动物行为学研究方法精选(九篇)

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第1篇：动物行为学研究方法范文

【关键词】药物和针刺;大鼠行为学;研究进展

doi:10.3969/j.issn.1006-1959.2010.05.335 文章编号:1006-1959(2010)-05-1330-02

行为医学,顾名思义,可以理解为研究人的行为的医学。具体地说,是研究与动物或者人的行为有关的一切知识和技术,从行为入手,来揭示生物的生命活动、健康与疾病的本质、规律,探索诊断、治疗、预防疾病、增进健康的行为科学技术和方法。有关行为医学的研究已经被广泛开展,本文仅对近一年来以大鼠为实验对象,通过使用药物和针刺等外加刺激来研究其对大鼠一系列行为学治标产生影响的研究进行简要的总结,并对其给予初步的分析。对药物和针刺等外加刺激对于行为学研究的前景作以展望。

1.药物对大鼠行为学的影响

张红岩等[1]使用雌激素作为外加刺激,观察雌激素对于偏头痛模型大鼠发病时其行为学的改变。研究结果表明:雌激素能减少中脑导水管周围灰质区5-羟色胺阳性神经元的激活,减轻偏头痛模型大鼠的行为学改变。张俊慧[2,3]应用复方消疲悦意饮作为刺激,观察了其对实验性慢性疲劳大鼠行为学的影响。结果显示造模组造模后大鼠水平及垂直运动次数明显减少,力竭游泳时间缩短,鼠尾悬挂不动时间延长(P

行为学的变化与各个系统的生理功能密不可分。各个系统的机能受到各种因素的影响发生改变的同时,行为学也会发生变化。各种药物通过不同的途径恢复机体的正常功能的同时,对行为学治标也起到了一定的改善。反过来,正常的行为学体系,也就为机体的正常生理学稳态提供了基本保证。如果机体行为学发生变化,正常的生理功能也很难保持在良好状态。这就为今后各种疾病的预防和治疗提供了新的途径。

2.针刺对大鼠行为学的影响

针刺,作为祖国医学宝库中的一朵奇葩,数千年来一直呗广泛使用,对于各个领域疾病的治疗和预防都起到了不俗的效果。最新研究表明针刺在行为学研究领域也有良好的疗效。

朱书秀[6]采用Meyne核注射微量A131-40制备动物模型,选取百会、太溪、足三里电针治疗,以Morris水迷宫评价大鼠学习记忆能力,免疫组化法观察海马区IL一1p、TNF-Ot的表达。观察电针对阿尔茨海默病大鼠学习记忆及海马区IL一113、TNF-Ot的影响,探讨了电针治疗的作用机理。结果表明模型组海马区IL一1p、TNF-Ot的量增加。学习记忆能力减退。经电针治疗后,IL一113、TNF-Ot的量较模型组减少,学习记忆能力增强。电针可显著改变AD模型大鼠的学习记忆能力,降低海马IL一113、TNF-Ot的含量。罗文舒[7]将大鼠随机分为空白组、模型组、西药组、针刺1组和针刺2组,采用长期不可预见性中等强度应激结合孤养造成大鼠抑郁症模型,分别测定大鼠糖水消耗量以及行为学的改变。借以观察针刺督脉的基础上加用足太阳经穴对抑郁症大鼠的疗效,结果与模型组相比,针刺督脉和足太阳经治疗组的糖水消耗量增加,行为学评分升高。说明针刺督咏和足太阳经可以改变抑郁模型大鼠行为学异常,在治疗抑郁症方面有一定优势。李丽萍[8]采用针刺百会、太冲穴对慢性应激抑郁模型大鼠行为学变化进行了观察研究。结果显示造模21天后各组大鼠的水平运动和垂直运动得分均较正常组明显减少,体重增加减慢,糖水消耗量降低;而针刺治疗组与阿米替林组均可显著增加大鼠水平运动和垂直运动得分,使体重增加,糖水消耗量增加,改善大鼠的抑郁状态,各治疗组间差异不显著。说明针刺可以改善慢性应激抑郁模型大鼠的抑郁状态。倪丽伟[9,10]使用Cnstina Tassore报道的方法并加以改进复制偏头痛大鼠模型,造模成功后分别给予相应针刺或药物处理,采用时间分段计数法观察造模后大鼠的行为症状变化。结果显示针刺和尤舒均能显著改善偏头痛模型大鼠的行为学症状且疗效相似。说明针刺可显著改善偏头痛模型大鼠的行为学症状。

以上报道可以看出,针刺穴位可以对很多疾病起到改善作用。针刺通过调节机体的功能,能够同时改善机体行为学的变化,进而进一步缓解机体功能。针刺作为一种损伤小、副作用小的方法,避免了由于长期药物治疗的副作用,可以作为今后行为学治疗的重要方法。

3.研究展望

世界卫生组织关于健康的定义是:健康不仅指一个人没有疾病或虚弱现象,而是指一个人生理上、心理上和社会上的完好状态。这就是现代关于健康的较为完整的科学概念。现代健康的含义是多元的、广泛的,包括生理、心理和社会适应性3个方面,其中社会适应性归根结底取决于生理和心理的素质状况。心理健康是身体健康的精神支柱,身体健康又是心理健康的物质基础。良好的情绪状态可以使生理功能处于最佳状态,反之则会降低或破坏某种功能而引起疾病。身体状况的改变可能带来相应的心理问题,生理上的缺陷、疾病,特别是痼疾,往往会使人产生烦恼、焦躁、忧虑、抑郁等不良情绪,导致各种不正常的心理状态。作为身心统一体的人,身体和心理是紧密依存的两个方面。而行为学正式研究这一领域的学科,我们通过药物、针刺,以及其他各种疗法的根本目的也就是改善机体的功能,说到底就是改善行为学。所以,对于行为学的研究还只是刚刚开启了大门,今后的研究还有待于进一步的开拓新方法,拓展新领域。相信随着医学的发展,将会有更多的研究成果被报道,更好的为人类真正意义的健康服务。

参考文献

[1] 张红岩.雌激素对于偏头痛大鼠行为学改变及中脑导水管周围灰质5-HT表达的影响.吉林大学学报(医学版)[J],2008,34(1):131-134.

[2] 张俊慧,胡兵,沈思钰.复方消疲悦意饮对实验性慢性疲劳大鼠行为学的影响[J].医学研究生学报,2008,21(8):817-819.

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[8] 李丽萍.针刺对慢性应激抑郁模型大鼠行为学的影响[J].针灸临床杂志,2008,(24)6:50-52.

第2篇：动物行为学研究方法范文

通过这次的《组织行为学》讲座，我了解到组织行为学是研究组织中人的行为与心理规律的一门科学，其实更是一直与人沟通与人交流的一种方式和方法。它是行为科学的一个分支，随着社会的发展，尤其是经济的发展促使了企业和组织的发展进步，组织行为学越来越受到人们的重视。“沟通，从心开始”为主题的讲座，令深深感受到组织行为学的魅力，建立有效沟通，完善工作方法。

通过课程，使我更加客观的看待每个人自身的优点和缺点，然而不是所有的人在任何时候都会扬长避短、知己克己、取长补短，在生活、工作中，我们有可能不了解自己，不了解他人，不了解某个场合的某种情况，所以会有生活、工作中的种种不顺心或者不愉快，小矛盾、大干戈油然而生。而事后，我们静下来的时候也许还会抱怨，也许会反思，自己的不对或他人的不是。这其中就涉及到组织行为学中许多观点。在现实的工作群体中，我们首先要进行反思自身问题，善待他人，他人也会善待自己。我们每个个体是相互交融在一起的，无论是家庭的一员还是作为团队的一员，我们要处理好团体与个体关系，切同存异，实现共同进步。

人是理性动物，也更是感情动物。很多时候人做事情都是会被感情所左右的，要想通过沟通达成意见的一致就要学会倾听别人的想法，也要站在别人的立场上去思考问题。心存他人，尊重他人，这样才可以得到他人的尊重和认可。当做一件事情或完成一个任务，各部门或各人之间有分歧的时候，需要去积极沟通和化解分歧，但是沟通并不等于只去表达你自己的认知和看法，以得到别人的赞同，而是要用一种尊重的态度去聆听各部门或每个人的观点，然后结合自己的想法找出分歧之处，，用最好的方式去向对方表达你的观点和看法，最后征求对方的意见已达到最后的一致。

最后要感谢王延骏和李可永等教授和老师辛苦授课和讲解，也衷心的感谢新疆农业大学精心为我们组织了一次“沟通，从现在开始”的为主题的讲座，让我们更深入了解了组织行为学的魅力和精髓所在。

第3篇：动物行为学研究方法范文

[关键词] 嗅觉; 嗅觉障碍; 评估方法; 动物实验; 文献综述

[中图分类号] R339.12 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562(2010)04-0434-04

doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2010.04.041

嗅觉是人体原始的感觉功能之一,它同视觉、听觉一样,是人体捕获外界信息的特殊装置。嗅觉还可以通过中枢神经系统影响人的情绪、调节生命周期。嗅觉障碍患者对周围的事物不感兴趣,反应平淡,生活质量下降,更可以造成精神上的压抑或忧郁。王鸿等[1]报道用T&T测试法测试了1 035例慢性鼻窦炎鼻息肉患者,86.3%的患者有嗅觉功能障碍,与患者的主诉有极显著的差异,说明嗅觉功能改变没有受到患者的注意。近几年随着人们对生活质量要求的提高,对嗅觉障碍的关注程度有了很大的提高。

嗅觉评估不仅仅是要判断嗅觉功能是否正常,还需要进一步判断嗅觉障碍的程度、性质、部位等因素,如果能提示病因以及预后则更有临床、实验应用的价值。在动物实验中关于嗅觉功能的研究已经有了较长的历史,出现了多种实验方法,但是目前为止还没有一个全面、客观、高特异性的金标准方法出现,本文就目前动物实验中的常见的嗅觉评估方法进行一个概括性的介绍。

1 行为学方法

动物实验和临床试验的最大区别在于动物无法准确地和实验者交流,所以行为学方法在动物实验中就显得极为重要。嗅敏动物的学习记忆能力、寻食能力等与嗅觉有很高的相关性,可以观察、记录其行为学的改变,从而判断其嗅觉功能的变化。目前报道较多的可以评估嗅觉功能的行为学方法有以下几种。

1.1 埋藏食物小球实验(buried food pellet test,BFPT)

BFPT是目前最常用于检测动物嗅觉功能的行为学检测方法[2]。目前比较通用的方法由Nathan等[3]于2004年报道,他的实验中使用找寻食物小球等待时间作为数据进行统计分析,即从小鼠被随机放置于盒子中开始,到小鼠揭开食物小球并用它的前爪或牙齿抓住食物小球的时间,如果5 min(300 s)内小鼠未找到食物小球,即被移走。林静等[4]以300 s(5次测试的平均值)内未找到食物小球作为判定小鼠存在嗅觉功能障碍的标准,并认为以300 s作为分组标准是合理的。

1.2 嗅觉测量仪

Slotnick等[5]利用行为学原理设计出一种用于动物实验的嗅觉测量仪,可以通过改变气味的浓度后观察动物的行为学变化来评价其嗅觉。该系统经众多实验验证其对动物嗅觉的检测是有效的[6],因操作方便且可进行多种设计,此方法被广泛应用于动物嗅觉功能的评估。

1.3 双瓶实验

有研究证实小鼠、大鼠在分辨某些物质的时候主要是依赖于嗅觉而非味觉,例如盐酸、盐酸奎宁(quinine HCl, QHCl)等有一定挥发性的物质 [7]。因嗅觉障碍时动物分辨饮用水和实验溶液的能力下降,通过两种溶液被动物饮用的程度可以评估动物嗅觉障碍的程度。

1.4 幼鼠超声发声实验

新生小鼠嗅觉的产生比其他的感觉要早。新生小鼠嗅到成年鼠窝的气味时可发出一种超声作为回应,检测这种超声的出现与否可以判断其嗅觉功能是否正常[8]。Lemasson等[8]用3-甲基吲哚来破坏新生小鼠的嗅上皮,结果成功地证实了该检测方法的可行性。而且在该实验中发现由于被破坏嗅觉的小鼠无法正确识别,其生存率大大降低,证明了嗅觉对新生小鼠有极其重要的作用。

行为学方法在动物实验的嗅觉评估中有很重要的作用,历史悠久、技术成熟,实验方法较为简单,实验装置花费较少,对嗅觉功能的初步评估价值较为肯定(尤其是埋藏食物小球实验和Slotnick的嗅觉测量仪),可行性及可重复性较高。需要注意的是本类实验受个体差异影响较大,实验前应经预评估剔除先天差异比较大的个体,而且样本量不宜过小,有时候还需对动物进行预先的训练。为保证实验的客观性,需要很好地进行实验设计与控制,有时连昼夜节律等变化的影响都需要考虑在内。行为学测试结果对嗅觉功能评估只是一个综合的结果,对嗅觉障碍程度、部位等的判断较差,如果能结合嗅觉诱发电位等客观检查可以做到更加客观、可信。在过去的实验中行为学测试往往与组织学检查相结合,既增加了实验的客观性,又为进一步研究嗅觉产生机制或嗅觉障碍的原因提供了基础。

2 客观评估方法

嗅觉的感受、传导是个比较复杂的过程,气味分子通过鼻腔到达嗅黏膜后被其表面的黏液所吸附,进而在黏膜层中扩散,到达嗅细胞。达到阈浓度的气味分子可刺激嗅细胞产生嗅觉电位,这是其感受过程。产生的嗅觉电位通过嗅神经穿过筛骨筛板,到达嗅球,其内有第2级神经元,再通过嗅束传导至初级嗅皮质及皮质内侧核,而后至海马回的内嗅皮层即次级嗅皮层,神经冲动引起大脑皮层的激活才能最后引发嗅觉。嗅觉功能的客观评估方法包括了对嗅觉感受、传导通路上各种指标,例如影像学、电生理学、组织学等的测量。目前动物实验中使用较多的及可能有较大发展前景的客观评估方法包括以下几类。

2.1 组织学方法

这里的组织学是泛指解剖取组织后进行的所有检查,包括大体解剖学、病理学、免疫学、分子生物学等诸多学科的检查方法。嗅觉系统的改变既可以由病变本身引起也可以是因为嗅觉障碍后的退行性变引起。组织检查比结构影像检查更有评估价值,因其可以更好地提示病因,也利于更好地研究嗅觉通路和嗅觉障碍产生的机制。目前组织学方法在动物实验中有很广泛的应用,从部位选择上看整个嗅觉传导通路包括从嗅黏膜直到海马回的内嗅皮层都有报道,从实验方法上看更是复杂多样,最常用的几种方法有如下几种。

2.1.1 病理学检查

这是早期免疫学技术及分子生物学技术还不是很发达时常用的检查手段,在早期嗅觉研究中有较多的应用,在嗅觉障碍的动物标本上可以看到细胞凋亡、空泡等变化,虽然特异性较差,但是也能提供宏观的信息,现在常常和其他检查方法一起使用,例如在陈志宏等的实验中在进行其他检查之前使用了HE染色方法检查了模型小鼠的嗅上皮,发现其嗅上皮变薄,其中的感觉神经元的细胞核层数变少[9]。

2.1.2 蛋白及核酸表达的检查

对相应组织中某些标志性蛋白及核酸的检查可以间接地反映嗅觉功能及提示嗅觉障碍的原因。例如用免疫组化方法检查嗅觉通路中嗅标记蛋白(olfactory marker protein, OMP)、酪氨酸羟(tyrosine hybroxylas, TH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、c-Fos蛋白等标记物在许多文献中都有记载。Buron等[10]在丙酮吸入诱导的嗅觉障碍实验中使用了嗅上皮组织的OMP及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作为观察指标,发现丙酮对于嗅上皮的损伤是有选择性的。有学者使用多巴胺及细小白蛋白作为标记物进行免疫组化检查,发现失嗅动物模型的嗅球中含多巴胺及细小白蛋白的神经元细胞数量明显减少,认为通过该失嗅动物模型可以对嗅球萎缩进行定量描述,提示多巴胺及细小白蛋白在嗅球中的表达对于失嗅的作用[11]。c-Fos蛋白可反映大脑组织活动程度,对c-Fos蛋白的观察可以一定程度上起到功能磁共振的作用[12]。

2.2 电生理学方法

2.2.1 嗅电图

将电极直接置于嗅区黏膜,当其接受嗅素刺激时记录到的一种慢相负性电位变化称为嗅电图,目前普遍认为它是单个嗅细胞电位变化的总和,嗅电图已经在动物实验中得到证实[13]。嗅电图最大的缺陷在于虽然其对嗅黏膜损伤引起的嗅觉障碍有较大的意义,但是对于黏膜后传导通路以及嗅球、海马回等中枢病变导致的嗅觉障碍没有什么评估价值。

2.2.2 嗅觉脑电图

嗅觉诱发脑电图是指在给予嗅刺激时,实验对象的脑电图可发生变化,Hirano等[14]用狗做实验时成功地获得了该变化,在他的实验中发现脑电图的快波对嗅觉功能的意义较大。嗅觉诱发脑电图又相继在大鼠等其他动物身上得到了验证[15]。嗅觉脑电图产生的机制还不是很明确,而且其特异性不是很高,故目前在动物实验中研究、应用的较少。

2.2.3 嗅觉诱发电位

又称为嗅觉事件相关电位(olfactory event-related potentials,OERP),最早是用电刺激动物嗅黏膜时在头皮特定部位记录到稳定的脑电位的变化,该方法经过一段时间的发展后认为其和自然嗅觉之间有一定的差距,故逐渐被化学气味诱导的嗅觉诱发电位所取代,目前使用的已经比较少。早期化学气味刺激除了有嗅觉刺激外还常常伴有物理刺激及对三叉神经的化学刺激,这些非嗅刺激干扰了正常嗅觉诱发电位的获得。随着仅能兴奋嗅觉系统而不兴奋三叉神经系统的化学物质如香草醛等,以及Kobal式嗅觉刺激器的出现,嗅觉诱发电位研究成为嗅觉研究领域的热点。嗅觉诱发电位仪至少包括嗅觉刺激器及脑电采集系统,测量时需要在电声屏蔽室进行,且需要给予一定的白噪声掩蔽刺激探头释放刺激时产生的干扰噪声。目前动物嗅觉诱发电位各波的具体来源以及与疾病间的相互关系还不清楚,嗅觉诱发电位的出现是否意味着动物确实产生了嗅觉还不能肯定,所以用来证明嗅觉传导通路是否畅通比较可行[16],而暂不能用于嗅性疾病的定位、定性诊断。嗅觉诱发电位应该是最可能成为动物嗅觉评估客观标准的检查方法。

3 影像学方法

3.1 嗅觉系统结构影像检查

有研究证明嗅球及嗅束等神经结构的生长与周围神经冲动的输入有关[17],所以嗅觉障碍后嗅觉系统各部位可有一定的不依赖于年龄的结构改变,通过磁共振影像检查可以发现这些改变,例如嗅球体积变小、嗅沟缺失或变浅、嗅束缺失等现象,从而间接评价嗅觉功能。

3.2 嗅觉系统功能影像检查

这是目前嗅觉研究的热点方向之一,主要技术有功能性磁共振成像(fMRI)、PET成像和脑信号的光学成像等。

3.2.1 功能磁共振检查

功能磁共振检查技术有很多,用于嗅觉系统功能的fMRI技术主要是(blood level dependent fMRI, BOLD fMRI),当氧合血红蛋白的比例增加时或去氧血红蛋白含量减少时,T2信号缩短效应减弱,表现为MR信号增强。嗅觉功能成像既能反映血流的变化,也能反映神经元活动的代谢变化,近些年在研究神经功能方面发挥着巨大的作用,特别是fMRI无放射暴露,可反复测试,且时间、空间分辨率要优于PET成像,故是目前嗅觉功能成像的主要方法。在大鼠实验中已经证实,7 T的fMRI能够显示气味刺激后大鼠嗅球的活化[11]。其空间分辨率很高,对于研究嗅觉相关皮层的定位、嗅觉功能障碍情况下嗅觉相关皮层反应的变化等有极大的应用价值。有学者拟通过信息技术将啮齿类动物嗅球的激活图像编成二维的气味图(OdorMap,OM)及气味图数据库(OdorMap Database,OMDB)以利于嗅觉工作者对嗅觉系统的研究[18]。功能磁共振应用在动物实验的嗅觉评估中需要注意的是:首先动物是不能配合磁共振检查的,故需要在麻醉下进行;其次磁共振是强磁场环境,故嗅觉刺激装置不能由金属制成。

3.2.2 脑功能光学成像

脑功能光学成像是近年来神经外科的热点研究方向,目前主要的实验技术有激光散斑衬比成像和内源信号光学成像。而应用于嗅觉功能检查的主要是内源信号光学成像,这里所指的内源信号,并不是神经元所表现出来的电信号,而是指由神经元活动所引起的有关物质组分、运动状态的改变而导致其光学特性的变化,在与某些特定波长的光量子相互作用后,得到的包含了这些特性的光信号,包括:血红蛋白信号、氧合血红蛋白信号、光散射特征信号等[19-20]。许多生理性过程如血红蛋白氧合度、细胞色素的氧合状态、神经胶质和神经元肿胀、功能性血流量改变等变化,都会影响到组织光反射特性的改变。通过探测反射光的变化量,就可以获得这种特异性的内源光学信号。内源光学信号成像在动物实验中已用于多种脑功能皮层功能的检查,比如视觉(猫、小鼠等)、躯体感觉皮层(大鼠、猫、松鼠猴等)、听觉皮层(南美栗鼠、猫、雪貂等)。Bathellier等[21]在实验中使用了内源光学信号原理和突触素荧光标记两种方法分别获得了香芹酮、苯甲酸甲酯刺激后大鼠嗅球的激活情况,在内源光学信号成像下,激活的嗅小球反光率下降,呈相对的冷色调,而在荧光标记实验中激活区域荧光反应较强。虽然内源光学信号成像的时空分辨率都较高,但是其穿透脑皮层的能力受限(大约数百微米),所以对于深层脑组织的观察就没有什么效果了。由于内源光学信号的确切生理来源至今没有定论,所以为了阐述内源光信号对应的生理意义及其与神经元电活动的关系,还需要与其他方法进行对比研究。

从其他感觉的评估方法来看,功能磁共振和诱发电位是研究的发展方向,但目前嗅觉产生、传导机制尚未完全明了,相关检查技术尚处于起步阶段,还需要进行大量的研究。目前的嗅觉研究可以根据不同的实验要求及实验条件选择不同的实验方法及实验方法的组合。嗅觉诱发电位及功能磁共振检查由于其初期投入较大,对硬件及技术条件要求较高,开展难度较大,在国内只有少数医院在从事这方面的实验。行为学方法操作简单,技术成熟,效果肯定,有很强的实用价值。组织学方法对于机理的研究十分重要,并且随着对嗅觉认知的加深,越来越多的标记物被发现,评估方法也越来越丰富。如果可以出现一种简单易行的嗅觉评估方法,那么可以极大地促进嗅觉的研究。

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第4篇：动物行为学研究方法范文

1鸟类脑大小对觅食创新的影响

很多动物行为学家都认为，在动物前脑大小与觅食创新之间存在着神经生物学联系［3］，因为前脑与动物行为的可塑性密切相关。通常是前脑越大，觅食创新能力越强。根据这一基本原理，Lefebvre等人（2004）［4］研究了北美洲和大不列颠群岛上各种鸟的前脑大小与觅食创新之间的关系。所谓觅食创新是指能取食和利用新的食物种类或采用新的觅食技巧。为此，研究人员利用了9种鸟类学杂志所提供的资料，收集了322种觅食创新（或觅食新技能），其中126种觅食新技能属于大不列颠群岛上的鸟类，192种属于北美洲的鸟类（表1）。这些觅食创新包括银鸥捕到小啮齿动物后将它们扔到岩石上摔死或沉入水中淹死；也包括普通乌鸦利用过路的小汽车把坚果压碎，这相当于把小汽车当钳子使用［5］Lefebvre等人曾计算过这些创新行为在不同类群（目鸟类中的分布情况，同时还分析过不同类群鸟类在大不列颠和北美洲的常见程度或稀有程度。在掌握各种鸟类觅食创新行为的同时，研究人员还获得了这些鸟类前脑相对大小的资料［6］。无论是在大不列颠群岛还是北美洲，鸟类前脑的大小都与觅食创新密切相关。凡是前脑比较大的鸟类，其觅食创新行为也更为常见。虽然有很多觅食创新都是在一次观察中发现的，但对多达322例觅食创新行为的大规模分析中，发现在前脑大小与觅食创新之间确实存在着直接的关系，这表明，这是动物行为学中一个重要而有意义的研究新领域。Sol等人（2006，2007）［7－8］曾研究过鸟类脑子较大是否对其生存和生殖有利的问题。长期以来人们一直未经验证地认为，脑相对较大有助于提高动物的适合度（fitness），特别是当种群进入一个新的陌生环境的时候，这时觅食创新对动物的生存和生殖就特别重要［9－10］。Sol等人曾研究了646例物种被引入新环境的实验（涉及196种鸟），其中大多是研究人员将一种鸟引入一个岛屿或原分布区以外的地方［11－12］。研究人员还收集了196种鸟有关脑大小的资料，并根据鸟大脑就大，鸟小脑就小的基本事实作了相应的校正，最终发现，在鸟的脑大小和能在新环境中成功定居之间存在着正相关关系，这是因为脑子较大的鸟类具有更强的觅食创新能力，这种能力可大大提高鸟类的食物摄取率，从而能提高鸟类的生存机会和生殖机会。

2动物有计划未来的能力吗？

学习是动物借助于个体生活经历和经验使自身行为发生适应性变化的过程，从这一学习的定义可以看出，任何当前发生的行为都是与此前的生活经历和经验相关联的。如果动物也能像我们人类那样能够根据先前的经历和经验预测和计划未来的话，那一定会大大增加自身的存活机会和适合度。目前属于这方面的研究还很少，因为长期以来人们一直认为计划未来是人类独有的能力，这也是人类与所有其他动物存在的一个主要差异［13］。然而随着时间的推移已变得越来越清楚的是，动物也具有一些一度被认为是人类所独有的行为，例如使用工具和纯粹是有利于未来生存的行为，这促使动物行为学家开始对动物有没有计划未来的能力产生兴趣并进行研究。动物行为学家认为，要想确认计划未来的行为必须满足两个条件：首先该行为必须是创新的或新颖的，它不是某些本能行为的表现，例如：迁飞行为有很多本能成分，虽然显示有一定的“计划性”，但不是我们要求的那样；其次，计划未来的行为不一定与动物当前的动机状态相关，而必定会涉及到未来某一时刻的动机状态。下面介绍一个最新的关于动物计划未来的研究实例，这就是松鸦为了计划未来而改变其觅食行为的现象［14］。松鸦是进行这类研究的一个极好的物种，因为它具有令人难以置信的记忆力，它生活在高海拔地区，常常要为未来贮藏大量的食物，每个个体每年大约要贮藏3万多粒种子，冬季和春季几乎完全依赖秋季贮藏的种子为生。松鸦不仅能记住它们贮藏食物的地点，而且还十分注意当它们在贮藏食物时谁在观察它们。在这种情况下，它们此后会把食物重新挖出来并进行深埋，以防这些食物被偷食［15］。Raby等人（2007）［16］利用一个简单而巧妙的实验检验了松鸦是否具有计划未来的能力。研究人员为松鸦提供两个隔室，其中一个隔室中含有食物松子，另一个隔室中没有食物，每天早晨松鸦只能见到和进入一个隔室，在连续6天的实验期间，两个隔室是交替出现的，各出现3次。每天实验的前一天晚上，不为松鸦提供任何食物，因此它们在见到隔室期间是处于饥饿状态。6天实验结束后，每天天黑前两小时，只为松鸦提供一点点食物，使它们得不到可供贮藏的种子。此后再为它们提供一个备有大量松子的场所，并提供两个以前曾多次拜访过的隔室，但现在每个隔室内又安装了一个能贮藏食物的“贮食杯”，使鸟类在天黑前可以把食物贮藏起来，如果它们愿意这样做的话。实验结果发现，在两个隔室中它们总是在其中的一个隔室中贮藏更多的食物（松子），而这个隔室是它们以前拜访过的那个不含有食物的隔室，这说明在越是缺乏食物的环境中，它们贮藏食物的行为就表现得越明显，这对于保障未来的生存是很重要的，这实际上是“为未来着想的一种行为适应性”。接下来Raby等人又安排了一个更加有趣的实验，他们训练松鸦使其知道在一个隔室中可以吃到花生，而在另一个隔室中可以吃到谷粒，松鸦对这两种食物都很爱吃。当按照上述同样的方法进行实验时，发现松鸦在含有花生的隔室中贮藏的食物是谷粒，而在含有谷粒的隔室中贮藏的是花生，这表明松鸦很注意并喜欢使它们的食物多样化，在它们为未来准备食物时也是遵循这一使食谱多样化的原则。除鸦科鸟类（如松鸦和星鸦）外，其他动物是否也有“为未来着想”和计划未来的行为，目前还研究得很少，尚有待于扩展研究范围。

3脑海马大小与贮食行为的关系

为了了解鸟类觅食行为与空间记忆力的问题，Hea－ley和Krebs（1992）［17］曾研究了7种鸦科鸟类的脑海马大小与贮藏食物的能力之间的关系。他们之所以选择研究脑海马是因为已知鸟类大脑的这个区域与食物的回收（复得）有密切关系。同时，鸦科鸟类也是研究这一问题的最好对象，因为在鸦科鸟类的各个物种之间，贮食行为的表现各不相同，便于用比较研究法进行分析。有些鸦科鸟类根本就不贮藏食物，而另一些鸦科鸟类则 必须在长达9个月期间完全依赖贮藏的食物为生［18－19］。Healey和Krebs［17］研究了两种几乎不贮藏食物的鸦科鸟类，即寒鸦（Corrus　monedula）和红嘴山鸦（Pyr－rhocorax　graculus），还研究了4种贮藏食物的鸦科鸟类，它们是秃鼻乌鸦（Corvus　frugilegus）、欧洲乌鸦（Corviscorone）、喜鹊（Pica　pica）和红嘴蓝鹊（Cisia　erythro－rhyncha），此外还研究了1种不仅贮藏食物，而且在长达9个月期间必须记住6　000～11　000粒种子埋藏地点的鸦科鸟类，即欧洲松鸦（Garrulus　grandarius）。当检查贮食行为与脑海马大小之间关系的时候，发现这些鸟类都表现出明显的正相关关系，即海马体积越大，贮藏食物的行为就越发达，这表明：海马大小是鸦科鸟类空间记忆力和贮食行为进化的关键因素。此外，动物行为学家还研究了在一个物种内部个体之间海马大小与贮食能力之间的关系，例如：生活在食物短缺环境中的个体比生活在食物丰富环境中的个体具有更发达的贮食能力，脑海马的体积也比较大［20］。这就是说，当鸟类生活在严酷环境中的时候，自然选择有利于增强它贮存食物的能力和此后重新找回这些食物的能力，也有利于海马体积的增大和海马神经元数量的增加。Pravosudo及其同事用来自食物丰富的科罗拉多州和来自食物短缺的阿拉斯加州的两个黑冠山雀（Po－ecile　atricapilla）种群检验和证实了这一观点。他们从阿拉斯加州的安克雷奇（Anchorage）捕捉15只活鸟，从科罗拉多州的温泽（Windsor）捕捉20只活鸟，然后将它们带回加利福尼亚大学的实验室，45天后测定这些鸟类贮藏种子之后再重新找到这些种子的能力。当为这些鸟提供可供贮藏的种子时，发现来自阿拉斯加（食物短缺）的山雀比来自科罗拉多（食物丰富）的山雀要贮藏更多的种子。同样重要的是，阿拉斯加山雀不仅比科罗拉多山雀贮藏更多的种子，而且它们重新找回这些种子的效率也更高，所犯错误也最少。从海马大小的角度进行比较，虽然阿拉斯加山雀比科罗拉多山雀的个体小体重轻，但其海马的体积却比后者大，而且海马所含有的神经元数量也更多。有趣的是，在不给予两地山雀贮藏食物的机会的情况下，它们之间海马大小的差异仍然存在，这表明：贮藏行为本身并不会使阿拉斯加山雀的海马变大，相反，两地山雀之间的差异应当是自然选择作用于海马大小的结果。目前，有关这一领域的大量工作正在进行之中。

第5篇：动物行为学研究方法范文

【摘要】 目的 建立兔脊髓缺血再灌注损伤模型，观察其行为功能改变，探讨发生脊髓缺血再灌注损伤的时间窗, 为治疗提供实验数据。方法 40只新西兰大白兔随机分为假手术组、缺血15min组、缺血30min组、缺血45min组和缺血60min组，每组8只。采用肾下腹主动脉阻断法,建立脊髓缺血再灌注模型。术后采用Reuters法对后肢感觉和运动反射功能评分，Jacobs 和Rivlin法对后肢运动功能分级。 结果 术后Reuter评分值总体变化趋势为缺血60min组>缺血45min组>缺血30min组和缺血15min组。Jacobs和Rivlin评分值总体变化趋势为缺血15min组和缺血30min组＞缺血45min组＞缺血60min组。 结论 本模型是一种较理想的脊髓缺血损伤模型。阻断腹主动脉血流30，45，60min可以模拟出轻、中、重不同程度局部脊髓缺血再灌注损伤。脊髓缺血时间越长，后肢运动功能损害越明显，脊髓缺血再灌注损伤的时间窗为30-45min。

【关键词】 脊髓 缺血/再灌注损伤 时间窗 行为医学

Evaluation of the functions of hindlimb in rabbit graded spinal cord ischemia/reperfusion injury by ethology

Liu Chong1,Shi Jin-shan1,Zhang jian-ping1,Feng ya-ping1,Zhang fang-xiang1,FANG Hua1,2*,Wang Quan-yun2.(1.Department of Anesthesiology Guizhou Provincial People,s Hospital, Guiyang 550002,China;2.Department of Anesthesiology,West China Hospital,Sichuan University,Chengdu 610041,China)

【Abstract】 Objective To make a ischemia/reperfusion injury model of spinal cord and investigate the relationship between time window of spinal cord ischemia/reperfusion injury and extent of function changes of behavior in rabbits. Methods 40 rabbits were equally randomized into the sham-operation group、ischemia for 15 min、30min、45min and 60min group. The spinal cord ischemia-reperfusion model was made by clamping the infrarenal aortic in rabbits. The sensory、motor and reflex functions of spinal cord were evaluated after reperfusion by the Reuters method and neurological functions of hind extremities were scored after reperfusion through the Jacobs and Rivlin method. Results The Reuter’s score during reperfusion from the highest to the lowest in the order was generally ischemia for 60 min group、ischemia for 45 min group、ischemia for 30 min group( andischemia for 15 min group ). The Jacobs and Rivlin score during reperfusion from the highest to the lowest in the order was generally ischemia for ischemia for 30 min group( andischemia for 15 min group ) 、ischemia for 45 min group、60 min group. Conclusions It is a very good model of ischemia-reperfusion injury in spinal cord.Mild , moderate and severe ischemia-reperfusion injury of regional spinal cord ischemia can be simulated by the occlusion of the infrarenal aortic for 30 minutes , 60 minutes and 90 minutes respectively.The motor funtion of rabbit hind limbs was significantly worsened due to prolonging the ischemic time. The time window of spinal cord ischemia-reperfusion injury is limited from 30 to 45 min.

【Key words】 Spinal cord；Ischemia-reperfusion injury；Time window；Behavior

在脊髓损伤动物模型的研究中，建立临床相似性好、可重复、可操作、更客观的动物模型后，对机体的运动、感觉、反射功能的神经行为学评价能够直接反映脊髓的损伤程度及外周行为功能的改善情况［1］。本实验通过建立不同脊髓损伤程度的新西兰大耳白兔脊髓缺血再灌注损伤模型，观察后肢运动及感觉情况并进行神经行为学评分，旨在进一步探讨脊髓缺血再灌注损伤后脊髓功能恢复的水平及其与神经行为学评分之间的关系。

材料与方法

1 实验动物分组及动物模型的建立：4-6月龄健康纯种新西兰大耳白兔40只(四川大学实验动物中心提供)，体重2.0-2.5kg，雌雄不拘，随机分为五组,假手术组（C0）、缺血15min组（C15）、缺血30min组（C30）、缺血45min组（C45）和缺血60min组（C60），每组8只。采用左肾动脉下方腹主动脉阻断法建立脊髓缺血再灌注损伤模型［2］。证实钳夹点以下腹主动脉搏动完全消失后,各缺血组分别阻断15min、30min、45min和60min后松夹，恢复灌注，逐层关腹，再灌注均为48小时。术中用温盐水纱布敷盖腹腔脏器，肛温维持在36-37℃，麻醉维持根据手术过程中动物的反应，追加初始剂量的1/3-l/2。动物麻醉后即耳中动脉穿刺持续监测平均动脉压（MAP）、心电图（ECG）、经皮脉搏氧饱和度（SpO2）及温度。i-STAT血气分析仪（美国）测定动脉血气。C0只进行手术操作，不阻断腹主动脉，后期手术操作同缺血组。动物清醒后归笼饲养，饲养室保持室温在24℃-26℃。

2. 观察指标：后肢运动功能评分参照Jacobs分级标准［1］，采用5分制法测定再灌注6小时、12小时、24小时和48小时动物后肢运动功能。以0～3级为截瘫标准,计算出各组动物的截瘫率。 后肢感觉和运动反射功能评价根据Reuter等评分标准［2］，综合评价再灌注6小时、12小时、24小时和48小时动物后肢感觉、运动反射功能。参考文献［3］略加改进，测定再灌注6小时、12小时、24小时、48小时斜面临界角度均值及再灌注48h斜板障碍率。斜板由两块100cm×40cm矩形的合金板通过铰链于一端相连而成，一块作底板，另一块为移动板，表面铺约6 mm厚的橡胶垫。板从水平位置(00) 起绕轴旋转，斜板基底部放置一测量角度的量角器，斜面角度可以测出。兔俯卧于移动板上，身体纵轴与斜板横轴垂直放置，头侧逐渐抬高以增大移动板与底板间的角度，直至出现动物向下滑行时，记录临界角，每例均测试3次，取其平均值。以评价动物后肢的负重能力。为了排除麻醉及手术等影响，采用斜板功能障碍率来评价，计算公式参照文献如下［4］:斜板障碍率（%）=（麻醉前度数-脊髓损伤后度数）／麻醉前度数×100%。

3 统计学方法：数据资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间神经行为学评分采用非参数检验（Kruskal-wallis）进行分析，使用 Mann-whitney u检验比较。斜板障碍率的比较采用卡方检验。统计软件为SPSS13.0。

结 果

1. 动物模型生理参数：手术过程中各组肛温、MAP、心率、SpO2、呼吸频率、血糖和血气分析指标均在正常范围内。

2. 术后动物一般情况观察：动物手术后2h内完全清醒。观察时间内，所有动物手术切口均愈合良好，无感染，均无意外死亡。根据Jacobs分级标准［1］，假手术组动物后肢均未发生瘫痪。缺血15min组和缺血30min组动物术后自主排便排尿功能逐渐恢复，再灌注48h时后肢均无明显瘫痪，截瘫率均为0（0/8）；缺血45min组和缺血60min组动物术后活动减弱, 饮食量减少，伴有腹部胀气、大小便功能障碍及双后肢肌张力明显降低等表现，再灌注48h时两组动物后肢出现为不同程度、不同类型的截瘫，可分为伸肌瘫痪、屈肌瘫痪和混合性瘫痪三种类型，截瘫率分别为87.5%（7/8）和100%（8/8）。

3. 后肢运动功能的评估 ：Jacobs分值越高动物后肢功能越接近正常。除假手术组各时间点后肢功能正常外，随着脊髓缺血程度的不同，各缺血组同时间点Jacobs分值显示出不同的差别；缺血15min组与缺血30min组各时间点组内和组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；缺血45min组与缺血60min组同时间点Jacobs分值逐渐下降，组间比较差异均有统计学意义（P

表1 各时间点各组动物Jacobs评分均值（x±s，n=8）

组 别 再 灌 注 时 间（h）

6 12 24 48

C0 5.00±0.00 5.00±0.00 5.00±0.00 5.00±0.00

C15 4.82±0.57 4.22±0.69 4.19±1.05 4.50±0.53

C30 4.57±0.66 4.26±0.95 4.13±0.61 4.15±0.83

C45 2.51±0.82 2.35±0.65 2.16±0.84 2.68±0.81

C60 0.58±0.63■ 0.67±0.79■ 0.59±0.85■ 0.55±0.51■

注：与同期缺血15min组比较，#P＜0.05，P＜0.01; 与同期缺血30min组比较，

P＜0.05，P＜0.01;与同期缺血45min组比较， P＜0.05，■P＜0.01

4. 后肢感觉和运动反射功能评价：参照Reuter评分法［2］，正常家兔后肢感觉和运动反射功能评分值为0分，全瘫时为11分，分值越高，说明后肢感觉和运动反射功能障碍越严重。假手术组各时间点后肢Reuter分值均为0分；再灌注各时间点，各缺血组动物后肢Reuter分值表现为不同程度的改变；缺血15min组与缺血30min组各时间点组内和组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；脊髓缺血时间超过30min，各时间点Reuter分值逐渐增加，缺血45min组与缺血60min组间比较差异有显著性（P

表2 脊髓缺血再灌注损伤后肢感觉和运动反射功能评分值（x±s，n=8）

组别 再 灌 注 时 间（h）

6 12 24 48

C0 0 0 0 0

C15 2.42±0.57 2.29±0.43 1.90±0.34 2.32±0.38

C30 3.38±0.61 2.84±0.36 3.12±0.58 2.42±0.76

C45 8.76±0.65 8.51±0.79 7.85±0.51 8.26±0.62

C60 10.84±0.77■ 10.63±0.45■ 10.23±0.67■ 9.63±0.62■

注：与同期缺血15min组比较，#P＜0.05，P＜0.01; 与同期缺血30min组比较，P＜0.05，P＜0.01;与同期缺血45min组比较， P＜0.05，■P＜0.01

5 斜面临界角测定：假手术组平均斜面临界角度为67.82±7.650。再灌注各时间点，各缺血组动物斜面临界角度表现为不同程度的改变；缺血15min组与缺血30min组各时间点组内和组间比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；脊髓缺血时间超过30min，各时间点斜面临界角度逐渐下降，缺血45min组与缺血60min组间比较差异有显著性（P

6 再灌注48h斜板障碍率：假手术组48h斜板障碍率为0。各缺血组随着脊髓缺血时间的不同，再灌注48h时动物斜板障碍率逐渐增加。缺血15min组、缺血30min组、缺血45min组和缺血60min组斜板障碍率分别为（5.73±1.47）%、（5.95±1.36）%、（41.56±5.78）%及（59.72±5.47）%。见表3。

表3 各时间点各组动物斜面临界角度均值（0，x±s，n=8）及再灌注48h斜板障碍率(%)

组 别 再 灌 注 时 间（h） 再 灌 注48h斜板障碍率

6 12 24 48

C0 67.47±7.28 69.26±9.51 65.84±7.25 64.38±8.93 0

C15 65.73±8.03 67.23±6.62 66.47±6.82 66.48±7.35 5.73±1.47

C30 62.72±6.25 69.85±7.15 64.37±8.43 63.63±6.39 7.95±1.86

C45 42.51±6.37 43.26±7.37 44.57±7.44 41.32±8.56 41.56±5.78

C60 36.54±4.53■ 35.63±5.63■ 33.28±6.05■ 34.81±5.33■ 59.72±5.47■

注：与同期缺血15min组比较，#P＜0.05，P＜0.01; 与同期缺血30min组比较，P＜0.05，P＜0.01;与同期缺血45min组比较， P＜0.05，■P＜0.01

讨 论

神经行为学评估是判断缺血再灌注损伤脊髓功能变化的重要指标。由于动物对神经行为学检测手段的应答具有一定的局限性，故既往脊髓损伤后的神经功能评估侧重于运动功能的研究方法可能影响其实验结果的可靠性及可比性。经过国内外学者多年的努力，提出了多种不同的评定标准和方法，主要包括Jacobs评分［1］、Reuter评分［2］、Rivlin斜板试验［3,4］、改良Tarlov评分［5］、BBB (Basso、Beaffic、Bresnahan）评分［6］、Baffourur评分［7］、Gale联合评分［8］等。这些评分标准从不同的方面对脊髓损伤程度提出了相对客观的标准。本研究结合实际情况，联合采用Rivlin斜板试验、Jacobs和Reuter评分法综合判断包括后肢运动、感觉、反射以及负重能力等几方面的变化。

本研究发现，虽然Jacobs分级法能够比较准确地评定脊髓缺血再灌注损伤平面以下的躯体自主动物功能，但过于笼统，不够精细，对于鼠、兔等较低级的哺乳动物，有些指标难以观察；实验一结果显示，脊髓缺血再灌注模型对脊髓前角运动神经元和后角感觉神经元的影响存在差异。因此，Reuter评分法虽然采分点多，能够综合反映后肢细微的神经功能变化，但不能灵敏辨别后肢瘫痪的程度，且易于主观判断，可能导致实验结果偏差；Rivlin法也有其自身的局限性，它主要从动物双下肢静态力量的角度为研究出发点，对于后肢的动态活动能力未加以考虑。因此，本实验联合运用Rivlin斜板试验、Jacobs和Reuter评分法，将多种观察指标和方法综合起来，从静态及动态角度采用双盲、双人独立观察记录，最后取均值进行脊髓功能综合评分［9］。此外，本实验根据自身重力对抗原理，自制适用于新西兰大耳白兔的合金斜板，利用自身重力将斜板试验用于兔脊髓缺血再灌注后后肢负重能力变化的研究。本研究表明，将这三种实验方法相结合，克服了使用某一评分方法的跨度较大、跳跃分布以及连续性较差的缺点，不仅弥补各自的不足，还可以提高实验评分方法的灵敏度，实验结果更为准确地、可靠地、相对客观地综合评定动物运动、感觉等多方面功能。

本实验显示，假手术组后肢Jacobs和Ruter评分术后均完全正常，且48h斜板障碍率为0。在各缺血组中，缺血15min组和缺血30min组动物术后自主排便排尿功能逐渐恢复，观察时间内斜面临界角度、Jacobs及Ruter分值均无显著改变，且再灌注48h时也无明显排便排尿功能障碍以及后肢均无明显瘫痪，截瘫率均为0（0/8），说明脊髓本身具有一定的修复功能，动物后肢功能在再灌注6h时能够恢复正常, 至再灌注48h时也未见明显的行为功能障碍，提示脊髓的自修复功能可能与脊髓缺血再灌注损伤程度有一定的关系，脊髓缺血短于30min虽然可能引起轻度脊髓缺血再灌注损伤，但随着脊髓血供恢复，后肢感觉和运动功能可以完全恢复到损伤前的水平。缺血45min和缺血60min组同时间点 Jacobs和Ruter分值分别表现为明显降低和升高，而斜面临界角逐渐下降，再灌注48h时斜板障碍率逐渐增加，表现为不同类型的截瘫、大小便功能障碍及双后肢肌张力明显降低，两组动物截瘫率分别为87.5%（7/8）和100%（8/8），与此同时，术后动物活动减弱, 饮食量减少，且伴有腹部胀气等表现，说明左肾动脉下腹主动脉阻断45min和60min不仅能够直接造成脊髓中、重度的脊髓缺血再灌注损伤，还可能间接引起腹腔和/或盆腔脏器不同程度的缺血损伤，提示脊髓缺血45min和60min后即使血流恢复，后肢感觉和运动功能也不能恢复至损伤前的水平。

术后神经行为学变化与脊髓缺血再灌注损伤程度密切相关。脊髓再灌注损伤程度与缺血时间有关, 即缺血时间超过一定限度后再灌注就会引起脊髓组织不可逆性损伤,在此时限内恢复血供则有治疗意义, 此时限即被称为再灌注损伤治疗时间窗。本研究显示，各缺血组同时间点后肢神经肌肉功能强弱总体变化趋势为缺血15min组和缺血30min组＞缺血45min组＞缺血60min组，说明阻断腰段脊髓血流15min、30min、45min和60min可以建立不同损伤程度的脊髓缺血再灌注模型，模拟轻度、中度、重度和/或完全性脊髓运动传导功能障碍，轻度和中度脊髓缺血再灌注损伤可能造成不完全性脊髓运动和感觉传导功能障碍，而重度以上的脊髓缺血再灌注损伤可能引起完全性脊髓运动和感觉传导功能损害，造成后肢感觉和运动功能障碍，提示, 脊髓组织如在一定时限内迅速恢复供血, 神经元可能恢复功能; 如超过一定的时限(再灌注损伤时间窗),则会发生不可逆损伤，失去治疗意义。“时间窗”这一概念于20世纪90年代提出，与脊髓缺血再灌注损伤的预后密切相关。脊髓缺血时间及程度、脊髓血运重建与否以及多因素介导的脊髓再灌注损伤是术后发生神经功能障碍的主要原因。本实验中, 兔脊髓缺血30min内后肢神经行为学变化不明显, 而脊髓缺血时间45min以上将造成后肢神经功能严重障碍，提示脊髓缺血再灌注损伤时间窗可能局限在30-45min之间，精确的时间点尚需要进一步的研究证实。

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［9］ Thomas AJ,Nockels RP,Pan HQ,et al.Progesterone is neuroprotective after acute experimental spinal cord trauma in rats.Spine.1999,24:2134-2138.

第6篇：动物行为学研究方法范文

摘 要：目的：观察化瘀通络方治疗大鼠局灶性脑缺血－再灌注损伤对脑组织自由基及一氧化氮合成酶（NOS）和iNOS变化的影响。方法：制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，给予化瘀通络方治疗后观察丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）及一氧化氮合成酶（NOS）和诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）的变化。结果：化瘀通络方可显著降低MDA含量以及iNOS和NOS活性，SOD含量升高。结论：在脑缺血再灌注损伤后, 化瘀通络方能抑制脑缺血再灌注后脂质过氧化反应，促进自由基清除，对抗自由基损伤，提高脑组织自身抗氧化能力，降低NOS和iNOS介导脑缺血－再灌注时的神经损伤，保护脑细胞。

关键词：化瘀通络方；脑缺血-再灌注损伤模型；SOD；MDA；NOS；iNOS

中图分类号：R285.5文献标识码：A文章编号：1673-7717（2011）03-0509-03

Effect of Huayu Tongluo Fang on the Expression of ROS and NOS in Brain

Tissue During the Reperfusion After Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats

QIU Zhao-juan1，ZHU Xuan-xuan1，DA Qing-guo1，WU Xu-tong1-ZHU Wu-yuan2

（1.Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjiang 210029,Jiangsu,China;

2.Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210029,Jiangsu,China）

Abstract:Objective:To observe the effect of huayutongluofang on expression of ROS,NOS and iNOS during the reperfusion after middle cerebral artery occlusion in rats. Methods:The cerebral IR rats model were established by middle cerebral artery occlusion.Treated the cerebral IR rats with huayutongluofang,then observing the changes of MDA,SOD,NOS and iNOS in brain tissue. Results:Huayutongluofang could reduce the expression of MDA,iNOS and NOS in brain tissue.While, after huayutongluofang treatment,the SOD level in brain tissue was increased.Conclusions:During the reperfusion after middle cerebral artery occlusion,huayutongluofang can restrain the Lipid Peroxidation,promote removal of oxygen free radicals, compete oxygen-free radical injury. While,runhoukaiyinkeli could reduce the possibility of nerve damage,protect neural cells from injured.省略。

缺血性脑卒中（Ischemic Cerebral Stroke, ICS），中医又称缺血性脑中风，是一种突然起病的脑部血液循环障碍性疾病。祖国医学将其列为“风、痨、臌、膈”四大疑难病之首。根据WHO公布的有关数据显示，世界范围内ICS的发病率为150～200人／10万人口。而在我国，60岁以上老年人ICS发病率高达30%～45%，幸存者中约50%留有不同程度的后遗症，且复发率高达40%～60%。ICS在临床表现以猝然昏扑导致口眼歪斜、半身不遂、智力障碍为主要特征，严重影响患者生活质量，已成为前3位的疾病死因之一，其病因和治疗药物一直是研究热点。近年来,中药在缺血性疾病治疗中的作用逐渐得到重视。化瘀通络法是我院神经内科经多年临床实践研制并应用于临床脑梗塞病人，前期临床研究发现化瘀通络方能明显改善神经功能缺损，用其治疗急性脑出血60例，治疗组基本痊愈12例（20.0%），显效24例（40.0%），有效16例（26.7%），无效8例（13.3%），总有效率86.7%。显示出满意的临床疗效。本研究通过制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型,探讨化瘀通络方对脑缺血再灌注损伤后脑组织自由基及一氧化氮合成酶（NOS）变化的影响。为化瘀通络方的临床应用提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验药品

化瘀通络方由葛根、当归、补骨脂、制大黄、水蛭等组成，由江阴天江药业有限公司提供，批号：0910119脑血康胶囊，山东昊福制药有限公司，批号：20100202，青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号：B091107，戊巴比妥钠，中国医药上海化学试剂公司，批号：F20091216 SOD、MDA、NOS试剂盒，南京建成生物工程研究所，批号：20100406。

1.2 实验动物和实验用饲料

SD大鼠，雄性，280～320g，由浙江大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（浙）2008-0033，实验用饲料由江苏省协同医药生物技术有限公司提供，批号20100325

1.3 实验用仪器

电子分析天平FA10047南京市计量测试所，80-2台式低速离心机，上海医疗器械有限公司手术器械厂，恒温水浴箱 HH-2，国华电器有限公司 ，756PC紫外分光光度计 上海光谱仪器有限公司

1.4 实验条件

实验大鼠均分笼饲养，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，室温（22±2）℃，55%～65%，光照适度，通风洁净。

1.5 实验统计

实验数据统计处理用±s表示,采用t检验,用SPSS 11.0统计软件进行统计分析。

2 实验方法

2.1 实验动物分组和MCAO模型的建立

选用健康雄性SD大鼠，体重280～320g，饲喂全价颗粒饲料，自由饮水，大鼠按简化分层随机法，随机分为6组：（1）假手术组: 给予等量生理盐水10mL/kg；（2）脑缺血再灌注模型组：给予等量生理盐水10mL/kg；（3）脑血康胶囊组：0.9g/kg，10mL/kg；（4）化瘀通络方大剂量组：16g/kg，10mL/kg；（5）化瘀通络方中剂量组：8g/kg，10mL/kg；（6）化瘀通络方小剂量组：4g/kg，10mL/kg。

以上除假手术组和脑缺血再灌注模型组给予等量生理盐水，其余各组大鼠灌胃给药，灌胃容量10ml/kg，每日一次，连续给药7天，实验前禁食不禁水，实验时以水合氯醛（30mg/kg）腹腔注射，待动物完全麻醉后，仰位固定于手术台上，颈部脱毛并消毒，于正中切开2cm，分离右侧颈总动脉（CCA），颈外动脉（ECA），颈内动脉（ICA），结扎ECA和CCA近心端，于ECA和ICA分叉处在ECA上穿线打一活结。在ECA上剪一小口，插入直径0.235mm的尼龙渔线，缓慢向分叉处插入，直到到达分叉处有阻力不能再插入为止。将ECA上活结系紧，固定渔线。剪断ECA，轻轻提起ECA残端使其与ECA成一直线，再缓慢将渔线向ICA插入，栓线插入深度约为（18.0±1.0）mm，在分叉处结扎，松开动脉夹，缝合皮肤，体外留少许栓线，缺血2h后将栓线抽离颈总动脉分叉处造成再灌注模型。模型成功标志：动物麻醉清醒后出现缺血侧Hornor征及对侧以前肢为主的偏瘫。如动物无此体征或于2h后仍不清醒者剔除。假手术组只切开皮肤，分离CCA、ECA、ICA后缝合。手术后给予抗生素青霉素抗炎。继续给药3天。

2.2 实验指标检测

2.2.1 神经行为学评分 MCAO大鼠麻醉清醒后，进行行为学评分。评分标准参考Longa等5分制法（0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前肢；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。）分值越高，说明动物行为障碍越严重。观察造模后3h，24h，48h，72h神经功能行为学评分，见表1

表1 化瘀通络方对脑缺血大鼠神经行为学评分的影响

（±s）

注：与假手术组比较，P

实验结果所示：局灶性脑缺血再灌注模型大鼠在3h、24h、48h、72h神经行为学评分高于各给药组，具有显著性差异；以3h神经行为学评分为重，24h～72h后神经行为有恢复，评分降低，化瘀通络方大剂量组在24h、48h和72h的神经行为学评分与模型组比较具有显著性差异；化瘀通络方中剂量组在24h和48h的神经行为学评分与模型组比较具有显著性差异；化瘀通络方小剂量组24h有显著性降低神经行为学评分作用，提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血大鼠再灌注后的神经元具有一定的保护作用，并具有减轻神经功能损伤的作用。

2.2.2 脑组织标本的制备 各组大鼠再灌注72h后,脱颈处死,断头后迅速取脑,将脑组织以冰生理盐水洗净血迹后，称取0.1g，置2mL冰磷酸盐缓冲液中于匀浆器中进行匀浆，将制备好5%脑组织匀浆用离心机3000r/min，4℃离心15min，取上清液测定SOD、MDA、NOS和蛋白含量。

2.2.3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中SOD、MDA、NOS的影响 见表2～3。

实验结果所示：局灶性脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中MDA含量显著高于假手术组，SOD显著性低于假手术组，化瘀通络方各给药组均可不同程度降低局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中MDA含量，升高SOD活力，与模型组比较具有显著性差异。提示：化瘀通络方对局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织的保护作用与降低MDA含量和升高SOD

表2 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中MDA含量

和SOD活力的影响（±s）

注：与假手术组比较，P

表3 化瘀通络方对脑缺血大鼠脑组织中TNOS

和iNOS的影响（±s）

注：与假手术组比较，P

活力有关。

实验结果提示：局灶性脑缺血再灌注大鼠脑组织中TNOS和iNOS含量明显增高，与假手术组比较具有显著性差异，（P

3 讨 论

关于缺血再灌注引起脑神经组织损伤的机制尚不十分清楚。近年研究发现自由基及其脂质过氧化反应在脑组织缺血再灌注的病理生理过程中发挥着重要作用，是脑缺血－再灌注损伤的重要机制之一，因此，抗自由基的毒害作用成为防治缺血再灌注损伤的重要措施。MDA是脂质过氧化物的终末产物，测定其含量可反映脂质过氧化程度和自由基对脑组织损伤的程度。SOD能催化超氧化物转变成活性较低的物质，是细胞内抗脂质过氧化作用的酶性保护系统。故认为测定以上指标可综合反映缺血再灌注后脑组织损伤与抗损伤的水平。

实验结果表明，脑缺血－再灌注可导致脑组织发生脂质过氧化反应，使MDA生成增加、SOD活性明显下降，显示出自由基的毒害攻击作用，符合当今脑缺血缺氧损伤的“自由基学说”；应用化瘀通络方治疗后，大剂量组和中剂量组均可明显提高SOD活力，使 MDA生成减少。提示，化瘀通络方能抑制脑缺血再灌注后脂质过氧化反应，对抗自由基损伤，促进自由基清除，提高脑组织自身抗氧化能力，保护脑细胞。

研究表明脑缺血/再灌流早期NO增多,对脑起保护作用;但脑缺血/再灌流的损害则与再灌流期NOS大量增多有关。缺血再灌注会引起诱导型NOS（iNOS）高表达。NOS是一组同功酶，广泛存在于各类组织、细胞中。研究表明NOS有3种亚型：①神经元型（nNOS）。活性依赖于Ca2+升高，最早在神经元中发现，生理状态下有表达，病理状态下可被诱导，在脑缺血神经元损伤的早期阶段起重要作用，脑缺血后10min活性上升，3h达高峰，介导脑缺血时早期神经元损伤。②内皮型（eNOS）。活性依赖于Ca2升高，最早在内皮细胞中发现，生理状态下有表达，病理状态下可被诱导，通过维持脑血流，在脑缺血后起保护作用，脑缺血后 1h活性上升，24h达高峰。③诱导型（iNOS）。活性不依赖于Ca2，最早在巨噬细胞中发现，在脑缺血神经元损伤的晚期阶段起重要作用，脑缺血后 12h活性上升，48h达高峰，介导迟发性神经原损伤。

实验结果表明，脑缺血2h再灌注 72h后，脑组织NOS活性和iNOS活性持续增高。化瘀通络方可通过降低NOS和iNOS活性而介导脑缺血－再灌注时的神经保护作用。

脑缺血再灌注损伤的发生与多种因素有关，研究表明化瘀通络方治疗脑缺血再灌注损伤机制可能与其清除氧自由基，抑制一氧化氮合成酶的产生，抗细胞凋亡，从而保护脑组织有关。

参考文献

［1］ 何清，周联生，赵静，等，依达拉奉对脑缺血再灌注大鼠脑组织超氧化物歧化酶、一氧化氮、丙二醛水平的影响［J］.齐齐哈尔医学院学报，2008,29（18）:2191-2193.

［2］ 余万桂，邓德明，等.连心碱对大鼠脑缺血/再灌注后NOS及c-fos蛋白表达的影响［J］.长江大学学报，2007,4（3）:220-222.

［3］ 李荣，吴伟，杨开清，等，脑醒喷鼻剂对再灌注损伤脑组织自由基及一氧化氮合成酶变化的干预作用［J］.中国中医药信息杂志，2003,10（7）:23-25.

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［6］ Jung KH, Chu K, Ko SY, Lee ST, Sinn DI, Park DK, et al. Earlyintravenous infusion of sodium nitrite protects brain against in vivoischemia-reperfusion injury［J］. Stroke，2006，37:2744-2750.

第7篇：动物行为学研究方法范文

【关键词】 益智宁神口服液/药理学;抽动—秽语综合征/中药疗法;神经递质;疾病模型，动物;大鼠;色谱法，高压液相

抽动—秽语综合征(tourette syndrome，ts)，又称多发性抽动症，是一种儿童期发病的慢性神经精神障碍性疾病。wWW.133229.cOM临床表现主要为突然、快速、反复、非节律性、不自主和刻板的运动性抽动和发声性抽动，还可能伴有各种行为紊乱、强迫观念与行为、认知障碍等，可不同程度地干扰和损害儿童的认知功能，影响社会适应能力。本病病因尚未明确，具有明显的遗传倾向，多见于4～12岁的儿童，患病率约为005%～3%，近年来发病呈明显上升趋势，男孩多于女孩[1]。广东省中医院儿科在临床实践中运用自拟方益智宁神口服液治疗该病，取得了较好的疗效[2]。本实验应用亚氨基二丙腈腹腔注射建立抽动—秽语综合征模型大鼠，观察该药对模型大鼠行为学和神经生物学的影响，现报道如下。

1材料与方法

11实验动物spf级sd大鼠60只，28～30d龄，体质量(250±10)g，雌雄各半。由广东省医学实验动物中心提供(许可证号:粤监证字2008d006，批号：0037766)。

12实验药品亚氨基二丙腈(iminodipropionitrile，idpn)购自alfa aesar公司(批号：c7323a)，中药益智宁神口服液(由广东省中医院提供，批号：080201)，对照药物为氟哌啶醇(上海信谊九福药业有限公司，批号：08031121)。

13仪器及试剂lc26a 型高效液相色谱仪、spd26av 荧光检测器、c2r4a 数据处理机均为日本岛津公司产品，脱水机、包埋机、切片机和生物显微镜等设备为德国leica公司产品，微量组织匀浆器为millipore公司产品，zh蓝星c/s型脑立体定位仪，高氯酸、乙二胺四乙酸二钠(edtana2)均为分析纯，甲醇为色谱纯，对照品由中国药品生物制品所提供。

14模型复制参考wakata[3]的方法，将亚氨基二丙腈溶解于生理盐水，稀释成浓度100mg/ml，给药途径为腹腔注射，剂量为150mg·kg-1·d-1，每天1次，共用7d。

15分组及给药选用sd大鼠随机分为4组：空白组和模型组各10只，中药组和西药组各20只，每组均雌雄各半。治疗组在造模后第2天开始给药，中药组按20kg的儿童每天口服20ml益智宁神口服液的比例计算，每只大鼠灌胃约2ml/d;西药组按20kg的儿童每天口服氟哌啶醇片1mg的比例计算，每只大鼠灌胃约015mg/d，连续14d。

16大鼠行为观察[4]采用观察评分，每次至少观察1h，主要诱发症状为运动行为和刻板运动。(1)运动行为评分：0分：安静或正常活动;1分：能过度兴奋;2分：探究行为增加;3分：跑;4分：跑和跳;(2)刻板运动(或定型运动)评分：0分：无刻板运动;1分：旋转行为;2分：头和颈部的上下运动过多;3分：头、颈部的上下运动过多加旋转行为;4分：头向侧摆合并头和颈部的上下运动过多。

17神经递质水平检测[5]第14天将所有实验大鼠迅速断头处死，借助脑立体定位仪，取右脑海马组织及边缘系统(包括纹状体、隔核、层壳核、基底节、齿状回)，精确称质量，置入1ml处理液(含01mol/l高氯酸和05g/ledtana2)中，微量组织匀浆器冰溶下匀浆，4℃冰冻离心10000r/min，取上清液置入-20℃保存。采用高效液相色谱法测定多巴胺(da)和去甲肾上腺素(ne)浓度。测样时，室温下解冻，进样20μl，以峰面积外标法定量。

18统计学方法采用spss130和sas913版本进行统计学处理和分析，各组神经递质水平检测数据分别进行方差齐性和正态分布检验，方差不齐采用秩和检验，检验水平α=005。

2结果

21各组行为学观察和评分各组治疗前后运动行为和刻板运动积分见表1。模型组行为学评分与空白组比较，差异有显著性意义(p<001)，表明造模是成功的。

治疗14d后，中、西药组运动行为积分和刻板运动积分降低，与模型组比较差异有显著性意义(p<005或p<001)，表明中药组和西药组对动物行为均有明显改善作用，中药组效果与西药组相仿。

22各组治疗前后脑组织da、ne含量变化比较表2结果显示：模型组脑组织da水平降低，ne水平升高，与空白组比较差异均有显著性意义(p<001);治疗14d后，中、西药组均可显著升高da水平，降低ne水平，与模型组比较差异均有显著性意义(p<005或p<001)，中药组作用与西药组相仿。表1各组治疗前后运动行为和刻板运动积分比较(x±s)　表2各组治疗前后神经递质水平比较

3讨论

idpn是一种中枢神经毒素，50年代以后就用于神经病理学的研究，本研究参考wakata[3]的方法复制模型，从神经生物学和行为学两方面观察药物治疗对ts模型动物临床行为学典型特征的影响。idpn诱发ts模型大鼠出现明显刻板运动和运动行为异常，如过度兴奋、探究行为、异常跑跳、旋转行为和头颈部上下侧摆等动作均具有ts临床行为学的典型特征，有时出现连续的嗤鼻、抬举上肢等动作，类似于人类ts患儿喉部发声、耸肩等特征行为。本研究通过对药物治疗前后ts模型大鼠运动行为和刻板运动行为评分的比较，发现中药组在改善动物ts典型特征行为方面效果明显，如头部、颈部的抽动减轻，旋转行为明显缓解，每次异常行为发作持续时间缩短，异常抽动次数消失，异常跑动及不规律的弹跳运动明显减少。

虽然目前对ts的神经生物学物质基础还未完全阐明，但基本认为中枢神经递质，特别是da、ne、5-羟色胺(5ht)等与ts之间关系密切[5]，因此，探讨大脑多巴胺类神经递质及其代谢产物的水平是证明药物神经生物学疗效的主要依据。本研究对大脑海马区da和ne水平进行测定，结果表明：治疗后中药组da水平明显升高，而ne水平有所下降，均趋向于正常水平。与ts有关的神经递质包括乙酰胆碱、肾上腺素、5ht、多巴胺等，主要分布于纹状体、隔区、蓝斑、黑质等海马、基底前脑及边缘系统，构成复杂的神经网络[6-8]。有关药物治疗对大脑组织不同部位和核团神经递质水平的影响文献报道并不一致，而且与检测时间点有很大关系[8]。本研究结果初步表明，中药治疗14d后，对大脑组织da和ne两种神经递质水平的变化产生显著影响，对于治疗过程中以及停药后神经递质的动态变化仍需进一步观察。

益智宁神口服液的主要组成为：熟地黄、黄芪、白芍、龙骨、远志、石菖蒲、五味子。其中熟地，其味甘，性微温，入心、肝、肾经，本品味厚气薄，为补血生精、滋阴补肾之要药，《珍珠囊》曰：“主补血气，滋肾水，益真阴”。黄芪，味甘，性微温，入脾、肺经，质轻升浮，为升阳补气之圣药。可补中气、益元气、温三焦、壮脾阳，选以补脾益气。白芍味苦、酸，性微寒，入肝经，既能养血敛阴，又能平抑肝阳，还能柔肝止痉;而龙骨味甘、涩，性微寒，入心、肝经，专攻平肝潜阳、镇静安神之用，两者搭配，养阴宁心，平肝潜阳。五味子性温，五味具备，酸能收敛，苦能清热，咸能滋肾，温而不燥，既能益气生津，补肾养心，用其养心滋肾安神;远志、石菖蒲有安神益智、化痰开窍之功效。诸药配伍，具有健脾滋肾、平肝熄风、宁神益智、化痰开窍之功效。氟哌啶醇是目前治疗ts的最有效药物之一[9]，疗效确切，但因副作用明显使其临床应用受到限制，通过实验结合临床用药发现，益智宁神口服液的疗效与氟哌啶醇无明显差异，且疗效更加稳定，易为患儿及家属接受。

【参考文献】

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第8篇：动物行为学研究方法范文

关键词：安宫牛黄丸；缺血性中风；大脑中动脉梗死大鼠模型；细胞因子

中图分类号：R743 R289.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）06-0710-03The Protective Effect of Angong Niuhuang Pill on Experimental Cerebral Ischemia

Liu Zongtao,Sha Dike,Liu Yuanxin,et al

The Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Medical University （Urumqi 830000）

Abstract：Objective To investigate the protective effect of Angong Niuhuang pill on experimental cerebral ischemia and its mechanism.Methods Rats were randomly divided into five groups：Sham group,model group,Angong Niuhuang pill group,western medicine group,Chinese traditional medicine with western medicine group.The models with focal cerebral ischemia of rat were established by the suture occluded method.Neurology evaluation was studied at 6 h,24 h,48 h and 72 h after middle cerebral artery occlusion（MCAO）and cerebral ischemia.The coefficient of brain and water content in whole brain were examined.The level of serum interleukin 10 （IL-10） in abdominal aorta was detected by enzyme linked in ununosorbent assay.Results Within four days of MCAO,different degrees of motion disturbances were observed in all rats except sham group.The coefficient of brain,the water content of whole brain and the level of serum IL-10 were obviously increased （P

Key words：Angong Niuhuang pillischemic apoplexymiddle cerebral artery occlusioncytokine缺血性中风，西医属于缺血性脑血管病范畴，是由于血管阻塞引起脑缺血损伤而致局灶或全脑的功能障碍。具有发病率高、致残率高、死亡率高和复发率高等特点，是威胁人类健康的重大疾病之一。中医认为，中风其本在肝肾亏虚，其标在风、火、痰、瘀、虚；它们在发病过程中相互影响，相互作用，临床出现烦躁神昏谵语，此乃为脑血管意外急性期的关键所在【sup】［1］【/sup】。Framingham流行病学研究结果,65%的中风为大脑中动脉供血区的血管堵塞所致,与之相应,大脑中动脉区局部缺血模型是实验性脑梗死研究中最常用的一种模型,其中大脑中动脉（MCA）线栓模型应用最为广泛【sup】［2］【/sup】 。因此本实验采用MCA线栓法造成局灶性脑缺血大鼠模型，探讨中药制剂安宫牛黄丸灌胃配合西药甘露醇与呋塞米针静脉给药对缺血性中风急性期大鼠脑水肿变化规律、血清细胞因子及神经行为学改变的影响，为中西医结合并治,多途径给药治疗缺血性中风提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠60只,3月龄，体重250 g～300 g,由新疆实验动物研究中心提供，实验动物使用许可证号：SYXK［新］2003-0003号环境温度控制在25℃～30℃饲养，空气湿度维持在（50±5）%，用灯照使动物体温维持在（37.5±0.5） ℃。

1.2 药物与试剂 安宫牛黄丸由北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂提供（国药准字Z11020076，批号9013181），实验前用蒸馏水配制成所需浓度；20%甘露醇、胞磷胆碱钠注射液，由上海旭东海普药业有限公司提供。呋塞米（速尿）由上海美优制药有限公司提供。白细胞介素（IL）-10定量ELISA试剂盒，购于上海瑞齐生物科技有限公司（批号20101221）。

1.3 仪器 显微手术器械（上海医疗手术器械厂）；电子分析天平（MC,京制0000249号,北京赛多利斯仪器系统有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；TGL-16C台式高速离心机（金坛市医疗仪器厂制造）；酶标分析仪（美国伯乐公司制造，X Mark）；参照文献【sup】［3］【/sup】，选用4-0尼龙线,栓线直径为0.25 mm～0.28 mm。

1.4 方法

1.4.1 动物分组与给药 将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、安宫牛黄丸组（中药组）、西药组、中西药组；假手术组、模型组均给予等容量生理盐水3 mL灌胃；安宫牛黄丸组给予3 mL安宫牛黄丸溶解液灌胃治疗；西药组给予20%甘露醇2.625 mL、速尿0.42 mg尾部静脉注射；中西药组在西药组治疗的基础上加用安宫牛黄丸（将1.134 g安宫牛黄丸加入54 mL水中溶解稀释）；每只3 mL溶解液灌胃。动物造模后连续灌胃给药4 d，于末次给药后分别处死。

1.4.2 大鼠局灶性脑缺血模型的建立 参照文献采用线栓法制备大脑中动脉（MCA）局灶性脑缺血模型【sup】［4］【/sup】:大鼠腹腔注射麻醉（即阿托品、氯胺酮、安定各2 mL、4 mL、4 mL，稀释至20 mL，0.75 mL/100 g）后,仰卧固定,颈部正中切口,钝性分离甲状腺，将其上翻并用无菌纱布保护，分离右侧颈总动脉（common carotid artery，CCA）、颈内动脉（internal carotid artery，ICA）、颈外动脉（externa1 carotid artery，ECA）,并在ECA、ICA分叉处结扎ECA,右侧CCA剪口约0.2 mm的侧“V”字形切口，插入头端烧成圆钝形直径为0.28 mm的尼龙线,使线栓经过CCA分叉处进入ICA，到达MCA起始处，进线长度约（18.5±0.5） mm,感觉有阻力时即停止插入，并向外稍拉出一点即可实现MCA起始端堵塞MCA所有的血液来源,然后将CCA连同尼龙鱼线一起结扎，扎紧备线，甲状腺复位，关闭并缝合皮肤切口。假手术组大鼠接受相似手术处理，但是不插入线栓。缝合皮肤,实现MCAO造模完成。动物入选标准（按Longa五级评分法【sup】［5］【/sup】取神经功能行为评分为1分、2分、3分、4分的动物）：选择苏醒后左上肢屈曲、行走时向左侧旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验,否则视为栓堵失败,弃之不用。模型成功后，分别于MCAO后6 h、24 h、48 h、72 h进行神经功能行为评分；大鼠在断头处死前取血清检测IL-10含量:各组大鼠麻醉后腹主动脉取血法分别取全血约5 mL，室温下放置20 min，然后以2 500 r/min离心10 min，小心吸取上清液即为血清标本（溶血标本不用），常温下保存备用。

1.5 观察指标及测定方法

1.5.1 神经功能行为学评分测定 动物苏醒后，按Longa法【sup】［5］【/sup】对其神经功能行为进行5分制评分：0分，无明显神经病学症状；1分，不能完全伸展左侧前爪；2分，向左侧旋转；3分，行走时向左侧倾倒；4分，不能自行行走。

1.5.2 脑系数 动物称重,造模给药4 d后断头取脑,沿脑桥上界水平切断,取全脑称重,脑系数全脑重÷体重×100%。

1.5.3 脑组织含水量的测定 造模给药4 d后断头取脑，去除小脑、嗅球、低位脑干等，用滤纸吸干表面水分，称量脑湿重，105 ℃烘烤24 h至恒重，精确称量干重，采用Elliot【sup】［6］【/sup】公式计算脑组织含水量。

1.5.4 血清IL-10含量测定 酶联免疫吸附法（ELISA法）检测IL-10含量，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.6 统计学处理 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 17.0软件做统计分析；组间比较用单因素方差分析及Student-Newman-Keuls test统计。

2 结 果

2.1 一般状态 假手术组大鼠麻醉苏醒后精神好，反应灵活，活动度大，全部存活，未见明显对侧肢体活动障碍。其余各组术后4 d精神均较造模前差，反应迟钝，饮食较前减少，自洁能力下降，扎堆蜷缩，均出现不同程度的肢体活动障碍，而以模型组为甚；其中模型组、西药组、中西药组分别有2只大鼠造模后半小时左右死亡；中药组有1只大鼠造模后昏迷不醒，于第2天死亡。

2.2 体重指数 大鼠造模前称重（g）为基础值，造模后第1天、第2天、第3天、第4天分别称重，取各时间点体重与基础值之比,即体重指数。与模型组比较，各组动物术后均有体重渐回升的过程；而假手术组体重上升较明显，与其他各组比较有统计学意义（P

2.3 神经功能行为学评分 假手术组大鼠都没有神经功能行为学症状，而模型组、中药组、西药组、中西药组大鼠则有不同程度的神经功能行为学表现。与模型组大鼠比较，中药组、西药组、中西药组均可降低大鼠的神经功能行为学评分（P

2.4 各组对局灶性脑缺血大鼠脑水肿的影响（见表3） 与模型组比较，其他各组大鼠脑系数、脑组织含水量明显降低（P

表3 各组对大鼠脑系数、脑组织含水量的影响（x±s）%

2.5 各组对局灶性脑缺血大鼠血清IL-10的影响（见表4） 与假手术组比较，各造模组IL-10均明显升高（P

表4 各组对大鼠血清IL-10表达的影响（x±s）ng/L

3 讨 论

安宫牛黄丸是我国传统药物中久负盛名的良方，是中医治疗中风之要药。安宫牛黄丸出自清代吴鞠通《温病条辨》，素有“救急症于即时，挽垂危于顷刻”的美誉，由牛黄、水牛角浓缩粉、麝香、珍珠、朱砂、雄黄、黄连、黄芩、栀子、郁金、冰片等11味药组成。具有清热解毒、豁痰开窍的功效，主治热病、邪入心包、高热惊厥、神昏谵语。临床研究表明，安宫牛黄丸制剂具有改善缺血性中风急性期神经功能缺损情况的作用【sup】［7］【/sup】。对于急性中风患者，安宫牛黄丸配合常规西医综合抢救治疗明显优于单纯常规综合抢救治疗【sup】［8］【/sup】。

IL-10作为一种抗炎性细胞因子，在缺血性脑损伤中具有脑保护作用。其保护作用是通过缩小脑梗死灶范围，减缓炎性细胞浸润和减少神经细胞凋亡而发挥的【sup】［9］【/sup】。本试验结果显示模型组大鼠血清IL-10升高，推测可能是动物在受到应激性损伤之后机体的自身保护机制而引起的；安宫牛黄丸组大鼠血清IL-10升高显著，与单纯西药甘露醇、呋塞米、胞磷胆碱静脉用药疗效未见明显差别，而中西药合用大鼠血清IL-10水平升高更为显著，从而最终保护脑细胞，改善神经功能缺损症状，降低缺血性中风大鼠的死亡率、致残率；这提示改变抗炎性因子IL-10的分泌为安宫牛黄丸对局部脑缺血大鼠脑损伤保护作用的机制之一。总之，虽然传统中药安宫牛黄丸给药途径受限,但仍是具有特殊功效的良药，其与西药联用也许会提高临床疗效。

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第9篇：动物行为学研究方法范文

[关键词] 肠易激综合征；动物模型；建模方法；观测指标

[中图分类号] R574 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）09（c）-0047-04

[Abstract] Irritable bowel syndrome （IBS） is a kind of functional bowel disease， and its etiology and pathogenesis has not been fully elucidated. At present， the main treatment principle is still symptomatic therapy. There are a lot of researches on IBS animal model， in which rats and mice are the most commonly animals used. Model construction methods are so many， such as physical and chemical stimulation， psychological stress， drug induced diarrhea， pathogen infection， compound method and others. The observation indexes included general situation， intestinal sensitivity test， intestinal transit function， pathological examination， and the detection of related brain gut peptide. Animal model now proceed only from a certain aspect of pathophysiological mechanism， however the pathogenesis of IBS is complex， inducing factors individual and diversified. So current animal model has limitations to some extent， and need further study. This paper aims to review the research progress on animal model of IBS.

[Key words] Irritable bowel syndrome； Animal model； Model construction methods； Observation indexes

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种功能性肠病，它是以腹痛或腹部不适为特征，并伴有排便习惯或粪便性状的异常。IBS的患病率在不同地区差异较大，全球范围内从1.1%至45.0%不等，中国的患病率为5.0%～6.0%[1]。到目前为止，关于IBS的病因及发病机制尚未完全阐明，临床上的主要治疗原则仍是对症治疗。IBS并不会危及生命，但对患者的生活质量有很大影响，同时，因其无法完全治愈，也大大增加了患者的经济负担。

作为科研先导，动物实验可以弥补临床研究的不足，尤其是在涉及伦理问题和一些容易出现偏倚的临床研究方面，有其独特的优势。因此，研究客观性、公认性、重复性较好的IBS动物模型对认识发病机制、病理生理和药物治疗有积极的作用[2-3]。本文拟对IBS动物模型研究进展作一综述。

1 研究对象

目前国内外最常用实验动物是大鼠与小鼠。李熠萌等[4-5]对近10年中医药对IBS的实验研究方法进行了综述，结果表明63%的文献均采用大鼠作为实验模型复制的对象，其中Wistar大鼠占25%，新生SD大鼠占20%，成年SD大鼠占18%；另有37%的文献选择了其他动物，如小鼠（20%）、豚鼠（8%）、兔（8%）等。刘清华[2]提出可以用与人类更相近的灵长类等动物作为研究对象，使动物模型更接近人类。

2 建模方法

2.1便秘型肠易激综合征模型进展

彭丽华等[6]采用冰水灌胃法复制大鼠便秘模型，方法如下：每只给予冰水（0～4℃生理盐水）2 mL，于上午8：00开始灌胃，每天1次，共14 d。停止灌胃后再观察14 d。期间始终给予正常饲食、饮水。该模型是以IBS模型新概念，为IBS研究提供新的条件。近年来，许多学者都采用这种方法构建便秘型肠易激综合征动物模型，如唐洪梅等[7]。

陆迅等[8]用结直肠球囊扩张刺激+限水法构建便秘型肠易激综合征大鼠模型：SD大鼠，使用Braun 8F导尿管自制的球囊，蘸少许石蜡油，在清醒的状态下，自轻柔插入，深度4～5 cm，大致达到大鼠的降结肠部位。每次刺激之前，检查球囊的密闭性。向气囊充气，维持肠道压力7.98 kPa（60 mmHg）（1 mmHg = 0.133 kPa），持续1 min，然后撤气。给予扩张刺激前，可预先刺激大鼠部，使其排尽大便，以减少粪团对扩张程度的影响。每天刺激1次，持续15 d。15 d后，大鼠禁水不禁食，连续3 d。该模型表现为便秘及内脏高敏感性，能较好地模拟人类。

王金贵等[9]采用冰水灌胃与冰敷束缚相结合制备便秘型IBS白兔模型。

2.2腹泻型肠易激综合征模型进展

腹泻型模型构建方法较多，有物理化学刺激、心理应激、药物致泻、病原体感染、复合方法及其他方法等。

物理化学刺激： Yasuo等[10]采用冷应激方法构建模拟IBS腹痛的SART大鼠应激模型：4周龄SD大鼠置于低温（0℃）与室温（24℃）交替变换的环境，每小时变换一次，9：30～16：30期间重复操作；之后从16：30～9：30，持续置于低温环境（0℃）。上述操作重复四天，建立SART大鼠应激模型。建模期间大鼠自由进食水，应激后置于24℃以用于后续实验。Salaga等[11]用蓖麻油灌胃小鼠致泻构建模型。陆敏等[12]采用AL-Chaer方法对幼龄大鼠进行结肠刺激构建模型，具体方法：SD孕鼠单独饲养，幼雄大鼠出生第8、10、12天，接受结肠气囊扩张刺激，每天一次，共三次。待出生60 d后开始实验。该方法建造的模型大鼠呈内脏高敏感性，且能持续至成年期。

心理应激：通过各种应激刺激使动物产生烦躁、恐惧等中枢兴奋性增高的方法来构建模型，应激刺激有束缚、避水、夹尾、慢性应激等，可单独也可同时使用，复合应用两种刺激方法较为常见。Ning等[13]用束缚的方法构建急性应激模型。Jianhua等[14]运用以下7种刺激构建慢性应激模型：12 h通宵照明；45℃热环境5 min；禁水24 h；4℃寒冷环境3 min；夹尾1 min；水平振动40 min；禁食24 h。石君杰等[15]用束缚+夹尾刺激造模，王艳杰等[16]用慢性应激+束缚刺激造模。

药物致泻：刘春等[17]通过番泻叶灌胃造模：除正常组外，其余各组大鼠均于上午8：00给予番泻叶灌胃，按10 mL/kg剂量，每天1次，连续4周；并从番泻叶灌胃第2周起用木夹夹尾以激怒大鼠，令其打架，每天30 min。第5周起停止造模。亦有很多其他人运用药物致泻造模，但大多都是与其他刺激因素综合运用。

病原体感染：Cheng等[18]通过口服方法使小鼠感染体内旋毛虫，诱导感染后肠易激综合征（post-infectio Irritable bowel syndrome，PI-IBS）。Huan等[19]亦用旋毛虫感染诱导PI-IBS小鼠模型，这种模型小鼠几乎没有胃肠道炎性反应，而肠道高敏感性却持续存在。Walter等[20]用灌胃活空肠弯曲菌法构建PI-IBS模型：大鼠连续2 d粪便中空肠弯曲菌阴性，证明体内空肠弯曲菌已排尽，饲养1个月。之后再饲养3个月以达到明确的后感染状态，这时大鼠大便性状改变，与IBS患者症状相似。

复合方法：复合方法主要有药物致泻+心理应激（束缚等）、化学刺激+心理应激（束缚等）以及多种因素综合刺激等。张涛等[21]和张道英等[22]都采用番泻叶灌胃+束缚应激刺激的方法造模。张声生等[23]用乙酸灌肠加束缚应激进行造模。闫雪等[24]用母婴分离、肠道化学刺激、束缚刺激三者结合为综合因素刺激造模。

其他方法：Bo等[25]用稀释的乙酸刺激新生幼鼠诱导IBS内脏痛模型。另外还有通过基因层面进行造模的，如Moechars等[26]用基因敲除的方法造模，但这方面的研究尚不太多，有待进一步深入研究。

3 观察和检测指标

3.1一般情况

各组大鼠每周称重1次，造膜及治疗期间观察大鼠精神状态、毛发色泽、进食、饮水、活动及大小便情况[17]。

行为学观测指标的选择：腹泻型IBS应该出现明显的拱背（证明有腹痛）、腹泻等主要的行为学特征，证明IBS的存在；肝郁应出现对外界刺激基本较少兴奋，淡漠，偶则抓耳乱窜、烦躁不宁、情绪不稳定、易激怒、易受惊吓等的行为学特征；脾虚出现食少纳呆、体重减轻、活动少、易疲劳（打斗时间梯减）、嗜睡、倦卧、扎堆、拱背、毛发枯而蓬乱不泽、污秽等的行为学特征。应该详细记录大鼠出现以上症状的时间以及特点[27]。

3.2肠道敏感性测试

腹肌回缩实验（abdominal withdrawal reflex，AWR）和直肠扩张（colorectal distension，CRD）反应：将大鼠放入一固定装置中，使其只能前后活动，不能转身，经插入球囊，固定气囊，向球囊内注入空气给予不同压力刺激，在不同压力下观察大鼠对直肠球囊扩张的腹肌回缩反射，每次持续扩张20 s，同时观察大鼠对不同压力下所致直肠扩张的反应，根据其反应记录半定量行为学评分。评分判定标准：0分，大鼠对结肠扩张时无行为学的反应；1分，结肠扩张时身体静止不动，头部运动减少，为初始感觉阈；2分，结肠扩张时腹部肌肉收缩，但腹肌未抬离桌面，为不适阈值；3分，结肠扩张时腹肌收缩并抬离桌面，为疼痛阈值；4分，结肠扩张时骨盆抬起，身体呈弓形，为最大耐受阈值[28]。

3.3肠道转运功能

肠道推进测试：胃肠道推进是评价胃肠动力和致泻、止泻作用的重要参数。模型大鼠禁食（不禁水）1 d后，用5 mL的注射灌胃注射器，给模型大鼠灌胃活性碳墨水3 mL，15 min后用腹腔注射 10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）的方法处死大鼠。处死后立即取出整个小肠，浸入5%福尔马林液以终止蠕动，水洗后，测量活性炭在小肠的移动距离，用占小肠全长（幽门到盲肠末）的百分率表示[24]。

3.4病理学检查

实验结束后处死动物，取结直肠组织标本，进行常规固定、包埋、切片，作病理形态学检查。HE染色后，光镜下观察结直肠组织标本表面层是否完整，有无溃疡[24]，杯状细胞形态及数量变化，水肿及炎性细胞浸润情况等；甲苯胺蓝染色后，光镜下进行肥大细胞计数[29]。

3.5相关脑肠肽的检测

脑肠肽是存在于中枢神经系统和胃肠道神经系统的小分子多肽，与IBS发病密切相关，包括有5-羟色胺（5-HT）、P物质（SP）、促肾上腺皮质激素释放因子、血管活性肠肽（VIP）、生长抑素等[30]。检测方法：眼眶取血，离心后取血清，于-20℃保存，按5-HT、SP、VIP等的试剂盒说明步骤测定光密度（OD）值；处死动物后，取结肠组织，研浆离心取上清液，按试剂盒操作说明测OD值，并计算结肠组织相应的含量[8]。

4 评价

由于IBS的病因及发病机制尚未完全清楚，临床表现也不尽相同。因此，IBS患者的临床症状很难通过一种动物模型来确切地反映。当前的IBS动物模型，大多仅从IBS病理生理机制中的某一方面着手，来模拟IBS的某些特征，尽管都有其一定的合理性，具有一定的理论基础，但因IBS发病机制的复杂性及其诱发因素的个体化与多样性，因而目前的动物模型均有不同程度的局限性[31]。

在过去的十几年里，各种动物模型已经发展到了解内脏超敏感性的基本机制及应激对内脏痛觉通路的影响。而在人类中，对内脏敏感性的评价主要是基于对肠道扩张的感知意识。这种对主观反映的评估方法不能用于动物研究[32]。

因此，应当进一步研究出更接近人体内复杂机制的IBS动物模型，并且找出对内脏高敏感性更加准确有效的评价指标，进一步完善造模方法与途径，来为临床研究与治疗提供更大的帮助。

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