域,正常Tau蛋白也出现了年龄相关的下降。蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一种针对磷酸化Tau蛋白的去磷酸化酶,PP2A催化亚基的甲基化可以激活该酶。研究显示,在APP及PS1基因突变的转基因小鼠中,PP2A的甲基化程度显著下降,结果显示Tau蛋白磷酸化增高。对培养的神经元添加叶酸拮抗剂甲氨蝶呤,也可导致PP2A去甲基化,从而增加Tau蛋白的磷酸化程度。另外,还有研究显示,Hcy可以使PP2A的甲基化程度及活性下降,而添加叶酸和B12则可以逆转这个过程。总之,Tau蛋白的磷酸化和脱磷酸化间平衡是维持微管稳定性的关键因素;而其中磷酸化相关酶类的甲基化程度,成为影响Tau蛋白磷酸化的重要因素。
3.2.3异常的细胞周期和神经元凋亡研究证实,细胞周期异常和神经元凋亡是AD神经退行性变的常见机制。AD神经元中细胞周期及凋亡途径关键因子受DNA甲基化影响并发生上调。包括细胞周期素B2基因、caspase-1基因、caspase-3基因等。这些相关基因的低甲基化使细胞进入异常细胞周期。同样,高Hcy可使培养神经元凋亡,也间接证实了低甲基化导致异常细胞周期;而使用SAM还可起到拮抗细胞凋亡的效果。
3.3A与miRNA
研究发现,miRNA可以调节APP的表达、APP处理、A聚积以及BACE1的表达,从而导致A毒性改变或影响神经再生。因而,miRNA失调可使APP表达及处理过程发生改变,最终引起神经元存活率和神经再生程度的改变。针对全球AD人群和正常老年人群的对比研究发现,特异性miRNA水平存在显著差异。研究显示,在AD中APP相关miRNA显著下降,而APPmRNA水平则保持平稳,提示miRNA影响APP表达是通过抑制转录而不是促进APPmRNA的裂解;同时,在AD皮层中miRNA-106b出现显著下降。具体机制还有待进一步研究。
3.4AD与一碳代谢
叶酸代谢又称为一碳代谢,需要SAM提供甲基。诸多研究表明,AD患者常存在血浆及CSF中Hcy升高(两者浓度升高常呈正相关),血浆叶酸和B12水平下降,以及脑组织中SAM减少。早期暴露于缺乏叶酸及B族维生素饮食的动物,其AD相关基因在脑组织中发生了表观遗传学修饰。SAM作为甲基化过程最重要的甲基来源,其产生及循环依赖于甲硫氨酸循环的正常进行[11]。研究显示,AD患者CSF中SAM出现显著下降,口服SAM(1200mg,qd)4?8个月,可以使CSF中SAM浓度升高。同时,维生素B12缺乏可使SAM产生减少,从而影响甲基化。前瞻性队列研究表明,高Hcy与AD高风险显著相关,而较高的叶酸摄入量可以降低老年人的AD风险。叶酸缺乏导致的SAM缺乏以及Hcy升高,使甲基化水平下降;并且,Hcy影响SAM和SAH水平,后两者可调节DNA甲基化活性以及蛋白翻译后修饰。另外,研究还发现Hcy可通过抑制甲基化,降低PP2A甲基化程度,从而导致Tau蛋白过磷酸化、NFT及SP形成。因此,最关键机制即:叶酸/同型半胱氨酸代谢异常导致AD相关基因启动子的表观遗传修饰(CpG区域甲基化状态的改变),使基因沉默(高甲基化)或过度表达(低甲基化),最终发生AD。
4表观遗传学在AD诊疗中的应用研究
近年来,随着表观遗传学在AD研究中的不断进步,研究者已逐渐将其应用于AD的诊断及治疗中,尽管多数还处于临床前试验阶段,但表观遗传学应用于AD临床的前景是乐观并值得期待的。
4.1表观遗传学诊断手段
利用亚硫酸氢钠进行甲基化测序是检测DNA甲基化的金标准。该方法利用盐析法从血液中提取基因组DNA,经过亚硫酸氢盐处理后,变性DNA中胞嘧啶转换为尿嘧啶,而5-mC则不发生转换,因此在经过PCR扩增和DNA测序后,胸腺嘧啶则代表非甲基化胞嘧啶,而5-mC(主要为CpG二核苷酸)仍为胞嘧啶。继而由该方法延伸出多个DNA甲基化分析法,例如:甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP)、结合亚硫酸氢盐限制性分析(combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)以及甲基敏感性单核苷酸引物(methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension,MS-SNuPE)等。然而,由于目前对AD相关基因甲基化的研究还不完善,只能在临床前研究中应用甲基化测序,用于对比分析AD中基因甲基化的真实状态。
实时基因成像(real-timegeneticimaging)技术是另一种判断基因表观遗传修饰的手段;该技术避免了尸检或动物研究,是一种新型的非侵入性的可视化基因调控检测。磁共振波谱(MRspectroscopy,MRS)即是这样一种特殊的磁共振成像,该技术可扫描到特定的蛋白,将来可使我们能够实现对基因表达变化的可视化实时检测,理论上而言可以追踪到DNA甲基化或组蛋白修饰的责任蛋白;因此,在一定程度上,将为AD的表观遗传学诊断和治疗提供新的手段[39]。
此外,另有研究发现,脂肪酸酰胺水解酶(fattyacidamidehydrolase,FAAH)参与了AD的发病,同时还发现FAAH易于从外周血中检出,并可作为一个新的潜在的AD生物标志物(biomarker),继而用于AD的预测或诊断。然而,由于一些AD相关蛋白或酶类在外周血中易降解,稳定的miRNA检测已成为反映疾病的重要手段。由于大多数AD患者外周血单核细胞中存在各种miRNA的表达上调(如miR-371、miR-517等),且与其在AD脑中高表达相对应,提示通过测定血浆及血单核细胞的miRNA谱变化,可作为AD诊断和病情评估的重要方法。
4.2AD的表观遗传学治疗
表观遗传学对研究AD的发病机制和病程转归,以及研发新的药物等方面开拓了广阔的空间。表观遗传学药物进入体内后,可充当基因转录或表达的“开关”,通过不同的基因修饰及调控基因表观修饰相关酶类的活性,继而达到在未改变DNA序列的情况下影响基因表型。因此,正是表观遗传学改变的“可逆性”,使与之相关药物的研发成为AD治疗研究的新方向和重点。
4.2.1HDACIs近年来,科学家们研发了多种新的HDACIs。根据化学形态主要分为4类:①短链脂肪酸类:如丁酸钠、苯丁酸盐和丙戊酸(valproicacid,VPA);②异轻肟酸(hydroxamicacid)类:如曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)、辛二酰苯胺异轻肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA);③环氧酮类:如trapoxinA和trapoxinB;④苯甲酰胺类:如MS-275。这些HDACIs与锌依赖性HDAC蛋白(zinc-dependentHDACprotein,I、II及IV类组蛋白亚型)相互作用;烟酰胺作为NAD+前体,可以抑制III类HDAC蛋白。其中,研究最广泛的是丁酸钠、苯丁酸盐、VPA、TSA和SAHA。
目前FDA批准上市的是SAHA,-种治疗T细胞淋巴瘤的新型化合物,不仅可增加组蛋白乙酰化水平,同时还可提高认知。在神经系统中,VPA具有抗惊厥和稳定情绪的作用,因此这些作用可能与引起组蛋白乙酰化改变有关;VPA还可以通过抑制GSK-3#介导的y-分泌酶裂解APP,从而抑制Ap的产生,减少A斑块,最终缓解AD模型鼠的认知功能障碍。Ricobaraza等研究显示,4-苯基丁酸乙酯(PBA)可通过降低GSD-3#来降低AD大鼠脑内Tau蛋白磷酸化,并可清除突触间A沉积,减轻内质网压力,从而恢复记忆并逆转学习障碍。而烟酰胺则可选择性降低Tau蛋白磷酸化并增加乙酰化的a微管蛋白。Fischer等也研究发现,非特异性HDACIs如VPA、TSA、4-苯基丁酸钠及伏立诺他等,都可以通过不同的表观遗传机制影响Ap沉积和Tau蛋白过磷酸化,并可改善学习和记忆力。另外,HDACi丙戊酸可以降低APP的表达,减轻大脑中的A肽斑块负担;研究还证实,HDACI治疗还可诱导树突发芽,增加突触数量,以及恢复学习行为和形成长期记忆。Zhang等报道,口服HDACIMS-275可改善神经炎症和脑淀粉样变,以及改善AD模型动物的行为能力。这些研究提示,HDACIs可通过调节HDAC蛋白活性和Tau蛋白磷酸化水平,从而用于AD的治疗.
HDACIs可选择性抑制HDACs,导致组蛋白乙酰化水平升高,恢复AD模型动物中组蛋白乙酰化水平及提高学习和记忆能力。例如:Guan等发现当脑内HDAC2过表达时,小鼠海马神经元树突棘密度降低、突触形成减少、CA1区LTP形成障碍、空间记忆和工作记忆损伤;而使用HDACIs则能够促进小鼠神经元树突棘和突触的形成,改善AD模型小鼠的学习和记忆减退状态。因此,HDAC2可能是HDACIs最适宜的治疗靶点之一,可能使脑神经元内合成新的蛋白以改善或恢复AD患者记忆。除此之外,HDACIs对基因表达的调节具有特异效应,可以在上调靶基因表达的同时下调其他基因;这种基因特异性常通过转录因子来调控,后者可以识别特定启动子和增强子序列,并赋予靶基因特异性(gene-specificeffects),使之对HDACIs具有敏感性[44],继而逆转表观遗传改变。同时,应用HDACIs治疗AD还应当考虑其是否可穿透血脑屏障,因此,最近的一项研究研发了一种可进入CNS(“CNS-penetrant”)的HDACIs(I类)EVP-0334,目前已进入I期临床试验用于AD治疗。
众所周知,AD大脑受累的主要区域为内侧嗅皮质、海马及杏仁核等。研究发现,与正常脑组织相比,AD患者皮质中HDAC6蛋白水平升高了52%,而海马中则升高了92%。HDAC6与Tau蛋白共同存在于核周,并发生相互作用;其中HDAC6具有独立的微管蛋白脱乙酰基酶的活性。使用HDAC6抑制剂Tubacin治疗或敲除HDAC6,并不能影响HDAC6与Tau蛋白的相互作用,但可以减少Tau蛋白磷酸化[55]。通过结合HDAC6,Tau蛋白可抑制脱乙酰酶活性,从而导致微管蛋白乙酰化增加;在Tau蛋白过表达的细胞中也可见这种增加;说明过量的Tau蛋白成为HDAC6的抑制剂,然而AD患者中正常Tau蛋白是减少的。文献显示,HDAC6的减少或丢失可改善联想和空间记忆形成[56,57],以及阻断A诱导的海马神经元线粒体运输障碍。最近有研究人员还发现,HDAC6无效突变(nullmutation)可以挽救神经元中Tau蛋白诱导的微管缺陷。他们采用遗传和药理学方法抑制HDAC6的tubulin特异性脱乙酰基酶活性,证实这种“挽救效应”有可能是通过增进微管乙酰化所介导的。这些研究结果表明,HDAC6有可能是AD和相关Tau病的一种独特的有潜力的药物靶点,HDAC6抑制剂有望成为AD治疗的新型药物。
目前研究证实,HDACIs可用来治疗神经变性病、抑郁、焦虑情绪、认知功能障碍及神经发育障碍,因此为AD的治疗提供广阔的前景。但现有的HDACIs存在生物利用度低、代谢快、低选择性等缺点。因此,研究开发结构新颖、副作用小、特异性及选择性高的HDACI具有重要的临床意义。
4.2.2饮食因素除此之外,饮食因素,例如叶酸、维生素B2、B6、B12、蛋氨酸、胆碱等都可以影响甲基供体SAM的形成,并影响DNMTs活性;同时,一些天然化合物,如异黄酮、黄酮、儿茶素、姜黄素、白藜芦醇等,可以改变表观遗传学机制,影响染色质修饰酶的活性,因此备受关注。
研究证实,传统用于抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡及预防高脂血症的姜黄素,也可用于治疗AD:在体外实验中,姜黄素可抑制A聚集沉积、A#诱导的炎症、户分泌酶及乙酰胆碱酯酶的活性;而体内实验则证实,口服姜黄素可抑制AD动物脑组织中Ap沉积、Ap寡聚化及Tau蛋白磷酸化,并改善行为及认知。另有研究发现,姜黄素还可加速淀粉样斑块的分解,继而改善AD的空间记忆障碍。据Bora-Tatar等[65]报道,在33种羧酸衍生物中,姜黄素是最有效的HDAC抑制剂,甚至比丙戊酸和丁酸钠更强效;另有研究也发现,姜黄素可显著降低HDAC1、3和8蛋白水平,并可提高乙酰化H4水平。同时,姜黄素还是潜在的HAT抑制剂,2004年Balasubramanyam等[66]发现,姜黄素是p300/CREB结合蛋白HAT活性特异性抑制剂,对维持一定的CREB水平起到关键作用。因此,姜黄素对HDAC和HAT均有调节作用;作为已知的抗氧化剂,姜黄素可能是通过调节氧化应激,从而对乙酰化和去乙酰化具有双重调节作用。
AD表观遗传学改变受环境、营养因素等诸多因素共同作用,因此自孕前保健开始,直至子代的一生,都保持机体内外生存环境的良好,保证表观遗传学正常修饰及表达,在一定程度上可能会预防AD的发生。同时,由于目前糖尿病、肥胖、心血管疾病、高血压等都是公认的AD高危因素,通过表观遗传学机制防治这些疾病,也是降低AD的发生风险的重要手段。另外,提倡低热量、低胆固醇和富含叶酸、B族维生素及姜黄素等的饮食,以及降低血浆Hcy值,可能对保护大脑神经元,改善老年期认知,以及预防AD发生或逆转AD的表观遗传改变,起到一定的积极作用。
4.2.3其他因素由于DNA甲基化是可逆的,该过程的相关酶类也可作为AD治疗的研究靶点,例如DNMT抑制剂。然而,目前对DNMT抑制剂的研究多局限于肿瘤的治疗,因此对于AD的治疗作用还有待进一步研究。另外,研究发现AD中与APP裂解机制相关的多个miRNA也发生了改变,因此针对miRNA的AD表观遗传治疗成为重要研究方向。2006年,中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所裴钢院士研究组研究发现,肾上腺素受体被激活后,可以增强y-分泌酶的活性,进而能够增加AD中Ap的产生。这项发现揭示了AD致病的新机制,提示肾上腺素受体有可能成为研发AD治疗药物的新靶点。
5展望
综上所述,在AD中,表观遗传学机制对疾病发生发展起到了关键作用,尤其是散发性AD。表观遗[8]传学调节障碍导致相关基因转录异常,引起关键蛋白或酶类异常,继而发生一系列病理生理改变,是AD发病的主要原因。表观遗传学改变可以通过表观遗传药物进行逆转,因而这不仅为AD的治疗开创了一片新天地,更引导医药行业进入了一个崭新的领域。
然而,使用表观遗传学药物治疗疾病也面临着一系列难题。对于目前可用的表观遗传学化合物如HDACIs及辣椒素等而言,主要的困难即缺乏针对不同脑区、不同神经元亚型或特异基因的“选择性”。
1 DNA甲基化和组蛋白乙酰化
1.1 DNA甲基化 DNA甲基化是指在DNA复制以后,在DNA甲基化酶的作用下,将S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基转移到DNA分子中胞嘧啶残基的第5位碳原子上,随着甲基向DNA分子的引入,改变了DNA分子的构象,直接或通过序列特异性甲基化蛋白、甲基化结合蛋白间接影响转录因子与基因调控区的结合。目前发现的DNA甲基化酶有两种:一种是维持甲基转移酶;另一种是重新甲基转移酶。
1.2 组蛋白乙酰化 染色质的基本单位为核小体,核小体是由组蛋白八聚体和DNA缠绕而成。组蛋白乙酰化是表观遗传学修饰的另一主要方式,它属于一种可逆的动态过程。
1.3 DNA甲基化与组蛋白乙酰化的关系 由于组蛋白去乙酰化和DNA甲基化一样,可以导致基因沉默,学者们认为两者之间存在串扰现象。
2 表观遗传学修饰与恶性肿瘤耐药
2.1 基因下调导致耐药 在恶性肿瘤中有一些抑癌基因和凋亡信号通路的基因通过表观遗传学修饰的机制下调,并与化疗耐药有关。其中研究比较确切的一个基因是hMLH1,它编码DNA错配修复酶。此外,由于表观遗传学修饰造成下调的基因,均可导致恶性肿瘤耐药。
2.2 基因上调导致耐药 在恶性肿瘤中,表观遗传学修饰的改变也可导致一些基因的上调,包括与细胞增殖和存活相关的基因。上调基因FANCF编码一种相对分子质量为42000的蛋白质,与肿瘤的易感性相关。2003年,Taniguchi等证实在卵巢恶性肿瘤获得耐药的过程中,FANCF基因发生DNA去甲基化和重新表达。另一个上调基因Synuclein-γ与肿瘤转移密切相关。同样,由表观遗传学修饰导致的MDR-1基因的上调也参与卵巢恶性肿瘤耐药的形成。
3 表观遗传学修饰机制在肿瘤治疗中的应用
3.1 DNA甲基化抑制剂 目前了解最深入的甲基化抑制剂是5-氮杂脱氧胞苷(5-aza-dc)。较5-氮杂胞苷(5-aza-C)相比,5-aza-dc首先插入DNA,细胞毒性比较低,并且能够逆转组蛋白八聚体中H3的第9位赖氨酸的甲基化。有关5-aza-dc治疗卵巢恶性肿瘤的体外实验研究结果表明,它能够恢复一些沉默基因的表达,并且可以恢复对顺柏的敏感性,其中最引人注目的是hMLH1基因。有关地西他滨(DAC)治疗的临床试验,研究结果显示,结果显示:DAC是一种有效的治疗耐药性复发性恶性肿瘤的药物。 转贴于
3.2 HDAC抑制剂 由于组蛋白去乙酰化是基因沉默的另一机制,使用HDAC抑制剂(HDACI)是使表观遗传学修饰的基因重新表达的又一策略。根据化学结构,可将HDACI分为短链脂肪酸类、氯肟酸类、环形肽类、苯酸胺类等4类。丁酸苯酯(PB)和丙戊酸(VPA)属短链脂肪酸类。PB是临床前研究最深入的一种HDACI,在包括卵巢恶性肿瘤在内的实体肿瘤(21例)Ⅰ期临床试验中有3例患者分别有4~7个月的肿瘤无进展期,其不良反应是短期记忆缺失、意识障碍、眩晕、呕吐。因此,其临床有效性仍有待于进一步在Ⅰ、Ⅱ期临床试验中确定。在VPA的临床试验中,Kuendgen等在对不同类型血液系统肿瘤中使用VPA进行了Ⅱ期临床试验,结果显示,不同的患者有效率差异甚远。辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)是氯肟酸类中研究较深入的一种HDACI。其研究表明,体内使用安全剂量SAHA时,可有效抑制生物靶点,发挥抗肿瘤活性。大量体外研究结果显示,联合使用DNA甲基化抑制剂和HDACI会起到更明显的协同作用。
3.3 逆转耐药的治疗 Balch等使用甲基化抑制剂—5-aza-dc或zebularine处理卵巢恶性肿瘤顺柏耐药细胞后给予顺柏治疗,发现此细胞对顺柏的敏感性分别增加5、16倍。在临床试验中,Oki等将DAC和伊马替尼(imatinib)联合使用治疗白血病耐药患者,结果说明,应用表观遗传学机制治疗恶性肿瘤确实可以对化疗药物起到增敏作用,并且在一定范围内其疗效与体内表观遗传学的改变呈正比。Kuendgen和Pilatrino等对HDACI和化疗药物的给药顺序进行研究,结果显示,在使用VPA达到一定血清浓度时加用全反式维甲酸可增加复发性髓性白血病和骨髓增生异常综合征患者的临床缓解率,这可能与VPA引起的表观遗传学改变增加患者对药物的敏感性有关。
4 展望
总的来说,应用表观遗传学修饰机制治疗肿瘤具有良好的应用前景,与传统化疗药物联合来逆转耐药,将给攻克恶性肿瘤等疾病带来新的希望。
参 考 文 献
摘要:目的:观察愈肝颗粒对大鼠肝癌模型的防治作用,并进一步探讨其表观遗传学机制。方法:采用甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP)技术检测大鼠肝组织p16抑癌基因异常甲基化情况,RT-PCR法检测3种主要DNA甲基转移酶(DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)水平变化,ELISA法检测血清AFP水平,HE染色观察肝脏病理情况。结果:HE染色显示愈肝颗粒组大鼠肝脏病理改变较轻,细胞异形性不明显,而模型对照组大鼠肝脏细胞异形性明显,癌细胞排列呈梁状或多板状或实性成片排列。结论:愈肝颗粒可对大鼠肝癌的发生有防治作用,其机制与调节DNMTs表达水平及调整p16抑癌基因基因启动子甲基化水平有关。
关键词:愈肝颗粒;大鼠;肝癌;二乙基亚硝胺;DNA甲基转移酶;p16基因;甲基化
中图分类号:R735.7文献标识码:A文章编号:1673-2197(2008)10-0026-02
原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一。尽管近年来肝癌在诊治有很大进展,但其预后仍不乐观,因此采取预防措施降低其发生显得尤为重要。中药在防治肝癌方面有广阔的前景。本课题旨在通过动物试验,制造肝癌模型,运用现代分子生物学技术观察愈肝颗粒对DNMTs、p16抑癌基因基因启动子甲基化水平的影响,探索愈肝颗粒防治肝癌的作用机理,为临床防治肝癌提供可靠的实验依据。
1材料与方法
1.1试验材料与仪器
RNA抽提试剂盒(Trizol试剂盒)及DNA抽提试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;大鼠p16基因甲基化检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司;RT试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司;PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;琼脂糖凝胶购自西班牙DIOWEST公司;DNAMarker购自天根生化科技(北京)有限公司;大鼠(rat)甲胎蛋白(AFP)检测试剂盒购自美国ADL公司;二乙基亚硝胺(DEN)购自sigma公司,愈肝颗粒浸膏由泸州市中医院制剂室生产,主要成分由茵陈、栀子、党参、黄芪、白术、青皮、丹参、泽兰、茜草等13味中药组成,SD大鼠由泸州医学院动物试验中心提供。
1.2方法
1.2.1动物模型制作及分组
选用标准清洁级SD大鼠70只,体重180±30g,将其随机分至3组,空白对照组10只,模型对照组30只,愈肝颗粒组30只,每组均为雌雄各半。模型对照组、愈肝颗粒组大鼠腹腔注射40mg/kg体重的DEN,2次/周,连续8周。空白对照组则注射等体积的生理盐水。同时,自实验开始愈肝颗粒组大鼠给予愈肝颗粒浸膏(每毫升相当于原生药1.86g)灌胃,10mL/kg体重,每天一次,连续8周。模型对照组、空白对照组大鼠给予等体积生理盐水灌胃,8周末处死动物,留取标本。
1.2.2RT-PCR检测
采用Trizol法提取肝组织RNA,NanoDorpND-1000核酸蛋白测定仪定量,-70℃冰箱保存。每个样本设40μL反应体积,将2μg总RNA为底物及2μL随机引物、2μL逆转录酶、4μLdNTPs、1μLRNaseInhibitor42℃反应20min,cDNA于-20℃冰箱保存。以各样本cDNA5μL为模板,引物对按前向、反向顺序排列为:DNMT1:5′-CTGAGGAAGGCTACCTGGCTAA-3′,5-TGTCCGACTTGCTCCTCCTG-3′,扩增片段204bp,DNMT3A:5′-GGAATGTGCCAGAACTGTAAGA-3′,5′-CCTGTAGCAATCCCATCAAA-3′,扩增片段404bp,DNMT3B:5′-TGGTGAAGCGGATGATGGAGATGGC-3′,5′-CCGATGGCGTACTGCTGCTCTTAGG-3′,扩增片段329bp,GAPDH:5′-AAATCCCATCACCATCTTCC-3′,5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′,扩增片段581bp。
PCR反应体系:逆转录反应后原液2.5μL,Primer1(10μM)1μL,Primer2(10μM)1μL,2×MasterMix12.5μL,反应体积25μL。反应循环的设置:94℃3min;94℃30sec,TM℃30sec,72℃1min,30循环;72℃延伸5min。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehydephosphate
dehydrogenase,GAPDH)为内参照。2%-3%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像系统进行半定量分析以目的基因条带与内参照GAPDH基因条带吸光度值进行比较,计算其比值,并对实验分组中各样本计算结果取均值(见表1)。
表1各组大鼠肝组织中MSP与DNMTs的表达情况
(±s)
注:与空白对照组比较,P
1.3统计学分析
采用SPSS13.0进行统计分析。数据均用均数±标准差(±S)表示,计量资料采用单因素方差分析,规定P≤0.05为有统计学意义。
2结果
2.1HE染色光镜下观察结果(见图1-6)
空白对照组(图1,2):肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列,大小均一,细胞核大而圆,胞质丰富。模型对照组(图3,4):癌细胞排列呈梁状、索状或不规则。愈肝颗粒组(图5,6):细胞排列基本规则,异形性不明显。
2.2p16基因异常甲基化
24例模型对照组大鼠肝脏标本经MSP法检测,18例p16基因启动子区异常甲基化(18/24),26例愈肝颗粒组大鼠肝脏标本MSP检测,p16基因启动子区异常甲基化(16/26),而10例空白对照组大鼠肝组织检测均为阴性(图7)(备注:造模死亡10只大鼠)。
图7p16基因启动子区甲基化MSP检测结果
2.3DNNMTs半定量结果
采用优化RT-PCR反应条件,对各个样本cDNA以特定引物(DNNMTs)及内参照GAPDH引物进行扩增,表1显示为半定量结果。
3讨论
本研究结果显示:24例模型对照组大鼠肝脏标本经MSP法检测,18例p16基因启动子区异常甲基化(18/24),26例愈肝颗粒组大鼠肝脏标本MSP检测,p16基因启动子区异常甲基化(16/26),而10例空白对照组大鼠肝组织检测均为阴性,说明p16基因的失活在肝癌的发生中有重要的意义,同时也表明愈肝颗粒可能通过抑制DNA的甲基化作用防治肝癌。模型对照组和愈肝颗粒组大鼠肝组织DNMTs水平检测结果与空白对照组比较,p16基因异常甲基化阳性组DNMT3A、DNMT3B升高较明显而DNMT1则相对下降,表明DNMT3A、DNMT3B在促进p16基因异常甲基化过程中起主要作用,同时表明3种DNMTs相对水平改变及相互作用与此进程关系密切;与Kimura等在肾透明细胞癌中的研究结果不同的是,DNMT1在MSP阴性的肝癌组织中高于正对照组并略高于异常甲基化阳性组。检测26例愈肝颗粒组与24例模型对照组大鼠肝组织DNMT1、DNMT3A、DNMT3B水平,结果显示:前者三项水平均较后者低,差异明显,均P
参考文献:
关键词 硒 表观遗传修饰 表观标志物抑制剂 抗癌药 开发
中图分类号:R979.1 文献标识码:A 文章编号:1006-1533(2017)03-0075-04
Selenium compounds ― looking forward to be developed as epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs*
ZHU Huiqiu1**, HUA Yan1, WANG Mingli2***
(1. Anhui Huaxin Pharmaceutical Co. Ltd., Hefei 230000, China; 2. Anhui Medical University, HeFei 230032, China)
ABSTRACT Selenium compounds can produce an intervention effect on the abnormality of epigenetic modification and then repress the occurrence and metastasis of tumor. They can be used as the inhibitors of some tumor specific epigenetic markers and expected to be developed as a new type of epigenetic targeting selenium-containing anti-tumor drugs.
KEy WORDS selenium; epigenetic modification; inhibitors of epigenetic markers; anti-cancer drugs; development
硒最重要的生物学功能是抗癌,并以多种机制发挥其抗癌作用。近年来的研究发现,硒又可对表观遗传学调控机制异化产生干预影响,特别是对在肿瘤发生机制中的特异性靶点进行干预,进而阻抑肿瘤的发生及转移。硒化物是某些肿瘤特异性表观标志物有效的抑制剂。硒的这个功能不仅对临床肿瘤诊断、治疗、预防具有现实意义,更为“含硒表观靶向抗癌药物”开发提供了科学依据。“含硒表观靶向抗癌药物”是期待开发的新型抗癌药。现就近些年在这些方面的相关研究作一简要介绍。
1 表观遗传学
什么是表观遗传学?从孟德尔遗传规律讲,亲代(一代)把遗传信息传递给子代(二代),主要由携带遗传信息的脱氧核糖核酸(DNA)分子中碱基的排列顺序(即碱基序列)来决定,并在细胞核内遗传。但人们在研究中发现,在DNA碱基序列以外还有一套调控机制,包括 DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA等,它们在不涉及改变DNA碱基序列的情况下,影响转录活性并调控基因的表达,改变机体的性状,并且是一种可以预和逆转的遗传机制。这种非孟德尔遗传现象,称作表观遗传学[1-2]。
2 硒对表观遗传修饰异常产生干预及逆D作用
肿瘤发生发展的主要生物学原因是原癌基因活化和抑癌基因失活[3]。研究显示,DNA甲基化水平同这些基因的表达密切相关。通常情况下,甲基化水平同基因表达呈负相关,甲基化程度越高,基因表达活性越低,甲基化程度越低,基因表达越活跃[4]。
DNA甲基化主要表现为基因组整体甲基化水平降低和局部CpG岛[在哺乳动物中富含胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)二核苷酸的一段DNA称为CpG岛]甲基化程度的异常升高,人类基因组的甲基化主要发生在CpG岛[5]。
研究表明,实体瘤普遍存在基因组广泛低甲基化现象,低甲基化使原癌基因活化,癌细胞异常增殖;低甲基化还使肿瘤转移增加,例如胃癌的甲基化水平越低,癌细胞浸润、转移的倾向越明显[6]。
CpG岛的甲基化程度异常升高,会导致某些抑癌基因表达沉默,进而参与肿瘤的发生发展。在正常情况下,CpG岛为非甲基化。当肿瘤抑癌基因的启动子区域(CpG岛)过度甲基化,就会使抑癌基因的表达沉默。其间DNA甲基转移酶(DNMT)家族中的DNMT1发挥着重要的调控作用,它的高表达导致抑癌基因在CpG岛失活。所以,CpG岛高甲基化成了多种肿瘤特异性表观标志物,已成为临床多种肿瘤早期诊断的依据和指标[7]。
近年来,作为表观遗传学调控机制之一的组蛋白修饰在肿瘤研究领域受到越来越多的关注。组蛋白乙酰化由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白去乙酰化酶(HDACs)共同调控,而编码HAT或HDAC的基因如果发生染色体易位、扩增等突变会导致某些肿瘤的发生。
可见,DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传修饰异常是肿瘤发生的另外一个机制。而近年研究发现,硒通过靶向干预可逆转甲基化和乙酰化异常的过程,从而抑制肿瘤的发生及转移。硒化物成了潜在的治癌新药物,是亟待开发、临床应用前景可观的“含硒表观靶向抗癌药物”。
2.1 硒对DNA甲基化产生干预作用
研究表明,膳食硒通过干预表观遗传过程显示出其抗癌潜力,膳食缺硒时组织呈现整体低甲基化[8]。Davis等[9]早些时候研究发现,给大鼠喂食缺硒膳食,其肝脏和结肠都出现显著DNA低甲基化,而经硒处理的人结肠癌细胞株Caco-2 DNA甲基化水平显著高于未经硒处理的对照组,据此研究者认为,膳食缺硒会增加肝脏和结肠肿瘤的发生。Remely等[8]研究表明,膳食硒营养缺乏会引起动物组织和人体结肠癌DNA低甲基化。我国学者徐世文等[4]通过实验也发现,饲料硒缺乏可导致鸡肌肉组织 DNA甲基化水平降低。硒对DNMT有抑制作用,缺硒会导致DNMT活性增加,使原癌基因活化,引起结肠癌等多种肿瘤发生。保持硒等营养素均衡摄入,有利于维持DNA甲基化正常水平及抑制DNMT活性[6]。
CpG岛DNMT1的高表达是使抑癌基因失活的重要机制。抑制DNMT1靶酶活性,使失活的抑癌基因复活,是肿瘤治疗中探索的新途径。硒在多种肿瘤中有去甲基化的生物学功能,能诱导失活的抑癌基因重新活化和表达[3]。研究发现,硒可以直接干预DNA甲基化,抑制腺癌细胞株DNMT的高表达[8]。膳食硒干预DNA甲基化的方式之一是通过去甲基化过程来调节DNMT1活性的;研究还证实,亚硒酸钠和苯甲基氰酸硒(BSC)、1,4-苯双(亚甲基)氰酸硒(p-XSC)两种合成硒化物对人大肠癌细胞核提取物中DNMT的活性都有抑制作用[10]。
各方面的研究验证,硒对DNA甲基化产生干预影响,是靶酶DNMT有效的抑制剂。
2.2 硒干预影响组蛋白的乙酰化
近年来,国内外学者研究发现,组蛋白去乙酰化酶与肿瘤的发生密切相关。HDACs家族中的HDAC1高表达可明显增加肿瘤细胞的增殖能力。在食管鳞癌、前列腺癌等多种肿瘤中均发现HDAC的高表达,靶酶HDAC已成为首选的攻击靶点。
目前,人们通过体内、体外的研究鉴定出了硒、丁酸盐、曲古抑菌素A(TSA)等一些HDAC的抑制剂,这些抑制剂可在体外诱导多种肿瘤细胞的生长停滞、分化或凋亡[2]。Somech等[11]通过临床试验表明,HDAC抑制剂对人体白血病及实体瘤进行治疗,表现出明显的抗肿瘤增殖效果,研究者认为,各类HDAC抑制剂是另一类新型抗癌药物、“癌症治疗的新工具”。
Xiang等[12]的研究证明,硒可以通过下调DNMT和抑制HDAC活性,活化人前列腺癌LNCaP细胞系中因高甲基化沉默的基因GSTP1, APC和CSR1。这些基因是具有保护免受氧化损伤的抗癌活性物质、化学致癌物解毒剂或肿瘤抑制剂。
甲基硒酸(MSA)是近年来新研制成的一种人工低分子量有机硒化合物,是很具潜力的抗癌制剂。Kassam等[13]通过对弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系(DLBCL)w外研究首次发现,MSA可以抑制该细胞系HDAC的活性。研究者认为,有关MSA抑制HDAC活性的作用以前从未报道过,从而为人们提供了硒元素一种新的机制,MSA是日后临床试验中可以使用的硒化物。
我国科研人员胡琛霏[2]通过蛋白质免疫印迹的方法,检测到MSA可抑制食管鳞癌细胞系HDAC的活性,降低HDACl和HDAC2的蛋白表达,引起细胞内组蛋白乙酰化水平显著升高;同时,还检测到硒甲硫氨酸(SLM)对食管鳞癌细胞系KYSEl50细胞和MCF7细胞的作用,在SLM处理细胞24 h后,细胞中组蛋白去乙酰化酶的活性也显著降低。
这些年,越来越多的含硒组蛋白去乙酰化酶抑制剂被发现和验证。亚硒酸钠、酮C甲基硒丁酸盐(KMSB)、甲基硒代半胱氨酸(MSC)、甲基硒丙酮酸(MSP)等硒化物都可以抑制HDAC活性,提高组蛋白乙酰化水平,作为潜在的HDAC抑制剂,发挥其抗肿瘤的作用[14]。Fernandes 等[15]介绍,KMSB 和 MSP在体外作为HDAC的竞争性抑制剂发挥抗癌作用;还报道,合成的SAHA含硒类似物(5-苯甲酰戊氰硒)二硒醚和5-苯甲酰戊氰硒对不同肺癌细胞株HDAC抑制效果比SAHA更好。SAHA是氧肟酸类HDAC抑制剂,是目前在临床上以皮肤T淋巴细胞瘤(CTCL)为适应症而广泛应用的表观靶向抗癌药物。这也提示,含硒类抑制剂对靶酶HDAC抑制效果优于无硒类抑制剂。
为何上述各种硒化物都可靶向抑制DNMT和HDAC活性,研究发现不管其结构如何改变,硒都是这些化合物生物活性的中心元素,发挥着关键作用,硒的这一生物学功能对含硒抗癌药物的开发具有重要的指导意义[16]。
2.3 硒对非编码RNA调控机制产生干预效应
表观遗传学的一个重要调控机制是非编码RNA。非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的RNA分子。近年来,非编码RNA一族中的微小RNA-200(miR-200)受到人们的高度关注。研究发现,miR-200家族中的成员微小RNA-200a(miR-200a)与肿瘤的发生发展关系密切,miR-200a在肿瘤组织中呈现明显低表达。因此,miR-200a的表达下调是肿瘤发生的重要因素之一,miR-200a也成了肿瘤特异性表观标志物[17]。
胡琛霏[2]通过TaqMan芯片,检测了MSA处理食管鳞癌细胞后细胞中微小RNA(miRNA)的变化情况,发现MSA可以上调细胞中miR-200a 的表达水平,miR-200a 表达升高后,负性调控Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)的表达,使Keap1蛋白水平下降,上调转录因子NF-E2相关因子2(Nrf2)蛋白水平并提高其转录活性(Nrf2活性受其细胞质接头蛋白Keap1的调控),从而活化Keap1-Nrf2信号通路。而Keap1-Nrf2信号通路在抗氧化、预防肿瘤发生等诸多方面有重要作用[18]。
体外研究显示[19] ,人脑膜瘤组织中miR-200a表达明显低于正常组织,β-循环蛋白(β-catenin)和其下游靶基因细胞周期蛋白D1表达显著增高,二者和miR-200a呈现负相关,上调miR-200a可降低β-catenin的表达,进而阻断Wnt/β-catenin信号传导通路来抑制脑膜瘤的生长。胡琛霏课题组前期研究也发现MSA可以抑制食管鳞癌细胞系中β-catenin的表达[2] 。研究已证实,Wnt/β-catenin信号通路的激活和高表达可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抑制肿瘤细胞的凋亡[20]。
由此可见,MSA可能介导、调控着miR-200a表达及参与复杂的分子调控网络,从而抑制肿瘤发生及转移。
3 展望
加强硒与表观遗传学之间关联的研究,有着重要的生物医学意义。它有可能解释硒化学抗肿瘤的新机制,从理论上证明硒元素可能具有表观遗传学的效应[21] 。综上所述,硒在肿瘤形成中对表观遗传修饰异常产生干预影响,靶向抑制肿瘤特异性表观标志物,逆转表观遗传修饰发生异化过程,使我们认识了硒化学抗癌的新机制、新作用,硒化物是潜在开发的新型靶向抗癌药物。Fernandes 等[15]指出,硒化物都是癌症治疗药。目前,非表观类含硒靶向抗癌药如硒唑呋喃、依布硒啉、乙烷硒啉等早已进入临床研究[16],展示出很有希望的临床应用前景。而含硒表观靶向抗癌药物是亟待开发的抗癌药“富矿”,加快开发含硒表观靶向抗癌药物,可为临床肿瘤治疗增加一种“新的工具”,为癌症患者战胜病魔增添一份新的希望。人们热切期盼“含硒表观分子靶向抗癌药物”早日问世。
致谢:本课题研究得到华中科技大学徐辉碧、黄开勋两位教授和安徽医科大学张文昌硕士的支持,在此表示衷心感谢。
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一般意义上的遗传学指基于DNA序列改变导致基因表达水平的变化,如基因突变、基因杂合丢失和微星不稳定等,表观遗传学指非DNA序列改变,是细胞内除了遗传信息以外的其它可遗传物质发生的改变。表观遗传学研究主要包括染色体重塑、组蛋白修饰,DNA甲基化,非编码RNA调控等。
真核细胞的特征是有细胞核,细胞核包含了真核生物几乎所有的遗传物质。真核生物基因组DNA储存在细胞核内的染色质中,核小体( nucleosome) 是构成真核生物染色体的基本结构单位。各核小体串联而成染色质纤维,核小体DNA长度约为165个碱基对,其中缠结在组蛋白八聚体周围的核心DNA( core DNA) 约1. 65圈,约合147个碱基对,而相邻的核小体之间的自由区域( linber DNA) 为20 - 50个碱基的长度,也就是基因组的75% ~ 90% 被核小体所占据。组蛋白八聚体由H2A、H2B、H3和H4各2个拷贝组成,每个核心组蛋白都有两个结构域: 组蛋白的球形折叠区和氨基末端结构像一条尾巴( tail) 位于核小体的球形结构以外,可同其它调节蛋白和DNA发生相互作用,染色体的高级结构和基因的转录调控都与组蛋白密切相关。核小体组蛋白的尾巴可以发挥信号位点的作用。
上面已谈到表观遗传学是指非DNA序列改变,而是改变染色质结构导致基因表达水平的变化。那么,染色质结构改变如何导致基因转录和表达水平改变的呢?
其一,在细胞里,DNA-染色质的形式存在,核小体是染色质的基本结构单位,75% ~ 90% 的基因组存在其中,核心组蛋白的尾巴的各种位点通过多种转移酶的作用,发生共价修饰,组蛋白通过电荷相互作用( 组蛋白尾巴带正电荷,DNA带负电荷) 如组蛋白乙酰化修饰可以通过电荷中和方式削弱组蛋白-DNA或核小体 - 核小体的相互作用,或引起构象的变化,破坏核小体结构,使DNA接近转导机构,激活转录。
其二,为保证染色质的DNA与蛋白质的动态结合,细胞内产生了一系列特定的染色体重塑复合物,也称重塑子,它们利用水解ATP的能量通过滑动、重建、移除核小体等方式改变组蛋白与DNA结合状态,使蛋白质易于接近目标DNA。依据重塑子包含的ATP酶中催化亚基结构域的不同,把重塑子分为SWI/SNF、ISWI、CHD、IN080四大家族。组蛋白修饰后如乙酰化的组蛋白可以募集转录复合物进入到一个基因位点,影响转录。
2 认知过程中的表观遗传学机制
通过新信息或经验获得的记忆可保持数月、数年,甚至终生,而长时间保持存活的蛋白质或mRNA的半衰期只有24 h,显然,二者之间存在很大的矛盾,那么记忆的物质基础到底是什么? 1984年,Crick提出了一个假设,即记忆编码在染色体的DNA上,虽然当时他并不是十分确信,但现已澄清,染色体是信息的携带者,而且可以代代传下去,染色体结构或化学上的改变与认知功能的关系可作如下的理解: 表观遗传学的改变是对来到大脑的信息、应激和神经元活性改变做出结构上的适应,最终将信息带至并激活特异性基因表达程序。目前研究证明,在脑的一些区域发生的表观遗传学改变如组蛋白的乙酰化、甲基化、磷酸化可以稳定地改变动物的行为,包括学习、记忆、抑郁、药物依赖、突触可塑性等等,为长记忆的形成、巩固和突触可塑性的形成、维持提供解释[5,6,7,8]。
阅读近十几年发表的有关表观遗传学文章后,解决了长期以来认知过程中令人费解的一些问题,本文着重介绍在脑的不同区域( 主要是海马和脑皮层) 组蛋白修饰和DNA甲基化在认知过程中的作用及其可能的机制。
2. 1组蛋白乙酰化[9,10,11]一系列表观遗传学改变都能影响记忆过程,其中组蛋白乙酰化,具有明确、显著地促进记忆的形成和巩固。组 蛋白乙酰 化是通过 组蛋白乙 酰化酶( HATs) 催化完成的。HATs将带正电荷的乙酰基转移到组蛋白N末端尾区内赖氨酸侧链的-氨基。组蛋白乙酰化酶被分成3个主要家族: GNAT超家族,MYST家族和P300 /CBP家族。将乙酰基从组蛋白移走,由组蛋白去乙酰化酶( HDACs) 催化完成,HDACs被分成4类: Ⅰ类,锌依赖型HDACs,Ⅱ类和Ⅳ类HDACs,Ⅲ类NAD依赖性HDACs。在哺乳动物中,海马在记忆形成中起重要作用。许多学者以海马区域作为研究对象,研究了组蛋白乙酰化对条件性恐惧中的背景记忆( contextual memory) 和空间记忆的影响。研究证明组蛋白乙酰化或抑制HDACs活性都能增强条件性恐惧中的背景记忆和Morris水迷宫中的空间记忆以及增加突触可塑性( synaptic plasticity) 。应当指出的是,脑中组蛋白乙酰化不是独立于其它组蛋白修饰而存在,而是在组蛋白乙酰化的同时,也往往存在组蛋白磷酸化、甲基化。组蛋白乙酰化削弱了组蛋白与DNA之间的静电亲和力,从而促进染色体结构接近转录基因机构,引起基因持续性改变,增加神经元活动,乙酰化修 饰后的组 蛋白也可 以募集其 它相关因子[10,11,12,13],如转录复合物,进入到基因位点,影响转录。
2. 2 组蛋白乙酰化的调节机制[14,15,16]
2. 2. 1神经元活性与组蛋白乙酰化组蛋白乙酰化可由许多类型的神经元活性所调节,例如,KCl介导的神经元去极化引起海马培养中的核心组蛋白H2B乙酰化的增加,再如,特异性受体激动剂可兴奋多巴胺能、乙酰胆碱能、谷氨酸能途径,增加小鼠海马H3K14和H3S10的乙酰化,在所有这些情况下,组蛋白乙酰化都伴有细胞外调节激酶ERK( MAPK家族中的一员) 的激活,直接激活MAPK-ERK信号途径可增加组蛋白乙酰化,而MAPK-ERK抑制剂则可阻断组蛋白乙酰化[16,17,18],这些研究表明,神经元活性引起组蛋白乙酰化是通过MAPK依赖性途径的激活,而且也可能是通过H3S10磷酸化之间的对话。后者常与在蛋白乙酰化同时存在,从染色体脱离的HPAC2引起的神经活性,也能改变组蛋白的乙酰化,用BDNF刺激皮层神经元,能引起HDAC2在胞嘧啶262和274位的硝基化及随后组蛋白的高乙酰化及随后组蛋白的乙酰化,并伴有神经营养因子依赖性基因表达的增强。已知MECP2可增加BDNF的表达,但被HDAC2负面调节。因此,神经活性参与了以HDAC2和BDNF为中心的正性反馈,该系统导致组蛋白乙酰化和基因自身的持续表达。
2. 2. 2突触可塑性与组蛋白乙酰化长时程突触可塑性涉及突触维持和交流有关基因表达的改变,已有充分材料证明,组蛋白乙酰化促进这一改变,例如在海兔( Aplysia) 组蛋白乙酰化能诱导长期易化 ( LTF) 并伴有CREB结合蛋白CBP的增加[19],类似的改变也在突触素( synapsin) 的启动子区域观察到,突触素与LTF和LTD均有关。不过,伴有CREB乙酰化的减少,正常情况下,诱导LTF需施加强电刺激,但如果提前给予RNA干扰( RNAi) ,弱的电刺激也能诱导LTF。这一发现提示,组蛋白乙酰化程度与突触可塑性程度密切相关,HDAC1能增加天然存在的突触传递过程,在哺乳动物的LTP也与组蛋白乙酰化水平有关。LTP诱导可平行出现H3和H4组蛋白乙酰化的增加,从研究中还明显看出LTP促进乙酰化,改变特异地存在于与突触传递有关基因如Reelin和BDNF启动子区域,这一结果与前述看法一致,即在组蛋白乙酰化过程中存在一个基因自身持续性改变的正性反馈系统。此外,有关HATCBP的研究表明,增加组蛋白乙酰化能促进LTP,部分或完全缺失CBP功能的小鼠出现组蛋白乙酰化水平的下降和LTP形成受阻。不过,不依赖转录的早期LTP不受影响。
2. 2. 3记忆形成与组蛋白乙酰化[20,21]在低等生物和哺乳动物进行的研究证明,不管哪种记忆类型或哪种记忆时相( 记忆获得,巩固和再现) 都能对组蛋白乙酰化进行调节,例如背景性和线索性恐惧记忆( fear memory contextual and fearmemory cued) 都能增加H3乙酰化,小鼠眨眼条件反射( eyeblink conditioning) 和大鼠潜伏抑制 ( latent inhibition) 能分别增加组蛋白H3和H4乙酰化,大小鼠物体识别记忆( Objectrecognition memory) 伴有H3和H4乙酰化的增加,此外优先食物转换( social transmission of food preference) 和食物厌恶记忆( food aversion memory) 等均能增加H3乙酰化,空间记忆( spatial memory) 伴有H2B,H3和H4乙酰化。
从上述组蛋白乙酰化研究的论述可得出以下几点结论:
( 1) 组蛋白乙酰化,不是脱离开其它组蛋白修饰而独立存在,即在发生组蛋白乙酰化的同时,也有组蛋白磷酸化、甲基化等的发生,其它表观遗传学改变对组蛋白乙酰化起了协同作用。
( 2) 神经元活性可调节组蛋白乙酰化,神经元活性的启动需要MAPK-ERK信号途径的激活。
长记忆和突触长时程增强均涉及许多基因的转导和表达,最常见和最重要的基因包括即早基因Zif/268,Creb,Bdnf和Reelin等。
( 3) 许多种类的神经活性存在一个以BDNF和HDAC2为中心的正性反馈系统,该系统可导致组蛋白乙酰化和基因自身持续表达程序。
( 4) 在多种生物体和细胞研究中观察到各种不同类型的记忆模式和不同记忆时相都能引起组蛋白乙酰化,进而促进记忆和有关基因的转录和表达。
( 5) 组蛋白乙酰化能引起长记忆的形成和巩固,但对无须转录的短记忆和早期LTP没有影响。
2. 3神经元活性是如何引起组蛋白乙酰化,它的作用机制是什么?[11]途径之一,神经元活性包括LTP和学习激活G蛋白偶联受体( GPCRs) ,然后依次激活腺苷环化酶( AC) 产生c AMP,后者激活PKA,PKA磷酸化MEK( MAPK家族中的一员) ,MAPK的家族成员能直接磷酸化组蛋白,随后启动组蛋白乙酰化。
途径之二,神经元活性可通过钙内流引起膜去极化,然后激活CAMKⅡ,后者磷酸 化甲基-CPG结合蛋白2( MECP2) ,使MECP2从染色体脱离出来,Calmodulin刺激BDNF启动子区域的基因转导。BDNF激活一氧化氮合酶导致组蛋白乙酰化酶2( HDAC2) 的硝基化,在硝基化作用下,HDAC2从染色体中脱离出来并强化硝基化,结果引起BDNF表达并参与正性反馈系统,进而促进记忆 - 持续性基因表达的改变( 见Fig 1) 。
其他一些学者的研究工作指出: 激动NMDA受体,抑制磷酸二酯酶( PDE) ,增加细胞内钙等多种途径均可激活PKA,PKA则可直接激活CBP,如前所述。含有乙酰转移酶活性的CBP与CREB结合,是提高突触可塑性形成长记忆的必备条件; NO启动组蛋白影响记忆的机制有二,一是激活N0-cG MP-Ca MKII-CREB磷酸化的信号转导途径; 二是NO依赖性的HDAC的5-硝基化,可增加组蛋白乙酰化,而NO供体与5-硝基谷胱甘肽,可抑制HDAC活性,因而,也能增加组蛋白乙酰化。此外,神经元活动或突触活动引起胞外钙内流入神经细胞内,使Me CP2的S421磷酸化,S80去磷酸化,后者从染色质分离出来,发挥对神经可塑性和记忆的调控作用。
2. 4 RNA干扰 ( RNA interference,RNAi)指内源性或外源性双链RNA( dsRAN) 介导细胞内mRNA发生特异性降解,导致靶基因表达沉默,产生相应功能表型缺失,RNA干扰下的基因沉默是表观遗传学的重要内容,人工合成的小RNA( SiRNA) 包括miRNA和SiRNA。小RNA序列较短,能指导Argonaute蛋白识别的靶分子并导致基因沉默。
已证明,组蛋白去乙酰化酶HDAC阻遏学习记忆,并在细胞内有广泛分布,人工合成HDACi显然有重要的治疗价值,HDAC2的结构很接近HPAC1,尽管如此,科学家们还是合成许多类型的HDACi,上述各种类型学习记忆和突触可塑性模型证明使用HDAC2i可促进记忆,增强LTP,阻遏记忆下降。
3 组蛋白和 DNA 甲基化[20,21]
甲基化可发生在组蛋白,也可发生DNA上。尽管这二种甲基化产生的方式、调节机制和涉及的酶与蛋白等有所区别,但二者甲基化的结果是一致的,即他们都能激活基因的转录与表达,从而促进长记忆的形成和提高突触可塑性。这点学术界的看法一致,没有任何异议。下面将重点介绍组蛋白和DNA甲基化是如何形成,又如何影响基因转录及长记忆和突触可塑性的?
真核细胞中,甲基化只发生在胞嘧啶第五位碳原子上,是由甲基转移酶所催化,以S-腺苷甲硫氨酸( S-adnosylmethionine,SAM) 作为甲基供体,将甲基转移到胞嘧啶上,DNA甲基化主要发生在Cp G双核苷酸序列的胞嘧啶上,哺乳动物异染色质的DNA约有80% 的CPG被甲基化,根据作用方式和反应酶不同,DNA甲基化分为两种: 维持甲基化( maintenance methylation) 和从头甲基化 ( de novo methylation) ,前者与DNA复制相关联。当甲基化的双链DNA被复制生成两条的新的双链DNA后,只有亲代链是甲基化的,甲基转移酶是DNMT1,后者则是DNA上甲基化状态的重新构建,它不依据DNA复制在完全非甲基化的DNA碱基位点上引入甲基,是甲基化的建立机制。甲基转移酶依赖于DNMT3a和DNMT3b的活性。
对基因转录的影响: 目前研究发现,组蛋白精氨酸甲基化常伴随转录的激活,赖氨酸残基上的甲基化则因赖氨酸所在的位置不同而有差别,赖氨酸甲基化发生在组蛋白H3的第4,第9,第27,第36,第79( K4,K9,K27,K36,K79) 位及H4K20位上,其中,在酵母和哺乳动物细胞中H3K4和H336位点被甲基化可以激活转录,而H3K9 K27 K79和H420的赖氨酸甲基化则可抑制转录。
DNA甲基化对基因表达的调节主要表现为抑制转录活性,一种可能的机制是由于DNA甲基化直接抑制了转录因子的结合,不能形成转录复合体,从而也就抑制了基因转录活性[16,18,20]。
对记忆的调节作用: Swati Gupta及其同事[21]研究了组蛋白甲基化对成年动物海马部位记忆形成的影响,他们的研究得出如下主要结果: 恐惧记忆能触发海马CA1区H3K4三甲基化( 转录激活标志) 和H3K9二甲基化( 转录抑制标志)的变化; H3K4特异的甲基化转移酶MⅡ缺失的小鼠出现长记忆形成障碍; 改变组蛋白甲基化与去乙酰化酶( HDAC) 抑制相偶联; H3K4三甲基化明显增加两种基因 ( Zif/268和Bdnf) 的启动子,这一事件出现在记忆巩固期间,已知这两种基因在记忆形成和神经可塑性中起重要作用。这些发现支持组蛋白甲基化在长记忆巩固中扮演重要作用,其他许多学者也都证明DNA甲基化与记忆形成和储存有关,如甲基化CpG结合蛋白1( methyl-Cp G-binding protein1) 基因缺失出现空间记忆能力丧失,甲基化CpG结合蛋白2 ( methyl-Cp Gbinding protein 2) 基因缺失的突变小鼠出现恐惧记忆、空间记忆和物体识别记忆的障碍。
海马DNA甲基化,对记忆形成起重要作用,但海马的改变是短暂的,训练后1 d之内便恢复到基础水平,长记忆以及记忆的巩固和储存依赖于脑的不同区域,据信长记忆的形成和巩固主要依赖于背侧前额叶前扣带皮层( dm DFC) ,为此探讨皮层组蛋白甲基化是否能促进长记忆的形成和巩固十分必要。Miller等采用背景性恐惧记忆试验探查皮层DNA甲基化对长记忆的影响,报道认为大鼠恐惧条件化环境中的背景记忆可维持数月,在这期间,近期( recent) 记忆会转变成远期( remote) 记忆,也即记忆从海马( HPC) 转变成依赖于dmP FC的记忆。首先,采用Me DIP即甲基化DNA免疫沉淀法测定皮层三种基因Zif/268,reln和Ca N的甲基化水平。动物试验则观察训练后7 d的背景记忆,将动物分为背景组( C) 、休克组( S) 和背景加休克组( CS) 。结果表明,在所有组和所有测定时间点,即早基因Zif/268均为去甲基化,说明环境刺激能广泛地改变dm PFC Zif/268的甲基化状态,相反的,一个记忆正性调节基因Reln仅在受训练的动物即CS组动物训练后1 h内出现高甲基化,随后即回归对照水平,训练后短时间内Ca N( 一种记忆抑制基因) 的甲基化无改变,但在训练后1 d,这一基因出现持久的甲基化,随后用BSP描绘训练后7 d Ca B甲基化的改变,发现仅CS组动物有显著的Ca N甲基化。为了解皮层DNA甲基化是否能反映联合学习,动物在训练前注射NMDA受体拮抗剂MK-801,证明MK-801干扰了训练后7 d动物恐惧记忆的获得( acquisition) ,也阻断了训练后2 d dmP FC Ca N和Reln的高甲基化,但不影响Zif/268的甲基化,进一步支持Ca N和Reln高甲基化是一种对联合性环境信号的特异性反应。Frankland等前期研究观察了训练后不同时间对ACC( anterior cingulate) 恐惧记忆再现( retrieval) 的干扰。结果证明ACC在18 ~ 36 d( 近期记忆) 经干扰失去记忆再现,但不是训练后1 d或3 d( 近期记忆) ,从这一结果估计记忆的巩固出现在训练后3 ~18 d,研究还证明皮层DNA甲基化可能在训练后1周内出现,该时段也是皮层留下记忆痕迹的时间,随后的实验证明训练后立即向背侧HPC( CA1) 注射NMDA受体选择性抑制剂AVP,证明APV不但能干扰学习,也能阻止训练后7 ddmP FC Ca N和Reln甲基化,表明一次性海马 - 依赖性学习经验就足以驱动皮层长时间、基因特异性甲基化改变,为了进一步探讨皮层DNA甲基化是否伴随长记忆的形成,观察了训练后30 d的皮层甲基化及记忆巩固的情况,结果证明在CS动物皮层的Ca N甲基化仍十分明显,而且与长记忆的出现和维持的时间段相吻合,此外还观察到在HPC有快速甲基化,而在dm PFC有持久的甲基化,以上研究阐明了以下几个问题: 第一,海马HPC可启动学习记忆,产出过渡性短记忆,第二,长记忆的形成和巩固依赖于dm PFC,第三,海马和皮层记忆的形成均缘于海马和皮层DNA的甲基化,或甲基化与其它组蛋白修饰的协同作用,第四,重要的记忆相关基因和受体包括Zif/268,Reln,Bdnf和NMDA受体。组蛋白甲基化是如何调整认知过程,它的生物学机制是什么?Day和Sweatt提出了阐明组蛋白甲基化是表观遗传学标志的假说[20],如在细胞内转变成功能性后果,出现三种可能性: 第一、DNA甲基化驱使神经细胞的反应状态发生了改变,即它允许、容纳其它机制参与进来产生协同效应和维持更加长远的改变; 第二、甲基化事件积极参与和改变基因的读出,促进记忆的进行,例如增加突触强度和突触可塑性; 第三、表观遗传学机制帮助神经细胞无增殖( aplastic) ,在神经元无增殖的情况下可以以稳定突触数量( synaptic weight) 的分布,后者是稳定记忆的必需条件,这一假设强调了突触可塑性在记忆过程中的重要性,事实上,国际上近年的研究表明老年痴呆认知功能的衰减与老年斑、A脑内沉积及神经纤维缠结无明显相关,由于突触在信息传递、信息加工中的重要作用,许多学者都支持突触功能降低( 包括突触效能下降和突触丢失) 是造成认知功能障碍乃至老年痴呆的主要原因,当前治疗老年痴呆和各种认知障碍的治疗方向都在寻找加强突触效能,防止突触丢失、增加突触新生的新药。
3. 1组蛋白磷酸化[25,26,27]组蛋白磷酸化修饰跟乙酰化和甲基化修饰一样具有调节认知功能的作用,这一修饰发生在组蛋白的H3、S1和S10丝氨酸残基上,由一组蛋白激酶包括丝裂原和应激激酶( MSKI) 和Aurora激酶家族催化完成。组蛋白磷酸化可被蛋白磷酸酶PP1和PP2a所逆转,这两种脱磷酸化酶又可被其它分子级联包括多巴胺和c AMP调节的磷酸蛋白32( DARPP32) 所抑制。最具特色的磷酸化标志存在于H3第10位( H3K10) 丝氨酸上,这一修饰招募了含有HAT活性的GCN5,因而能增加邻近组蛋白赖氨酸残基K9和K14的乙酰化,这解释了为什么组蛋白乙酰化和磷酸化常常同时存在。另外,H3S10磷酸化通过改变DNA和组蛋白尾部间的交互作用增加转录因子的结合。
许多研究工作已揭示组蛋白的磷酸化具有调节记忆形成的作用,编码RSK2的基因突变能产生低咖啡摄入综合症( coffin-lowry) ,有精神迟缓、精神异常等表现。在动物模型上的研究,背景性恐惧条件反射形成后,H3S10磷酸化和H3S10 / K14磷酸乙酰化迅速增加,但ERK抑制后可阻断其增加。同样的,缺失MSKI的小鼠出现恐惧记忆和空间记忆障碍,这一缺陷却不因给予HDAC抑制剂所逆转,提示组蛋白磷酸化途径与组蛋白乙酰化并行而不是位于乙酰化的下游,与此相协调的是,组蛋白磷酸化酶PPI受抑制,能改善长时程物体识别记忆和空间记忆而不影响短记忆,从这些发现推测: 通过抑制PPI来增加组蛋白磷酸化对治疗学习记忆障碍可能是一个有明显特色甚至是互补的治疗策略。
除学习记忆外,H3S10磷酸化也与药物成瘾行为学反应有关联。可卡因可引起纹状体H3S10磷酸化的增加,敲除MSKI的小鼠出现对服用可卡因行为反应的障碍。核内积累的DARPP-32能影响对可卡因和蔗糖奖励的行为反应。组蛋白磷酸化也已被证实是抗精神病和抗巴金森氏症下游的一个重要靶标,针对表观遗传学这一组蛋白磷酸化修饰设计和开发有治疗潜能的化合物是很有意义的。一项有意义的研究指出,MSKI主要存在于神经元和纹状体、杏仁核、海马等脑区,MSKI这一选择性分布是治疗干扰药物成瘾的一个很好的候选者。
哺乳动物细胞Aurora激酶家族成员的结构和功能在进化上保守,根据该家族成员在细胞内的定位可分为3种: Aurora-A,Aurora-B和Aurora-C。Aurora-B是有丝分裂中组蛋白H3的第四位丝氨酸磷酸化所必需的激酶。组蛋白H3磷酸化主要由Aurora-B激酶控制,除MSK和Aurora外,IB激酶( nuclear,IKK) 复合物中的异构体( IKK) 也可以调控海马区域组蛋白的磷酸化修饰,IKK是核因子B的一种去抑制调控子,抑制IKK可以阻止背景性环境下长期记忆的再巩固( reconsolidation)[24]。
组蛋白磷酸化促进长记忆形成和巩固的机制主要是磷酸基因携带的负电荷中和了组蛋白上的正电荷,造成组蛋白与DNA亲和力的下降,使DNA容易接近转录机构,激活基因转录,这是长记忆形成所必需的,也解释了为什么组蛋白磷酸化不影响短记忆。
在正常生理和表观遗传学的生化反应中,磷酸化使蛋白质和基因活化,随后的生化和生物学反应才能继续进行,所以在细胞繁殖、分化、细胞存活、DNA复制、转导和重组、细胞凋亡以及信号转导中发挥重要作用。
3. 2 其它组蛋白修饰与认知功能[27,28,29]
组蛋白泛素修饰涉及三类催化酶: 泛素激活酶( ubiquitin activating enzyme,E1 ) ,泛素接合酶 ( ubiquitin conjugatingenzyme,E2) 和泛素连接酶 ( ubiquitin protein ligase,E3 ) 。依赖这三种酶分三步进行泛素化修饰,第一步E1利用ATP形式存在的能量与泛素结合成高能硫酯键,构成泛素 - E1偶联物将泛素激活; 第二步,通过转酯作用将活化的泛素转移到泛素结合酶E2的活性半胱氨酸残基上; 随后,E2将活化的泛素转移至泛素连接酶E3上,形成高能量E3 - 泛素偶联物,最后E3可直接或间接地促使泛素转移到特异靶蛋白上,使泛素的羧基末端与靶蛋白的赖氨酸的-氨基形成肽链或转移到已与靶蛋白相连的泛素形成多聚泛素链,有一个去泛素酶大家族,从赖氨酸残基上移去泛素。
组蛋白泛素化有广泛的细胞功能,最著名的是控制转录的启动和延长,泛素酶/去泛素酶与其它组蛋白修饰,特别是与组蛋白甲基化有牵连,组蛋白泛素化与神经退性病变之间的关联来自亨廷氏病,Huntington与泛素连接酶h PRC12存在交互作用。在多个亨廷氏病动物模型上观察到泛素化的H2A的增加和泛素化的H2B减少,导致组蛋白甲基化模式的改变和基因转录下调,故以泛素连接酶为靶标设计药物对亨廷氏病可能有潜在的治疗价值。
多聚( ADP-核糖) 聚合酶[poly( ADP ribose) polymerases,PARPS]在与记忆行为有关的组蛋白修饰中起一定作用,PARPs可催化ADP核糖单位从NAD+转移到组蛋白靶位点上,不仅可影响染色质的局部结构,还可影响转录因子及染色质重塑复合体的结合,在操作性条件反射和位置回避实验中均证明PARP1可增加长记忆的形成。
3. 3衰老和神经退行性疾病的表观遗传学[27,28,29,30]衰老和年龄相关性神经退行性疾病是一个非常复杂的过程,过去有大量报道衰老与神经退行性疾病没有太多差异,如老年痴呆出现各种病理改变也在衰老过程中出现,但从未从表观遗传学方面去寻找原因,现有的研究揭示,表观遗传学的异常修饰是衰老和神经退行性疾病的主要机制,其主要病理特征表现在两个方面:
其一,组蛋白和基因组DNA甲基化的减少,在衰老和神经退化性疾病中表现突出,如神经细胞和基因组DNA亚甲基化( hypomethylation) 和甲基转移酶( HAT) 活性缺失,在AD患者的病理性神经元和基因组DNA的亚甲基化水平更低。Mastroeni等用免疫组化方法检测了死后AD和非AD( ND) 病人眶内皮层Ⅱ神经元的DNA甲基化和8种甲基化维持因子的免疫反应性,发现ND和AD神经细胞核具有甲基化胞嘧啶免疫反应阳性的神经细胞数分别为91. 7% 1. 3% 和39. 9% 3. 4% ,甲基化胞苷呈阳性的细胞数分别为91. 1% 1. 3% 和51. 8% 6. 1% ,即AD病人的两种甲基化模式比ND病人明显降低,DNMT,MOD2和P662均系甲基化维持因子,在ND病人神经元呈免疫反应阳性,而AD病人神经元免疫呈阴性,此外,RPL26和5. 8 SrRNA也有量的减少。
其二,HDAC2表达增加,研究证明神经退行性改变、衰老和长期应激都能引起HDAC2表达增加,如在神经退行性疾病和衰老时,神经毒性因子如A,氧化应激( H2O2) 和细胞内D25和CDK5激活,糖皮质激素受体( GR) 与临近组蛋白HDAC2启动子区的GR反应元件( CRE) 结合,增加脑内HDAC2水平,HDAC2优先与学习、记忆、神经可塑性有关的基因如BDNF结合,同时降低组蛋白乙酰化和基因的表达,破坏BDNF介导的正性反馈系统,从而降低神经可塑性和记忆的形成与巩固。
发表在《科学》杂志上的两篇研究揭示啮齿类动物的中含有一定数量的RNA,这些RNA分子能够影响子代的代谢活动。由于这些RNA是帮助合成蛋白质的关键元件(即转运RNA),因此这一发现揭示了一类新型的遗传物质。来自西雅图西北太平洋糖尿病研究所的遗传学家约瑟夫・纳多认为这一发现十分的令人震惊,但也不是完全毫无可能。
这一项研究揭示了一类新的RNA分子――转运RNA。其中一项工作中,遗传学家奥利弗・ 兰度向雄鼠饲喂低蛋白的饲料,发现这些雄鼠细胞中参与胆固醇与脂肪代谢的基因表达水平上升。之后,他们分析了这些雄鼠中的成分,发现其中含有相当数量的转运RNA,并且证明了这些转运RNA是在经过附睾过程中积累的。
另外一项研究则是由中科院的一个研究组做出的。他们通过向雄鼠饲喂高脂或低脂的食物,之后将这些雄鼠的注入未受精的卵子中。之后,他们开始追踪后代的代谢活动的规律(这些后代小鼠均饲喂正常食物)。结果显示,饲喂高脂食物的雄鼠的后代虽然体型较瘦,但还是显现出了肥胖与糖尿病的相关症状:葡萄糖摄入异常,胰岛素耐受。为了证明是否转运RNA参与其中,研究者将这些转运RNA单独注入未受精卵子中并让其接受正常的受精。结果显示,即使单独注入接受高脂食物的雄鼠中的转运RNA,也会使后代产生代谢异常的症状。
如今,研究者需要回答“这些遗传性状是否稳定,能否通过改变饮食的方式矫正”。RN段的作用并不一定都是有害的,如果坏的饮食习惯能够遗传给下一代的话,那么我们有理由相信好的饮食习惯也能遗传下去。 父亲可能影响孩子脑发育
美国宾夕法尼亚大学的研究人员在国际学术期刊PNAS上发表了一项研究进展,他们在分子水平上发现了应激如何改变雄性小鼠的,并通过这种方式影响其后代对应激的应答情况。他们还发现这种变化是通过表观遗传学的方式或microRNA进行传递的,并非通过改变DNA。
在早期研究中,研究人员已经证实在之前通过更换笼盒或进行狐狸尿(捕猎者气味)暴露处理雄性小鼠,使其处于应激状态,其后代对应激的应答情况会存在障碍。研究人员将受到应激的雄性小鼠和未受到应激的雄性小鼠的进行对比分析,发现在应激小鼠中有9种microRNA表达出现升高。
为进一步证实这一结果,研究人员将这9种microRNA通过显微注射的方式注入小鼠受精卵,随后植入正常雌性小鼠体内进行繁殖,并以假注射或注射单个microRNA作为对照。当子代小鼠成年后,研究人员检测了这些小鼠对应激的应答情况。研究人员表示,检测结果与他们之前观察到的结果完全匹配。
当接受多microRNA注射的小鼠受到轻微应激,它们体内可的松水平更低,这表明这些小鼠在早期神经发育过程中存在非常广泛的变化。
研究人员对这几个microRNA的靶向mRNA进行了分析,结果表明来自母亲卵细胞的mRNA受到了microRNA的攻击,并导致这些受到攻击的mRNA水平发生下降,研究人员还特别指出,这些受到影响的mRNA主要编码参与染色质重塑的蛋白分子。
研究人员表示,他们接下来准备对导致microRNA释放的上游因子进行进一步研究以及是否能够通过给予奖励等方式对上述过程进行干预,防止雄性亲代将异常应激反应传递给下一代。 母亲遗传给女儿负责情绪调节的脑结构
关键词:研究生;创新;分子生物学;教学改革
中图分类号:G642.0 文献标志码:A 文章编号:1674-9324(2016)02-0070-02
随着知识经济与科学技术的发展,高等学校以传承知识为主的传统教育模式正向强调能力与素质培养的创新教育模式转变。如今,创新已成为一种时代精神,培养高素质的创新人才是时代对高等学校提出的迫切要求。但由于近年来我国研究生招生教育规模的扩大,使得研究生教育阶段的人才培养在某种程度上出现了“一刀切”的现象,制约着创新型研究生人才的培养。因此,加强研究生创新能力的培养,提高研究生培养质量凸显其空前的必要性和迫切性。
目前我国研究生教育普遍存在着学生自主探索学习能力不足,研究创新能力较低,而导致这些问题发生的主要原因是现在的教学体系对研究生的创新学习能力培养不够[1]。在发达国家的研究生教育课程中,讲座式、研讨班式和案例式的课程比例在整个课程体系中高达40%~50%。与国际著名大学相比,我国的研究生教育课程内容和教学方法还存在一定差距,表现在以传统的理论课教学为主,进行灌输式教学,大大限制了学生的自主性和创新性。
分子生物学自诞生以来,是生命科学发展最为迅速的前沿学科,已渗透到生命科学的各个领域。《分子生物学》一直是本校基础与临床各医学专业硕士研究生必修课程,但由于其内容偏抽象难以理解、知识更新又快,传统的教学方法使得学生的学习效果并不理想。新时期分子生物学的教学目标不再是单纯让学生掌握基本的分子生物学原理,更要让学生学会如何应用这些基础知识来解决当下所面临的医药科研难题。鉴于此,笔者尝试对我校2014级医学类研究生的分子生物学课程进行改革,在传统的传授式教学基础上注重多种启发式教学方式的应用,以未采取教学改革的2013级研究生为参照,评估教改前后教学效果,以探讨新型教学模式对研究生自主性学习及分析、解决问题能力的影响。
一、分子生物学课堂教学中多种教学方式的实施
1.教材与最新研究进展的结合。在讲授分子生物学理论知识的同时,笔者注重介绍最新的国际学术动态和科研成果,引导学生去探索新的知识,培养其创新思维。例如在讲到真核基因表达调控的染色体结构与真核基因表达密切相关时,我们会给大家提及现在比较热门的“表观遗传学”。给学生们介绍些影响因子比较高的表观遗传学方面的英文文章,布置他们阅读文献后写出相关综述。使大家认识到表观遗传对基因表达的调控不仅体现在DNA的甲基化,组蛋白的乙酰化、甲基化以及一些非编码校RNA的调控都属于其调控范畴。这样,同学们不仅掌握了表观遗传的概念,对其技术路线和应用等方面都有所涉猎;一定程度上又提高了他们阅读英文文献的能力,对他们以后进入课题研究有很大的帮助。
2.PBL(Problem-based learning)教学方法的应用。PBL是一种强调以学生主动学习为主,提倡以问题为基础的讨论式、启发式教学方法[2]。它是由1969年美国的神经病学教授Barrows在加拿大的麦克马斯特大学创立,目前被国际公认的培养创新型人才的一种教学方式。
PBL的教学组织形式是“教师提出问题―个人查找资料准备―集体研讨”。首先教师要提出具有探索性的问题,一方面要兼顾教学的重点内容,另一方面要结合国内外研究热点。比如在讲到分子生物学的基因组学、转录组学和蛋白质组学等各种组学研究时,我们针对医学类研究生提出的问题是“试述主要组学有哪些,组学如何推动未来医学的发展”。同学们分组进行准备和讨论,考虑到学时有限,2014级选修学生数达358人,我们采取的是8~10人一组,每个小组每学期至少参与一次讨论,自行选定题目,小组人员分工合作查阅各类文献资料,认真地分析讨论,最终提出解决问题的思路和方案,并以PPT形式在课上进行总结汇报。根据汇报内容的完整性、条理性、创新性等由老师及其他组人员分别进行打分。该种教学模式引发了同学们对分子生物学学习的兴趣,不仅培养同学们独立思考、解决问题的能力,还增强了团队协作能力。
3.专题讲座式教学方式的应用。在分子生物学课程内容安排中,我们还尝试邀请校内科研工作者进行了“如何进行科研论文的写作”和“如何撰写基金申请书”两次实用的科学研究方法专题讲座。例如我们邀请本校获得多项国家自然科学基金资助、拥有“河北省优秀科技工作者”殊荣的教师给学生们讲解国家、省自然科学基金的写法及体会。进行讲座的老师从项目题目的写法开始,到立题依据、研究内容与目标、研究方案、可行性分析、项目特色与创新、经费预算及工作基础和条件,不仅向同学们展示了基金书写的全部流程,还介绍了自己的一些宝贵经验。通过这次讲座,不仅对同学们马上要进入的选题阶段有很大益处,从长远来看对他们以后独立进行课题申请也提供了重要的参考。
二、教改实施后的效果评价
目前,我校研究生的分子生物学课程考核还是以试卷考核为主,试卷考核作为期末成绩占总成绩的70%,平时成绩占30%。试卷70%的内容以教材的基础知识为主,30%为课堂相关内容的拓展和深入。平时成绩由上课出勤情况和平时作业组成,作业由教师布置与教学内容相关的问题和综述组成。为了评估应用多种教学方法的教学效果,我们对实施教改的本校2014级358名医学专业研究生与以单一式讲授式教学方式为主的2013级362名研究生的分子生物学平均成绩进行分析比较。结果如表1所示,2014级研究生无论是平时成绩、期末成绩还是最后总成绩均高于2013级研究生,其中总成绩之间比较具有显著性差异(P
以上比较结果显示,教改后的2014级研究生的分子生物学成绩普遍高于2013级学生。平时成绩高不是出勤率变化有多大,主要源于2014级学生平日作业成绩提高,考虑可能是老师设定问题后,同学们以小组形式查找文献资料再讨论、总结,比原来自己单独查资料更有效,从而获取的信息更丰富、材料组织得更加全面和深刻。期末成绩比原来高,其实基础理论成绩变化不大,主要是拓展内容部分成绩提高了。笔者考虑这与采用新型教学模式使同学们有更多机会接触并思考最新的科研进展是密不可分的。
三、结语
研究生课程教学是研究生教育的重要组成部分,是一个非常重要的系统工程,其质量高低直接影响研究生创新能力的培养。以往的研究生课堂教学以传授性方式为主,老师作为中心,学生是被动的听众,培养的人才大多缺乏想象力和创新能力,与21世纪国际竞争对创新人才的需求背道而驰[3]。本文笔者以医学专业研究生为研究对象,对分子生物学课程进行改革,教学方式由原来单纯的讲授式教学向综合应用各种教学方式转变。将PBL和专题讲座等启发性教学方式渗透进传统教学模式中,努力实现以学生为中心,教师在整个教学过程中只是组织、指导和促进者的转变。在理论教学中注重增加学术前沿内容,开拓学生视野,培养学生科研兴趣和创新思维。教改的调查结果显示新型教学模式获得了良好的教学效果,不仅帮助了学生更好地掌握理论知识从而提高考试成绩,最重要的是调动学生学习积极性、主动性,学会科学研究方法、培养科学创新能力,这对于培养新时期同时从事教学、科研、医疗的高级医学人才具有重要意义。
参考文献:
[1]马彬,杨克虎,田金徽,等.改革培养模式,造就创新人才――研究生循证医学教学改革实践[J].中国循证医学杂志,2009,9(4):481-483.
关键词:分子生物学;课程教学;改革研究;创新生物学人才
分子生物学的目标是在分子水平上阐明细胞活动的规律,从而揭示生命的本质[1]。虽然它在生物类专业课程体系中充当着重要角色,对生命科学的发展起着至关重要的作用,但是分子生物学的教学却因为课程内容多,学科交叉广,理解难度高,信息量大,知识更新快而使教学效果差强人意,集中表现为教师授课难和学生学习难。这种现状不但困扰着老师和同学,也与大学培养高素质创新型人才的目标不相适应。如何克服分子生物学课堂教学的“瓶颈”?本人在从事十多年的分子生物学教学过程中,努力研究和探索多种形式的教学改革,力求提升教学效果和教学质量。
一、教学内容的合理组织
分子生物学的教学除了选用好的教材,制定完善的教学大纲,如何组织教学内容是教学的一个非常重要环节[2]。教学内容呈现给学生的应该是完整、清晰的、有层次、条理的知识。我们在组织教学的过程中,首先从提高自身学科素养着手。“一本教材书,数种参考书”,除分子生物学国内、国外各类版本外,与分子生物学相互交叉和渗透的其他学科,如细胞生物学、生物化学、遗传学,我们也都进行了系统的学习和强化,不断夯实专业知识、拓展专业领域,基本构建了分子生物学完整的知识体系,具备了对教材处理的前提。既避免了教学中各学科的重复,也进一步凝练了知识。此外,我们还通过网络教学平台向全国优秀教师学习,在不断的探索中总结出了教学内容合理组织的一些思路。1.思维导学模式。在DNA复制教学环节,知识点多,并且较分散,很容易在教学中造成学习困难和知识混淆的现象,针对这章教学的特点,我们采用了思维导学模式,收到了非常好的教学效果。2.重点、难点解读。本科教学形式多样化,也更提倡学生的自主学习,但并不是淡化了教师的教学,反而对教师提出了更高的要求[3]。教师必须围绕每堂课的教学目的,合理组织和引导学生理解并掌握教学的重点和难点内容。比如在讲解染色体端粒末端修复机制中,教师首先要从教材的知识结构中梳理出重点。染色体端粒末端修复机制的知识点包括:(1)引物切除造成的遗传信息缺失;(2)端粒末端的特点;(3)体细胞和性细胞末端修复机制的不同;(4)DNA结构的变化;(5)端粒酶的修复机制。梳理知识点后,总结教学重点:一是引物切除后损伤修复在体细胞和性细胞中的不同;二是四链DNA结构;三是端粒酶的修复机制。其中端粒酶修复机制的讲授是学生学习的难点。难点集中在端粒酶的性质和修复发生的过程。经过对教学内容中重点和难点的准确把握和合理组织,教师才能在课堂教学中突出重点、突破难点,让学生的课堂学习无障碍。
二、教学方法和手段的改进
教学方法的推陈出新,是教学改革的重要内容[4]。为发挥学生作为教学主体的能动性,我们根据具体的教学内容设置了启发式、联想式、探究式等多种教学方法[5],让学生参与到教学过程中,不仅活跃了课堂气氛,而且在分享知识的同时,更注重教会学生灵活掌握学习的方法。
1.启发式教学。启发的目的在于举一反三,触类旁通。针对每一次的课堂教学,设计一些抛砖引玉的问题,供学生思考与讨论,这成为了分子生物学理论教学的重要组成部分。如进行到真核生物基因表达调控学习环节,提出甲基化修饰的生物学意义,这个问题覆盖范围广,涉及到了DNA复制的调节、蛋白质和DNA甲基化修饰对基因表达的调控,以及Epigenetic(表观遗传学)方面的知识。通过提出问题—讨论分析—不断启发—再讨论分析—归纳总结—解决问题这一系列的互动教学活动,充分调动了学生课堂学习的主动性和积极性,在不断的讨论分析中通过展示不同的思维、发表各自的观点,不但有利于促进学生在学习中发现问题、解决问题,而且有利于学生通过对基础知识的消化、理解来达到理论的升华、拓展[4]。
2.联想式教学。分子生物学是在生物化学、细胞生物学和遗传学的基础上发展而来[6],因此知识相互交叉、相互渗透。在授课的过程中,教师一方面要避免重复,一方面要通过联想知识点适时培养学生的发散性思维,提高学生对知识的迁移能力和整合能力。如在讲解化学修饰对基因的表达调控时,将细胞生物学中的信号转导有机结合,使学生了解基因表达调控对细胞信号转导的作用机制。
3.探究式教学。在分子生物学教学中,每一个理论知识的背后都是科学研究的重大突破。如确定遗传物质是DNA的两大经典实验,我们以探究的形式呈现教学内容,从实验设计,到结果显示,再经过讨论分析并得出结论,以课题研究的角度,研究人员的身份引导学生进入学习角色,将学科概念、理论产生的起因和过程展示给学生,启发学生努力探索,走近科学,让学生从中领悟知识形成的探究性和科学性,逐渐培养具有创新意识和能力的高素质研究型人才。4.多媒体多样化教学。分子生物学的教学内容具有微观性、复杂性、抽象性和动态性。传统的教学手段无法满足教学的需求,而多媒体技术则具有声像俱佳、动静皆宜的特点[7],是传统教学无法比拟的。多年来我们不断补充和完善教学手段,逐渐形成了独具特色的多媒体教学课件。多媒体图像处理清晰直观,文字表述简洁明了、主题突出。课件中的图像来源于国内外的网络数据平台。如讲述DNA半保留复制机理时[8],首先将DNA可能存在的几种复制方式用图像展现,并利用Meselson和Stahl设计的DNA复制同位素示踪实验和密度梯度离心实验来进行结果验证,引导学生明确掌握DNA半保留复制特点,并结合文字,通过图文并茂的多媒体课件,将教学内容中的背景知识、基本概念、基本理论,以及静态、抽象的微观知识清晰讲解。多媒体课件动静结合、声像互动。对于生命过程中动态的知识点,比如DNA的复制、RNA的转录、蛋白质的翻译过程,可以将这些复杂的生命过程利用多媒体手段做成动画并配以文字和声像,形象直观地展现给学生,既加深了学生对知识的理解,也提高了其学习效率。
三、知识领域的拓展
分子生物学的教学内容除包含基础理论知识外,还有大量理论应用的研究方法部分。我们在教学中不仅仅将知识局限在教材中,利用课堂教学不断引导学生去了解本学科相关领域内的研究热点、最新进展、发展趋势[8],以及生物技术在生产实践中的广泛应用。
1.专题讲座与专题讨论。专题讲座是教师根据教学内容,自己组织参考资料对教学内容的延伸与拓展。比如在讲授“SNP技术”时,先从遗传标记分析的发展着手,把一代、二代的标记分析做知识性的回顾,再将纳入教材的第三代标记分析“SNP”做详细的讲解,引导大家理解什么是单核苷酸多态性,核苷酸多态性研究的生物学意义以及在医学、农业、畜牧等多种领域的发展与应用。通过这种方式激发了学生的学习热情和求知欲,也使教师不断地进行知识的更新,及时了解本学科当前发展的趋势、研究的热点以及争论的问题。专题讨论则是以学生为主体,根据课程教学内容,组织学生就某一个专题自行查阅、组织文献资料,并在课堂上展开讨论[9]。比如在讲授基因重组的教学内容时,设计“转基因的利与弊”供学生讨论。引导学生思考基因工程药物和转基因动植物对社会产生的巨大影响,让知识离开课本走进生活,从而唤起学生学习的兴趣和探索未知领域的欲望。这不仅使学生更加深入、系统地理解所学知识,并且培养了学生灵活运用知识的能力[10]。
2.生物信息技术与数据库。生物信息技术已经发展成为分子生物学研究方法中不可分割的一部分,比如在“PCR技术”的专题讲座中,不仅要对实验目的、原理、操作以及应用进行讲解,还要特别对引物设计的生物信息技术进行补充,介绍学生对一些常规的生物信息技术软件Primer6.0、DNAman、Olig6.0、DNAS-tar、Cluster等有一个基本的认知度。在整个分子生物学的教学中,学生需要自行查阅和组织各种文献资料,因此,必须特别强调互联网资源运用的重要性。教师通过介绍中国知网、维普、清华同方、NCBI等几个常用资源库,使学生了解如何利用资源库进行查询,对互联网资源的熟练应用使学生的知识体系得以完善,学生通过自身的努力来提高信息收集和辨别的能力,培养了学生的自学能力。
四、教学改革中应该注意的问题
1.教师的专业修养与教学基本功。教师在教学中具有双重身份,既是一名导演,又是一名演员。作为导演,首先需要有最新的教学理念,整个教学过程中适时设问、适时讨论、适时启发。其次要有较强的课堂组织能力,根据学生的学习情况,把握课堂节奏,调动学生课堂学习激情,使教学有的放矢。否则会在教学中出现“启而不发”和论证条理不清的现象;作为演员,还要有良好的课程驾驭能力,通过教师扎实的专业知识、广泛的认知领域、全面的知识结构,呈现给学生的是一个丰盛的知识大餐,而不是一锅夹生饭。因此作为教师,必须从理论水平、科研水平、思维水平这3个方面提高教师自身的专业素质,此外,还要掌握适合自己的各项教学技能。
2.多媒体教学的合理应用。多媒体教学只是一种提高教学效果的辅助手段,是为教师的教学和学生的学习服务的,只有运用合理才可能达到好的效果。因此尽量避免在多媒体教学课件上出现过多的文字,否则多媒体成了教学活动中的主体,老师由照本宣科转变为扮演放映员和播音员的角色。学生的学习兴趣不高,教学效果也就适得其反。多媒体和传统教学只有合理地结合,取长补短,才能在课堂教学中体现出其真正的价值。总之,教学改革的目标是帮助学生建立学科知识体系,培养学生良好的科学素养,提升学生后继学习的能力。正如叶圣陶先生所说:“教师的教学,不在于给学生搬去可以致富的金子。而在于给学生点金的指头。”目前,我们关于分子生物学课堂教学改革还处于不断探索和实践阶段,除了需要不断地提高教师自身的学科修养和科研素质外,也以“夯实基础、拓展知识、增强能力、提高素质”[8]作为教学的目的和人才培养目标,努力在今后把教学工作开展得更加有生有色,为社会培养更多高素质创新型人才。
作者:武晓英 乔宏萍 张猛 吴丽华 郝雪峰 单位:太原师范学院
参考文献:
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【关键词】 杀伤细胞抑制性受体 基因表达调控 DNA甲基 组蛋白乙酰化
HLA半相合异基因造血干细胞移植具有广泛的临床应用前景, 但伴随的问题是移植物抗宿主病发生率高, 免疫重建缓慢, 感染机会增加, 如何克服这些问题是目前造血干细胞移植领域的研究热点。近年来一系列重要的临床研究发现, 在去除T细胞的HLA半相合异基因造血干细胞移植中, 杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immnoglobulinlike receptor, KIR)表型不合(移植物抗宿主方向)是对预后有利的因素[1-4]。KIR基因家族是表达在人自然杀伤(nature killer, NK)细胞和部分T细胞表面的具有调节功能的细胞表面分子家族, 它通过与靶细胞表面相应的HLA I类分子结合, 传导激活或抑制信号, 调节NK细胞功能[5]。KIR基因在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达模式, 由此形成了多种多样的能够特异性的识别、 清除异常细胞的NK细胞群[6]。因此, 只有了解KIR基因表达调控机制, 才能进一步明确NK细胞的生物学特性, 才能使人为调控NK细胞活性为临床应用成为可能。但是, 目前关于KIR的表达调控机制尚不完全清楚。本研究旨在从表观遗传学的角度对KIR3DL1基因的表达调控机制进行深入研究。
1 材料和方法
1.1 材料 人NK细胞系NK92MI购自美国ATCC细胞库; 5氮胞苷(5azacytidine, Aza)、 曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)、 肌醇、 巯基乙醇、 叶酸均购自Sigma公司; 氢醌和亚硫酸氢钠由上海生化试剂公司生产; αMEM培养基、 TRIzol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司; 马血清、 胎牛血清购自Hyclone公司; DNA提取试剂盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)、 MMLV逆转录酶、 dNTPs、 oligo(dT)18、 pGEMT easy载体、 T4 DNA连接酶、 感受态大肠杆菌JM109均购自Promega公司; Taq酶购自TaKaRa公司; PCR产物回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)购自Qiagen公司; PCR引物合成及测序均由北京奥科生物技术有限公司完成。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 NK92MI细胞用含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、 1.5 g/L NaHCO3、 0.2 mmol/L肌醇、 0.1 mmol/L巯基乙醇、 0.02 mmol/L叶酸、 125 mL/L马血清、 125 mL/L胎牛血清的αMEM培养基, 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养、 传代。
1.2.2 总RNA及DNA的提取 采用TRIzol RNA提取试剂盒按说明书步骤提取细胞总RNA, 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit按说明书步骤提取细胞基因组DNA, 紫外分光光度计定量。
1.2.3 DNA的亚硫酸氢盐修饰 参照文献[7]的方法, 取1 μg经1 mL注射器抽吸剪切后的基因组DNA, 加入去离子水稀释至50 μL, 向其中加入3 mol/L NaOH 5 μL, 37℃孵育25 min使DNA解开双链; 然后加入新鲜配制的10 mmol/L氢醌30 μL及3 mol/L亚硫酸氢钠520 μL(其内已加3 mol/L NaOH 370 μL), 混匀后于50℃孵育16 h; 用QIAquick Gel Extraction Kit纯化修饰后的DNA, 加入3 mol/L NaOH 5 μL, 37℃孵育20 min终止硫化修饰, 最后经3倍体积的无水乙醇沉淀后溶于20 μL去离子水, 修饰后的DNA于-20℃贮存备用。
1.2.4 PCR扩增及测序检测启动子甲基化状态 按照完全修饰后的KIR3DL1基因DNA序列设计特异性引物, 采用半巢式PCR扩增KIR3DL1基因启动子。第1轮PCR反应的上游引物: 5′GAAGAAGAGTTTGAATTTTAG3′, 下游引物: 5′CCATATCTTTACCTCCAAATC3′。以经亚硫酸氢钠修饰后的DNA为模板, 采用25μL的体系行PCR扩增, 体系包含2.5μL 10×PCR缓冲液、 1.5 mmol/L MgCl2、 200 μmol/L dNTPs、 上下游引物各10 pmol/L和1.25 U Taq酶。扩增条件: 95℃预变性10 min, 然后95℃ 90 s, 48℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共34个循环, 循环结束后继续于72℃延伸10 min。将扩增产物经20倍稀释后取1 μL作为模板进行第2轮扩增, PCR条件同前,上 游引物: 5′GTTAGTATAGATTTTAGGTATTT3′, 下游引物序列同前, 扩增产物长度397 bp。PCR产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 将PCR产物切胶回收后用T4 DNA连接酶与pGEMT Easy载体相连,连接反应体系: PCR产物与pGEMT Easy载体比例为3∶1, 2×连接反应缓冲液 5 μL, T4 DNA连接酶1 μL, 用去离子水补至10 μL, 4℃孵育过夜。取5 μL连接反应产物转化感受态大肠杆菌JM109, 将PCR初步鉴定阳性的克隆送测序鉴定。
1.2.5 甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂处理NK92MI细胞 实验前1 d将NK92MI细胞传代, 实验当天将细胞接种在 35 mm细胞培养皿中, 每个培养皿的细胞数为2×106个, 用2 mL完全培养基培养。实验孔加入终浓度依次为1 μmol/L、 2.5 μmol/L、 5 μmol/L的Aza, 或同时加入2.5 μmol/L的Aza和50 nmol/L的TSA, 或仅加入50 nmol/L的TSA, 对照孔加入等量PBS缓冲液, 细胞继续置于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度孵箱中培养。每隔24 h更换新鲜培养液及相同浓度的药物, 于处理72 h后收获细胞, 检测基因表达。每组实验重复3次。
1.2.6 RTPCR检测KIR3DL1基因表达 在20 μL逆转录体系中加3 μg RNA, 42℃水浴1 h, 95℃ 5 min灭活逆转录酶后, 取1 μL逆转录反应液为模板行PCR扩增。根据文献[8]合成引物, KIR3DL1上游引物: 5′ACATCGTGGTCACAGGTCC3′, 下游引物: 5′ACAACTTTGGATCTGGGCTT3′, 产物长度为682 bp; 内参照βactin上游引物: 5′CGCGAGAAGATGACCCAGATC3′, 下游引物: 5′TTGCTGATCCACATCTGCTGG3′, 产物长度为734 bp。PCR体系同上。扩增条件: 94℃预变性5 min后, 94℃ 1 min, 61℃ 1 min, 72℃ 45 s, 共5个循环, 然后94℃ 30 s, 60℃ 45 s, 72℃ 45 s, 共30个循环, 循环结束后继续于72℃延伸10 min。PCR产物行15 g/L琼脂糖凝胶电泳, 紫外凝胶成像仪扫描分析, 以KIR3DL1/βactin光密度比值作为KIR3DL1 mRNA水平相对值。
1.2.7 统计学处理 数据以x±s表示, 采用SPSS10.0统计软件包行t检验, 检验水准以P
2 结果
2.1 NK92MI细胞中KIR3DL1启动子区甲基化模式 CpG二核苷酸在KIR基因转录起始区域密度增加, 其出现率(观测值与期望值的比率)≥0.6, 符合CpG岛的定义[9], 因此, 本研究将KIR3DL1基因自转录起始位点上游-270 bp至下游+69 bp之间的这段长339 bp的序列定义为CpG岛, 为便于分析说明, 将这段序列内的全部19个CpG二核苷酸位点以转录起始位点编号, 上游为“-”, 下游为“+”。NK92MI细胞基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后, 采用PCR扩增KIR3DL1基因启动子序列, 将扩增产物连接到T载体, 转化感受态大肠杆菌, PCR初步鉴定阳性重组子, 随机挑取10个克隆行初步PCR鉴定, 均可扩增出与预期大小相一致的目的片段(图1)。阳性克隆进一步测序, 结果与GenBank数据库中KIR3DL1基因启动子序列(基因号NM_013289)比对, 除第1、 4、 5号克隆序列错误外, 得到7条正确的序列。亚硫酸氢盐修饰可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变, 以第10号克隆测序结果为例, 可见全部19个CpG二核苷酸位点由于被甲基化, CpG二核苷酸中的胞嘧啶保持不变, 其他部位的“C”全部发生改变(图2)。综合分析所得7条正确序列测序结果, NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子CpG二核苷酸位点甲基化频率在70%~100%之间, 因此, KIR3DL1基因启动子处于高度甲基化状态(图3)。
图1PCR方法鉴定含KIR3DL1启动子pGEMT easy载体的克隆(略)
Fig 1 Identification of clones containing KIR3DL1 promoterpGEMT easy vector by PCR amplification
M: DNA marker; 1-10: PCR products of clone 1 to 10.
图2 经硫化修饰后的KIR3DL1启动子部分测序结果(略)
Fig 2 Partial result of DNA sequencing of bisulfiteconverted KIR3DL1 promoter
图3 NK92MI细胞系中KIR3DL1启动子各CpG位点的甲基化频率(略)
Fig 3 Methylation frequency at inpidual CpG positions of KIR3DL1 promoter in NK92MI cell line
2.2 去甲基化诱导NK92MI细胞KIR3DL1表达增加 为进一步分析KIR3DL1基因启动子甲基化与基因表达的关系, 采用不同浓度的去甲基化药物Aza处理NK92MI细胞, 结果显示, 终浓度为1 μmol/L的Aza作用72 h, NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比无明显增加(t=0.632, P=0.562), 而2.5 μmol/L和5 μmol/L的Aza可以使KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比分别增加66.6%和114.6%(统计分析结果分别为: t=3.411, P=0.027; t=6.454, P=0.003), 说明去甲基化药物Aza可以诱导NK92MI细胞中KIR3DL1表达, 随药物浓度增加, 这一诱导作用逐渐增强(图4A); 单用50 nmol/L的TSA处理NK92MI细胞72 h, KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比无统计学意义(t=0.203, P=0.852), 将50 nmol/L的TSA与2.5 μmol/L Aza联用处理NK92MI细胞72 h, KIR3DL1 mRNA表达量与单用Aza组相比也无统计学意义(t=1.840, P=0.140), 说明单用TSA不能诱导KIR3DL1表达, 其与Aza联用后也没有协同作用(图4B)。
图4 RTPCR方法检测经5氮胞苷和曲古抑菌素A处理的NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达(略)
Fig 4 Detection of KIR3DL1 mRNA levels in 5azacytidine and trichostatin Atreated NK92MI cells by RTPCR
A: NK92MI cells were treated with different final concentrations of 5azacytidine (1 μmol/L, 2.5 μmol/L and 5 μmol/L) for 72 h; B: NK92MI cells were treated with 2.5 μmol/L of 5azacytidine and (or) 50 nmol/L of trichostatin A for 72 h. aP
3 讨论
KIR基因家族位于人染色体19q13.4, 目前发现有17个成员。KIR基因家族的特点是各成员在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达, 每个NK细胞只表达KIR基因家族部分成员, 一种KIR分子的表达不依赖于其他KIR分子, 从而形成了表达多种多样KIR分子的NK细胞群[5]。KIR基因的这一特有的表达模式对NK细胞特异性识别和清除异常细胞非常重要。在异基因造血干细胞移植中由于供受者之间KIR不相容引发的异源反应性NK细胞活性有利于增强移植物抗白血病作用、 抑制移植物被排斥和移植物抗宿主病、 促进造血干细胞植入, 延长患者生存期, 因此, 明确KIR表达调控机制, 调节NK细胞活性, 对改善造血干细胞移植预后具有重要临床意义, KIR基因表达调控机制已成为近年来的研究热点[10]。KIR3DL1基因与KIR家族其他成员的5′侧翼区序列同源性高达91.1%~99.6%, 在NK细胞表面呈多样性表达[11]。本研究组的前期实验证实KIR3DL1基因启动子在没有内源性KIR3DL1基因表达的K562细胞中具有活性(结果未显示); Stewart等[12]的研究也证实, KIR3DL1基因启动子不仅在有KIR3DL1基因表达的NK细胞系YTIndy中有活性, 并且在没有KIR3DL1基因表达的T细胞系Jurkat中也具有活性。可见KIR3DL1基因转录激活所需的反式作用因子在不同细胞系中广泛分布, 提示表观遗传机制可能在调控KIR3DL1基因表达中发挥重要作用。为此, 本研究首先采用亚硫酸氢盐测序法对NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子甲基化状态进行了检测, 证实KIR3DL1基因启动子存在高甲基化, 然后用去甲基化药物处理NK92MI细胞, 研究启动子甲基化与KIR3DL1基因表达的关系, 以确定KIR3DL1基因的表达是否受甲基化调控。
大量研究已证实DNA甲基化可以调控基因表达[13], 启动子甲基化, 基因转录活性被抑制; 去甲基化, 这一抑制作用被取消。DNA甲基化介导转录抑制的机制可能包括以下三方面: 其一, DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位点相结合, 抑制基因转录; 其二, 通过在甲基化DNA上结合特异的转录阻遏物(如甲基胞嘧啶结合蛋白1, 2), 这种蛋白质可以和转录因子竞争性地与甲基化DNA的结合位点结合, 抑制基因转录; 其三, 甲基化改变了蛋白质与DNA的相互作用, 导致染色质结构的改变,抑制基因转录。Aza是一种常用的甲基化抑制剂, 它通过与DNA甲基化酶共价结合, 降低其生物活性,从而逆转DNA甲基化。本研究证实Aza能够诱导NK92MI细胞KIR3DL1基因表达增加, 由此可以推断KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。
组蛋白乙酰化是表观遗传调控的另外一个重要方面[14], 组蛋白乙酰化由乙酰基转移酶催化完成, 此时染色质呈疏松状态, 有利于基因的表达; 相反, 组蛋白去乙酰化由去乙酰基转移酶催化完成, 此时染色质呈压缩状态, 不利于基因的表达。组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂TSA通过提高组蛋白乙酰化水平, 活化基因转录。但本研究应用TSA处理NK92MI细胞, 未见KIR3DL1基因表达增加, 也没有观察到其与Aza的协同作用; 本研究的前期结果显示, 即使用300 nmol/L的TSA也不能明显增加KIR3DL1基因转录(结果未显示); Santourlidis等[15]的研究也发现, 用25 nmol/L的TSA处理NKL细胞系不能诱导KIR3DL1基因转录增加。由此推测组蛋白乙酰化可能在KIR3DL1基因表达调控中作用不大。
综上所述, 通过检测NK92MI细胞KIR3DL1基因启动子区甲基化模式, 证实NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子存在高甲基化, 去甲基化处理能够诱导NK92MI细胞表达KIR3DL1基因, 因此, NK92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。
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