表观遗传学研究方法精选(九篇)

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第1篇：表观遗传学研究方法范文

孙英丽，中国科学院北京基因组研究所“百人计划”研究员、博士生导师，研究方向包括癌症表观基因组和癌症基因组的研究、肿瘤细胞中表观遗传调控和DNA通路损伤修复通路的关系研究、针对肿瘤细胞特异表观遗传调控的药物设计和筛选、针对肿瘤细胞DNA通路的药物设计和筛选。2000年获得北京大学生命科学学院博士学位之后，她先后在麻省理工学院和哈佛大学医学院从事博士后研究和讲师工作，进行肿瘤与细胞凋亡、DNA损伤修复的研究。2010年回国后，进入中国科学院北京基因组研究所工作。

我们能改变遗传病掌控人类命运这个事实吗？“这正是现代医学努力的方向，现在我们已经知道人类全部的基因组序列，接下来的任务就是通过人为手段调控和靶向作用于疾病基因。”孙英丽笑着说，“人类基因组解密以前想都不敢想，但现在人体内几乎每个密码都被我们掌握了，这就涉及到一个新的概念—个性化医疗。”

“个性化医疗”，是一种新型的疾病诊疗理念，是指针对每个人身体特质与病情特点给予针对性治疗。如今，个性化医疗已不再是梦想，它已经在发病率很高的乳腺癌的治疗中发挥了作用，运用个性化医疗的方法，早中期乳腺癌的生存率已经能够达到90%。个性化医疗是中科院北京基因组研究所非常重要的一个研究方向，据孙英丽介绍，北京基因组研究所专门建立了个性化医疗和重大疾病重点实验室，希望在个性化医疗方面能够开展更多研究，为每个人找到战胜疾病的最佳“武器”。

孙英丽回国后主要从事的肿瘤细胞以及干细胞的表观遗传和基因组稳定性的研究，又涉及到了一个新的研究方向—表观遗传学。表观遗传学是与遗传学相对应的概念，是人类基因组概念的一个补充，是不涉及DNA序列改变但影响细胞性状的遗传改变。传统遗传学认为只有DNA的性状发生了改变，才会影响功能和性状。但随着研究深入，人们发现即使是同卵双胞胎，也会存在很大差别，有时候其中一个患了严重的疾病，另外一个可能很健康，这些传统遗传学无法解释的问题，有望用表观遗传学解答。

孙英丽解释说，人类患病原因除了受遗传因素影响之外，还受环境影响，表观遗传学则将环境因素包括进来，对传统遗传学进行了很好的补充。目前在表观遗传学方面，孙英丽的研究主要集中在DNA甲基化和组蛋白甲基化两个方向，目标是检测肿瘤患者的甲基化水平，并进行相关调节，研发对肿瘤治疗有针对性、特异性的药物，提高治愈率。

第2篇：表观遗传学研究方法范文

【关键词】 精准医疗；肿瘤；研究进展；综述

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2016.04.216

精准医疗是通过基因组、蛋白质组等组学技术和其他前沿科技， 依据患者内在生物学信息及临床特点， 在分子学水平为疾病提供更加精细的分类及诊断， 从而对患者进行个性化精准治疗的一种新型医疗模式[1]。2011 年美国相关学者首次提出精准医疗的概念[2]。2015年美国总统奥巴马在国情咨文中谈到“人类基因组计划”， 并宣布实施精准医疗计划将这一研究推向新的[3]。

恶性肿瘤已成为目前全球主要的死亡原因之一， 其是一类基因性疾病， 大多具有自己独特的基因印记和变异类型， 基因组发生的突变， 可以影响细胞信号、染色体、表观调节及代谢等过程。这些研究成果很早已被利用在肿瘤的治疗中， 许多针对这些特异基因改变及表观遗传学改变的靶向药物已经上市或正在研发。肿瘤的精准医疗通常分为3个步骤：基因及表观遗传学检测、大数据分析和临床药物应用[1]。

1 基因及表观遗传学检测

基因是指携带有遗传信息的DNA或RNA序列， 是控制性状的基本遗传单位。基因通过指导蛋白质的合成来表达自己所携带的遗传信息， 从而控制生物个体的性状表现。基因检测是通过对血液、其他体液或细胞的DNA检测， 获得肿瘤单核苷酸有义突变、拷贝数变异、融合基因等基因变异的信息。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）曾一度认为是一类性质单一的疾病， 但近年发现DLBCL中具有不同的基因表达亚型， 如GCB（germinal-center B-cell-like）、ABC（activated B-cell-like）， 其起源于B细胞分化的不同阶段， 具有不同的生物学特性， ABC亚型中的基因变异可以引起NF-κB的活性改变， 导致预后不良[4]， 这已被临床实践所证实。

表观遗传学就是研究基因表达的学科， 是指基因表达的改变不依赖于基因信息的改变， 而是依赖于DNA甲基化和组蛋白的化学修饰。这些异常改变在一定条件下可以向正常逆转。肿瘤发生过程最常见的表观遗传学改变为抑癌基因启动子区CpG岛的甲基化， 其引起的表达沉默可以影响肿瘤相关信号通路[5]。DNA甲基化是真核细胞的表观遗传修饰之一， 甲基化程度愈高， 基因的表达则降低。骨髓异常增生综合征存在p15、p16、降钙素基因等一系列抑癌基因的过度甲基化， 使抑癌基因表达受抑制， 细胞易于形成恶性克隆[6]。其他表观遗传学改变如组蛋白的乙酰化、磷酸化等也均可影响基因的转录活性[5]。随着二代基因测序技术及大规模多水平组学生物学技术的兴起， 肿瘤精准医疗有了越来越强的技术基础。

2 大数据分析

目前已经知道人类各种正常组织的基因及基因表达， 患者的基因及基因表达都有了参考标准， 基因表达数据的分析与建模已成为生物信息学研究领域中的重要课题。人类的基因数目很大， 基因及其表达的变异信息数据库也十分庞大， 从海量的组学数据中提取有价值的数据， 就要祛除大量的“无关信息”， 这需要具有极高精确性的分析模型与分析方法， 全球很多学者均致力于该领域的研究。如人类肿瘤基因图谱计划（TCGA）， 就是应用基因组分析技术， 特别是采用大规模的基因组测序方法， 将人类全部癌症（近期目标为50种包括亚型在内的肿瘤）的基因组变异图谱绘制出来， 并进行系统分析， 旨在找到所有致癌和抑癌基因的微小变异， 其中包含体细胞突变、拷贝数变异、mRNA表达、蛋白质表达等各类信息。这一计划整合了约7000种人类肿瘤的复杂分子网络[7]。2012年， 国际千人基因组计划团队发表了1092个人类基因数据， 绘制了人类基因组遗传多态性图谱[8]。这些均表明人群中存在大量的遗传变异， 从而造成肿瘤细胞生物学行为和药物疗效等方面的差异。

3 临床药物应用

肿瘤的精准医疗就是以大数据分析结果作为参考， 给予患者个体化的药物治疗方案， 再根据治疗结果进行反馈， 确认更多有价值的基因及蛋白组靶点， 开发更多的药物， 保证精准医疗的不断完善。在应用这些药物治疗肿瘤之前， 必须明确肿瘤中是否包含这些药物所靶向的改变， 也只有这一部分患者才会对上述治疗敏感。而对于无特异性基因改变或表观遗传学改变的肿瘤患者， 上述治疗除了无效， 还会带来一定的毒副反应。

1997年11月上市的利妥昔单抗是抗CD20人鼠嵌合抗体， 是第1个应用于临床肿瘤的靶向治疗药物， 已成为治疗弥漫大B细胞淋巴瘤及滤泡淋巴瘤等CD20阳性的淋巴瘤的一线药物[9]。伊马替尼通过抑制bcr/abl融合基因的酪氨酸激酶活性、PDGFR和干细胞因子受体c-kit的活性， 治疗慢性粒细胞白血病、Ph染色体阳性的急性淋巴细胞白血病和胃肠间质瘤[10， 11]。曲妥珠单抗仅适用于HER2基因阳性的乳腺癌患者[12]。而阿扎胞苷则是首个被美国食品和药物管理局（FDA）批准的去甲基化的表观遗传药物， 用于骨髓增生异常综合征的治疗[13]。均显示出了显著的疗效， 堪称精准医疗的典范。可以看出， 可供选择的药物的多少直接关系到治疗的成败。研究表明， 这些靶向药物除了单用， 还能相互或与化疗药物联用， 以进一步提高临床疗效。例如利妥昔单抗联合CHOP方案治疗DLBCL， 可以提高缓解率， 延长患者的生存时间， 是目前国际上治疗DLBCL的一线方案。

4 小结

当前的肿瘤治疗正逐渐从宏观层面对“病”用药向更微观的对“基因、表观遗传”用药转变， 精准医疗可以实现“同病异治”或“异病同治”， 已成为肿瘤治疗的一个趋势。但目前该治疗模式仍需进一步完善， 需要发现更多的目标靶向， 建立更完善的疾病知识网络和新分类系统， 建立更精确、可靠的组学数据标准化整合模型， 研发更多有效、低毒的靶向药物。肿瘤的精准医疗之路任重道远。

参考文献

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[12] 贾朝阳， 应明真， 王雅杰. Her-2阳性的复发转移性乳腺癌的一线治疗进展.综述与进展， 2013， 42（4）：196-198.

第3篇：表观遗传学研究方法范文

十年如一日 醉心肿瘤研究

应建明医师于1998年获北京医科大学医学学士学位后免试保送攻读北京大学医学部病理学系研究生,2000年7月毕业获医学硕士学位后分配到中国医学科学院肿瘤医院病理科工作。 2003年公派前往美国约翰霍普金斯大学医学院新加坡研究中心工作,从事肿瘤表观遗传学的研究。2004年7月在香港中文大学医学院临床肿瘤学系攻读博士学位。2007年博士毕业后面临继续在国外任职的选择,应建明内心依旧难以释怀的肿瘤情结使他回到中国医学科学院肿瘤医院病理科工作,现任病理科分子病理实验室主管。目前已发表论著40余篇,其中SCI论文20余篇,曾获北京市科技进步三等奖和2006-2007年度香港中文大学研究生最佳研究成绩奖。2009年入选北京市科技新星计划。

应建明医师的科研工作方向为肿瘤表观遗传学及肿瘤标记物的鉴定和应用。现承担及参与国家自然科学基金、院所科研项目基金6项,并为国内外多种著名肿瘤杂志的特约审稿人。肿瘤表观遗传学改变是肿瘤发生和发展最关键的分子机制之一。应建明医师主要从事发现和鉴定被表观遗传学机制尤其是DNA甲基化沉默的新抑癌基因。以国内常见肿瘤如食管癌、鼻咽癌、结肠癌、胃癌、肺癌等为肿瘤模型,应用各种技术如表观遗传学方法、基因组学、杂交消减、微距阵杂交等鉴定新的候选抑癌基因。部分研究成果发表于国际著名肿瘤学研究杂志。发现并研究这些被表观遗传学调控失活的抑癌基因,不但有利于了解肿瘤发生和发展的分子机制,而且为开发新的肿瘤生物标记物用于肿瘤早期诊断、预后评估及肿瘤分子治疗提供了科学基础和依据。

分子病理学的“践行者”

通过应建明医师的讲解使我们了解到,在肿瘤诊治过程中,外科从术前、术中到术后,放化疗从诊断到选择治疗方案,病理诊断的指导作用贯穿始终,包括疗效评价以及判断预后。然而,人类对肿瘤发生发展的认识是局限的,在肿瘤发展的长期连续过程中,传统病理诊断依靠肿瘤组织形态的表现已经不能满足对不典型或少见肿瘤的诊断和鉴别诊断。随着分子生物学和生物医学的不断发展,人们对肿瘤的分子机制逐渐得以阐明,病理学诊断步入了新的分子水平异常检测和鉴别。应建明医师凭借着十余年的潜心研究和艰苦磨砺,在新的挑战面临时毅然承担了建设和完善了分子病理实验室的重任,在担任实验室主管的一年内逐步开展了以原位杂交、荧光原位杂交(FISH)、PCR、RT-PCR、DNA测序、流式细胞术等技术为主的十余项分子病理检测项目。这些检测项目的建立为肿瘤患者的诊断鉴别及促进个体化治疗提供了有力的帮助。

肿瘤病理诊断依靠组织形态结合当前较完善的免疫组化技术可以对大部分肿瘤做出正确判断,但对于某些类型肿瘤尤其是少见类型需要依赖分子病理检测才能对其良恶性作出判断,例如,克隆性基因重排检测用于协助判断良性淋巴结反应性增生和恶性淋巴瘤;针对肿瘤的特异性染色体易位检测用于协助鉴别软组织肿瘤的组织来源。显而易见,分子病理检测的应用成为对这部分肿瘤的确诊和鉴别分类不可缺少的关键性依据,即所谓肿瘤分子分型,直接关系到后续的治疗方案选择。

随着分子生物学、生物医学的不断发展和分子靶向药物的出现,分子靶向治疗已经成为了肿瘤治疗的未来发展方向,而这种治疗必须以肿瘤特异的分子靶点检测为前提。这些分子靶点在同一种肿瘤的不同个体之间、甚至同一个体的肿瘤发展的不同阶段是存在着差异的,必须根据患者的分子病理检测结果进行治疗方案和药物的选择。如检测HER2基因的表达/扩增状态、EGFR和KRAS基因的突变状态是选择分子靶向药物曲妥珠单抗、西妥昔单抗和易瑞沙治疗乳腺癌、结直肠癌和肺腺癌的前提。大量的临床研究已证实这些药物对有适应症的患者具有很好的疗效,反之则有毒副作用。

应建明医师告诉我们,分子病理检测项目的建立只是个开始,要确保这些检测结果的长期准确性和可靠性必须进行严格的质量控制,避免检测结果的假阳性和假阴性。病理科非常注重分子病理检测的室内外质控,并率先在乳腺癌的检测项目中贯彻流程管理理念,从标本的收集、固定到检测实现了严格的规范化操作优化流程。目前应建明医师还担任着北京市病理质量控制和改进中心的荧光原位杂交(FISH)检测管理工作组职务。

第4篇：表观遗传学研究方法范文

心肌缺血时，有氧代谢发生障碍，葡萄糖利用减少，脂肪酸利用增多，使氧利用率下降，心脏供能不足；同时，无氧代谢导致的酸性代谢产物增加，引起细胞内酸中毒。此外，心肌缺血还能引起氧自由基及钙离子超载，诱导心肌细胞凋亡，导致严重的临床症状。因此，改善能量代谢，清除自由基，减轻钙超载，抵抗细胞凋亡，实现心肌保护作用成为改善心肌缺血的重要途径［10］。研究表明，针灸在实现心肌保护方面具有自身的优势。一方面，针灸可通过改善能量代谢，实现心肌保护。心肌缺血时，能量代谢相关酶发生改变，电针能提高心肌组织糖原、琥珀酸脱氢酶和三磷酸腺苷酶的活性，纠正心肌相关酶的异常，增强能量代谢，改善心肌缺血。另一方面，针灸可减少自由基，缓解心肌缺血症状。热休克蛋白（HSP）属应激蛋白，能减少氧自由基释放，减轻心肌缺血损伤，从而保护机体［11］。研究证明电针“内关”穴可以增强缺血心肌细胞HSP90和HSP70mRNA表达，以减少氧自由基的释放，从而缓解家兔心肌缺血症状［12－13］；而且，针刺“内关”穴能抑制细胞内Ca2＋超载，实现心肌细胞保护，电针“内关”通过上调心肌钙泵和钠泵基因表达，增强钙泵和钠泵活性，降低心肌细胞内Ca2＋含量，从而达到抑制钙超载，实现对心肌组织的保护作用，表现为促进心电活动、改善心肌组织形态和超微结构［14］。大量研究表明，针刺可以调控凋亡基因的表达水平，延长细胞周期，减少细胞凋亡，保护缺血心肌细胞。有研究指出电针可以调节诱导细胞凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl－2在家兔缺血心肌中的表达，即抑制凋亡基因Bax和促进抗凋亡基因Bcl－2的表达，抑制心肌细胞凋亡，从而达到保护心肌细胞的作用［15］。c－fos基因是一种原癌基因，参与调节体内许多过程，如细胞周期、细胞分化、肿瘤转化及细胞凋亡等，正常情况下细胞内c－fos表达呈低水平状态，心肌缺血可激活c－fos基因的表达从而启动心肌细胞凋亡。研究表明，电针可降低c－fos基因表达，改善急性心肌缺血的过程［16－17］。所以不难看出，针灸能通过多种途径实现心肌细胞保护。总之，针灸干预心肌缺血的疗效和机制已初步得到证实和揭示，但尚未完全阐明，在一定程度影响了针灸治疗心肌缺血在临床的应用和推广。因此，需要引进新的理念、新的方法技术进行深入探索。

2表观遗传调控在针灸治疗心肌缺血的机制研究中的应用

目前主要涉及的表观遗传调控包括CG辅酶甲基化、组蛋白转录后修饰、RNA干扰等，具体可分为DNA甲基化、蛋白质共价修饰、染色质重塑、微小RNA调控4个方面［18－19］。越来越多的研究表明，表观遗传调控在心肌缺血过程中扮演重要角色，参与了疾病的发生、发展及预后的全部过程，因此，我们探讨从该角度开展针灸治疗心肌缺血机制研究的新方向。2．1表观遗传调控与心肌缺血的相关性以动物和人为载体的研究都表明，心肌缺血与表观遗传调控密切相关。表观遗传标记物在心肌缺血发生发展过程中的变化，反映出DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及微小RNA是调控心肌缺血的关键因素。大鼠神经甲基化系统在心肌缺血中受到抑制，可导致缺血部位的儿茶酚胺浓度升高，作用于心脏，使心率加快，收缩力增强，心输出量增加；怀孕期间的营养不良会改变DNA甲基化，增加成年后患心血管病的风险，且DNA甲基化在6个特殊位点对产前环境很敏感，可能提高妇女患心肌缺血的风险［20－22］。同时，有研究认为，组蛋白H3赖氨酸4甲基化（H3K4me）转移酶和它们的辅助因子是调控胚胎发育及细胞特异性的重要因素［23］；而Smyd2作为一种组蛋白甲基转移酶，介导H3K4甲基化，改变心肌细胞组蛋白甲基化修饰和心肌细胞靶基因的转录调控，促进心肌细胞分化和发育［24－25］。最新研究报道组蛋白H3赖氨酸27去甲基化酶赖氨酸K特异性脱甲基6A（UTX）可以促进心肌细胞生长发育，UTX基因敲除小鼠因心脏发育障碍死于胚胎发育早期［26］。除甲基化之外，组蛋白的乙酰化在心肌缺血中的作用受到广泛关注。发生心肌缺血后，心肌细胞蛋白发生了去乙酰化，抑制去乙酰化则能减少其损伤，组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂通过组蛋白去乙酰化酶Sirt1介导，后者含量增加，能有效促进心肌缺血耐受，诱导心肌保护［27－29］。HDAC－7抑制剂可与缺氧诱导因子（HIF）结合影响基因转录，增强HIF活性，从而促进心脏血管新生［30－31］。同时，HDAC抑制剂曲古柳菌素A可降低缺血心肌凋亡基因Caspase3表达，抑制心肌细胞凋亡，也可促进干细胞向心肌细胞分化，介导心肌细胞再生［32－33］。进一步研究发现，组蛋白H3赖氨酸9乙酰化（H3K9ace）与缺血心肌保护密切相关，通过调节血管再生因子、细胞凋亡因子和HSP基因表达达到抗缺血性损伤效果。其中VEGF、Sirt1与组蛋白赖氨酸乙酰化关系最为密切［34－39］。除组蛋白修饰之外，microRNA上调或下调通过作用于靶基因激活相应的分子信号通路参与心肌保护，调控心肌缺血损伤。染色体重塑也被证明与心肌细胞生长发育相关［40－41］。

总之，DNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA等表观遗传调控在心肌缺血过程中具有重要意义。2．2表观遗传调控与针灸防治心肌缺血机制研究从上述表观遗传调控与心肌缺血的相关研究成果可知，表观遗传调控介导细胞凋亡、心肌细胞保护和心脏血管再生，在心肌缺血发生发展过程中具有特殊地位，是目前医学研究的热点。从该角度切入进行针灸防治心肌缺血研究，必然是今后研究的一个新方向。同时，结合表观遗传调控自身特性，即强调除了DNA和RNA序列以外，还有许多调控基因信息，虽然本身不改变基因的序列，但其通过基因修饰、蛋白质与蛋白质、DNA和其它分子的相互作用，多层次、多途径影响和调节遗传基因的功能和特性，这些调节同时存在可逆性。这与针灸作用整体性、综合性、双向性、多靶点的特点具有一定的相似性。因此，将表观遗传学的理念和技术引入针灸抗心肌缺血机制研究，乃至整个针灸研究领域，都具有较强的可行性。结合针灸自身优势特点，以及其抗心肌缺血研究现状，融合上述表观遗传调控在心肌缺血发生发展过程的作用特点，我们认为，今后的研究可从两个方面进行，一是针灸对心肌缺血疾病的预防。治未病思想历来是中医理论的核心，早在《黄帝内经》中就强调“不治已病治未病”。现代研究证实，针刺具有提高机体机能的作用，如实施心肌缺血再灌注手术前针灸“内关”穴，能提高心肌细胞耐缺血能力，延长动物生存期，这无疑为心肌缺血患者赢得了宝贵的抢救时间［42］。而表观遗传调控与之密切相关，HDAC直接参与耐缺血，如果以此进行深入研究，一旦得以证实，将为临床进行再通手术前实施针灸干预的应用提供科学依据［43］。另一方面，则是在现有的研究基础上，继续深入探讨针灸抗心脏缺血机制研究。根据心肌缺血的不同阶段，有重点地开展相应研究。如急性期、亚急性期，主要围绕针灸促心肌细胞存活、抑制细胞凋亡，以及改善能量代谢，从而实现心肌细胞保护进行研究。针灸能有效调控心肌组织中Sirt1、HSP70、Caspase3、c－fos、Bcl－2等物质的表达，实现保护心肌目的，但其背后的调控机制如何，尚未得到证明。研究表明，HDAC能有效调控Caspase3表达，H3K9ace能影响HSP70水平等，从这些角度深入揭示针灸促心肌保护机制，将为针灸的更广泛应用提供基础。在慢性期，则主要围绕促进血管新生开展。已有的研究证实针灸能促缺血区域的血管新生，且与VEGF密切相关，但调控VEGF表达发生改变的机制并未得到证明。肿瘤存在大量的新生血管，研究中发现，H3K9ace在此过程中扮演重要角色，我们可以推测，在针灸促VEGF表达，介导血管新生过程中，H3K9ace可能具有重要意义。同时，也可以充分结合针灸抗心肌缺血机制研究成果，着重筛选出相应优势靶点，进行新药开发，或许可能成为新药开发的新靶点。除此之外，还可进行相应的拓展。研究表明，心脏中存在心肌干细胞，在某些影响因素干预下，能不断增殖、分化形成新的心肌干细胞。这个过程中表观遗传调控发挥重要作用［44］。针灸有促体内干细胞增殖、分化的能力，比如促脑内神经发生，实现脑保护［44－45］。那么针灸是否也能促进心脏干细胞增殖、分化，实现心肌保护？从表观遗传学的角度研究，也将成为我们关注的方向。

3小结

第5篇：表观遗传学研究方法范文

关键词：生物科学 遗传学 教学内容 重复

中图分类号：G642.3 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1672-8181.2013.19.020

遗传学是研究生物遗传和变异规律的一门科学。它是现代生命科学教学中最重要的主干课程之一，是高等院校生物科学等相关专业必修的专业基础课。现今，遗传学正以极快的速度向前发展，并不断渗透到其它生物、医学学科，这使得原本在遗传学中讲授的内容也同时出现在其他课程的教学内容中。这种现象反映了遗传学在生命科学中的核心地位，也凸显了高校遗传学教学所面临的教学内容重复问题。事实上，为体现一门课程的系统性、完整性和先进性，在编写教材时，学科之间有关内容的相互渗透、交叉以至重复是不可避免的。但相同的内容在多门课程的课堂教学中反复出现会使学生失去学习兴趣，浪费宝贵的课时，使教学效率大打折扣。本文将对该问题进行分析，并提出一些对策供同行讨论。

1 遗传学与其它课程教学内容重复的具体表现

目前，我国各大专院校生物、医药、农林等专业均开设有遗传学。虽然不同专业的教学重点有所不同，但核心内容相对统一。遗传学是笔者所在学院生物科学等专业本科生的一门必修课，这门课的任务是：引导学生牢固掌握遗传学最重要的基本原理，熟悉各分支学科的主要理论与研究方法，了解遗传学的重大理论与技术进展，熟悉遗传学研究技术与实验装备，为学生毕业后在本学科以及相关学科中的发展打下坚实的基础。

除遗传学外，我院还为生物科学专业的学生开设有细胞生物学、分子生物学、基因工程、生物化学、微生物学等专业必修课。我们选用的遗传学教材的内容基本上涵盖了遗传学的各个发展阶段，其中，遗传物质的细胞学和分子基础、染色体的结构变异、基因突变与DNA损伤修复、原核生物和真核生物基因表达的调控等章节[1]与上述几门课程的教学内容分别存在着不同程度的交叉（表1），有的甚至是其它课程的重点内容。尤以分子生物学、基因工程这两门课的教学内容与遗传学的相似度最高，这三门课几乎都重复着共同的遗传学问题――遗传物质的结构、复制、转录、翻译、调控、突变、重组等。另外，我院生物科学专业细胞生物学、分子生物学的开课时间与遗传学相同，这使得遗传学教学内容重复的问题更加突出。

表1 遗传学教学内容在其它课程中的分布

2 问题的根源

其它课程的教学内容与遗传学出现重复并不是偶然的，这种局面的形成与遗传学自身的发展特点及其学科内涵有很大的关系。

遗传学的研究进程按照不同历史时期的学术水平和工作特点，大体上可划分为经典遗传学、生化遗传学、分子遗传学、基因工程学、基因组学和表观遗传学等数个既彼此相对独立又前后互相交融的不同发展阶段[2]。如果以半个多世纪前Watson和Crick提出DNA双螺旋结构为界，也可以简单的将整个遗传学的发展过程划分为经典遗传学（classical genetics）和分子遗传学（molecular genetics）两大阶段：经典遗传学以孟德尔遗传学为基础，主要研究性状在系谱中的传递，即基因在亲代和子代之间的传递问题；分子遗传学则是在分子水平上研究生物遗传和变异机制的遗传学分支，主要研究基因的本质、基因的功能以及基因的变化等问题。

在整个遗传学的发展史上，分子遗传学的地位无疑是相当重要的。它的兴起使遗传学的面貌焕然一新，既系统地继承和发展了经典遗传学和生化遗传学的研究脉络，又全面地影响并渗透到后继学科的各个领域。从内容上来看，分子遗传学与分子生物学的学科界限十分模糊。通过对上述课程教学内容的分析我们也不难发现，那些重复的内容有相当一部分是分子遗传学范畴的。另外，由于生化遗传学和早期的分子遗传学研究都以微生物为材料，因此遗传学与微生物学、生物化学之间必然存在着千丝万缕的联系。而基因工程学、基因组学本身就是现代遗传学的分支学科，它们成为生物科学专业的必修课或进入课堂教学是高校课程设置不断细化和专业化的结果，也难免会与同时开设的遗传学存在教学内容上的重叠。

3 解决教学内容重复问题的对策

教学内容重复无疑会影响教学效果。我们通过实践发现，从授课内容本身、教师和学生、以及教学方法等环节入手，能够有效地避免重复对教学带来的不利影响。

3.1 合理调整教学内容

近些年来，同行们在遗传学教学内容的调整上作了大量的改革和探索。常见的做法是根据自己的理解及理论专长跳跃式地分割讲授，或根据自己的经验对教学内容做出取舍，甚至有人提出只讲经典遗传学而放弃分子遗传学。上述做法并不能有效地解决遗传学的教学内容重复问题，相反会造成教学不成体系的局面，对“教”和“学”都很不利[3]；而如果无视教学内容重复的存在，贪多求全、面面俱到，对所有内容蜻蜓点水般逐一讲解，又无法实现大学遗传学教学深度和难度的提升。

我们认为，对遗传学教学内容进行删减是必要的，但必须遵循遗传学的发展历史和保持其完整的知识结构体系，不能大刀阔斧整章删除，而应在重复章节内部进行微调，具体做法包括：精简繁杂冗长的内容，下放学生能看懂的内容（自学），突出基础性、应用性的内容，增加前瞻性的内容等。这就要求教师有较高的遗传学理论修养，准确把握各章节特别是重复内容在整个遗传学教学体系中的地位，做好教学内容的层次划分，根据层次选择不同的授课侧重点。

3.2 加强授课教师之间以及师生间的协调沟通

教学内容重复已成为遗传学等课程授课教师的共识，对各自的教学内容进行删减无疑成了最简单、最常用的一种解决方法。但如果大家在没有交流的情况下对同样的内容都作了删除，重复的内容反而会变成被遗忘的内容。因此，积极促成遗传学与其他相关课程任课教师间的沟通十分必要。

我们认为，集体备课是教师之间进行相互沟通的一种有效形式。通过这种方式，相关课程的教学人员能够坐下来共同研究教学内容，在“知己知彼”的基础上协调、统筹各自的授课章节，明确重复内容的教学分工，制订满足包括遗传学在内的多门课程教学需要的授课计划，做到各有侧重而又不失体系的完整性。这不仅可避免实际教学过程中的低级重复，还能保证课程之间的相互衔接，有助于学生顺利地掌握所有课程的教学内容。另一方面，还应当加强授课教师和学生之间的课内外交流。如：教师可在开课前召开师生座谈会，了解所教班级学生对重复内容的掌握情况；开课后则根据学生的反馈，随时调整教学方案。

3.3 优选教学方法

为了保持遗传学完整的知识结构体系，所谓的重复内容不但不可不讲，而且还要下功夫选择合适的教学形式或方法来讲。对于在其他课程已深入学过而在遗传学中只需一般了解的内容，通过简单的问答引导学生回顾这部分内容即可；对于对遗传学新知识点有重要铺垫作用的其他课程的基础性知识，可采取布置学生课前或课中自学、再集中小结的方法帮助学生巩固复习之，还要注意从遗传学的角度阐明同一知识点，突出遗传学的学科特色；对于其他课程仅略有涉及但在遗传学中须进一步加深了解的内容，宜先勾起学生对这部分知识的点滴回忆，同时指出学生现有知识的不足，从而激发他们的求知欲，然后顺理成章地讲下去，在学生的高度关注中完成该知识点在遗传学中的深入讲授；对于一些有特殊作用的重复内容，则要综合运用多种教学方法将其讲好讲透，如：减数分裂在遗传学和细胞生物学的教材中均有详细的描述，属于重复的教学内容，但却是理解遗传的连锁交换和重组的一把钥匙；在整个遗传学的教学过程中，应反复多次向学生强调和提及减数分裂过程中的染色体行为，将这部分知识迁移和渗透整合进连锁遗传分析、真核生物遗传分析、细菌和病毒的遗传分析等多个章节，使枯燥难懂的遗传学分析过程变得易于理解，让重复的内容为新的知识点和教学难点服务。

此外，遗传学与其他课程之间还可以开展合作教学。如：我们尝试将遗传学和细胞生物学这两门专业基础课的实验课合二为一，以综合性大实验的形式开设，从而将遗传学和细胞生物学关联起来，有助于学生从整体上把握这两门课程，实现了教学资源的整合，提高了教学效率，较好地化解了教学内容重复的问题。

4 结语

遗传学与多门课程教学内容的重复是客观存在的，随着生物科学专业课程设置专业化程度的提高，这种局面将变得愈来愈突出。因此，调整遗传学教学内容势在必行。但无论进行怎样的调整，都必须遵循遗传学的发展历史、保持基础遗传学完整的知识结构体系。作为遗传学的授课教师，既要关心遗传学研究的最新动态，又要加强对遗传学理论体系的整体把握和理解，只有这样才能合理有效地解决遗传学教学内容重复的问题，从而节约教学资源，提高专业课教学质量。

参考文献：

[1]戴灼华，王亚馥，粟翼玟.遗传学[M].高等教育出版社，2008.

[2]吴乃虎.基因工程原理[M].科学出版社，1998.

[3]程焉平，刘春明，王洪振.尊重教学规律，保持遗传学教学的系统性[J].吉林师范大学学报（自然科学版），2007，（2）：82-84.

作者简介：袁茵（1981-），女，河南开封人，研究生，讲师，从事遗传学教学工作，广东药学院生命科学与生物制药学院，广东广州 510006

陆幸妍，广东药学院生命科学与生物制药学院，广东广州 510006

第6篇：表观遗传学研究方法范文

关键词　遗传学实验　教学创新　开放式教学　实验管理

中图分类号：G423　文献标识码：A

现代生命科学以及由此衍生出的生物技术和生物工程与基因都发生着丝丝缕缕的联系。遗传学正是研究基因的科学。遗传学基础理论的发展和应用研究，已使工业、农业、林业和医药产业等相关领域发生了巨大变革。随着新技术、新方法的出现，遗传学的研究内容也正发生着深刻的变化，并导致社会对人才的基本素质提出了更高的要求。作为人才培养摇篮的高等教育，怎样适应学科发展的需要，在生命科学领域培养出创新型人才，是高等教育工作者一直在思考的问题。

遗传学实验教学作为理论教学的补充，不仅能验证教材上抽象的理论，辅助学生掌握知识，还可以训练学生动手能力和创新思维，可以有效地调动学生学习积极性。而传统的《遗传学》实验教学中存在着一些共有的问题：经典验证性实验多，探究性实验少，不能满足学生掌握新技术、新方法的要求；实验课和理论课脱节，教学评价体系不合理。0此外，由于遗传学实验自身的特点，部分实验需要持续很长时间，但由于课堂教学时间和教学条件的限制不能开展。因此，如何利用有限的课时安排合理设计遗传学实验教学内容，打破传统的封闭式教学模式，建立科学合理的实验评价体系，是从事遗传学教学实验教师一直都努力试图解决的问题。

基于以上考虑，笔者在开展遗传学教学和实验室管理的过程中，逐步改革教学内容和教学模式，将课堂四十五分钟改为课堂与课外相结合，通过几年的实践总结了一些心得，在此与大家分享。

1　新时期遗传学实验教学的特点

遗传学中学科渗透和交叉现象很普遍，这也体现在遗传学实验中。如果把生命科学的课程体系比喻为一棵大树，遗传学就是这棵大树的主干之一。由于化学、物理学、计算科学等内容的渗入，现代遗传学已经衍生出了发育生物学、分子生物学、基因组学、生物信息学、基因工程等学科。在现代生命科学专业课程设置中，一般都会设置相关课程，这些课程都和遗传学存在联系，也与遗传学教学内容知识点存在交叉。因此，遗传学实验项目的设置极易与其它课程出现“撞车”现象。比如：有丝分裂和减数分裂在细胞生物学实验中也可以开设：植物DNA提取实验在分子生物学实验中也可以开设。一旦“撞车”出现，不仅耽误学生学习，浪费课时，还会让学生在不断地重复中对课程产生厌倦，觉得该课程可有可无，失去学习兴趣。避免与其它课程实验重复，既保证学生在有限的课时学到最多的知识，也能最大程度训练学生的动手能力。

实验持续时间长是遗传学实验教学的另一个特点。与生物学中的其它学科的实验不同，遗传学实验中有很大部分是需要通过长时间培养实验材料，中间过程持续观察才能完成的，比如果蝇杂交实验和生活史观察实验、植物有性杂交实验。与此相矛盾的是，实验教学安排的时间相对分散，每次课时间很短，在教学管理上教务管理部门也要求教师在指定时间完成实验教学，这就限制了一些实验项目的开设。

遗传学是一门飞速发展的学科，不断有新知识、新技术补充到遗传学中。比如，在传统教材中不涉及基因组学的内容，而最近20年，基因组学已经成为遗传学的重要组成部分。除此之外，发育遗传学、行为遗传学、反向遗传学、表观遗传学和生物信息学等分支学科的内容也不断补充到了遗传学教材中。在理论课讲述这些最新知识的同时，实验课怎样保持和理论课一致，怎样为学生提供消化这些知识的动手机会?针对这一特点，要求在开设遗传学实验时，应随时跟踪学科最新进展，设计和更新实验项目，或者发动学生自主设计实验巩固书本知识。

2　遗传学实验开放式教学内容取舍的原则

遗传学实验项目的选择，首先应兼顾理论性与实践性、基础与应用、经典与现代这几对矛盾。遗传学是理论性和实践性都很强的学科，实验安排时应根据本专业培养目标和学生实际情况，合理安排基础性实验与应用性实验，并适当设计一些新的实验。对于重点院校的学生，应加强理论性实验，鼓励学生自主设计实验验证某一结论。而应用型人才培养的学校则应当偏向应用性、实践性实验项目的开设，以满足学生毕业后进入工作岗位后的动手需求。

遗传学实验项目确定应考虑其它实验课程，避免教学内容冲突。在实验项目的选择上，我们对以前安排的实验内容进行了重新编排，比如：“植物DNA提取”、“随机扩增多态性分析”等在《分子生物学》课程里会涉及到的实验内容在遗传学实验里就大胆地放弃，让学生在《分子生物学》实验里完成，而在遗传学实验中则加入RFLP验证孟德尔遗传定律的内容，直接将分子生物学实验结果引入遗传学分析中，既验证了孟德尔遗传定律，也让学生初步认识了分子生物学在遗传学中的应用。对于有丝分裂和减数分裂的观察，《细胞生物学》实验也会涉及到，但两门课观察的重点不同，细胞生物学侧重观察染色体结构，而《遗传学》实验侧重染色体行为及分裂时期的观察，这样的实验在开设时应向学生讲明观察重点，并且与《细胞生物学》实验课协调，将两个内容合并在遗传学实验中开出。

打破时间和空间限制。遗传学实验中有部分实验持续时间长，很难仅靠课堂时间完成实验，也不利于安排实验。以前在安排此类实验时，受多种因素的限制，一般都不予开设。实验室开放对提高学生的实验操作技能、切实开展综合性或设计性试验项目、推动并帮助学生开展科研和毕业设计成效显著，是培养学生实践动手能力和创新精神的有效途径。所以我们在教学中考虑将传统的课堂实验和开放实验相结合。开放性实验适合于周期比较长的实验，比如果蝇大实验中，教师在课堂上以多媒体的形式充分讲解了实验要求及注意事项后，让学生领取果蝇瓶，课外自己收集和培养果蝇，随时可以观察果蝇的生活史。这个过程既培养了学生的观察习惯和动手能力，也使学生对作为遗传学研究重要材料的果蝇的接触更充分，观察更仔细，让学生对遗传学研究材料和方法产生了浓厚的兴趣。

3　遗传学实验开放式教学的实施与实验室管理

验证实验是课堂教学的补充，便于学生理解课堂抽象的知识。然而，由于验证性实验验证的理论、方法、步骤及结果都是已知的，使实验教学过程变成教师照本宣科讲述，学生机械地模拟重复的过程，造成学生实验积极性不高，对实验结果的成败不重视，盲目的承认失败甚至篡改实验数据以求相符。设计性实验可以训练学生的思维能力和动手能力，让学生学会独立开展工作。一些报道强调验证性实验过多，难以提高学生的创新能力，应加大综合性、设计性实验的比例。而宋兴舜等则认为应将验证性实验与设计性实验有机结合。0在以 前的实验教学安排中，设计型实验由于内容分散，管理麻烦，是大家不愿触及的方面。如何在有限的课时里兼顾巩固知识和能力训练，在安排实验内容的时候需要深思熟虑。为适应学科的快速发展，在遗传学实验教学中，必须强化教师的开放式教学理念，强化学生的动手实践和自主创新意识。从课堂教学和课外研究两个方面，通过对实验教学观念开放、教学内容开放、实验室和实验时间开放、教学方法和手段开放等进行分析，探讨开放式教学在遗传学实验中的应用。。

基于以上考虑，笔者在教学过程中逐步安排了一些开放性验证实验和设计性实验，比如植物染色体观察的实验，要求学生独立选材，同学之间选材不能相互重复，做到实验项目的选材开放；实验开始前独立设计方案，方案内容应包括水培获得新生根尖、材料前处理过程、染色方法的选取、压片过程、观察和拍照等步骤，每一步骤都应有详细说明，实验方法的选择上保持开放：方案设计完成经老师同意后，完成一个植物材料的染色体装片制备并提交染色体图，实验过程开放。这些实验过程均要求学生在课堂以外自由安排时间完成。经过几年的实践，结果发现85以上％的学生能独立完成实验，70％以上的学生需要反复多次才能完成任务。在实验过程中，动手能力强的同学还能将这一实验与染色体核型分析实验结合，提交核型分析图。通过该部分设计性实验操作，学生在观察了不同物种具有不同的染色体的同时，学会了查阅文献的方法和工作方案的制订，认识了教材中选取蚕豆或洋葱作为染色体观察材料的原因，认识到要完成一张效果良好的染色体装片的艰难。对实验教师来说，这种发散式的教学方法，也积累了很多植物材料的细胞遗传学操作的知识，为以后改进实验奠定了基础。很多学生反映类似的开放性实验时间可自由安排，实验过程可放开思维，进入实验室操作学会了一些基础的科研技能。此外，还认识到了实验准备的艰辛，更珍惜以后的实验机会了。

在实验教材中将果蝇实验分为果蝇生活史、果蝇杂交和果蝇唾腺染色体制备等几个独立实验。我们改进后的实验则以果蝇为主线，要求学生从野生型果蝇的收集到生活史观察再到唾腺染色体制备融合为一个大实验，要求学生在实验教材所提供知识的基础上，在规定时间内完成实验内容，而将杂交实验和孟德尔遗传定律的验证实验改用其它实验材料来完成。

不可否认的是，将部分遗传学实验从课堂移到课外增加了任课教师和实验室工作人员的工作量，在管理上开放性实验也增加了难度。开放式实验教学要求教师在课外时间也要进入实验室指导，实验室经常处于开放状态，实验仪器设备和药品的使用管理能在一定程度上放开。在实际操作中，我们采用教师网上答疑和在指定时间指导相结合的方式对学生进行辅导。在实验室管理上，试剂方面控制关键药品的使用，常规药品可以适当放开，对一些配制难度较大的溶液统一配制；对显微镜、显微照相系统的使用则采取专人负责制，保证仪器的安全。而水培实验和果蝇饲养实验等内容则允许学生将材料带回宿舍，便于学生随时观察。

4　开放式实验教学的考核指标体系

实验教学考试方法的改革作为实验教学改革的重要内容之一，是当前教学改革中值得深入研究与实践的问题。以前实验考核的方式主要以实验报告为主，针对这样的考核方式，学生常出现相互之间抄袭，作业敷衍的现象，既不能反映学生实验的真实水平，考核指标也比较单一。针对这些问题，结合我们的开发性实验，我们重新制订了实验成绩评价标准，经过我们设计改进后的实验考核主要包括验证性实验考核和开放性实验考核两部分。验证性成绩的记录摈弃了以前单纯看实验报告打分的情况，在实验中对实验结果提出规定要求，课堂上实时检查并记录学生的实验结果，要求学生立即在实验结果栏描述结果并由教师及时确认，防止课后抄袭。对实验原理、实验步骤等内容也杜绝抄袭课本，要求用自己的语言表述。每次实验结束后均布置思考题，启发学生动手之后学会思考，发掘问题。在开放性实验部分，教师将实验设计方案纳入评分范围，实验进行过程中记录平时成绩，对实验结果不做硬性要求，但可作为评分参考。

在平时实验成绩记录之外，还单独设计了期末实验考试。期末实验考核采取开放式考核，拟定考试题目范围，让学生独立设计实验步骤，独立实验，在规定时间内独立完成详尽的实验报告。这些评分方式考查了学生搜集资料，独立开展项目的能力。这样的考试既灵活，也发挥了学生的主观能动性，更训练了学生的科研思维，为以后进入研究岗位奠定基础。

5　结束语

第7篇：表观遗传学研究方法范文

关键词 行为遗传学；数量遗传学；分子遗传学：基因：人格

分类号 B845

1 引言

人格是一个人独特精神面貌的整体反映，是需要、动机、兴趣、态度、价值观、气质、性格、能力等多个方面的整合。它的形成和发展与遗传因素息息相关。然而，人格的遗传性究竟如何？到底哪些基因在起作用？它们又是如何起作用的？针对诸如此类的问题，行为遗传学家们试图为我们提供有效的解答，并由此形成了一个重要的研究领域，即人格行为遗传学研究。

人格行为遗传学研究就是运用行为遗传学理论和方法来考察和揭示人格特征（包括人格障碍）和人格差异的遗传基础问题。它强调遗传基因是塑造人格核心特征和造成人格个别差异的主要因素，但并不忽视环境的作用，甚至主张人格特征与人格差异是多种基因、多种环境以及基因与环境动态交互作用的结果。早在19世纪中后期，英国心理学家高尔顿（Galton，F.）就首先利用家谱法和双生子法研究了人格差异的遗传基础。尽管他的研究因未将遗传和环境区分开来而具有诸多局限，但它“为人类行为的变异范围提供了档案证明并且说明了行为变异存在遗传基础”（Plomin，DeFries，McClearn，& McGuffin，2008），是运用行为遗传学方法研究人格差异的先驱性尝试。高尔顿之后的20世纪，人格的行为遗传学研究因行为主义主流范式的盛行而长期遭到“冷遇”。前者强调人格的遗传性，而后者坚持环境论并认为人格由社会化的习惯决定，两者的矛盾在这种势力不均的情势下曾一度不可调和。

但近几十年来，行为主义的逐渐衰落和现代生物学特别是分子生物学的飞速发展分别为人格的行为遗传学研究提供了巨大发展空间和发展动力，并使它由传统的数量遗传学取向发展到分子遗传学取向。分子遗传学取向是发端于20世纪初而到20世纪末才应用于人格研究的一种新取向，它在研究方法和研究理念上都较数量遗传学取向具有革命性突破，目前正以惊人的速度发展着。可以说，人格遗传学研究进入到分子遗传学时代（Johnson，Penke，& Spinath，2011）。不过，两种研究取向在基本思路方面各有特色，在具体研究方面都取得了很多有价值的成果，积极推动了人格行为遗传学研究的复兴和发展。

2 数量遗传学取向

人格的数量遗传学（quantitative genetics）研究取向主张运用双生子研究、收养研究等设计来估计群体中遗传因素对人格表现型方差的贡献率，旨在用数量化的手段从宏观上估计某种人格变异在多大程度上是由遗传效应引起的，并考察遗传通过与环境交互作用或相关影响人格的方式以及这些效应发生的具体情境。

2.1 人格遗传率

数量遗传学衡量人格遗传性大小的核心指标是遗传率（heritability），即在某群体内观测到的人格总变异中能被遗传变异解释的百分比，它既可以揭示遗传是否影响某种人格特征又可以指明这种影响达到何种程度。人格遗传率可以用公式h2=Vg/Vp（其中h2代表人格遗传率，Vg代表遗传导致的人格变异，V。代表观测到的人格总变异）来表示，数值在0～1之间，越接近于0，说明变异越少源于遗传；越接近于1，说明变异越多源于遗传。需要指出的是，遗传率估计具有如下三个特点：第一，它具有群体特异性，仅仅适用于解释样本或群体的人格差异，而不适用于描述个体人格的遗传性；第二，它假定遗传因子和环境因子之间不存在相关或交互作用；第三，它会因测量方法和计算方法不同而有细微差别（郭永玉，2005；Larsen & Buss，2009）。

2.2 数量遗传学设计

为了把基因和环境对人格差异的贡献分离开来，数量遗传学家采用了家族研究、双生子研究和收养研究等多种研究设计。家族研究是最早用于人格研究的行为遗传学方法，但它不能将遗传与共同环境的作用区分开来，因而不能得出准确的遗传率；双生子研究是现代人格行为遗传学研究最常用的一种有效方法，它在一定程度上克服了家族研究的缺陷，但它的等环境假设和代表性也往往令人担忧：收养研究作为一种强有力的自然实验法，是“解开影响家族相似性的遗传和环境源之结的最直接方法”，避免了双生子研究中的等环境假设问题，提供了环境影响人格差异的最佳证据，但它也存在三个争议，即代表性、生前环境影响和选择性安置效应（Plomin et al.，2008）。

鉴于以上三种方法各有其长处和不足，在过去的20多年中，数量遗传学家已经开始利用家族研究、双生子研究和收养研究的组合设计来研究人格。例如，研究分开抚养的同卵双生子就把双生子研究和收养研究各自的优点进行了有效整合，并且分开抚养的同卵双生子在某种人格特质上的相关系数可以直接解释为遗传率的一个指标（Larsen & Buss，2009）。另外，随着离异和再婚现象增多而产生的继亲家庭研究，自然地综合了家族研究与收养研究的优势，也是一种有趣和有效的组合研究设计。对多组比较的组合设计，甚至简单的收养和双生子研究，现代行为遗传学通常采用模型拟合（model fitting）的方法进行统计分析，即建立一个反映各种遗传和环境因素对某种人格特质贡献大小的结构方程模型，并将其与观测到的相关进行比较，从而估计出遗传和环境的影响程度（郭永玉，2005）。

2.3 具体研究与发现

数量遗传学取向的人格研究者利用上述设计主要对人格特质、人格障碍以及态度与偏好的遗传性问题进行了考察。

2.3.1 人格特质

数量遗传学关于人格特质的研究主要涉及人格的五大特征，即外倾性、宜人性、责任心、神经质和经验开放性，其中研究最充分的要数外倾性和神经质。多数数量遗传学研究表明，“大五”人格模型中的所有因素都具有中等大小的遗传率，并且此研究结果在不同年龄段、不同性别以及不同文化背景的样本群体中具有普遍一致性（saudino，1997；Loehlin，McCrae，Costa，& John，1998）。例如，两项以双生子为被试的研究表明，神经质和外倾性的遗传率估计值分别为43%和52-54%（Wray，Birley，Sullivan，Visscher，& Martin，2007；Rettew，Rebollo-Mesa，Hudziak，Willemsen，& Boomsma，2008）。以往数量遗传学对“大五”人格的研究通常都以正常人群为被试，最近许多研究开始关注异常人群“大五”人格的遗传性问题。例如，Kendler，Myers和Reichborn-Kjennerud（2011）的研究表明，边缘型人格障碍与“大五”人格中的神经质维度存在显著的遗传正相关，而与宜人性和责任心维度存在显著的遗传负相关。Hare等人（2012）的研究表明，躁郁症患者人群“大五”人格的遗传率（23%～32%）某种程度上低于正常人群的研究结果（40%～60%）。我们固然可以推测是异常人格影响了“大五”人格遗传率的变化，但要得出确切的因果结论还需依赖未来数量遗传学和分子遗传学更加细致的综合研究。

除“大五”人格外，研究者还对活动水平（activity level）和“精神病”人格特质的个别差异进行了行为遗传学分析。活动水平是气质的一个组成元素，其个别差异出现于生命早期，并随着时间推移在儿童身上表现出稳定性。Spinath，Wolf，Angleitner，Borkenau和Riemann（2002）对300对双生子的研究表明，活动水平存在40%的遗传率。“精神病”人格特质包括权术主义、铁石心肠、冲动性不一致、无所畏惧、责备外化和压力免疫等方面。Blonigen，Carlson，Krueger和Patrick（2003）对353名男性双生子进行了研究，发现所有这些“精神病”人格特质都表现出中等或高等的遗传率。

数量遗传学研究发现，尽管不同研究设计所得出的具体数值会有所不同，但一般的人格特质都具有较高的遗传率估计值（Krueger & Johnson，2008）。

2.3.2 人格障碍

数量遗传学系统研究的人格障碍主要有精神分裂型人格障碍、强迫型人格障碍和边缘型人格障碍。精神分裂型人格障碍具有轻微精神分裂样症状，用个人访谈法和问卷法所做研究表明，它具有非常高的遗传率（Kendler，Myers，Torgersen，Neale，& Reichbom-Kjennerud，2007）。强迫型人格障碍是一种神经精神病状态，以思想、情感、观念以及行为的反复为典型症状，它所包含的五个因素即禁忌、污驰/清洁、疑虑、迷信/仪式和对称/囤积的遗传率位于24%和44%之间（Katerberg etal.，2010）。上述两种人格障碍可能是精神机能障碍遗传连续体的一部分，因为它们分别与精神分裂症和强迫焦虑症之间存在某种程度的遗传重叠（Plomin et al.，2008）。边缘型人格障碍是一种以心境反复无常、自我认同感紊乱、情绪冲动以及行为不稳定等为主要表现的人格障碍，它很大程度上受遗传基因影响。例如，对荷兰、比利时和澳大利亚三个国家5000多名双生子的数量遗传学研究表明，加性遗传效应（additive genetic effect）可以解释42%的边缘型人格障碍变异，而且这一结果具有跨性别和跨国别的一致性（Distel et al.，2008）。最近一项10年的双生子纵向研究发现，边缘型人格障碍特质在14～24岁的各个年龄段都具有中等的遗传率，且遗传率有随年龄增长而轻微上升的趋势，而这些特质的稳定性和变化受遗传因素高度影响，一定程度上也受非共享环境的影响（Bornovalova，Hicks，Iacono，& McGue，2009）。

2.3.3 态度与偏好

稳定的态度和偏好通常被看作人格的一部分，并表现出广泛的个体差异。数量遗传学家对态度和偏好的遗传性进行了饶有趣味的考察。综观多数研究可知，态度的核心特征传统主义具有中等的遗传率。例如，一项明尼苏达的双生子研究表明，传统主义的遗传率为63%；一项对654名收养和非收养儿童的纵向研究表明，遗传对保守态度具有重要影响，并且显著的遗传影响早在12岁时就已产生（Larsen & Buss，2009）。然而，并不是所有态度和信仰都表现出中等水平的遗传率，这要因所研究的态度类型而异。例如，一项对400对双生子的研究表明，对上帝的信仰、对宗教事务的参与以及对种族一体化的态度的遗传率为零（Larsen&Buss，2009）。基因似乎也影响职业兴趣或偏好。一项用修订版的杰克逊职业兴趣量表（JVIS）做的研究表明，34种职业兴趣中有30种的遗传率在37%和61%之间（schermer & Vernon，2008）。这表明，我们绞尽脑汁作出的职业选择很大程度上受到我们从父母那里继承的基因的影响。但值得我们注意的是，为什么有些态度和兴趣具有较高的遗传性，而有些态度和信仰的遗传性不明显甚至为零？或许未来的行为遗传学研究能够给出答案。

3 分子遗传学取向

人格的分子遗传学（molecular genetics）研究取向主张在DNA水平上用基因测定方法研究特定基因对人格表现型的影响效应，旨在超越传统人格数量遗传学研究仅停留在统计学层面考察遗传率的局限，而从微观层面直接鉴别对人格产生重要遗传影响的具体基因或基因组合，以精确揭示人格特征（包括人格障碍）或人格差异的根本遗传机制。

3.1 人格候选基因

已知人类基因具有数万种之多，要想从中找出对人格起作用的特定基因是件困难的事情。况且，复杂的人格或行为特质并不简单地遵循孟德尔的单基因遗传定律，而是同时受作用幅度不完全相同而又相互协同和相互作用的多个基因的影响，这就又大大增加了确定这些基因的难度。因此，研究者不可能对所有基因都进行考察，更多的是考察候选基因与人格的关系。人格候选基因（candidate gene）是被假定与某一人格特质有关的基因，通常人们已了解其生物学功能和序列，它们可能是结构基因、调节基因或在生化代谢途径中影响性状表达的基因。研究者一般通过了解相关生理机制来确定人格的候选基因。例如，用于治疗活动过度的药物常含有多巴胺，因而像多巴胺受体、多巴胺启动子和多巴胺转运体这样与多巴胺有关的基因便成为候选基因研究的目标。我们通常缺乏哪些基因是人格候选基因的强假设，因此试图将那些与具有生理作用的DNA标记有关的基因与人格联系起来的做法是很有道理的（张丽华，宋芳，邹群，2006）。

3.2 研究策略

人格分子遗传学研究者主要采用连锁策略和关联策略来寻找和鉴别对特定人格或行为特质有广泛遗传影响的具体基因。连锁策略（linkagestrategy）采取从行为水平到基因水平的“自上而下”的研究思路，它以携带某种人格特质或障碍的家系为研究对象，对连续几代人的DNA样本进行分析，以确定是否有对该人格特征影响较大的特定基因存在。由于研究者并无假定的候选基因，这种策略对定位单基因遗传特质的强效基因十分有效，但当牵涉若干个作用较小的基因时它便不再那么有效。然而，大多数复杂的人格或行为特质往往牵涉多个微效基因，于是另一种较新的关联策略（association strategy）便成为最常用的确定人格基因的策略。关联策略采取由基因到行为的“自下而上”的研究思路，通过考察拥有某种特定基因（或等位基因）的个体比没有该基因的个体在某种特定人格特质上的得分是高还是低，来确定候选基因与人格或行为特质之间的关联情况，即一种可能的因果关系。关联策略比连锁策略更容易找到只有微弱效应的特定基因，但系统性不够强。

随着人类基因组多态性研究以及SNP分型技术的发展，全基因组扫描（genome-wide scanning）逐渐成为一种标志性的分子遗传学人格研究策略（Strobel & Brocke，2011）。它主要包括对人格表现型的全基因组连锁分析和全基因组关联分析，先将人格表现型的相关位点定位于染色体某个区域，然后再进行候选基因研究或连锁不平衡分析，确定其具体基因位点。例如，一项用全基因组扫描做的研究表明，伤害回避与8p21染色体区域存在显著相关（zohar et al.，2003）。

3.3 具体研究与发现

基因主要是通过大脑中的神经递质系统来影响人格的，因而参与调节神经递质系统的基因便成为主要的候选基因。在Cloninger等人的人格心理生物模型中，新颖性寻求（novelty-seeking）、伤害回避（harm-avoidance）和奖赏依赖（reward-dependence）三种气质维度被假定分别与大脑调节不同类型刺激反应的三种神经递质系统即多巴胺（dopamine）系统、5-羟色胺（serotonin）系统和去甲。肾上腺素（noradrenaline）系统相联系。此类理论假设促使人格分子遗传学研究者们主要从这三种神经递质路径考察了基因多态性与人格之间的关系。

3.3.1 多巴胺系统

多巴胺是脑部负责快乐和兴奋的一种积极化学物质，它的缺乏会促使个体积极寻求有效物质或新异经验以增加多巴胺释放。到目前为止，人格研究中最早且最多关注的DNA标记是位于第11号染色体短臂上的多巴胺D4受体基因（DRD4）。1996年，两个独立研究小组同时在《自然遗传学》上报告了DRD4基因的3号外显子中的48-bp VNTR多态性与新颖性寻求之间存在正相关，标志着人格分子遗传学研究的初步登场（Ebstein & Israel，2009）。其中，Ebstein领导的小组运用三维人格问卷（TPQ）对124名犹太健康志愿者进行了测量，发现长重复段DRD4等位基因对新颖性寻求具有6%的解释效应，而未发现它与另外三个TPQ指标（奖赏依赖、伤害回避和坚持性）有显著关联（Ebstein et al.，1996）；Beniamin领导的小组运用大五人格量表修订版（NEO-PI-R）对315名美国成人和兄弟姐妹进行了预测测量，也发现拥有长重复段DRD4等位基因的个体比拥有短重复段DRD4等位基因的个体新颖性寻求水平显著高，并且发现长重复段DRD4等位基因与NEO-PI-R量表的外倾性和责任心两个维度显著相关，而在其他三个维度即神经质、开放性和宜人性上未见此结果（Benjamin et al.，1996）。对于这两种研究的结果可能的解释是，拥有长重复段DRD4等位基因的个体对多巴胺的相对缺乏反应敏感，需要寻求外界新异经验来增加多巴胺释放，而拥有短重复段DRD4等位基因的个体倾向于对脑中已经存在的多巴胺作出高度反应，无需寻求新异经验便可使多巴胺含量达到适当水平。

此后，一系列研究对DRD4基因与新颖性寻求这种人格特质之间的关联进行了重复验证，但结果并不完全一致。两项分别以德国人和日本人为被试的研究证实DRD4基因与新颖性寻求特质之间的确存在显著关联（strobel，Wehr，Michel，&Brocke，1999；Tomitaka et al.，1999）；Burt等人对明尼苏达137个双生子家庭所做的研究发现，DRD4基因与新颖性寻求测量指标之间不存在任何关联（Bun，McGue，Iacono，Comings，&MacMurray，2002）；Ekelund等人则得出了与1996年研究相反方向的结果，即在新颖性寻求水平较高的群体中，2次和5次重复等位基因而非7次重复等位基因的频率更高（Ekelund，Lichtermann，Jarvelin，& Pelmnen，1999）。除此之外，有些研究还发现DRD4基因与其他人格候选基因存在联合效应。一项关于1岁新生儿对新异事物反应的研究发现，DRD4基因中的48-bp VNTR与5-羟色胺转运体基因（5-HTT）中的一种多态性存在联合效应（Lakatos et al.，2003）。之所以会出现如此多样的研究结果，可能与样本大小、被试特点（年龄、性别和种族文化等）、测量工具、研究设计等因素有关。例如，分组方法不同所得研究结果就会有很大差异（Tsuchimine et al.，2009）。不管怎样，这都有待于进一步研究证实。

除DRD4基因外，研究者还对多巴胺系统中的其他人格候选基因进行了考察，如多巴胺D2受体基因（DRD2）、多巴胺D3受体基因（DRD3）、多巴胺D5受体基因（DRD5）以及多巴胺转运体基因（DATl）等。一项用多种人格测验所做的研究表明，DRD2基因的-141C插入/缺失多态性与卡氏人格量表（KSP）测量的冷漠以及北欧大学人格量表（SSP）测量的自信缺乏之间存在关联（JSnsson et al.，2003，），而利用气质性格量表（TcI）对被试所做的一项研究表明，-141C插入/缺失多态性和DRD2/ANKK1基因的TaqlA多态性与人格特质之间可能并非存在直接强相关，而是在DRD2基因与ANKKl基因的交互作用条件下才对人格产生影响（Tsuchimine et al.，2012）。在一个由862名个体组成的样本中发现DRD3基因与神经质和行为抑制存在关联，而当该样本扩大到1465人时这种关联未得到验证（Henderson et al.，2000）。有研究表明，DRD5基因可能与人格的持续性发展有关（Vanyukov，Moss，Kaplan，Kirillova，&Tarter，2000）。由于发现DAT1基因与具有某些新颖性寻求特征的注意缺陷多动症（ADHD）存在关联（Jorm et al.，2001，），有人用极端分数个体为被试考察了DATl基因与新颖性寻求之间的关联，结果表明这种效应只在女性被试身上有所显现（van Gestel et al.，2002）。

3.3.2 5-羟色胺系统

5-羟色胺作为一种生物胺，对于人类的攻击性、抑郁、焦虑、冲动、幸福感等情绪情感具有重要调控作用。此系统中最经常被研究的人格候选基因是5-羟色胺转运体基因（5-HTT），该基因越长释放和回收5-羟色胺的效率越高，已有许多研究考察了它与伤害回避等焦虑类人格特质之间的关联。5-HTT基因具有两种多态性：5-HTT基因连锁的多态性区域（5-HTTLPR）和5-HTT基因2号内含子中的VNTR多态性，其中人格研究关注最多的是5-HTTLPR。

1996年的一项经典研究发现，短5-HTTLPR等位基因携带者较长5-HTTLPR等位基因携带者在神经质和伤害回避维度上的表现水平更高（Lesch et al.，1996）。功能性磁共振成像表明，携带一个或两个短5-HTTLPR等位基因复本的个体在对恐怖刺激的反应中表现出更强的杏仁核神经元活动（Harid et al.，2002）。这种由遗传导致的杏仁核对情绪刺激的兴奋性差异支持了该结论。不过，也有一些其他研究并未发现此种关联（Flory et al.，1999；Tsai，Hong，& Cheng，2002）。还有一些研究得出了相反结果。例如，使用极端得分个体做的一项研究发现，短5-HTTLPR等位基因在低伤害回避群体中比在高伤害回避群体中出现的频率更高（van Gestel et al.，2002）。2004年的一份元分析指出。这种可重复性的缺乏很大程度上是由于样本量过小以及所使用的量表不同而导致（Sen，Burmeister，& Ghosh，2004）。分析者发现，运用大五人格量表测量的神经质与5-HTTLPR有显著关联，而运用气质性格量表测量的伤害回避与5-HTTLPR不存在任何显著关联。2008年的另一份元分析也得出了类似结论（Munaf6 et al.，2008）。然而，使用NEO-PI-R量表对4000多名被试进行的一项大型研究发现，5-HTTLPR与神经质或其各维度（焦虑，抑郁，愤怒，敌意，自我意识，冲动。易受伤害性）之间不存在任何关联（Terracciano etal.，2009）。近年来，有研究者发现，与其杂合子同伴或短等位基因的纯合子同伴相比，具有长5-HTLPR等位基因的纯合子个体通常更关注积极情感画面，而选择性地回避一同呈现的消极情感画面（Fox，Ridgewell，& Ashwin，2009）。这表明他们通常更加乐观。使用信息加工眼动跟踪评估法进行的另一项研究发现，短5-HTLPR等位基因携带者在视觉上更加偏爱积极场景而回避消极场景，长5-HTLPR等位基因的纯合子个体更加无偏地看待情绪场景（Beevers，Ellis，Wells，& McGeary，2009）。这表明，短5-HTLPR等位基因携带者可能比长等位基因纯合子个体对环境中的情绪信息更加敏感。对于5-HTLPR与人格特质之间关系的这些看似不一致的结论，还有待进一步研究确证。此外，一项最新研究显示，5-HTLPR与Val66Met两种多态性对伤害回避存在显著交互作用（Ariaset al.，2012）。

除5-HTT基因外，研究者还对5-羟色胺系统中的另外两个人格候选基因5-羟色胺2A受体基因（5-HT2A）和5-羟色胺2C受体基因（5-HT2C）进行了考察。有研究者在双极性精神障碍患者和健康控制组群体中检验了5-HT2A的1号外显子中的一种单核苷酸多态性与伤害回避维度之间的关联，但是没有发现任何关联存在（Blairy et al.，2000）。还有研究者以健康日本人为样本对5-HT2A的5种单核苷酸多态性进行了考察，没有发现它们与气质性格量表的任何维度存在关联（Kusumi et al.，2002）。就5-HT2C与人格的关系而言，研究者发现5-HT2C中的一个点突变与三维人格问卷的奖赏依赖维度和坚持性维度存在关联，并且DRD4与5-HT2C对奖赏依赖存在显著交互效应（Ebstein et al.，1997）。然而，后来的一项重复性研究发现，5-HT2C对奖赏依赖不存在主效应，但DRD4与5-HT2C对奖赏依赖确实存在显著交互效应（Kühn et al.，1999）。

3.3.3 去甲肾上腺素系统

在人格的分子遗传学研究中，人们对去甲肾上腺素系统的关注远不及对多巴胺系统和5-羟色胺系统的关注多，但也取得了一些研究成果。有研究以健康被试为样本，考察了去甲肾上腺素转运体（NET）的一种外显子限制性片段长度多态性（RFLP）与气质性格量表中各维度之间的关系，但没有发现任何关联存在（Samochowiec et al.，2001）。不过，另一项以朝鲜人为被试的研究表明，去甲肾上腺素转运体的T-182C基因多态性与气质性格量表的奖赏依赖维度存在显著关联（Ham，Choi，Lee，Kang，& Lee，2005）。有研究表明，在中国人被试中，αla肾上腺素受体基因（ADRAlA）和0c2a肾上腺素受体基因（ADRA2A）的多态性与三维人格问卷各维度之间不存在任何关联（Tsai，Wang，& Hong，2001）。而之前的另一项研究发现，ADRA2A的一种常见单核苷酸多态性与易怒性、敌对性和冲动性诸测量值之间的确存在某些关联（comings et al.，2000）。关于去甲肾上腺素系统的诸候选基因与人格之间关系的研究，有待进一步加强。

4 总结与展望

行为遗传学通过数量遗传学和分子遗传学两条取径对人格遗传性问题进行了不同层次的详细探索，取得了较为丰富的研究成果，推进了我们对人格遗传程度和遗传机制的深刻认识，也有利于促进人格研究的科学化。人格行为遗传学研究的两类取向各具优势和不足。数量遗传学取向借助生态研究设计从宏观上估计遗传变异对人格差异的解释程度，资料获取经济简单、技术要求低，并且结果解释相对容易，但它无法确切地告诉我们究竟哪些基因或多态性导致了人格差异以及具体作用过程如何（Parens，2004），对研究设计和被试取样的依赖性较强，况且面对遗传与环境实际存在相关或交互作用的不争事实，遗传率的解释意义往往遭到质疑（Lerner，2011）。分子遗传学取向摆脱了数量遗传学取向存在的诸多不足，可以从DAN水平精确细微地探知造成人格障碍或差异的特定基因及其作用机制，但研究程序繁琐复杂，对新兴生物技术要求较高，在人格候选基因的选择上带有推测性，迄今为止尚未产生符合最初预期的可重复的实质性人格研究成果（McClellan & King，2010）。除此之外，两类研究取向还存在诸多共同的问题：一是受测量手段限制，对被试自陈报告依赖性高，往往会造成某些人格特质在防卫或伪装心理作用下被隐藏；二是由于研究设计和技术、被试取样、人格和基因自身复杂性以及环境与基因的交互作用等原因，研究结果的可重复性不高（Kim & Kim，2011）；三是受过去百余年消极心理学研究传统的影响，所研究的对象主要是精神分裂症、抑郁症、多动症等病理人群（张文新，王美萍，曹丛，2012），缺乏对健康人群积极人格品质的遗传研究；四是研究成果的现实利用率低，未能把研究所得成果及时有效地转化为现实效益。

鉴于人格行为遗传学研究所存在的诸多问题，未来研究应特别注意以下五个方面：

（1）强调两种研究取向的有机结合，在数量遗传设计中加入对特定基因型的直接测量。这两种研究取向各有优缺，可以相互弥补，况且分子遗传学的许多工作需用传统数量遗传学设计综合考虑环境与遗传因素来完成。未来研究可以在数量遗传设计中加入对特定基因型的直接测量，例如，可以先用数量遗传学方法确定某种人格特征是否具有遗传性以及遗传到什么程度，然后再用分子遗传学方法从根本上细微探究影响人格的具体基因及其作用方式。

（2）注重多学科和多范式的有效整合。人格的行为遗传学研究是一项综合性很高的困难工作，涉及遗传学、心理学、生物学、神经科学、医学和社会学等多门学科，因此需要在更广泛的视野下进行多学科的整合研究。人格的遗传机制相当复杂，靠单一研究工具（如自陈问卷）或研究范式很难获得理想结果，今后应在传统研究范式的基础上综合采用脑成像、诱发电位、前脉冲抑制和计算机博弈模型等一些新的研究范式，从多个角度综合考察和相互印证人格与基因的关系，从而弥补由自陈报告带来的弊端，同时克服可重复性低的问题。

（3）扩大对健康人群积极人格品质的研究。未来人格行为遗传学研究不仅要研究病理人群的消极人格品质，而且更要研究正常人群甚至超常人群的积极人格品质，探究它们的遗传性及分子作用机制，为积极人格品质的培养提供遗传学依据。

第8篇：表观遗传学研究方法范文

关键词：p21基因；甲基化；动脉粥样硬化

动脉中膜血管平滑肌细胞（VSMC）发生增殖和迁移并转化为泡沫细胞是动脉粥样硬化（AS）形成过程中的核心事件。细胞周期是各种因素刺激细胞增殖的最后信号通路，p21是体内最重要的细胞周期蛋白，可与几乎每一个Cyclin-CDK复合物结合并使其失活，从而阻碍细胞进入增殖期。p21等在高胆固醇等促AS因子作用下表达下调，导致动脉平滑肌细胞增殖和迁移， 但在此过程中没有发现p21基因的突变，从而使传统遗传学理论对此无法解释。表观遗传学理论，尤其是DNA甲基化为解决AS等多基因遗传疾病提供了新的思路。DNA甲基化不改变基因编码序列，但启动子区高甲基化将导致基因表达抑制和基因沉默。本课题观察p21基因甲基化对泡沫细胞形成的影响，为阐明AS发病机制提供理论依据。

1资料与方法

1.1一般资料 Gp Genome DNA修饰试剂盒购自Chmicon，PCR试剂盒购自赛百盛公司，四甲基偶氮唑盐和二甲基压砜购自Sigma公司，细胞培养基、小牛血清等购自Gibico。常规化学试剂为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1人血管平滑肌细胞的培养：无菌取剖宫产胎儿脐动脉，剥取中膜按贴块法培养VSMC，取第3-5代用于实验研究。实验前以无血清培养基培养12h使细胞处于静止状态。在无血清培养液中加入0.2%牛血清白蛋白，然后加入不同浓度OX-LDL刺激24h，未加刺激同时孵育24h细胞作为对照。

1.2.2氧化低密度脂蛋白的制备（ox-LDL）：采用非连续性密度梯度超速离心法分离提取LDL。新鲜人不抗凝血低速离心分离血清，用溴化钾调节密度至1.3g/ml，4°C 50000r/min离心5h，收集LDL，PBS透析，超滤除菌后4°C保存。Lowry法定氮，采用硫酸铜诱导氧化修饰，置于PBS中透析24h后4°C保存备用。

1.2.3 p21 基因甲基化检测：采用甲基化特异性PCR法。饱和酚-氯仿法提取样本DNA，取溶解的DNA样本1ug，参照Gp Genome DNA修饰试剂盒（Chmicon公司）应用亚硫酸盐修饰，回收后提纯行PCR反应。p21甲基化特异引物上游序列为5′-TACGCGAGGTTTCGGGATCG-3′，下游序列 5′-AAAAACGACCCGCGCTCG-3′，扩增产物片段为133bp；p21非甲基化特异引物上游序列为5′-TATGTGAGGTTTTGGGATTGG-3′，下游序列 5′-AAAAACAACCCACACTCAACC-3′，扩增产物片段为133bp。引物由赛百盛生物公司合成。建立50μl反应体系，内含10×反应缓冲5μl ，dNTP1μl，上下游引物各20pmol，Taq酶0.5单位，模板 DNA 5μL，双蒸水补至50μl，覆盖石蜡油，940C 5min 后，进入940C变性1 min ，670C复性1 min ，720C延伸1 min的循环，共35个循环，最后720C延伸5 min，产物行琼脂糖凝胶电泳分离，拍照后扫描条带，以同一样本甲基化条带与非甲基化条带之比进行甲基化程度半定量。

1.2.4 细胞增殖活力检测 MTT比色法。细胞弃去培养液，PBS洗涤，再加入20μL MTT工作液及200μL培养液，4h后吸去上清，每孔加入二甲基亚砜150μL，充分振荡使结晶物融解，490mm波长在酶标仪上测定各孔光吸收值，以试验孔OD均值/对照孔OD均值作为细胞增殖的相对活性。

1.2.5 泡沫细胞的半定量 细胞油红"O"染色，拍照后利用图像扫描仪根据细胞脂滴的面积进行细胞分类。细胞脂滴的面积小于细胞核的面积者记为"-"，面积等于或大于细胞核的面积记为"+"，即为泡沫细胞，每一块玻片计数100个细胞，计算泡沫细胞的阳性率

1.3统计学分析 计量资料数据采用x±s表示，计数资料以百分比（%）表示，所有统计分析均在SPSS12.0软件上进行。P

3讨论

动脉粥样硬化是严重危害人类健康的血管疾病，其发病机制复杂，迄今尚未阐明。血管平滑肌细胞的增殖和迁移受周期依赖激酶（CDK）和细胞周期蛋白共同作用而完成，尤其是G1期过渡到S期受周期蛋白依赖激酶抑制因子的调节。p21是体内最重要的细胞周期蛋白，可与几乎每一个Cyclin-CDK复合物结合并使其失活，从而阻碍细胞进入S期。在高胆固醇等促AS因子作用下， p21等抑制增殖因子表达降低，导致SMCs增殖和迁移，成为富含脂质的泡沫细胞 [4]。

基因的甲基化是表观遗传学上对基因表达进行调控的一种常见机制，是最常见的复制及转录后修饰方式，常常导致基因的表达抑制。DNA甲基化是指在甲基转移酶介导下CpG 二核苷酸中胞嘧啶第5位碳原子加上一甲基基团，变成5-甲基胞嘧啶[3]。高度保守的管家基因启动子区富含CpG 二核苷酸，启动子区高甲基化导致基因表达抑制，使该基因沉默和失活[1]。

研究发现相关基因的甲基化在动脉粥样硬化发生发展中起着重要作用。对同型半胱氨酸（Hcy）的研究提示Hcy浓度升高会影响体内许多物质的甲基化过程，Hcy已被认为是独立的致AS危险因子[3，8]。已知AS患者粥样斑块中雌激素受体α（ER2α） 基因的甲基化水平显著增高；体外试验结果证实Hcy可以促进VSMCs向泡沫细胞转化，同时伴有ER2α甲基化增加，上述结果提示ER2α基因表达沉默与AS 形成间存在相关性[8，10]。对动脉粥样硬化兔颈动脉斑块p53基因检测提示其甲基化程度明显增高。

VSMCs的增殖和迁移是动脉粥样硬化的主要病理特征之一，本研究结果表明ox-LDL可以通过影响DNA的甲基化修饰引起p21高甲基化，这可能是其促VSMCs增殖进而引起动脉粥样硬化的重要机制。

参考文献：

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第9篇：表观遗传学研究方法范文

[关键词] 5-氮杂-2'-脱氧胞苷；死亡相关蛋白激酶；胃癌；细胞增殖；细胞凋亡

[中图分类号] R734.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）11（b）-0014-04

[Abstract] Ojective To explore the effects of DNA methylation inhibitor 5-Aza-2'-deoxycytidine （5-Aza-CdR） on the proliferation， apoptosis and the expression level of tumor suppressor gene DAPK in human gastric cancer cell line BGC803 cells. Methods BGC803 cells were treated with different concentrations of 5-Aza-CdR and divided into four groups， including control group， 5-Aza-CdR 1 μmol/L group，5-Aza-CdR 5 μmol/L group and 5-Aza-CdR 10 μmol/L group. Cell counting Kit-8 was employed to detect cell proliferation， cell apoptosis was measured by AnnexinⅤ/PI apoptosis detection kit， RT-PCR was applied to detect the DAPK mRNA expression. Results The proliferation of BGC803 cells was significantly inhibited in a dose-dependent manner compared with control group， after 5-Aza-CdR treatment， the apoptotic rates of cells increased significantly （P < 0.05）. The expression levels of DAPK mRNA was gradually increased in a time-dependent manner （P < 0.05）. Conclusion 5-Aza-CdR inhibited cells proliferation， promoted cells apoptosis and induced the expression of DAPK gene in BGC803 cells.

[Key words] 5-Aza-2'-deoxycytidine； Death-associated protein kinase； Gastric cancer； Cell proliferation； Cell apoptosis

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，每年因胃癌死亡的人数位居癌症死因第2位[1]。胃癌的发生发展是涉及多个基因的复杂过程，与抑癌基因的异常改变密切相关。肿瘤表观遗传学认为基因启动子区CpG岛甲基化是抑癌基因表达下调甚至失活的重要机制，但这种变化是可逆转的，去甲基化药物能够逆转抑癌基因启动子甲基化状态，恢复其正常表达[2]。死亡相关蛋白激酶（death-associated protein kinase，DAPK）是一种凋亡正向调节分子，可被肿瘤坏死因子α、神经酰胺、细胞外基质（ECM）存活信号和pl9AFR5等多种因子激活，进而诱导凋亡[3]。有研究表明在头颈部肿瘤、胃癌、肺癌及膀胱癌等多种肿瘤细胞中，DAPK启动子区域DNA高甲基化水平与该基因表达沉默有关[4-7]。Satoh等[8]发现15%的胃癌组织存在DAPK基因启动子区CpG岛甲基化。本文以人胃癌BGC803细胞株为研究对象，研究体外去甲基化药物5-杂氮-2'脱氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-Aza-CdR）对胃癌细胞株增殖、凋亡及细胞中DAPK基因的表达影响，为探讨胃癌的发生发展机制及治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

BGC803细胞来源于中国医科大学遗传学教研室，5-Aza-CdR购自美国Sigma公司，CCK-8购自北京碧云天公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，总RNA提取试剂盒，RT-PCR试剂盒，GoTaq Master Mix购自美国Promega公司，AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒购自北京宝赛公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养、分组及药物处理 RPMI1640培养液（含10%小牛血清，100 μ/mL 青霉素，100 μ/mL链霉素）在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养BGC803细胞。培养至60%汇合度时，对照组使用不含5-Aza-CdR的普通完全培养液，实验组分别为加入不同浓度5-Aza-CdR处理液分别记为5-Aza-CdR 1 μmol/L组、5-Aza-CdR 5 μmol/L组、5-Aza-CdR 10 μmol/L组，每隔24小时换液1次。

1.2.2 CCK-8检测细胞增殖变化 将各组BGC803细胞按1500/孔接种96孔板，每组设3个复孔，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在细胞培养箱内孵育4 h，测定450 nm波长OD值，连测3 d，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞增殖曲线。以上实验重复3次。

1.2.3 AnnexinⅤ/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率变化 细胞传代24 h后，实验组将5-Aza-CdR 10 μmol/L浓度配制的培养液加入培养瓶中，对照组换普通培养掖，每24小时换液1次。待72 h后分别回收细胞，制成单细胞悬液，再用PBS离心洗涤，调整待测细胞密度为1×106个/mL。取1 mL细胞，1000 r/min， 4℃离心10 min，弃上清液，加入PBS清洗细胞2次，将细胞重悬于100 μL结合缓冲液，加入5 μL AnnexinⅤ-FITC和10 μL PI轻轻混匀，避光室温孵育15 min后，加入400 μL结合缓冲液，立即FCM检测。

1.2.4 半定量RT-PCR 检测各组细胞DAPK mRNA 表达变化 用总RNA提取试剂盒提取5-Aza-CdR 10 μmol/L组不同处理时间（0、24、48、72 h）的细胞内RNA，用两步法将RNA逆转成cDNA后进行PCR实验，DAPK引物序列为5'-GATAGAAATGTCCCCAAA-3'（上游）；5'-TCTTCTTTGGATCCTTGA-3'（下游），长度为343 bp。作为内参的人β-actin引物序列为5'-CCAGATCATGTTTGAGACCT-3'（上游）；5'-TTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3'（下游），长度为480 bp。扩增反应条件：95℃ 5 min变性，95℃复性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃延伸10 min，4℃暂时保存。实验重复3次。产物行1.2%琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统（Tanon-2500 R）拍照及分析表达情况。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件，正态分布计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 讨论

DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5'碳位共价键结合一个甲基基团。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则使基因重新活化和表达。抑癌基因启动子区域CpG岛高度甲基化可导致相关基因表达沉默，从而直接参与、影响或调控肿瘤的发生发展过程，是癌症发生的重要机制[9]。由于DNA甲基化修饰不涉及DNA序列改变，这种改变是可逆的。5-Aza-CdR是一种高效的DNA甲基转移酶（DNMT）抑制剂，它可与DNMT不可逆性结合，具有较强的去甲基化作用，恢复表观遗传学沉默的基因的表达水平，纠正肿瘤细胞的异常生物学特征[10-11]。目前5-Aza-CdR已在临床急性粒细胞白血病的治疗中得到较成功的应用[12]。Wang等[13]报道，胃癌SGC7901和BGC823细胞经5-Aza-CdR处理后，细胞增殖明显受到抑制。本研究用不同浓度去甲基化药物（5-Aza-CdR）处理胃癌细胞BGC803细胞72 h后，发现5-Aza-CdR能明显抑制细胞的增殖。

本研究显示，5-Aza-CdR对胃癌BGC803细胞具有诱导凋亡的作用。肿瘤细胞凋亡受众多凋亡相关基因调控。DAPK是一种钙调蛋白调节的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于细胞凋亡的正调控因子，广泛参与多种途径介导的细胞凋亡[14]。在多种肿瘤中已发现DAPK基因CpG岛有不同程度的高甲基化，DAPK表达明显受到抑制[15-16]。本研究发现胃癌BGC803细胞中DAPK mRNA表达水平很弱，使用10 μmol/L 5-Aza-CdR处理细胞后，可恢复DAPK mRNA表达并呈时间依赖性升高，并且基因的表达状况与细胞的生长状况平行。由此提示，5-Aza-CdR可能通过恢复DAPK基因CpG岛的去甲基化水平，使基因恢复其转录活性，从而诱导其重新表达，发挥DAPK的肿瘤抑制作用。其具体甲基化的改变状态尚需进一步研究。

综上所述，本研究发现5-Aza-CdR抑制胃癌细胞BGC803增殖及诱导凋亡，可能与其去甲基化恢复DAPK基因表达及功能有关，这为胃癌的诊断及去甲基化治疗提供了依据。

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