表观遗传学主要研究精选(九篇)

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第1篇：表观遗传学主要研究范文

基因表达正确与否，既受控于DNA序列，又受制于表观遗传学信息。表观遗传学主要通过DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑和非编码RNA调控等方式控制基因表达。近年发现，副突变也包含有表观遗传性质的变化。

1.DNA甲基化

DNA甲基化是由酶介导的一种化学修饰，即将甲基选择性地添加到蛋白质、DNA或RNA上，虽未改变核苷酸顺序及组成，但基因表达却受影响。其修饰有多种方式，即被修饰位点的碱基可以是腺嘌呤N-6位、胞嘧啶的N-4位、鸟嘌呤的N-7位和胞嘧啶的C-5位，分别由不同的DNA甲基化酶催化。在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基，CG二核苷酸是最主要的甲基化位点。DNA甲基化时，胞嘧啶从DNA双螺旋突出，进入能与酶结合的裂隙中，在胞嘧啶甲基转移酶催化下，有活性的甲基从S-腺苷甲硫氨酸转移至胞嘧啶5-位上，形成5-甲基胞嘧啶（5mC）。DNA甲基化不仅可影响细胞基因的表达，而且这种影响还可随细胞分裂而遗传并持续下去。因此，它是一类高于基因水平的基因调控机制，是将基因型与表型联系起来的一条纽带。在哺乳动物细胞的基因组DNA中，约有3%～5%的胞嘧啶是以5-甲基胞嘧啶形式存在的，同时70%的5-甲基胞嘧啶参与了CpG序列的形成，而非甲基化的CpG序列则与管家基因以及组织特异性表达基因有关。因而CpG的甲基化与否在基因的表达中起重要作用。高度甲基化的基因，如女性两条X染色体中的一条处于失活状态，而为细胞存活所需一直处于活性转录状态的持家基因则始终处于低水平的甲基化。在生物发育的某一阶段或细胞分化的某种状态下，原先处于甲基化状态的基因，也可以被诱导去除甲基化，而出现转录活性。

2.组蛋白修饰

组蛋白是真核生物染色体的基本结构蛋白，是一类小分子碱性蛋白质。组蛋白有两个活性末端：羧基端和氨基端。羧基端与组蛋白分子间的相互作用和DNA缠绕有关，而氨基端则与其他调节蛋白和DNA作用有关，且富含赖氨酸，具有极度精细的变化区，这类变化由乙酰化、磷酸化、甲基化等共价修饰引起。这些修饰可作为一种标记或语言，是“组蛋白密码”的基本组成元素。这种组蛋白密码可被一系列特定的蛋白质所识别，并将其转译成一种特定的染色质状态以实现对特定基因的调节，这显著地扩大了遗传密码的信息储存量。

3.染色质重塑

真核生物染色质是一切遗传学过程的物质基础，染色质构型局部和整体的动态改变，是基因功能调控的关键因素。染色体重塑是指染色质位置和结构的变化，主要涉及在能量驱动下核小体的置换或重新排列，它改变了核小体在基因启动子区的排列，增加了基因转录装置和启动子的可接近性。染色质重塑的发生和组蛋白N端尾巴修饰密切相关，尤其是对组蛋白H3和H4的修饰。修饰直接影响核小体的结构，并为其他蛋白提供了和DNA作用的结合位点。染色质重塑主要包括两种类型：一类是含有组蛋白乙酰转移酶和脱乙酰酶的化学修饰;另一类是依赖ATP的物理修饰，利用ATP水解释放的能量解开组蛋白和DNA的结合，使转录得以进行。

4.非编码RNA

调控有多种功能性非编码RNA可对基因表达水平进行干扰。各种生物中双链RNA（dsRNA）可通过不同途径被分割成小的干涉RNA（siRNA）或RNAi。RNA干涉（RNAi）属于转录后基因沉默，它可使转录后的同源mRNA降解，使同系的DNA序列发生修饰性变化（甲基化），使rRNA甲基化，从而使目的基因表达沉默。

5.副突变

副突变是指一个等位基因可以使其同源基因的转录产生稳定可遗传变化，即一个等位基因被另外一个等位基因在转录水平上被沉默且这种能力可遗传。这种现象是1956年R.A.Brink在研究玉米的R基因座位时发现的。此后在其他植物、真菌甚至小鼠中发现。

二、遗传学和表观遗传学的关系

传统遗传学认为遗传信息储存于DNA的序列中，它主要研究基因序列改变所致的基因表达水平的变化，是基因质的变化;表观遗传学则认为遗传信息是DNA甲基化形式和组蛋白密码、RNA干涉等，它实际上是以基因表达水平为主的量变遗传学。表观遗传变异也能遗传，并具重要的表型效应，但其不同于基因突变。在整个生命过程中，表观遗传学机制能对激素、生长因子等调节分子传递的环境信息在不改变DNA序列的情况下做出反应。因此，只有二者彼此协同，生命过程才能按序正常进行，否则就会出现异常。由此可见，遗传学和表观遗传学系统既相区别、彼此影响，又相辅相成，共同确保细胞的正常功能。

三、表观遗传学研究的应用前景

表观遗传学补充了“中心法则”忽略的两个问题，即哪些因素决定了基因的正常转录和翻译以及核酸并不是存储遗传信息的唯一载体;在分子水平上，表观遗传学解释了DNA序列所不能解释的诸多奇怪的现象。例如，同一等位基因可因亲源性别不同而产生不同的基因印记疾病，疾病严重程度也可因亲源性别而异。表观遗传学信息还可直接与药物、饮食、生活习惯和环境因素等联系起来，营养状态能够通过改变表观遗传以导致癌症发生，尤其是维生素和必需氨基酸。

第2篇：表观遗传学主要研究范文

表观遗传学（epigenetics)是与遗传学（genetic)相对应的概念，是对经典遗传学的有益补充；其认为在不改变基因序列的条件下，生物体从基因到基因表型之间存在一种调控，这种机制即“表观遗传学”的含义。尽管已被提出70余年,但直到近10余年，随着科学家们对这种“获得性遗传”的进一步认识，才成为生命科学界最热门的研究之一。因此,研究者们转换思维，从表观遗传学角度对AD发病及治疗进行了研究，发现了一系列表观修饰的关键酶类，以及对这些酶类发挥影响的药物，从而为AD药物研发提供了新的思路和研究方向。本文拟就AD的表观遗传学治疗研究综述如下。

1阿尔茨海默病（AD)概况

阿尔茨海默病（AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。它是最常见的痴呆类型，西方国家[中50%?70%的痴呆属于AD。其病因及发病机制复杂，涵盖了遗传和环境的危险因素，涉及成千上万个基因表达的改变，以及多种信号途径的上调，如P淀粉样肽W-amyloidpeptide,Ap)的沉积、Tau蛋白过度磷酸化、炎症、氧化应激、能量代谢、血管因素及细胞凋亡周期异常等。ad的典型病理改变包括突触丧失、某些神经递质水平下降、神经元内异常物质沉积以及选择性脑神经细胞死亡，使大脑受累区域广泛萎缩，导致记忆力丧失伴行为改变和人格异常，严重者可影响工作及社会生活。受累区域常会出现A沉积、老年斑（senileplaques,SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)及Tau蛋白过度磷酸化等。疾病逐渐进展恶化，甚至累及生命。遗憾的是目前尚缺乏延缓或阻碍疾病进展的治疗手段。

在AD中，涉及神经元退行性改变的基因达200余个,越来越多的研究数据发现在没有基因序列改变的情况下，某些机制也可以决定致病基因何时或怎样表达，最终导致AD发病。因此，AD基因组并不能完全解释发病机制[14]。已知编码APP、PSEN1和PSEN2的基因仅可导致家族性早发型AD(early-onsetAD,EOAD);而大多数（约95%)AD均为晚发型AD(late-onsetAD,LOAD)或散发型。因此可以推断，表观遗传现象或环境因素参与了LOAD的致病。这就部分解释了为什么同一家族中有的家庭成员发病而另一些不发病；而且，在年轻的同卵双胞胎中基因组无实质上的差异，而在同一老年双胞胎中其基因表观遗传学上存在显著差异。

大量研究数据证实，基因-环境相互作用在AD的病理生理过程中发挥了关键作用营养物质、毒素、环境暴露及人的生活行为,都可以在不改变基因组序列的条件下使基因激活或沉默。目前已知的可调控基因转录和表达的表观遗传学机制主要分两大类：①基因选择性转录的调控：包括基因组DNA甲基化，多种组蛋白甲基化及乙酰化等修饰；②基因转录后的调控：包括微小RNA(microRNA,miRNA)和小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等非编码RNA的调节，以及沉默的核糖体RNA(ribosomalRNA,rRNA)基因。除此之外，染色体重塑、基因印记、X染色体失活也属于表观遗传学范畴。

2表观遗传学

表观遗传学的涵义即在DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达与功能发生改变，并产生可遗传的表型。基本机制即：通过多种基因修饰，影响基因转录和（或）表达，从而参与调控机体的生长、发育、衰老及病理过程。至此，表观遗传学的发现极大丰富了传统遗传学的内容，使人们认识到遗传信息可以有两种形式：即DNA序列编码的“遗传密码”和表观遗传学信息。它和DNA序列改变不同的是,许多表观遗传的基因转录和表达是可逆的，这就为许多疾病的治疗开创了乐观的前景。

2.1组蛋白修饰

组蛋白在DNA组装中发挥了关键作用，利用核心组蛋白的共价修饰传递表观遗传学信息。这些修饰主要包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化及特定氨基酸残基N-末端的SUMO化;其中组蛋白氨基末端上的赖氨酸、精氨酸残基是修饰的主要靶点,这些组蛋白翻译后修饰(post-translationalmodifications,PTMs)对基因特异性表达的调控，是其表观遗传学的重要标志。正常机体内，组蛋白修饰保持着可逆的动态平衡。一般而言,组蛋白乙酰化是在组蛋白乙酰转移酶（histoneacetyl-transferase,HATs)的催化下，从乙酰辅酶A上转移乙酰基到组蛋白N-末端的赖氨酸残基上；由于乙酰化中和了组蛋白的正电荷，使组蛋白末端和相关DNA带负电荷磷酸基团之间的作用减弱，降低了组蛋白和DNA之间的亲和力，这种染色质构象的放宽有助于转录因子向靶基因片段聚集并利于转录的进行。而去乙酰化则是组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases,HDACs)将乙酰基从乙酰化组蛋白转移到乙酰辅酶A上，形成了致密的染色质状态，从而使基因转录下降或沉默。

2.2DNA甲基化

DNA甲基化较组蛋白修饰更进一步，是表观遗传学的又一重要机制。DNA甲基化主要是在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase,DNMTs,包括DNMT1、2、3a/b和4)催化下，将同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)-甲硫氨酸循环中S-腺苷甲硫氨酸（SAM)中的甲基，由四氢叶酸转移到胞嘧啶的第5位上形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC)。其中，相邻的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CpGs)是最主要的甲基化位点。在人类基因组中，CpG以两种形式存在：一种分散存在于DNA中，其CpG70%?90%的位点是甲基化的；另一种CpG呈密集分布于一定区域，称之为“CpG岛”（CpGislands),通常位于或接近基因启动子区（promoterregions),在正常人体基因组中处于非甲基化状态。CpG岛中的胞嘧啶甲基化可以阻碍转录因子的结合，从而可致基因沉默。一般而言，高度甲基化的基因可致表达抑制,而低甲基化的基因可增强基因表达或过表达。

2.3非编码RNA

表观遗传学调控机制涉及RNA的主要包括:miRNA、siRNA以及维持细胞周期的沉默rRNA基因的一部分。

miRNA是较短的双链RNA分子，约有22个核苷酸，来源于机体自身基因即细胞核及细胞质中较大的RNA前体，有自己的启动子和调控元件。人类基因组中有约700?800个miRNA。这些小分子RNA在转录后通过绑定靶mRNA,从而抑制转录或诱导mRNA分裂降解。大多数miRNA具有高度保守性和组织特异性，可以调控机体中30%?50%的蛋白质编码基因。siRNA长短与miRNA相似，作用方式也有很多相同之处，区别在于siRNA可以体外合成,多由外源性导入或感染诱导产生。

重复rRNA基因的复制为真核生物核糖体提供了初始活性位点，在基因表达中是蛋白质合成的热点区。不同细胞类型可表现不同的活性rRNA比率,提示随着细胞发育分化，rRNA基因拷贝数比例会发生改变。沉默rRNA的表观遗传学方式在这个过程中发挥了重要作用,使活性和非活性rRNAs保持了动态平衡。

2.4染色质重塑、基因印记和X染色体失活

染色质重塑（chromatinremodeling)指基因复制、转录和重组等过程中，核小置和结构及其中的组蛋白发生变化，引起染色质改变的过程；主要机制即致密的染色质发生解压缩，暴露基因转录启动子区中的特定结合位点，使转录因子（transcriptionfactor,TF)更易与之结合。基因印记(geneticimprinting)指来自亲本的等位基因在发育过程中产生特异性的加工修饰，导致子代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达方式，即一个等位基因有表达活性，另一等位基因沉默。X染色体失活指雌性哺乳动物细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象,即X染色体被包装成异染色质，进而因功能受抑制而沉默化，使雌性不会因为拥有两个X染色体而产生两倍的基因产物。

3AD的表观遗传学3.1组蛋白修饰

研究显示，在AD中存在组蛋白的PTMs。组蛋白3(histone3,H3)磷酸化作为激活有丝分裂的关键步骤，可使AD海马神经元呈过磷酸化状态。对APP/PS1突变小鼠和野生型小鼠进行条件恐惧训练,结果显示前者乙酰化H4较野生小鼠组降低50%;之后对突变组进行HDAC抑制剂（histonedeacetylasesinhibitors,HDACIs)曲古抑菌素A的治疗，显示前者乙酰化H4水平出现了上升。在一项皮层神经元培养模型研究中，APP过度表达则可导致H3和H4乙酰化降低，以及c-AMP反应元件结合蛋白（cAMP-responseelementbindingprotein,CREB)水平下降;而CREB则是脑神经元中激活记忆相关基因，形成长期记忆的关键蛋白。总之，尽管在AD患者、AD动物模型及AD培养模型中，都出现了组蛋白修饰,但这个过程是极其复杂的,特异性位点会因功能状态不同而出现组蛋白乙酰化增加或减少。

3.2DNA甲基化

3.2.1相关基因的甲基化研究显示，尽管很难判

断AD中甲基化程度是升高还是下降，但12个甲基化的AD特异性基因表现出了显著的“表观偏移”；同时研究还发现，在DNMT1启动子内一些CpG位点也表现出年龄相关的表观偏移。研究还发现，叶酸、甲硫氨酸及Hcy代谢与DNA甲基化机制显著关联。例如，人类及动物模型叶酸缺乏将导致基因组整体低甲基化，而补充叶酸则可部分逆转甲基化程度。Smith等研究发现，衰老及AD人群中都出现了叶酸缺乏和甲硫氨酸-Hcy周期的改变。另一研究发现AD患者脑脊液（cerebro-spinalfluid,CSF)中叶酸显著下降，同样下降的还有CSF及脑组织中SAM。同时还观察到AD患者脑组织中S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)及血浆中Hcy的升高，后者可抑制DNA甲基化。

目前已知的AD相关基因主要包括：p淀粉样蛋白前体（APP)基因、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)基因、载脂蛋白E(ApoE)基因、p-分泌酶（BACE)基因、sortilin相关受体基因(sortilin-relatedreceptor1gene,SORL1)以及白介素1a(IL-1a)和白介素6(IL-6)基因等。其中，APP基因、BACE基因或PS1基因均存在可调控的CpG甲基化位点。有研究显示,一例AD尸检的大脑皮层中APP基因发生了完全去甲基化，而正常样本或匹克氏病（Pick’sdisease)患者样本则没有这种变化。实验发现，叶酸缺乏所致的BACE和PS1基因表达增强，可通过补充SAM而恢复正常。同样，体内实验发现，给予APP过度表达的转基因小鼠缺乏叶酸、B12及B6的饮食，可以使SAH升高并上调PS1和BACE的表达，以及促进A的沉积和出现认知障碍。在LOAD尸检标本中，研究者发现了著名的“年龄依赖的表观遗传学漂移”(age-dependentepigeneticdrift);对CpG岛异常的表观遗传学控制,可能促成了LOAD的病理变化,因此，“表观遗传学漂移”可能是LOAD个体易感的重要机制。

3.2.2Tau蛋白相关的甲基化Tau蛋白是一种微管结合蛋白（microtubulebindingprotein,MAP),它能与神经轴突内的微管结合，具有诱导与促进微管形成，防止微管解聚、维持微管功能稳定的功能。对记忆和正常大脑功能起重要作用。然而，在AD中,Tau蛋白不仅不再发挥正常功能，还会因异常磷酸化或糖基化等改变了Tau蛋白的构象，使神经元微管结构广泛破坏，形成以Tau蛋白为核心的NFT,最终导致神经元功能受损或神经元丢失。

人体在正常条件下，Tau蛋白启动子的AP2结合位点是非甲基化的，但SP1和GCF结合位点则被甲基化。而随着年龄的增加，SP1作为一种转录激活位点甲基化程度升高,GCF作为启动子抑制位点则逐渐去甲基化，因此总体而言Tau蛋白的基因表达是下调的。尤其在额叶及海马区域，正常Tau蛋白也出现了年龄相关的下降。蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一种针对磷酸化Tau蛋白的去磷酸化酶，PP2A催化亚基的甲基化可以激活该酶。研究显示，在APP及PS1基因突变的转基因小鼠中，PP2A的甲基化程度显著下降，结果显示Tau蛋白磷酸化增高。对培养的神经元添加叶酸拮抗剂甲氨蝶呤，也可导致PP2A去甲基化，从而增加Tau蛋白的磷酸化程度。另外，还有研究显示，Hcy可以使PP2A的甲基化程度及活性下降,而添加叶酸和B12则可以逆转这个过程。总之，Tau蛋白的磷酸化和脱磷酸化间平衡是维持微管稳定性的关键因素；而其中磷酸化相关酶类的甲基化程度,成为影响Tau蛋白磷酸化的重要因素。

3.2.3异常的细胞周期和神经元凋亡研究证实,细胞周期异常和神经元凋亡是AD神经退行性变的常见机制。AD神经元中细胞周期及凋亡途径关键因子受DNA甲基化影响并发生上调。包括细胞周期素B2基因、caspase-1基因、caspase-3基因等。这些相关基因的低甲基化使细胞进入异常细胞周期。同样,高Hcy可使培养神经元凋亡，也间接证实了低甲基化导致异常细胞周期；而使用SAM还可起到拮抗细胞凋亡的效果。

3.3A与miRNA

研究发现，miRNA可以调节APP的表达、APP处理、A聚积以及BACE1的表达，从而导致A毒性改变或影响神经再生。因而,miRNA失调可使APP表达及处理过程发生改变，最终引起神经元存活率和神经再生程度的改变。针对全球AD人群和正常老年人群的对比研究发现，特异性miRNA水平存在显著差异。研究显示，在AD中APP相关miRNA显著下降，而APPmRNA水平则保持平稳，提示miRNA影响APP表达是通过抑制转录而不是促进APPmRNA的裂解；同时，在AD皮层中miRNA-106b出现显著下降。具体机制还有待进一步研究。

3.4AD与一碳代谢

叶酸代谢又称为一碳代谢，需要SAM提供甲基。诸多研究表明,AD患者常存在血浆及CSF中Hcy升高（两者浓度升高常呈正相关)，血浆叶酸和B12水平下降，以及脑组织中SAM减少。早期暴露于缺乏叶酸及B族维生素饮食的动物，其AD相关基因在脑组织中发生了表观遗传学修饰。SAM作为甲基化过程最重要的甲基来源，其产生及循环依赖于甲硫氨酸循环的正常进行[11]。研究显示,AD患者CSF中SAM出现显著下降，口服SAM(1200mg,qd)4?8个月,可以使CSF中SAM浓度升高。同时，维生素B12缺乏可使SAM产生减少，从而影响甲基化。前瞻性队列研究表明，高Hcy与AD高风险显著相关，而较高的叶酸摄入量可以降低老年人的AD风险。叶酸缺乏导致的SAM缺乏以及Hcy升高，使甲基化水平下降；并且，Hcy影响SAM和SAH水平，后两者可调节DNA甲基化活性以及蛋白翻译后修饰。另外，研究还发现Hcy可通过抑制甲基化，降低PP2A甲基化程度，从而导致Tau蛋白过磷酸化、NFT及SP形成。因此，最关键机制即：叶酸/同型半胱氨酸代谢异常导致AD相关基因启动子的表观遗传修饰（CpG区域甲基化状态的改变)，使基因沉默（高甲基化）或过度表达（低甲基化)，最终发生AD。

4表观遗传学在AD诊疗中的应用研究

近年来，随着表观遗传学在AD研究中的不断进步，研究者已逐渐将其应用于AD的诊断及治疗中，尽管多数还处于临床前试验阶段，但表观遗传学应用于AD临床的前景是乐观并值得期待的。

4.1表观遗传学诊断手段

利用亚硫酸氢钠进行甲基化测序是检测DNA甲基化的金标准。该方法利用盐析法从血液中提取基因组DNA,经过亚硫酸氢盐处理后，变性DNA中胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5-mC则不发生转换，因此在经过PCR扩增和DNA测序后，胸腺嘧啶则代表非甲基化胞嘧啶，而5-mC(主要为CpG二核苷酸）仍为胞嘧啶。继而由该方法延伸出多个DNA甲基化分析法，例如：甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP)、结合亚硫酸氢盐限制性分析（combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)以及甲基敏感性单核苷酸引物(methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension,MS-SNuPE)等。然而，由于目前对AD相关基因甲基化的研究还不完善，只能在临床前研究中应用甲基化测序，用于对比分析AD中基因甲基化的真实状态。

实时基因成像（real-timegeneticimaging)技术是另一种判断基因表观遗传修饰的手段；该技术避免了尸检或动物研究，是一种新型的非侵入性的可视化基因调控检测。磁共振波谱（MRspectroscopy,MRS)即是这样一种特殊的磁共振成像，该技术可扫描到特定的蛋白，将来可使我们能够实现对基因表达变化的可视化实时检测，理论上而言可以追踪到DNA甲基化或组蛋白修饰的责任蛋白；因此，在一定程度上，将为AD的表观遗传学诊断和治疗提供新的手段[39]。

此外，另有研究发现，脂肪酸酰胺水解酶（fattyacidamidehydrolase,FAAH)参与了AD的发病，同时还发现FAAH易于从外周血中检出，并可作为一个新的潜在的AD生物标志物（biomarker),继而用于AD的预测或诊断。然而，由于一些AD相关蛋白或酶类在外周血中易降解，稳定的miRNA检测已成为反映疾病的重要手段。由于大多数AD患者外周血单核细胞中存在各种miRNA的表达上调（如miR-371、miR-517等),且与其在AD脑中高表达相对应，提示通过测定血浆及血单核细胞的miRNA谱变化,可作为AD诊断和病情评估的重要方法。

4.2AD的表观遗传学治疗

表观遗传学对研究AD的发病机制和病程转归,以及研发新的药物等方面开拓了广阔的空间。表观遗传学药物进入体内后，可充当基因转录或表达的“开关”，通过不同的基因修饰及调控基因表观修饰相关酶类的活性，继而达到在未改变DNA序列的情况下影响基因表型。因此，正是表观遗传学改变的“可逆性”，使与之相关药物的研发成为AD治疗研究的新方向和重点。

4.2.1HDACIs近年来，科学家们研发了多种新的HDACIs。根据化学形态主要分为4类：①短链脂肪酸类：如丁酸钠、苯丁酸盐和丙戊酸（valproicacid,VPA);②异轻肟酸（hydroxamicacid)类：如曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)、辛二酰苯胺异轻肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA);③环氧酮类：如trapoxinA和trapoxinB;④苯甲酰胺类：如MS-275。这些HDACIs与锌依赖性HDAC蛋白（zinc-dependentHDACprotein,I、II及IV类组蛋白亚型）相互作用；烟酰胺作为NAD+前体，可以抑制III类HDAC蛋白。其中，研究最广泛的是丁酸钠、苯丁酸盐、VPA、TSA和SAHA。

目前FDA批准上市的是SAHA,-种治疗T细胞淋巴瘤的新型化合物，不仅可增加组蛋白乙酰化水平，同时还可提高认知。在神经系统中，VPA具有抗惊厥和稳定情绪的作用，因此这些作用可能与引起组蛋白乙酰化改变有关；VPA还可以通过抑制GSK-3#介导的y-分泌酶裂解APP,从而抑制Ap的产生，减少A斑块，最终缓解AD模型鼠的认知功能障碍。Ricobaraza等研究显示，4-苯基丁酸乙酯（PBA)可通过降低GSD-3#来降低AD大鼠脑内Tau蛋白磷酸化，并可清除突触间A沉积，减轻内质网压力，从而恢复记忆并逆转学习障碍。而烟酰胺则可选择性降低Tau蛋白磷酸化并增加乙酰化的a微管蛋白。Fischer等也研究发现，非特异性HDACIs如VPA、TSA、4-苯基丁酸钠及伏立诺他等，都可以通过不同的表观遗传机制影响Ap沉积和Tau蛋白过磷酸化，并可改善学习和记忆力。另外,HDACi丙戊酸可以降低APP的表达，减轻大脑中的A肽斑块负担；研究还证实，HDACI治疗还可诱导树突发芽，增加突触数量，以及恢复学习行为和形成长期记忆。Zhang等报道，口服HDACIMS-275可改善神经炎症和脑淀粉样变，以及改善AD模型动物的行为能力。这些研究提示,HDACIs可通过调节HDAC蛋白活性和Tau蛋白磷酸化水平，从而用于AD的治疗.

HDACIs可选择性抑制HDACs,导致组蛋白乙酰化水平升高，恢复AD模型动物中组蛋白乙酰化水平及提高学习和记忆能力。例如：Guan等发现当脑内HDAC2过表达时，小鼠海马神经元树突棘密度降低、突触形成减少、CA1区LTP形成障碍、空间记忆和工作记忆损伤；而使用HDACIs则能够促进小鼠神经元树突棘和突触的形成，改善AD模型小鼠的学习和记忆减退状态。因此，HDAC2可能是HDACIs最适宜的治疗靶点之一，可能使脑神经元内合成新的蛋白以改善或恢复AD患者记忆。除此之外,HDACIs对基因表达的调节具有特异效应,可以在上调靶基因表达的同时下调其他基因;这种基因特异性常通过转录因子来调控，后者可以识别特定启动子和增强子序列，并赋予靶基因特异性（gene-specificeffects),使之对HDACIs具有敏感性[44],继而逆转表观遗传改变。同时，应用HDACIs治疗AD还应当考虑其是否可穿透血脑屏障，因此，最近的一项研究研发了一种可进入CNS(“CNS-penetrant”)的HDACIs(I类）EVP-0334,目前已进入I期临床试验用于AD治疗。

众所周知，AD大脑受累的主要区域为内侧嗅皮质、海马及杏仁核等。研究发现，与正常脑组织相比,AD患者皮质中HDAC6蛋白水平升高了52%,而海马中则升高了92%。HDAC6与Tau蛋白共同存在于核周，并发生相互作用；其中HDAC6具有独立的微管蛋白脱乙酰基酶的活性。使用HDAC6抑制剂Tubacin治疗或敲除HDAC6,并不能影响HDAC6与Tau蛋白的相互作用，但可以减少Tau蛋白磷酸化[55]。通过结合HDAC6,Tau蛋白可抑制脱乙酰酶活性,从而导致微管蛋白乙酰化增加；在Tau蛋白过表达的细胞中也可见这种增加；说明过量的Tau蛋白成为HDAC6的抑制剂，然而AD患者中正常Tau蛋白是减少的。文献显示，HDAC6的减少或丢失可改善联想和空间记忆形成[56,57],以及阻断A诱导的海马神经元线粒体运输障碍。最近有研究人员还发现,HDAC6无效突变（nullmutation)可以挽救神经元中Tau蛋白诱导的微管缺陷。他们采用遗传和药理学方法抑制HDAC6的tubulin特异性脱乙酰基酶活性，证实这种“挽救效应”有可能是通过增进微管乙酰化所介导的。这些研究结果表明,HDAC6有可能是AD和相关Tau病的一种独特的有潜力的药物靶点,HDAC6抑制剂有望成为AD治疗的新型药物。

目前研究证实，HDACIs可用来治疗神经变性病、抑郁、焦虑情绪、认知功能障碍及神经发育障碍,因此为AD的治疗提供广阔的前景。但现有的HDACIs存在生物利用度低、代谢快、低选择性等缺点。因此,研究开发结构新颖、副作用小、特异性及选择性高的HDACI具有重要的临床意义。

4.2.2饮食因素除此之外，饮食因素，例如叶酸、维生素B2、B6、B12、蛋氨酸、胆碱等都可以影响甲基供体SAM的形成，并影响DNMTs活性；同时，一些天然化合物，如异黄酮、黄酮、儿茶素、姜黄素、白藜芦醇等，可以改变表观遗传学机制,影响染色质修饰酶的活性，因此备受关注。

研究证实，传统用于抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡及预防高脂血症的姜黄素，也可用于治疗AD：在体外实验中，姜黄素可抑制A聚集沉积、A#诱导的炎症、户分泌酶及乙酰胆碱酯酶的活性；而体内实验则证实，口服姜黄素可抑制AD动物脑组织中Ap沉积、Ap寡聚化及Tau蛋白磷酸化，并改善行为及认知。另有研究发现，姜黄素还可加速淀粉样斑块的分解，继而改善AD的空间记忆障碍。据Bora-Tatar等[65]报道，在33种羧酸衍生物中，姜黄素是最有效的HDAC抑制剂，甚至比丙戊酸和丁酸钠更强效；另有研究也发现，姜黄素可显著降低HDAC1、3和8蛋白水平，并可提高乙酰化H4水平。同时，姜黄素还是潜在的HAT抑制剂，2004年Balasubramanyam等[66]发现，姜黄素是p300/CREB结合蛋白HAT活性特异性抑制剂，对维持一定的CREB水平起到关键作用。因此，姜黄素对HDAC和HAT均有调节作用；作为已知的抗氧化剂，姜黄素可能是通过调节氧化应激，从而对乙酰化和去乙酰化具有双重调节作用。

AD表观遗传学改变受环境、营养因素等诸多因素共同作用，因此自孕前保健开始,直至子代的一生，都保持机体内外生存环境的良好，保证表观遗传学正常修饰及表达,在一定程度上可能会预防AD的发生。同时，由于目前糖尿病、肥胖、心血管疾病、高血压等都是公认的AD高危因素，通过表观遗传学机制防治这些疾病，也是降低AD的发生风险的重要手段。另外，提倡低热量、低胆固醇和富含叶酸、B族维生素及姜黄素等的饮食，以及降低血浆Hcy值，可能对保护大脑神经元，改善老年期认知，以及预防AD发生或逆转AD的表观遗传改变，起到一定的积极作用。

4.2.3其他因素由于DNA甲基化是可逆的，该过程的相关酶类也可作为AD治疗的研究靶点,例如DNMT抑制剂。然而，目前对DNMT抑制剂的研究多局限于肿瘤的治疗，因此对于AD的治疗作用还有待进一步研究。另外，研究发现AD中与APP裂解机制相关的多个miRNA也发生了改变,因此针对miRNA的AD表观遗传治疗成为重要研究方向。2006年，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所裴钢院士研究组研究发现，肾上腺素受体被激活后，可以增强y-分泌酶的活性，进而能够增加AD中Ap的产生。这项发现揭示了AD致病的新机制，提示肾上腺素受体有可能成为研发AD治疗药物的新靶点。

5展望

综上所述，在AD中，表观遗传学机制对疾病发生发展起到了关键作用，尤其是散发性AD。表观遗[8]传学调节障碍导致相关基因转录异常，引起关键蛋白或酶类异常，继而发生一系列病理生理改变，是AD发病的主要原因。表观遗传学改变可以通过表观遗传药物进行逆转，因而这不仅为AD的治疗开创了一片新天地，更引导医药行业进入了一个崭新的领域。

然而,使用表观遗传学药物治疗疾病也面临着一系列难题。对于目前可用的表观遗传学化合物如HDACIs及辣椒素等而言，主要的困难即缺乏针对不同脑区、不同神经元亚型或特异基因的“选择性”。

第3篇：表观遗传学主要研究范文

【关键词】 急性髓细胞白血病； 表观遗传学； 靶向治疗

急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一组异质性疾病，以造血干细胞克隆紊乱为特征，是成年人急性白血病中最常见的类型。近20年来，人们对AML的发病机制和预后的研究有了长足的进展，患者的完全缓解率也有了明显的提高，但仍有2/3成年AML患者未能达到治愈，复发、难治及老年AML仍是目前临床治疗的难题。为此，临床工作者和科研人员不断探索新途径，积极寻求AML治疗新方法。

近年来，表观遗传学的研究逐渐成为人们关注的热点。随着研究的深入，人们对AML的发病机制有了新的认识，随之而来的靶向治疗也给患者重新带来希望。该研究主要包括三个方面的内容：DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码microRNA。研究表明，表观遗传学的调控机制参与调节许多重要的生理过程。在血液肿瘤的发生和转化中，表观遗传学异常与遗传学异常具有同样重要的作用。表观遗传基因的修饰对于基因的差e表达有着至关重要的作用，它决定着细胞的类型及细胞从良性到恶性的转变。尤为重要的一点，这种修饰是可遗传的、动态的、可逆的，并且不影响下游的DNA序列。表观遗传的修饰基因，如DNMT3A，TET2，IDH1和IDH2，ASXL1和MLL1上的频发突变，影响了造血细胞的自我更新和/或分化能力，促进髓系细胞的转化，促进白血病的形成[1]。表观基因组在AML的发生中有重要的靶标性作用，它具有内在可塑性，通过特异性的酶、转录因子、与表观遗传机制相关的其他蛋白重新编码对表观遗传基因的修饰，为治疗提供了新的可能。

本文将描述表观遗传基因的失调是如何在AML中发挥作用的，同时强调目前和未来的治疗手段在发现新靶标上的多种尝试。此外，还将涉及AML中个体化的靶向治疗，包括术语的定义，适应证的相关描述以及临床实施的具体措施。

1 表观遗传学的针对性治疗

1.1 DNMT3A突变及DNMT抑制剂 DNA甲基化是表观遗传调控的重要组成部分，通常与转录沉默有关。在急性白血病中，已被确定多种肿瘤抑制基因的过甲基化与转录抑制通过增殖、分化和生存过程的失调导致白血病的发生[2]。来自MDS的DNA甲基化谱研究数据显示，抑癌基因的异常甲基化可能是驱动MDS进展为AML的主要机制[3]。胞嘧啶甲基化是指C5位的胞嘧啶残基被DNA甲基转移酶（DNMTs）催化，并生成C5甲基胞嘧啶（5-MC）的过程。基因组DNA甲基化是由DNMT3通过半甲基化的模板（从头甲基化）建立的，并由DNMT1全甲基化模式（维持甲基化）予以保持。这些过程使得不同的可遗传的DNA甲基化模式可以用来区分AML亚型、预测预后，并有潜力作为生物标志物来预测患者对治疗的反应[4]。AML要么普遍低甲基化，要么过甲基化，这提示表观遗传途径的过度和不足可能对白血病的发生都很重要[5]。数据表明，在白血病干细胞中，DNMT1可维持其DNA甲基化模式，并参与其自我更新的过程[6]。研究表明，DNMT3A在造血干细胞自我更新和分化过程中起着关键的作用。重要的是，DNMT3A的功能缺失性突变发生在30%的细胞遗传学正常的AML中，可能与临床预后较差有关，但AML的这些突变对于DNA胞嘧啶甲基化和转录的影响尚不清楚，且DNMT3A的单独缺失并不足以导致白血病形成[7]。大多数的突变涉及882位的精氨酸，在体外导致甲基转移酶活性的降低[8]。到目前为止，尚无特异性针对DNMT3A的靶向治疗。本节讨论的“表观遗传修饰的靶向治疗”指的是针对DNMT抑制剂的去甲基化治疗。

美国食品药品监督管理局（FDA）批准的2种DNMT抑制剂为：阿扎胞苷及其脱氧衍生物地西他滨。这两种药物均用于MDS的治疗，现在依据一些临床试验的结果，也普遍应用于AML的治疗。

在一项多中心Ⅱ期研究中，有227位初治AML患者接受了地西他滨治疗。每个疗程中静脉滴注地西他滨持续72 h，用量为135 mg/m2，间隔6周重复用药，共4个疗程[9]。该研究表明，总体有效率为26%，中位生存期为5.5个月，1年存活率为28%。在另一项多中心Ⅱ期临床试验中，给予55位60岁以上的AML患者静滴地西他滨治疗，每日用量为20 mg/m2，连续5 d给药，每4周为一疗程。结果，该试验中AML的完全缓解率为24%，中位生存时期为7.7个月。

在一项针对高危MDS（包括骨髓中原始细胞比例为20%～30%、根据WHO标准应列为AML）的临床试验中，给予患者阿扎胞苷治疗：每日用量为75 mg/m2，连续7 d皮下注射用药，28 d为一个疗程。与对照组（接受传统治疗方案）相比，阿扎胞苷组有明显的生存获益。而对于一些次要的评价指标而言，比如输血需求、静脉抗生素的使用和住院天数等，阿扎胞苷组有明显优势。与之类似的是，在法国的一项临床研究中，149名初治老年AML患者接受了相同剂量和疗程的氮杂胞苷治疗，总体有效率为33%，完全缓解率为23%，总体生存期为9.4个月[10]。对于接受了大剂量诱导化疗和异基因造血干细胞移植的AML患者，使用阿扎胞苷维持治疗可能会减少或延迟白血病的复发。

1.2 IDH1/2突变及IDH1/2抑制剂 DNA甲基化与同型二聚体酶IDH1/2催化的柠檬酸代谢有关，二聚体酶可催化异柠檬酸氧化脱羧成α-酮戊二酸（α-KG）。研究发现，有10%～30%正常核型的AML患者发生了IDH1/2功能突变，引起酶功能异常，导致2-羟基戊二酸（2-HG）的产生和积累。由于TET2和包含jumonji-c结构域家族的组蛋白赖氨酸去甲基化酶均依赖于α-KG，当机体发生IDH1/2突变，并积累2-HG，可导致DNA和组蛋白甲基化的增加[11]。IDH1/2突变对预后的影响研究得到了自相矛盾的结果，可能是因为突变位置的差异和（或）伴随其他基因的突变。例如，一项关于AML的随机临床试验表明，IDH2的第140位的精氨酸残基发生突变与良好的预后相关。不但如此，同时伴有NPM1和IDH1或IDH2突变的细胞遗传学正常的AML患者也有良好的受益，3年总生存率（OS）可高达89%。然而，IDH1/2和TET2突变是相互排斥的，但具有这两种不同的突变的AML患者具有相似的甲基化过程。

目前，一项早期临床试验正在进行，旨在研究IDH1/2抑制剂对发生了IDH1/2突变的AML患者的影响。这是一种针对IDH1/2突变酶的小分子靶向抑制剂，可减少2-HG的生成，诱导H3K9me3的脱甲基作用，并能增强相关分化基因的表达[12]。

1.3 MLL基因突变及DOT1L蛋白甲基转移酶抑制剂 MLL基因位于染色体11q23，编码H3K4甲基转移酶（HMT），该酶参与组蛋白的重构，影响HOX基因和Wnt信号通路[13]。有5%～7%的初发AML病例发生MLL重排，与不良预后相关[14]。MLL区域是染色体易位和重排的高发区，能产生多种融合蛋白，其中一些有致癌性。研究显示，MLL融合蛋白和DOT1L之g的作用导致了白血病的发生[15]。

已有研究表明，DOT1L HMT的酶活性诱导了存在MLL基因重排的AML的形成。DOT1L抑制剂可减少H3K79的甲基化和MLL融合基因的表达。目前，具有高度选择性的DOT1L抑制剂的研究已进入临床试验阶段，而选择性抑制HMT EZH2的强效抑制剂也正在研究中。

1.4 组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂 单独使用HDAC抑制剂治疗AML，其临床作用并不令人满意。因而，能否与DNMT抑制剂联合使用增强疗效，则备受期待。目前，诸多相关的临床试验正在开展当中，而且对多种HDAC抑制剂，包括丙戊酸、mocetinostat、帕比司他、伏立诺他等，与阿扎胞苷或地西他滨联合使用的疗效进行了评价，但结果并不如人意。在一项二期临床试验中，恩替诺特联合阿扎胞苷治疗AML并未提高疗效[16]。需要注意的是，与早期的体外试验采用序贯用药不同，此项试验中这两种药物是同时应用的。恩替诺特是一种强效的细胞周期抑制剂，可能会抑制阿扎胞苷的整合，导致脱甲基作用减弱。

1.5 赖氨酸乙酰化抑制剂 具有布罗莫结构域的蛋白质可识别组蛋白末端的赖氨酸残基，这种相互作用可被小分子抑制剂所抑制。当前，已开始对数种BET抑制剂进行临床试验。研究表明，BET抑制剂可抑制白血病干细胞和祖细胞增殖，并且可阻断MLL介导的白血病转化[17]。

1.6 赖氨酸去甲基化酶抑制剂 研究结果显示，KDM1A/LSD1在体外可有效抑制AML细胞系和原代白血病细胞。在联合使用HDAC抑制剂和全反式维甲酸时，这种抑制作用更显著。研究表明，MLL白血病受其影响最大，AML的其他亚型和其他髓系肿瘤也对之敏感[18]。

2 表观遗传学发展在AML靶向治疗方面的挑战

2.1 靶向治疗的治疗靶点 AML在发生、发展过程中有一系列的异常表现，就疾病本身而言，有许多方面的异常可以进行针对性的治疗，包括表观遗传途径的调节、基因突变、细胞表型、信号转导通路、白血病干细胞和骨髓微环境等。最近有关AML克隆构型的研究表明，AML克隆异质性始终伴随着疾病的进展及复发[19]。因而，AML的治疗靶点是不断变化着的，在疾病的不同时期需用不同的药物进行治疗。有关初发AML克隆构型的研究显示，在基因层面界定的白血病亚克隆和白血病干细胞之间具有明显的功能异质性[20]。目前的挑战是明确和清除所有的克隆，而非以往那样狭隘地认为，靶向治疗的关键就是应用某种方法，通过单向靶点来消除优势克隆。

2.2 靶向治疗的对象 如何选择靶向治疗的对象是一个比较重要的问题。根据不同的分类方法，AML患者可划分为不同的亚群，但这样的分类方法均有各自的优点和不足之处。

AML患者也可以根据预后进行分类。在过去，对新药的早期试验通常在复发和难治病例中进行，显而易见，这是一种很令人困惑的试验模式。由于复发或难治AML病例与初发病例在生物学上和临床上是不同的，因而对初发病例作新药研究十分重要。可以根据细胞遗传学、分子遗传学和表观遗传学数据，对初诊患者进行风险评估并预先判断其治疗效果的优劣。例如，一项研究表明，在不同的甲基化区域，有高水平甲基化的7个基因其低表达具有更好的临床结果[21]。目前认为，在临床研究中，靶向治疗的对象应该是那些预后可能不良的初发AML病例。

2.3 靶向治疗的时机 临床上通常将AML治疗分为诱导、巩固和缓解后治疗。临床研究表明，把针对表观遗传学调控的靶向药物与其他药物联合使用，结果比单一用药效果更好。因此，已考虑将试验新药添加到主流的诱导方案当中来。多年来有关AML治疗的临床实践表明，尚无哪一种化疗方案更优于阿糖胞苷联合蒽环类药物的“7+3”经典方案的，所以应把该方案作为主要的诱导方案，新药可以添加于此或者作为单药评估其疗效。这样，纳入临床试验的初治患者将会接受其一进行治疗。

各种证据表明，诱导后残留的白血病细胞与治疗前的肿瘤细胞在生物学上是有区别的。因此，临床上重复应用同一治疗方案并不合理。研究表明，表观遗传学靶向治疗在AML完全缓解后或移植后，或可控制白血病克隆的演变。目前，多数靶向治疗药物是非细胞毒性的，对低负荷白血病而言，治疗成功的可能性更大。当然，还需要更多的AML患者参与到临床试验中来，进行新型药物的有效性验证。

2.4 靶向治疗的有效性评价 表观遗传学靶向治疗一般需要长达几周甚至几月的时间方显成效。此外，基于形态学和免疫表型的分析方法并不能有效评价靶向治疗的疗效。因而，可以凭借DNA甲基化特征、基因表达谱、高光谱测定法以及其他技术手段来做生物学标志的鉴定，通过生物学标志能充分预测疗效，并提高疾病监控能力。然而，在当前临床实践中，尚未能常规使用此类表观遗传学的生物学标志。

3 展望

随着对AML表观遗传修饰基因突变的认识的深入，人们发现表观遗传学在AML生物学发生中起着复杂而重要的作用。AML的表观遗传学靶向治疗策略已经改变了临床应用，AML患者的个体化靶向治疗将成为现实。然而，现实中还面临着诸多挑战，其中最大的挑战就是AML生物学和患者本身的高度异质性。只有通过创新性的临床试验、可靠的科学研究和医患的共同参与等努力，才可能真正实现AML患者的个体化治疗。

⒖嘉南

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第4篇：表观遗传学主要研究范文

【关键词】恶性肿瘤；表观遗传；甲基化；基因印记；微小RNA；组蛋白

【中图分类号】R730.5 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）04-0017-02

随着近年来分子生物学研究的不断发展，人们已经认识到恶性肿瘤的遗传和表观遗传的因素综合作用导致了恶性肿瘤的发生。在分子水平上对于恶性肿瘤的研究发现几乎所有肿瘤都能找到表观遗传水平的异常。恶性肿瘤的发生机制的研究对于早期诊断、治疗以及提高生存率有极其重大的意义。

1.恶性肿瘤细胞的生物学性状及特点

肿瘤是一种多基因，经历多步骤突变所引起的细胞克隆性疾病，具有以下生物学特性：①分化不好，异型性大。②核分裂象多，可见病理性核分裂象。③生长速度较快。④浸润性或外生性生长。⑤常见出血、坏死、、溃疡形成等继发改变。⑥对机体的影响较大，破坏原发部位和转移部位的组织；坏死、出血，合并感染和恶病质也常发。

2.肿瘤的发生与表观遗传

传统遗传学认为肿瘤是多基因参与的疾病，通常是2个/2个以上癌/抑癌基因参与按一定方式组合的多基因、经历多步骤突变所引起的细胞克隆性退化性疾病。主要基因：缺失、重排、断裂、突变等。基因改变的结果就是原癌基因激活，抑癌基因失活，如结肠癌相关基因：APC，RAS，P53，DCC.脑胶质瘤相关基因：P53，Interferons，MTS1，MTS2，EGFR，肺癌相关基因：RAS，c-myc，Rb，P53等。

近期的研究表明，在相当一部分肿瘤患者的癌细胞中，其主要的基因是完整的，并没有发现任何的变异，突变和缺失等，这些事实就提示我们重新思考恶性肿瘤的发生机制，是不是有什么比基因改变更为重要的因素导致了正常细胞的恶变。随着后基因时代的到来和日益发展，人们越来越深刻的认识到，生物体除了具有编码遗传信息外，还存在大量隐藏在DNA序列之中或之外的遗传信息，这些非编码RNA、DNA甲基化和组蛋白共价修饰系统共同构成的组蛋白密码等，统称为表观遗传学信息 [1]。 此种遗传方式称为表观遗传方式，而研究表观遗传方式的学科称之为表观遗传学[2]。表观遗传有三个特点①可遗传性；②可逆的基因表达调节；③没有DNA序列的变化或者不能用DNA序列变化来解释。表观遗传的研究的具体内容主要包括：DNA甲基化、基因印记、DNA甲基化与转座子的稳定性、组蛋白共价修饰、染色质重塑、假基因、基因组中的非编码RNA、微小RNA、反义RNA、内含子、核糖开关。

2.1 DNA甲基化

对于不同肿瘤细胞的DNA分析表明，恶性肿瘤细胞中出现基因突变的概率要大大低于预期[3]而在转录组范围内检测结肠直肠癌中由启动子高甲基化引起的基因表达的抑制，发现高达5%的已知基因在肿瘤细胞中发生了异常的启动子高甲基化[4]。因此我们可以推测，与基因突变相比，DNA甲基化改变在细胞恶变过程中可能发挥了更大的作用。

众所周知，p53基因是一个重要的抑癌基因，对于畸变、损伤的细胞可引发其凋亡程序，使细胞发生凋亡，50%的恶性肿瘤中存在p53基因的沉默失活[5]。p53基因编码区的甲基化状态很容易发生脱氨基作用而发生5mCT的转换。同时，INK4a/ARF基因启动子区域的甲基化可以使p14ARF 表达下降，导致原来受p14ARF 抑制的MDM2表达上升，从而结合p53并使其发生蛋白质水平的讲解，进而帮助细胞逃避p53引起的细胞凋亡[6]。近年来研究结果表明，肝癌细胞中端粒酶阳性率高达84%，明显高于癌旁组织、肝硬变组织及慢性肝炎组织，而正常肝脏组织没有端粒酶活性。端粒酶的重要成分人端粒酶逆转录酶（hTERT）的活性与端粒酶活性高度相关。次研究中的肝细胞系L02中hTERT启动子有甲基化修饰，其mRNA低水平表达，经5’-aza-dC去甲基化处理，hTERT mRNA可被上调，端粒酶活性也随之上升，其mRNA高表达亦不受5’-aza-dC影响[7]。由此我们可以认为hTERT mRNA的低表达与启动子甲基化修饰相关，从而导致恶性肿瘤的无限复制。钙结合蛋白（S100A4）是S100A家族中的一个成员，在结肠，胃，胰腺，乳腺等恶性肿瘤中呈现高表达，并与肿瘤细胞的侵袭，转移以及不良的预后有关，它能调控产生降解细胞外基质的酶，有利于细胞的运动侵袭扩散，是单个的恶变细胞穿过细胞外基质转移到毛细血管和淋巴道。Xie R等研究表明，在子宫内膜中，S100A4过表达时由于启动子区低甲基化造成的[8]。位于线粒体的BCL-2相关蛋白BNIP3，也是一个凋亡因子，可诱使缺氧损伤的细胞凋亡，但是BNIP3的启动子区域也包含有CpG岛，发生恶性变的细胞BNIP3启动子区高甲基化会引起该基因的沉默，那么细胞液就可以逃避缺氧时的凋亡[9]。

2.2 组蛋白

组蛋白甲基化的失平衡与人类许多肿瘤相关，比如常见的乳腺癌、前列腺癌、肝癌等。失平衡的出现导致与这些恶性肿瘤相关的抑癌基因或者癌基因平衡的改变。众所周知，EB病毒感染与鼻咽癌及Burkitt淋巴瘤的发生息息相关，其中EBNA2是EB病毒的核心抗原之一，LMP1（潜伏期膜蛋白1）是已确认的EB病毒编码蛋白，有促癌的作用，二者在EB病毒相关的鼻咽癌及Burkitt淋巴瘤的发生中，主要在原始B淋巴细胞的分化和增殖过程中起作用。而最近的研究表明，组蛋白的甲基化的改变可导致EBNA2和LMP1基因转录能力的异常，从而影响EB病毒感染潜伏期细胞的致癌潜能。Chau等研究发现，EB病毒Ⅰ期潜伏期细胞中的H3K9高甲基化导致EBNA2和LMP1基因转录的抑制，致使其致癌能力下降。而H3K4的甲基化导致EBNA2和LMP1基因转录的激活，使得EB病毒Ⅲ期潜伏细胞致癌潜能提高。组蛋白去乙酰化酶能取出赖氨酸残基上的乙酰基，是基因表达沉默，由此可见组蛋白的异常去乙酰化可能源于乙酰化酶特异性下降.故组蛋白去乙酰化酶的改变引起组蛋白活性的改变从而导致基因表达的沉默，如果这个沉默基因是抑癌基因，那么就会引起恶性肿瘤的发生.

2.3 基因印记

H19是位于人11p15.5染色体区域的印记型基因，可能是一种与肿瘤发生呈负相关的基因。11p15.5是人类最大的基因基因簇集区域之一，近年来的研究表明H19与肾母细胞瘤、胚胎性横纹肌肉瘤呈现负相关[10]。 并且H19基因在高分化侵袭力弱的肿瘤细胞中不表达，而在低分化高侵袭力的肿瘤细胞中大量表达。葡萄胎中当H19基因丢失会增加恶性倾向的的发生机率[11]。Li[12] 报道了肝癌和肝胚胎瘤都有IGF2的启动子和LOI（Loss of Imprinting）的表达异常。IGF2在我们人类有四个启动子，其中启动子Ⅰ是非印记基因，主要是启动非等位基因的表达，例如人肝脏IGF2的表达。而启动子Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ是印记化基因，可以启动单等位基因的表达，主要在胚胎期具有活性。如果成年肝脏出现P2、P3和P4的激活表达，并且伴随LOI的出现，则与肝癌的发生密不可分。如果胚胎期的IGF2发生了LOI则大大提高了发生肝胚胎细胞瘤的可能性。由此可见基因印记的发生与其发育的不同阶段对于肿瘤类型以及发生有不同的影响，也就是具有发育阶段的特异性。

2.4 微小RNA

Yanaihara等[13]研究发现，肺癌肿瘤细胞与正常细胞比较有43种微小RNA的差异，28种表达下降，15种表达上升，这些变化的微小RNA大部分处于基因的缺失、扩增、转位的高发区域。其中49%的微小RNA在复发的和没有复发的非小细胞肺癌中出现表达差异。由此我们可知，特殊的微小RNA表达谱可以预测肺癌的预后情况。马兆龙等[14] 利用实时定量PCR及微小RNA芯片技术检测乙肝病毒相关性肝癌组织、乙肝肝硬化组织、人类正常肝脏细胞中的微小RNA表达谱的差异，发现乙肝相关性肝癌组织、乙肝肝硬化组织两者与正常的肝细胞的微小RNA相比较，前两者的表达超过正常2倍的微小RNA有6个，下调超过2倍的微小RNA有8个。与正常肝细胞相比有明显差异的微小RNA，在乙肝肝硬化和乙肝病毒相关肝癌中在表达量上无明显差别。故推测微小RNA表达的出现可能表明了这一病理进程：乙肝病毒感染肝硬化肝癌的必然进程，而微小RNA的表达的出现是此进程的使动因素。Kota等[15]研究表明，恢复在肝细胞肝癌中表达下调的微小RNA的表达水平可以抑制肿瘤的进一步发展。由此进一步证实了，微小RNA在恶性肿瘤发生中的重要作用

3.结语

综上所述，DNA甲基化、组蛋白、基因印记、微小RNA等表观遗传修饰的异常在恶性肿瘤发生、发展中有着不可或缺的作用。由此我们可以据此对恶性肿瘤的早期诊断，治疗以及预后的判断。由于部分表观遗传修饰的可逆性，对于恶性肿瘤的治疗，一些甲基化转移酶抑制剂和去乙酰化抑制剂在临床中的良好的治疗效果，要求我们对于各种表观遗传修饰与肿瘤病因之间关系仍需要进行深入研究，从而明确肿瘤发生过程中的重要靶标.更好的做好早期筛查和诊断，以及治疗，为此更好地为恶性肿瘤的诊断治疗提供更好的理论基础途径。我们相信，随着表观遗传学以及恶性肿瘤等相关学科的深入研究，表观遗传修饰将成为恶性肿瘤筛查，早期诊断以及靶向治疗提供新的科研途径。

参考文献：

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第5篇：表观遗传学主要研究范文

随着对白血病发病机制的深入研究及其治疗方案的改进,白血病的完全缓解率也有明显的提高,但仍有一部分患者最终会复发。近年来的研究发现, 白血病的复发与微小残留病密切相关。微小残留病(minimal residual disease, MRD )是指经过诱导治疗达临床缓解时，白血病患者体内残留的少量白血病细胞。对患者进行微小残留病监测对白血病的治疗和预后判断具有非常重要的意义。检测MRD的关键是寻找分子基因标志。细胞免疫表型及遗传学的异常改变在急性白血病MRD 检测中占有重要地位。令人遗憾的是，这些方法只适用于少数患者，大多数患者并不具备遗传学的预后指标。随着对急性白血病分子生物学发病机制研究的进步，人们把急性白血病的发生归结为抑癌基因和原癌基因通过遗传学和表观遗传学机制的发生异常改变［1］。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制，其与肿瘤发生、发展以及检测相关机制的研究逐步成为研究的热点。表观遗传学生物标记（Epigenetic biomarkers），特别是DNA 甲基化相关标记检测拥有遗传学标记、抗体等标志不具备的优势。本文就MRD细胞分子遗传学的检测方法及DNA甲基化检测MRD的临床应用进行综述。

1 常用白血病MRD检测方法的研究进展

1.1 分子生物学方法：遗传学的改变，包括染色体易位/缺失、基因突变等是白血病发生的基础，其所导致的正常基因表达调控紊乱和功能异常是白血病发生的主要原因。异常的遗传学改变，已成为急性白血病临床检验资料的重要组成部分。

实时定量聚合酶链反应( RQ-PCR ) 方法结合了PCR和荧光探针两种技术，通过定量检测白血病细胞中标志性基因实时观测MRD，是目前检测MRD最为敏感的方法，灵敏度可达10-4-10-5，已成为临床实验室建立MRD检测方法的首选。其检测的基因标志包括：（1）染色体异位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 细胞受体（T-cell receptor ，TCR）重排等，常见的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表达增高的肿瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）发生突变的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病发展过程中比较稳定,以其作为PCR检测MRD的分子标志具有特异性强、敏感度高的优点［2］。但是这些检查不仅价格昂贵，其检测的标本为RNA，存在不易保存，结果不稳定的缺点。更令人遗憾的是,由于白血病是一组异质性很大的恶性血液病，各亚型之间遗传背景不同，这些遗传学基因标志只能覆盖1/3的白血病类型，还有2/3类型的白血病不具备遗传学基因标志，无法在临床上进行MRD的检测。即使联合应用多种基因仍有40%～50%的患者无法找到适当的基因标志检测MRD，使其疾病状态缺乏准确的判断依据。

1.2流式细胞术( FCM)：FCM是通过检测在正常细胞上不表达或低表达而在白血病细胞上表达或高表达的白血病相关免疫表型来定量检测MRD，能够准确定量残留白血病细胞数，并且还能了解残留白血病细胞的凋亡情况［3］。其优势是每秒可检测5 000～10 000个细胞,并能用计算机记录处理,快速地对各个细胞进行多参数定量分析,灵敏度达到10- 4。但应用此法必须要对患者初发时的免疫表型特征有详尽了解,以便选择适当的标志检测MRD。因为白血病细胞与正常细胞相比, 通常低达10- 5～10- 6, 可能低于FCM检测范围而使这种方法缺乏特异性; 而且随着病程发展, 细胞表面的抗原发生改变, 会导致假阴性结果。

2 异常DNA甲基化检测白血病MRD的临床研究进展

DNA甲基化是指在DNA序列不变的情况下，通过影响基因转录活性以调控基因的表达。DNA甲基化作为一种表观遗传学改变与白血病的发生密切相关，在不改变遗传信息的前提下导致细胞遗传特性改变，作为肿瘤性疾病"二次打击"经典假说的重要补充，已成为白血病研究的新热点。DNA异常高甲基化导致抑癌基因的失活在白血病发生发展、诊断、监测微小残留病、预测病情以及指导治疗方面都有重要作用，这些表观遗传学标志作为MRD监测标志物的临床研究逐渐引起大家的关注。

P15基因甲基化与白血病的关系目前研究最为深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者发生p15基因高甲基化，且持续p15基因高甲基化预示疾病复发。与p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明显延长（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。

Au等［5］检测了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在发展为治疗相关的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早为两年前。提示pl5甲基化发生在t-MDS/AMI 早期，检测p15甲基化有助于判断预后、指导治疗。在一组65例急性早幼粒细胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年无病生存率仅为29．64％ ，显著低于34例无甲基化的患者79%。p15基因甲基化与预后不良相关。

Id4和zo-1是我室新发现的两个血液系统相关候选基因，并对其在白血病发生、复发中的作用及应用于MRD检测进行了系列基础与临床研究。

采用MS-PCR的方法对完全缓解期白血病患者骨髓标本检测id4基因甲基化状态，结果发现：（1）58例完全缓解的急性白血病人MRD的检出率为41%，MRD阳性的患者12个月内复发率为62.5%，而非甲基化的患者12个月内复发率仅为10%。（2）16例异基因外周血干细胞移植后的白血病患者中，5例检测到MRD的患者中有4例在1年的随访期出现复发，而11例移植后MRD持续阴性的患者无一例复发。

研究对26例完全缓解的急性白血病患者进行zo-1基因甲基化检测，MRD检出率为34.6%，MRD阳性的患者12个月内复发率为57.1%，而非甲基化的患者12个月内复发率仅为15.4%，MRD阳性病人复发率明显高于阴性者。Id4和zo-1基因甲基化检测可能成为急性白血病新的生物标记用于预测疾病的预后以及复发。

随着PCR 技术的进步，将实时定量PCR（real-time PCR）与MSP 结合提高了甲基化分析检测的特异性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR为MRD检测开辟了另一种解决方法。甲基化定量水平的变化对于细胞修复、肿瘤预后、肿瘤化疗后的耐药等提供了新的研究指标，可以从另一个层面上揭示其发生机制。因此，甲基化定量PCR技术被应用与临床各领域的研究。

Shuchi等［6］以启动子区高甲基化状态的雌激素受体α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做为MRD标志，采用定量甲基化特异性PCR对180例急性白血病患者骨髓标本进行检测，结果发现：（1）临床缓解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因启动子区呈现高甲基化状态的患者较低甲基化状态的患者有更高的复发风险，而且ER-α和p15INT4B基因启动子区甲基化水平的增高与患者无病生存期（disease free survival,DFS）缩短有明显相关性。（2）对5名儿童ALL患者ER-α基因启动子区甲基化程度进行了自诱导缓解后的追踪检测，结果提示疾病复发状态较缓解状态ER-α基因启动子甲基化水平增加。其结果与目前常用的MRD监测标志TCR/免疫球蛋白重排水平结果基本一致。

另一研究以启动子区高甲基化状态的p73、p15、p57KIP2基因为MRD标志，通过对199例Ph染色体和MLL阴性的处于完全缓解状态（complete remission,CR）的成人ALL标本进行定量甲基化特异性PCR检测，研究结果提示p73基因启动子区甲基化水平与第一次CR持续时间及无病生存期（DFS）及总生存期（overall survival, OS）缩短间有显著相关性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR检测有可能成为一种评估急性白血病复发风险及MRD检测的有效手段。

结语

白血病作为一种恶性肿瘤，复发是影响其患者生存的主要问题。患者体内白血病微量残留病是复发的主要根源，对患者进行微量残留病监测在白血病的治疗和预后判断中具有非常重要的意义。遗憾的是，由于绝大多数患者缺乏明确的遗传标记作为早期检测和准确评估MRD的标志，在临床上常因治疗不足导致疾病复发或治疗过度引起严重并发症，绝大多数患者在发病后1~3年内死亡。因此，要在白血病MRD早期检测和指导治疗上有所突破，就必须寻找能够早期诊断白血病MRD的特异性强、通用性好的分子标志物。DNA 甲基化作为肿瘤相关标记，与遗传学标记、细胞表面抗体等标志具有更多的优势。首先，临床常规的肿瘤标记检测以蛋白或者RNA为对象，必须采集新鲜样本以确定检测结果的准确性。而甲基化检测则以DNA 为样本，很容易从各种体液中，甚至石蜡包埋组织中得到，极大地扩展了研究资源。其次，甲基化以DNA作为研究对象，较RNA 和蛋白更稳定，更容易保存。进而保证了检测结果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的变化对于肿瘤预后、肿瘤化疗后的耐药等提供了新的研究指标，可以从另一个层面上揭示其发生机制。

参考文献

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第6篇：表观遗传学主要研究范文

龄成为可能。作为表观遗传学重要组成部分的dna甲基化，在机体生长、发育、衰老的过程中存在着动态变化过程．通过

检测dna甲基化改变，有望构建与之相关的年龄变化模式，用以推断个体年龄。本文着重介绍dna甲基化水平的改变与

个体年龄的相关性及其在判断个体年龄方面的前景。

【关键词】法医物证；dna甲基化；年龄推断；生物体衰老

【中图分类号】d9l9．2

【文献标识码】a

【文章编号】1007—9297(20__)04—0284—05

当前在法医学实践中，对个体年龄的推断主要是

依据人类学方法测量骨骼、牙齿等一些具有年龄相关

性的检材．并根据相关模型进行计算。分子生物学的

飞速发展，开拓了人们的视野。借助于分子生物学理

论和方法．在细胞水平、分子水平发现一些可能与年

龄相关的遗传学改变，如dna损伤修复能力、端粒的

长度、线粒体片段的缺失、dna甲基化水平、b一半乳糖

苷酶活性以及基因表达谱等。lll dna甲基化是表观遗

传学(epigenetics)的重要组成部分，在维持正常细胞

功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重

要作用．在衰老的过程中某些细胞会发生年龄相关的

变化，121例如某个cpg岛的从头甲基化会关闭一个基

因，使这个基因相关的生理功能丧失：同样。甲基化的

丢失也会激活正常情况下沉默的基因．造成不恰当的

异位表达(ectopic expression)。必须指出，表观遗传研

究丝毫没有降低遗传学或基因组学的重要性，恰恰相

反，表观遗传学是在以孟德尔式遗传为理论基石的经

典遗传学和分子遗传学母体中孕育的专门研究基因功

能实现的一种特殊机制的遗传学分支学科。认识到表

观基因组在发育、生长和衰老过程中存在着一个动态

变化的过程，以及体细胞的表观基因组有重新编程的

可能性，有助于我们以新的观点来探索衰老的机制，构

建年龄变化的模式。本文就dna甲基化与个体年龄的

相关性及其在判断个体年龄方面的前景进行探讨。

一

、概述

(一)表观遗传学和dna甲基化

遗传学是与表观遗传学(genetic)相对应的概念。

遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变

化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而

表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表

达水平变化，如dna甲基化和染色质构象变化等：表

观基因组学(epigenomics)~0是在基因组水平上对表观

遗传学改变的研究。甲基化是最重要的表观遗传修饰

形式。dna甲基化是生物体在dna甲基化转移酶

(dnmts)的作用下，以s一腺苷酰一l一甲硫氨酸(sam)

为甲基供体，将甲基转移到特定碱基上去的过程，

dna甲基化多发生在胞嘧啶，大多在一cpg一序列上。

胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶(5-methylcytosine．

5-mc)。这种dna修饰方式并没有改变基因序列。但

它调控了基因的表达。

哺乳动物中．cpg序列在基因组中出现的频率仅

有l％，远低于基因组中的其他核苷酸序列。但在基因

组的某些区域中，cpg序列密度很高，可以达均值的5

倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区．形成所谓

cpg岛。通常cpg岛大约含有500多个碱基。在哺乳

动物基因组中约有4万个cpg岛，而且只有cpg岛

的胞嘧啶能够被甲基化，cpg岛通常位于基因的启动

子区或是第一个外显子区 。人类基因组中大小为

100～l 000 bp左右且富含cpg二核苷酸的cpg岛总

是处于未甲基化状态．并且与56％的人类基因组编码

基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明，人类

基因组cpg岛约为45 000个．大部分染色体每1 mb

就有5—15个cpg岛。平均值为每mb含lo．5个cpg

岛，cpg岛的数目与基因密度有良好的对应关系。健

康人基因组中．cpg岛中的cpg位点通常是处于非甲

基化状态，而在cpg岛外的cpg位点则通常足甲基化的。这种

甲基化的形式在细胞分裂的过程中能够稳定的保留。阁基因

调控元件(如启动子)所含cpg岛中的5-mc会阻碍

[作者简介]李鑫(1974一)，男，山东淄博人，主检法医师，硕士研究生，主要从事法医遗传学研究。

法律与医学杂志20__年第l3卷(第4期)

转录因子复合体与dna的结合，所以dna甲基化一

般与基因沉默(gene silence)相关联；而去甲基化

(demethylation)往往与一个沉默基因的重新激活(re．

activation)相关联。当机体衰老或呈病理状态，特别是

肿瘤发生时，抑癌基因cpg岛以外的cpg序列非甲

基化程度增加，而cpg岛中的cpg则呈高度甲基化，

以至于染色体螺旋程度增加及抑癌基因表达的丢失。

一般说来，dna的甲基化对维持染色体的结构、x染

色体的失活、基因印记和肿瘤的发生发展都起重要的

作用。【6】

(二)dna甲基化的生物作用及特点

1．dna甲基化与基因表达

dna甲基化在维持正常细胞功能、遗传印记、胚

胎发育过程以及衰老过程中起着极其重要的作用。研

究表明胚胎的正常发育得益于基因组dna适当的甲

基化。例如：缺少任何一种甲基转移酶对小鼠胚胎的

发育都是致死性的。[31此外，等位基因的抑制被印记控

制区(icrs)所调控，该区域在双亲中的一个等位基因

是甲基化的。17]印记基因的异常表达可以引发伴有突

变和表型缺陷的多种人类疾病。甲基化抑制基因转录

主要通过以下机制来实现。

(1)直接抑制。cpg岛甲基化真接干扰tf与调控

区dna 的结合． 例如camp反应元件结合蛋白

(creb)，ap一2，e2f，nfkb等tf不能与相应的dna

位点相结合。但有些tf如sp1，ctf与甲基化和非甲

基化位点都能结合，这表明甲基化单独不足以阻止体

内tf与dna相结合。

(2)间接机制。近年来发现一些甲基化dna结合

蛋白如mdbp1，mdb2以及甲基化cpg结合蛋白如

mecp1，mecp2与甲基化dna特异结合，抑制基因转

录。其介导转录抑制的程度取决于甲基化密度和启动

子的强度。如低密度甲基化可完全抑制一些弱的启动

子，但对强的启动子则收效甚微。

(3)dna甲基化还可通过影响染色体结构来抑制

转录。不仅甲基化启动子区形成的核小体抑制体外起

始转录，而且mecp1与甲基化启动子cpg位点结合

后，可引起染色质聚缩成非活性高级结构，以至于转

录因子不能与其相结合，从而抑制转录。

dna甲基化状态并非固定不变．在许多哺乳动物

组织内，基因组甲基脱氧胞嘧啶水平随老化而下降，

在鲑鱼、小鼠、大鼠、牛与人类的脑、肝脏、大肠粘膜、

心脏和脾脏内发现dna脱甲基化作用。相反，大鼠肺

则不发生脱甲基化，大鼠。肾内甲基脱氧胞苷总含量增

加。这说明甲基化状态随老化而变化，即发生甲基化

· 285 ·

和脱甲基化，但总的说来，最常见的变化似乎是进行

性的脱甲基化。这些变化均可导致随老化而发生的基

因表达变化。

2．dna甲基化与肿瘤的关系

研究表明，dna甲基化在肿瘤的发生、发展中起

重要作用。甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要

因素，这种变化包括dna甲基化总体水平降低和启

动子等基因表达调控元件附近的cpg岛局部甲基化

水平的异常升高，从而导致基因组的不稳定(如染色

体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表

达)和抑癌基因的不表达。如果抑癌基因中有活性的

等位基因失活，则发生癌症的几率提高，例如：胰岛素

样生长因子一2(igf一2)基因印记丢失导致多种肿瘤，

如wilm‘s瘤。【8j

3．dna甲基化与基因印记

基因组印记是性细胞系的一种表观遗传修饰，这

种修饰有一整套分布于染色体不同部位的印记中心

来协调。印记中心直接介导了印记标记的建立及其在

发育全过程中的维持和传递，并导致以亲本来源特异

性方式优先表达两个亲本等位基因中的一个．而使另

一个沉默。基因组印记是可遗传的，dna的甲基化在

基因组印记的分子机理中充当重要角色。dna高甲基

化是一个基因印记抑制信号，dna甲基化对控制印记

基因中父子和母子等位基因的不同表达具有重要作

用。[91

4．人类基因组dna甲基化的特点

dna甲基化的基本特征有：1)数量多、信息容量

大；2)可遗传性：有丝分裂时分化细胞可以稳定地将

甲基化模式传递给子代细胞：3)相对稳定性，即在体

内．内外环境短时间变化不会引起细胞基因组甲基化

谱的改变；4)与snp标记毗邻，提供不同层次信息，相

互补充。人类基因组dna甲基化还有自身特点。

(1)时空特异性。dna甲基化是记录细胞分化历

史、维持组织特异性基因表达的主要机制之一。有学

者认为，dna甲基化可能使分化细胞基因组重新编

程，通过dna 甲基化来控制基因的时空表达，调节发

育过程和各种生理反应。在不同组织或同一类型细胞

的不同发育阶段，基因组dna上各cpg位点甲基化

状态的差异构成基因组dna甲基化谱。组织特异的

dna甲基化谱是哺乳动物基因组的一个显著特征。

细胞之间dna甲基化模式的差异是在个体发育

的过程中逐步形成的，并在以后的有丝分裂中保持不

变。在胚胎发育过程中，细胞的甲基化模式按一定方向

发生有规律地变化。成年个体，组织特异性基因形成组

· 286 ·

织特异性的甲基化模式。随着年龄增长，基因组dna甲

基化总体水平不断下降．特定dna片断的甲基化程度

可以增高或降低。取决于组织细胞和基因种类。

(2)亲缘特异性。在某些基因座，所有组织体细胞

都选择性地将亲代一方的等位基因甲基化．呈现亲缘

依赖的等位基因甲基化模式。

(3)病理特异性。在病理状态下，组织细胞的dna

甲基化谱发生特异性的改变。dna甲基化改变在许多

肿瘤的发生发展过程中发挥重要的作用。目前证实，启

动子高甲基化是肿瘤抑制基因第三种常见的失活途径。

二、dna甲基化与年龄相关性

分化细胞的稳定性是高等生物的基本特征之一。

然而，在衰老过程中某些细胞会发生年龄相关的变

化。例如，某种cpg岛的从头甲基化会关闭一个基因，

丧失与这个基因相关的生理功能；同样．甲基化的丧

失也会激活正常情况下沉默的基因，造成不恰当的异

位表达。2o世纪8o年代初，wilson等测定了体外培养

的人、田鼠及小鼠成纤维细胞dna的5 甲基胞嘧啶

含量，发现均随细胞分裂次数的增加而降低．且下降

速度以人、田鼠、小鼠的次序递减．而永生化细胞系的

5 甲基胞嘧啶含量则保持相对稳定。以dna甲基化

酶抑制剂5 氮杂胞苷或5 氮脱氧胞苷处理人二倍

体成纤维细胞或某些肿瘤细胞，可使其增殖能力下

降，体外培养寿限缩短。因此，dna甲基化水平也可以

作为细胞分裂的“计时器”。体内实验同样发现基因组

整体甲基化水平有随龄降低的趋势。

在基因组整体甲基化水平降低的同时，衰老过程

中也伴有个别基因甲基化水平增高的现象。最早证明

与年龄相关启动子cpg岛的甲基化是人结肠组织雌

激素受体(estrogen receptor，er)基因，年轻个体中，几

乎检测不到er基因的甲基化，以后，随龄逐渐升高。

另外。胰岛索样生长因子2(insulinlike growth facror，

igf2)、肌原调节蛋白myod1、体觉诱发电位组分

n33基因启动子cpg岛的甲基化水平在正常的结肠

组织中同样随龄升高。tra等用限制性界标基因组扫

描技术对t淋巴细胞20__个基因座的甲基化年龄变

化情况进行了调查，发现29个基因座有变化，其中23

个增加，6个降低。也许．这些特定基因的甲基化是更

好的衰老生物学标志。

陈培利等_10]利用人胚肺二倍体成纤维细胞(hu

man fetal lung diploid fibroblasts。2bs)进行体外培养。

发现其p16基因启动子区及外显子i处的dna甲基

化水平随个体细胞代龄的增加而降低。他们首先将

2bs细胞在体外作常规传代培养(规定3o代龄以内为

法律与医学杂志20__年第l3卷(第4期)

年轻细胞，55代龄以上为衰老细胞，在31至54代龄

之问位中年细胞)。然后用有机法提取细胞dna，取各

组dna各llxg加入sinai约40u，25~c酶切过夜(smai

不具备甲基化修饰作用)。然后对p16基因外显子i

及13-actin进行pcr扩增。

ll 二| ’。_ lll

l | _ __⋯一_l＼

‘l ＼_ _l’ _li ＼

_l＼ il 、

l i、

4 _ li 0_ _l

年轻细胞中年j田胞老年细胞

围1不同代龄2bs细胞p16外显于pcr扩增条带的吸光度扫描值【’。

寰1 不同代龄2bs细胞pl6外丑于l殛i~-actinpcr扩增条带的吸

光度扫描值

组别 n

沣：#以b—actin的值校正后结果；t检验，与年轻细胞相比， p<o．05

实验结果(参见表1)表明，不同代龄2bs细胞

p16基因外显子i上的扩增产物均低于相对的未酶切

的b—actin对照组，且其dna甲基化水平随代龄的增

加而趋于降低，在年轻细胞中甲基化水平约为64％．

而在衰老细胞中仅为24％，降低约40％。在之后的研

究中，陈培利等在以2bs为模型的衰老研究中发现，

细胞分裂一次端区(即端粒)缩短50bp，抑制dna甲

基化则可导致细胞早衰。⋯】他们测定了去甲基化处理

后的2bs细胞的端区长度．研究表明老年2bs细胞衰

老表型更加明显，端区长度较对照细胞缩短，而年轻

细胞则变化不显著。从而推断甲基化的改变可以影响

染色质的构象，从而可能改变端区结合蛋白与dna

的作用l1 1，后者可以进一步引起端区长度改变。

三、dna 甲基化检测方法

随着对甲基化研究的不断深入，各种各样甲基化

检测方法被开发出来以满足不同类型研究的要求。

dna甲基化可以从甲基化含量、甲基化水平、甲基化

模式和甲基化图谱分析等多种途径进行分析。甲基化

含量分析5mc在基因组中所占的总体比例：甲基化水

2 1 8 6 4 2 0

l n n

璎辍 越

法律与医学杂志20__年第13卷(第4期)

平分析单个cpg胞嘧啶甲基化的发生率，若同时分析

多个cpg位点，则可以制作甲基化水平图谱；甲基化模

式分析一段单链dna上一组cpg的甲基化状态组合。

根据研究目的，甲基化检测方法分为：基因组整体水平

的甲基化检测，特异位点甲基化的检测和寻找新甲基化

位点。从研究所用的处理方法不同分为：基于pcr的甲

基化分析方法；基于限制性内切酶的甲基化分析方法；

基于重亚硫酸盐的分析方法和层析法等。[31以下归纳

总结了主要的甲基化分析方法以及相关特性。

(一)基因组整体水平甲基化分析

高效液相色谱柱(hplc)及相关方法。hplc是一

种比较传统的方法，能够定量测定基因组整体水平

dna甲基化水平。它由kuo等1980年[131首次报道。

过程是将dna样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱基，

水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光

测定吸收峰值及其量，计算5mc／(5mc+5c)的积分面

积就得到基因组整体的甲基化水平。oefner等1992

年提出变性高效液相色谱法(dhplc)用于分析单核

苷酸和dna分子。邓大君等20__年i141将其改进与

pcr联用建：立了一种检测甲基化程度的dhplc分析

方法。将重亚硫酸盐处理后的产物进行差异性扩增。

由于原甲基化的在重亚硫酸盐处理时仍被保留为胞

嘧啶，因此原甲基化的在pcr扩增时，其变性温度也

相应上升。使pcr产物在色谱柱中保留的时间明显延

长．这样就可以测定出pcr产物中甲基化的情况。

这种方法的最明显优点是：可用于高通量混合样

本检测．能够明确显示目的片段中所有cpg位点甲基

化的情况．但不能对甲基化的cpg位点进行定位。

其他基因组水平甲基化分析还有sssi甲基转移

酶法，免疫化学法，氯乙醛法等。各具优缺点。

(二)特异性位点的dna 甲基化的检测

1．甲基化敏感性限制性内切酶(ms—re—pcr／

southern)法

这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲

基化区的不切割的特性．将dna消化为不同大小的

片段后再进行分析。 这是一种经典的甲基化研究方

法，其优点是：相对简单，成本低廉，甲基化位点明确，

实验结果易解释；

2．甲基化特异性的pcr(ms—pcr)

herman等[161 1996年在使用重亚硫酸盐处理的基

础上新建的一种方法。它将dna先用重亚硫酸盐处

理。这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化

的不变。随后行引物特异性的pcr。检测msp扩增产

物．如果用针对处理后甲基化dna链的引物能扩增

· 287 ·

出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对

处理后的非甲基化dna链的引物扩增出片段．则说明

被检测的位点不存在甲基化(见图2)。[15·17]

． ／

5’衄_{2盈__ 平 盈3． 5-啪__曩墨|_唧h _霉叠__甲3·

— __． —

p1．m ri 一 一

图2甲基特异性的pcr扩增(ms—pcr)示意i莩i。dna经重亚硫酸盐处

理后。以处理后的产物作为模板．加入甲基化特异性的引物(primer 1)

或非甲基化的引物(primer¨)．进行特异性的扩增(如图所示)，只有结

合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。[1s,1

(三)寻找新甲基化位点

1．限制性标记基因组扫描(rlgs)

costello等20__年报道的rlgs[ 81能对整个基因

组的甲基化状态进行分析．发现新甲基化基因的方

法。这种方法联合使用了限制性内切酶及二维电泳。

其过程是：先用甲基化敏感的稀频限制性内切酶not

i消化基因组dna，甲基化位点保留，标记末端、切

割、行一维电泳，随后再用更高频的甲基化不敏感的

内切酶切割。行二维电泳，这样甲基化的部分被切割

开并在电泳时显带，得到rlgs图谱与正常对照得出

缺失条带即为甲基化的可能部位。

2．联合甲基化敏感性限制性内切酶的mb(com．

pare—ms)

srinivasan yegnasubramaniant 91 20__年报道了一

种新方法compare—ms．该法将mbd柱层析法与

ms—re联用。互补了各自单用的弊处，能够快速、敏感

的检测dna甲基化情况(见图3)。[19j

四、甲基化型分析的优势以及存在的问题

(一)甲基化作为检测对象的优势

1．甲基化型既能反映有关基因功能状态及与此相

连的多种疾病相关的丰富信息。叉具有简单的“二元

化”性质，即令甲基化为“0”，非甲基化为“1”，就可以进

行数字化处理，便于开展大规模和自动化监测分析。

2．dna分子十分稳定。有可能将它和dna的snp

分析等置于同一个技术平台。同时它又比rna和蛋白

质更便于保存和运输。并可对已经石蜡、甲醛或乙醇预

· 288 ·

_f 簟

图3 联台甲基化敏豫性限制性内切酶的mbd (compare-ms)示

意围。用甲基化以外的位点的内切酶ia酶)与甲基化敏雅的内切酶(b

酶)联用．则甲基化的dna链不被切开。非甲基化的切开．再行mbd

捕获存在甲基化位点的dna片段。最后行实时pcr扩增并分析。f删

处理的样本进行分析，可以开发历史上储备的病理学资

料。

(二)存在的问题

目前还未找到dna甲基化改变与年龄之间的精

确的量化关系式。虽然人们对个体细胞的衰老及其基

因甲基化水平的改变有了初步的了解．但还在研究探

索二者之问的精确的量化关系。[201对使用dna甲基

化改变来推断个体年龄的大小，仍需要进行大量的研

究和调查。

(三)付诸于实践之前还必须解决的问题

1．确定表观遗传修饰与特定生理指标的相关性：

2证实将这些指标作为鉴别诊断的潜在可能性和

技术可行性：

3．通过一定规模的流行病学调查来验证实验室内

的表观遗传生理及病理发现在人群中的真实性。

五、dna甲基化在法医学中判定个体年龄上的展

望

目前，研究dna甲基化水平改变与个体年龄的

相关性尚处于试验阶段，但已引起许多学者的关注。

人类表观基因组协会(human epigenome con—sortium，

hec)于20__年1o月正式宣布开始投资和实施人类

表观基因组 计划(human epigenome project，hep)。

dna甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的

重要研究内容，hep的最终目标是就要确认这些dna

甲基化位点在人类基因组的分布与频率，以指导和系

统研究dna甲基化在人类表观遗传、胚胎发育、基因

印记等发挥的作用。 借助于该计划的实施和分子生

物学技术的发展，在法医实践中可以通过调查各年龄

段人群基因组dna甲基化分布以及相关频率，建立

相关统计学模型，将来有望成为法医个体年龄判定的

一项重要的生物学指标。(感谢西安交通大学医学院第一附

法律与医学杂志20__年第l3卷(第4期)

属医院妇产科、环境与疾病相关教育部重点实验室郑鹏生教授

和顾婷婷同学的支持和帮助。)

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第7篇：表观遗传学主要研究范文

[关键词] Beckwith-Wiedemann综合征；表观遗传学；DNA甲基化；印记基因；Wilms肿瘤

[中图分类号] R726.5 [文献标识码] C [文章编号] 1673-9701（2016）26-0155-03

表观遗传学是近年来医学研究的新热点，而Beckwith-Wiedemann 综合征（BWS）是研究表观遗传学的代表性疾病之一。本病是一种罕见的先天性印记基因表达异常综合征，印记基因最具特征的标志是DNA 获得甲基化和去甲基化，其致病基因位于第11 号的染色体短臂15.5 区域，以脐膨出、巨大舌和身体的一侧生长过剩为主要表现，临床上还可见短暂性低血糖、面部鲜红斑痣、内脏肥大、肿瘤等其他表现。本文通过介绍我院收治的1例Beckwith-Wiedemann 综合征患儿情况，以提高临床医生对本病临床表现、诊断、发病机制的认识，现报道如下。

1 病例资料

患儿，女，36+1周早产，于2014年9月25日9：35于我院产科出生，患儿系第1胎第1产，顺产，其母胎膜早破5 h，产前无宫内窘迫，生后Apgar评分1 min、5 min均为10分，出生体重3600 g，羊水、脐带未见异常，胎盘大，生后发现患儿舌大伴吐舌，为进一步治疗转入我科。

母孕史：其母孕期规律产检，孕29周时宫内B超提示胎儿双肾增大，孕34周时宫内B超提示胎儿巨舌症？家族史：父母体健，非近亲结婚，否认家族遗传病病史及中毒、外伤史。

入院查体：体重：3550 g，身长：50 cm，头围：33 cm，神清，精神反应可，眼裂稍小，鼻梁低平，舌大，吐舌，哭声响亮，婉转有调，颜面可见红斑，前囟平软约1.5 cm×1.5 cm，左顶部可触及2 cm×2 cm×3 cm血肿，心音有力，律齐，心前区未闻及杂音，两肺呼吸音清，腹软，腹正中剑突下至脐部可见一条状隆起，哭闹时明显，脐根部粗大，肝肋下2 cm，质软边锐，脾肋下未及，双侧肢体对称，无偏身肥大，四肢肌张力正常。

辅助检查：血尿便常规无异常，血生化无异常，TORCH（-），血胰岛素（空腹）3.35 μIU/L（3.3～19.5 μIU/L），超声心动图：房间隔缺损3 mm，继发孔型。腹部B超：肝脏增大，双肾增大，双侧肾盂分离。

小儿外科：脐疝，腹白线疝。皮肤科：面部鲜红斑痣。口腔科：舌体良性肥大。

诊治经过：入院第2天出现血糖偏低（2.5 mmol/L），经喂养糖水及奶、静脉输入葡萄糖，血糖恢复正常。住院期间每天均在空腹喂奶前有1～2次血糖偏低，经加强喂养后血糖正常。

出院后随访：出生后40 d，混合喂养，血糖监测正常。右侧肢体较左侧偏大（右上肢、下肢较左侧长0.5 cm，右下肢较左侧粗0.5 cm），活动好，肌张力正常，用力时腹中线部位膨隆。血AFP 257.6 ng/mL（

MS-MLPA结果：母源KvDMR去甲基化，母源H19甲基化或父源的单亲二倍体。

2 讨论

2.1 发病率及病因

第8篇：表观遗传学主要研究范文

【关键词】 辅助生殖技术；妊娠早期；染色体异常

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.04.042

近年来， 助生殖技术（assisted reproductive technology， ART）V泛用于治疗不孕问题， 相关研究显示[1]， 发达国家每年有≥3%的辅助生殖技术出生儿， 辅助生殖技术为不孕家庭带来了福音。自然流产是一种人类优胜劣汰的自然选择结果， 发生自然流产的几率为15%， 在全部流产中占75%的比例， 导致自然流产的主要原因是染色体异常（夫妻染色体异常与胚胎染色体异常）。近30年来， 辅助生殖技术得到了高速发展， 但有相关报道指出[2， 3]， 辅助生殖技术致早期妊娠流产率较高， 为此， 本院对400例流产患者进行了绒毛细胞分离和染色体分析， 现做如下报告。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2015年1月～2016年1月本院收治的孕早期流产患者400例， 将其中320例自然妊娠孕早期自然流产患者作为对照组， 80例因辅助生殖技术致妊娠的孕早期自然流产患者作为观察组。观察组患者年龄22～43岁， 平均年龄（33.6±3.3）岁， 孕周7～12周；对照组患者年龄25～44岁， 平均年龄（31.2±5.2）岁， 孕周7～12周。两组患者一般资料比较， 差异无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。在告知两组患者实验过程及目的后， 均表示愿意参加实验并签署知情同意书， 实验获得了医院伦理委员会批准同意。

1. 2 方法 先提取绒毛细胞， 对流产的患者进行子宫清宫术， 备好负压吸引管， 清宫时严格遵守无菌操作规程， 采用负压吸引管利用负压原理， 吸附绒毛组织5～20 mg。将这5～20 mg绒毛组织作为标本， 放入生理盐水中浸泡， 并立即送入中心实验室备检。标本送达后， 立对绒毛组织标本进行分离培养， 采用双抗清洗法清洗标本， 去污物（血块、蜕膜组织）， 保留典型的绒毛组织约10 mg， 将清洗后的标本放入离心管置入离心机进行离心操作， 离心结束后观察管内分层， 去除上层的液体， 在下层滴入生物酶（胶原酶、胰酶）， 将标本放入保温箱， 仔细观察并记录， 待出现绒毛散开现象时， 立即滴入母牛血清， 采用电子显微镜观察绒毛细胞形态。当视野中出现成片状细胞， 将标本放入新鲜的培养液中并滴入生物碱（秋水仙素）， 再次放置在保温箱内， 放置时间为4 h， 然后去掉上层清夜， 将标本置入水浴箱， 2 h后取出， 将标本放入离心机再次离心， 将离心后的标本去上清液制成悬液， 通过莱卡显微镜进行观察， 选择两名医生同时读标本玻片， 每例计算20个分裂象， 分析2个核型（嵌合体加倍计数）。

1. 3 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P

2 结果

观察组患者中

3 讨论

辅助生殖技术是治疗不孕不育的一种手段， 有体外受精-胚胎移植（IVF-ET）、卵子体外成熟（IVM）、人工受精（AI） 等形式[4]。根据WTO的相关数据显示[5-9]， 我国的不孕症发病率高达15%， 传统的治疗远远不能满足日益增长的不孕不育患者的治疗需要。

自然流产是妊娠过程中常见的并发症， 而染色体异常则是自然流产的主要原因之一， 包括夫妻染色体异常和胚胎染色体异常[10-12]。夫妇染色体异常常见的有平衡易位和罗伯逊易位， 胚胎染色体异常常见的有三倍体、多倍体及染色体平衡易位、嵌合体等。与自然流产相比， 辅助生殖技术妊娠不增加妊娠早期流产率， 但是与流产孕妇的年龄存在着一定的关系。本研究通过对流产的患者进行子宫清宫术， 清宫时采用负压吸引管利用负压原理， 取出绒毛组织5～20 mg作为实验标本， 将其放入生理盐水中浸泡， 然后对绒毛组织标本进行分离培养， 采用双抗清洗法清洗标本， 去除血块及蜕膜组织， 保留典型的绒毛组织， 进行离心操作， 观察标本现象。发现自然妊娠孕早期自然流产患者的绒毛细胞染色体异常率与辅助生殖技术致妊娠早期自然流产患者的绒毛细胞染色体异常率无明显差异（P>0.05）， 但是不同年龄间差异具有统计学意义（P

相关研究显示[2]， 辅助生殖技术能影响表观遗传（印记基因）的调控， 影响胚胎植入和胎儿生长等， 表观遗传学方面的异常能使胚胎停育， 基因印记缺陷会导致早期妊娠的不稳定易发生流产[1]。控制性招促排卵过程中， 大剂量促性腺激素的使用， 可能是引起配子及胚

胎印记异常， 辅助生殖技术实施时间正处于印迹重建的窗口期， 运用于当中的操作会对配子及胚胎的甲基化状态发生一定的影响。

本文研究结果显示， 观察组患者中

综上所述， 辅助生殖技术并不增加妊娠早期流产胚胎染色体异常的发生率， 但绒毛细胞染色体异常与育龄妇女的年龄有明显的关系， 年纪≥40岁的患者采用辅助生殖技术妊娠更容易导致妊娠早期流产。

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第9篇：表观遗传学主要研究范文

【摘 要】目的：研究小鼠早期胚胎各发育阶段组蛋白H3K4单和双甲基化的变化过程。方法：准备受孕母鼠，获取小鼠各阶段正常早期胚胎，通过4%多聚甲醛固定，0.4%triton透膜，0.1%牛血清白蛋白封闭，抗H3K4单双甲基化一抗染色处理，二抗避光孵育后，利用免疫荧光技术，对各个阶段早期胚胎组蛋白H3K4单和双甲基化表达水平鉴定。结果：成功得到所需要的各发育阶段的正常早期胚胎。发现：从1细胞胚胎到8细胞胚胎组蛋白H3K4单和双甲基化表达水平整体呈下降趋势，在1细胞胚胎达到最高，8细胞胚胎表达水平最低，桑葚胚和囊胚较8细胞胚胎表达水平又有所回升。结论：在早期胚胎发育过程中，组蛋白H3K4单和双甲基化程度成逐渐下降趋势。

【关键词】小鼠早期胚胎；组蛋白H3K4；甲基化；表观遗传修饰

表观遗传是指DNA序列不发生变化但基因表达却发生了可遗传的改变［1］。这种改变是细胞内除了遗传信息以外其他可遗传物质发生的改变,即基因型未发生变化而表型却发生了改变,且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递［2-3］。其修饰方式主要有DNA甲基化，去甲基化和组蛋白乙酰化。它们对于早期胚胎和配子的形成和发育、组织特异性基因的表达、大部分基因沉默(gene silencing)起关键作用，在正常细胞过程，比如雌性哺乳动物X染色体失活，以及酵母中配对型位点的沉默方面也有重要作用［4］。

组蛋白修饰是表观遗传学里主要修饰方式之一，到目前为止，在组蛋白上至少发现有八种不同的修饰方式，我们了解比较多的是乙酰化、甲基化和磷酸化这样比较小的共价修饰。近几年的研究发现，H3K9的甲基化与基因的沉默有关，而H3K4的甲基化却可以使基因活化且H3K4的甲基化可招募HP1或其同源物与之结合，从而使基因所在部位异染色质化，这表明，组蛋白的甲基化可能与异染色质的形成有关［9-11］。H3K4位点发生的甲基化可以激活基因的转录，其必须在H2B的123位赖氨酸呈现泛素化的状态下进行，根据以往研究表明，H3K4甲基化可能是转录发生的早期事件，由于这种修饰在多细胞动物中是异常复杂的，因此研究H3K4单和双甲基化的具体功能更具有重要的意义。

本实验中，我们研究了组蛋白H3K4单和双甲基化对小鼠早期胚胎各阶段动力学变化过程, 有助于揭示表观遗传学对哺乳动物早期胚胎基因表达、调控、遗传的重要作用。

1 实验材料和方法

1.1 实验试剂：孕马血清（PMSG）,购自宁波激素制品厂；人绒毛膜促性腺激素（HCG，宁波激素制品厂）；胰酶消化液（Sigma）；4%多聚甲醛（Sigma）；0.4%triton（Sigma）；0.1%BSA(牛血清白蛋白)；一抗（兔抗鼠H3K4单和双甲基化，Abcam）；二抗（羊抗兔，Santa cruz）；PBS磷酸缓冲液。

1.3 小鼠的超数排卵及：选择6～8周龄健康昆白小鼠，并进行光照控制：6：00～ 2O：O0光照，2O：O0～6：00黑暗。16：00-17：OO时雌鼠腹腔注射PMSG10IU(宁波激素制品厂)，48h后再注射hCG10IU(宁波激素制品厂)，然后将其与雄鼠2：l合笼。次日早上8点之前检查阴道栓，有乳白色或者黄色冻胶物（阴道栓）即确定为怀孕，见栓当天上午确定为怀孕0.5天。同样方法取分别怀孕0.5天, 1天, 1.5天, 2天,2.5-3天及3.5天的母鼠进行实验。

1.4 小鼠早期胚胎的获取：取分别怀孕0.5天, 1天, 1.5天, 2天,2.5-3天及3.5天的母鼠，将母鼠置于超净工作台上，对其进行断颈处理，用手术剪剪开腹部，暴露子宫。用镊子和细针将子宫连同卵巢同其余组织分离，然后置于盛有PBS的培养皿内。用无钙镁PBS洗涤3次，弃除表面残余血迹。将培养皿置于倒置显微镜下，用细针分离卵巢和子宫周围的脂肪组织。1细胞的获取：用镊子固定子宫一端，取细针戳破输卵管的壶腹部，暴露1细胞，用自制吸取胚胎工具吸出胚胎，并将其吹入盛有PBS液的四孔板中。2-8细胞的获取：剪去卵巢，用镊子固定子宫一端，另一手持5 ml注射器抽取PBS液，插入子宫，冲洗输卵管，待胚胎被PBS液冲出后，用工具吸出胚胎，并将其吹入盛有PBS液的四孔板中。桑葚胚，囊胚的获取：剪去输卵管和卵巢，用镊子固定子宫一端，另一手持5 ml注射器抽取PBS液，插入子宫，冲洗子宫，待胚胎被PBS液冲出后，用工具吸出胚胎，并将其吹入盛有PBS液的四孔板中。

1.5 染色与细胞组蛋白H3K4甲基化的检测：除1细胞需经过胰蛋白酶消化去掉胚胎上的颗粒细胞外，其余都同下步骤。用4%多聚甲醛固定胚胎30分钟，然后用 0.4%triton 透膜20分钟, 再用0.1%牛血清白蛋白（BSA）封闭30分钟，每个步骤结束后都需要用PBS液清洗三遍，每次二分钟。之后加一抗（兔抗鼠抗H3K4单或双甲基化）4℃放置过夜，第二天上午用PBS液清洗干净后再加带有荧光标记的二抗（羊抗兔FITC）避光孵育1小时。荧光显微镜下观察、拍照。

2 实验结果

2.1 组蛋白H3K4单和双甲基化修饰免疫荧光染色：检测早期胚胎（1细胞至囊胚）H3K4单甲基化表达水平（图1）

根据染色强度绘制出相对荧光强度曲线（图2）。

从图1和图2可以观察出，组蛋白H3K4修饰在早期胚胎阶段大致上呈下降趋势，在1细胞-8细胞期间较为明显，在1细胞维持较高水平，到8细胞阶段，其表达水平降到最低，随后到桑葚胚和囊胚，表达水平又稍有所提高。

2.3 组蛋白H3K4双甲基化修饰免疫荧光染色

同时检测早期胚胎（1细胞至囊胚）H3K4单甲基化表达水平（图3）。根据染色强度绘制出相对荧光强度曲线（图4）。

从图3和图4可以观察出，在小鼠早期胚胎发育的整个早期过程中，组蛋白H3K4修饰在早期胚胎阶段大致上呈下降趋势，在1细胞维持较高水平，到8细胞阶段，其表达水平降到最低，随后到桑葚胚和囊胚，表达水平又稍有所提高。但是与单甲基化修饰相比，亦可以发现，双甲基化修饰的荧光信号强度要高于单甲基化，也就是说，对于组蛋白H3K4而言，双甲基化比单甲基化更容易发生在早期胚胎中。

3 讨论

组蛋白H3第4赖氨酸的甲基化作为共价修饰的方式之一, 可以发现H3K4甲基化是组蛋白修饰中的一个非常重要的方式,与基因的转录调控有关,与多种癌症的发生发展关系密切,现已成为表观遗传学研究的热点。虽然体细胞克隆技术已经在多种动物中得以实现,但克隆胚胎怀孕率低、出生后异常等问题,严重制约了体细胞克隆技术的开发应用。有研究证实,供体细胞核在受体卵母细胞中不完全或异常的表观遗传重编程是导致克隆胚胎发育异常的重要原因。组蛋白的共价修饰是重要的表观遗传修饰,具有复杂而广泛的生物学功能。在正常生殖细胞发生和胚胎发育过程中,染色体要经历广泛的DNA甲基化、去甲基化,核小体核心组蛋白也要通过各种共价修饰调节染色体功能,从而完成遗传信息的传递和调控胚胎的发育［15］。目前,我们对早期胚胎组蛋白H3K4表达水平的动力学变化过程还不是很清楚。本实验对此进行了较为系统的研究。

结果发现早期胚胎阶段组蛋白H3K4单和双甲基化表达大致呈下降趋势，（图2，图4所示）在1细胞-8细胞期间较为明显，但在8细胞阶段，其表达水平降到最低，随后到桑葚胚和囊胚，表达水平又稍有所提高。结果推断，组蛋白甲基化信号在在1细胞时期维持了较高的水平，随着胚胎的发育和分裂分化，由于配子本身基因的表达，使组蛋白甲基化的程度越来越低。本实验的研究结果可加深早期胚胎组蛋白修饰的重编程,为改善克隆效率提供理论依据。

参考文献

［1］Wolffe AP, MatzkeM A. Epigenetics: regulation through rep repession ［J］. Science, 1999, 286 (5439): 81～486.

［2］Lewin B．Gene Ⅷ．Perarson Prenc Hall press ［M］. 2004.

［3］Jaenisch R, Bird A. Epigenetic regulation of gene expression：how the genome integrates intrinsic and environmental signals ［J］. Nat Genet, 2003, 33(sup): 245～254.

［4］Li E. Chromatin histone modification and epigenetic reprogramming in mammalian development ［J］．Nat Rev Genet, 2002 , 3(9): 662～673.

［5］Lachner M, O Carroll D, Rea S, Mechtler K, Jenuwein T．Methylation of histone H3 lysine 9 creates a binding site for HP1 proteins ［J］Nature, 2001, 410(6824): 116～120.

［6］Bannister A J, Zegerman P, Pattridge J F, Miska E A, Thomas J O, Allshire R C, Kouzarides T. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromodomain［J］. Nature, 2001, 410(6824): 120～124.

［7］Rong W, David M, Gilber W S. Heterochromatin，HP1 and methylation at lysine 9 of histone H3 in animal ［J］. Chromosoma, 2002, 111(1): 22～36.