免疫学的定义精选(九篇)

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第1篇：免疫学的定义范文

【关键词】 免疫固定电泳；M蛋白；β巯基乙醇

M蛋白是浆细胞或B淋巴细胞单克隆恶性增殖分泌的大量结构均一的， 无抗体活性和无免疫活性免疫球蛋白或其肽链亚单位， 临床上称之为单克隆免疫球蛋白（monoclonal proteins， M蛋白）[1]。免疫固定电泳技术是结合区带电泳的分离作用和单克隆抗体的特异性及高敏感性来检测样本中的单克隆免疫球蛋白[2]。此技术在恶性单克隆免疫球蛋白血症的诊断、分型、疗效随访和意义未名单克隆免疫球蛋白血症转化的病程监测都有重要意义。

1 血清免疫固定电泳常见问题

①抗原抗体比例不合适 免疫增殖性疾病中会出现某种或几种免疫球蛋白异常增高， 高浓的球蛋白使血清免疫固定电泳某个球蛋白区出现有着色较深的浓密条带或出现边缘着色而中心区域蛋白不着色的“口型”。着色较深的浓密条带的出现会使判读很困难， 是否有单克隆条带隐匿在其中不容易判读；还是此样本为一个多克隆免疫球蛋白病无法区分。“口型”容易出现假阴性的结果。② IgM型聚合度高， 非特异性沉淀影响判读， 在β或γ区可见致密而均质条带。第一种情况凝胶的点样处和整个泳道出现沉淀。另一种情况是出现两条单克隆带。③IgA型谱带宽而弥散， IgA型较其他类型的单克隆比较谱带宽而弥散不易判读。④血清免疫固定只有重链单克隆成分， 初诊时血清免疫固定只有重链单克隆成分勿轻易诊断为重链病。⑤血清免疫固定只有轻链单克隆成分。⑥血清免疫固定电泳阴性的浆细胞病， 临床上典型的浆细胞病特征及病理损伤， 但血清免疫固定电泳为阴性。⑦血清免疫固定的血清蛋白电泳条带假的狭区带易与M蛋白混淆。以上讨论了对血清免疫固定电泳技术在日常工作中常见问题， 现就其问题逐一分析和解决。

2 分析与讨论

①高浓度的球蛋白需要考虑提高抗体浓度或降低抗原的浓度， 一般采用生理盐水降低抗原浓度的方法[3]。掌握正确的适合自己实验室试剂盒的稀释比例， 最好先进行免疫球蛋白及轻链的定量。因免疫固定电泳的检测灵敏度可达0.25 g/L， 恰当的稀释比例在胶片上会呈现清晰且浓而狭窄界限明显的沉淀线即单克隆免疫球蛋白。②由于大量IgM多以19 S五聚体形式存在， 造成凝胶的点样处和整个泳道出现沉淀的情况。19 S五聚体伴随7 S单体亚单位会造成两条单克隆带[4]。这两种情况经β巯基乙醇处理会使大分子聚合蛋白解聚和适当的稀释能得到理想的单克隆条带。β巯基乙醇使用浓度为100 μl标本中加入10 μl10%的β巯基乙醇。另需注意β巯基乙醇毒性分级为高毒且具有特殊臭味， 高浓度吸入本品有致人死亡危险， 有条件的话可在通风橱中戴手套操作。③由于IgA分子的多态性形成的二聚体和三聚体导致蛋白质的不同迁移率[5]。使IgA型单克隆免疫球蛋白病呈现多条带的现象。在不能清晰判读的情况下可以用经β巯基乙醇处理使大分子聚合蛋白解聚和适当的稀释的解聚方法。④有些M蛋白的四级结构会阻碍轻链抗原决定簇与其相应的轻链抗血清的结合， 此时可经β巯基乙醇处理使大分子聚合蛋白解聚和适当的稀释的解聚方法， 再做实验能得到正确的结果。⑤若与三种重链α， γ， μ不发生反应而与κ或λ轻链反应， 则需进一步作游离轻链的补充检测。若呈阴性结果， 则需再做抗IgD和抗IgE检测。⑥第一种为不分泌型多发性骨髓瘤；第二种为轻链型多发性骨髓瘤， 由于轻链的分子量较小易迅速自肾排除故有时血清中反而呈现阴性。这种情况可用本-周蛋白的检测或尿固定电泳来检测轻链的单克隆成分的有无。⑦溶血标本在β位会形成血红蛋白区带；陈旧血清在近原位由于IgG的聚合形成的窄区带；血浆标本在r位会形成纤维蛋白原带[6]。以上3种情况可通过样本的质量前控制， 用新鲜血清标本可以避免此类情况的发生。

参考文献

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第2篇：免疫学的定义范文

2015年7月3日14时许，孙某（男，43岁）驾驶一辆电动三轮车行至辽宁省营口市老边区305国道金牛山大街南富玺钢材城路口附近路段时与一辆翻斗车相撞后受伤，经医院抢救无效于2015年7月5日16：40左右死亡。

2临床资料

现病史：患者于1h前车祸中伤及头面部及胸部，伤后意识不清，头面部创口流血，无恶心及呕吐，无抽搐及二便失禁，急诊行CT检查后收入病房。病来无尿痛及血尿，无腹泻及便秘，未进食水。体格检查：T36.5℃，P81次/min，BP108/60mmHg， R18次/min。专科检查：昏睡状态，问话不答，双侧瞳孔等大正圆，直径2.5mm，光反射灵敏，头面部创口敷料包扎，无血性液渗出，无面瘫，耳鼻无溢液，颈软，双肺呼吸音清，心率70次/min，腹平软，无反跳痛，左侧肢体瘫，肌力Ⅲ级，双膝腱反射正常，双巴氏征阴性。2015年7月4日CT诊断：左侧大面积脑梗塞可能性大，左侧额顶部软组织肿胀。请结合临床。2015年7月4日11：20～13：40手术记录：…。手术名称：左侧标准大骨瓣减压术。…。术中诊断：左侧外伤性大面积脑梗塞，脑疝…。确定诊断：左侧外伤性大面积脑梗塞，脑疝，头面部皮裂伤，颈部皮裂伤，脑震荡。

3法医学检验

3.1尸表检验 成人男性尸体一具，尸身长170cm，发育正常，营养良好。尸斑呈淡红色，分布于尸体背侧未受压部分，指压不褪色；尸僵已形成，存在尸体各大关节，程度较强。头部戴网状止血纱帽，头顶部敷料包扎在位伴有血染。颜面苍白，双眼睑闭合，睑球结膜苍白，角膜轻度混浊，双侧瞳孔不等大、正圆固定，其中左侧直径0.5cm，右侧直径0.6cm，舌位于齿列内，口、鼻腔及双侧外耳道未见异常分泌物。

3.2损伤检验

3.2.1前额面部正中近发际处经左额部、顶部至左颞部有一“U”型长28.0cm开颅术后创口，已缝合，缝线在位。

3.2.2左顶部有一0.8cm×0.3cm闭式引流术后创口，已缝合，缝线在位。

3.2.3左额颞部有一不规则形态8.0cm×0.2cm-2.0cm表皮剥脱伴皮下出血，其中有两处分别长1.8cm、4.0cm创口，已缝合，缝线在位。

3.2.4右额面部有一2.5cm×1.0cm表皮剥脱伴皮下出血，局部小创口已缝合，缝线在位。

3.2.5右眼周、右颧部可见多处细小创口，均已缝合，缝线在位。

3.2.6下颌底至左颈部有一14.0cm×0.5cm-3.0cm不规则形态表皮剥脱伴皮下出血，其中可见多处皮肤裂伤，已缝合，缝线在位。

3.2.7左肘背部可见两处表皮剥脱伴皮下出血，大小分别为1.1cm×1.6cm、0.2cm-0.6cm×1.1cm。

3.2.8右大腿中下段前外侧可见两处皮下出血，大小分别为6.0cm×1.0cm、7.0cm×1.5cm。

3.3解剖检验

3.3.1头部 常规切开头皮，见左侧头皮下出血，面积在11.0cm×10.0cm左右，左侧标准大骨瓣减压术后，颅骨缺损面积在10.0cm×10.0cm左右，人工硬脑膜缝合在位，右侧颞肌无出血。锯开颅骨，见硬膜外无出血，剪开硬脑膜，未见硬膜下出血，取出脑组织，可见左侧大脑少量薄层蛛网膜下腔出血，切开左侧大脑实质，可见多处散在脑挫裂伤灶，切开脑干左侧实质有处挫伤、出血灶。颅底左侧颅后窝颈内动脉管入口处可见一长约5.0cm血栓样物附着。

3.3.2颈部 “一”字纵行切开颈前区皮肤，未见颈部肌肉出血，在颈总动脉、颈内动脉分叉处切开动脉可见血栓样物堵塞颈内动脉管腔，肉眼观察动脉管壁未见粥样硬化斑块形成。

3.3.3胸腹部 “一”字纵行联合切开胸腹部皮肤，分离软组织，胸壁软组织及肋间肌未见破裂及出血，肋骨无骨折，气胸试验阴性。锯开两侧肋骨，左右胸腔内未见积液、积血，心包完整无破裂，剪开心包，心包内可见少量淡黄色心包液，心脏完整无破裂，心脏浆膜下可见多处散在出血点（斑），右肺下叶可见多处散在出血点（斑）。腹腔内无积液、积血，各脏器位置正常，完整无破裂。其他未见明显异常。

3.4提取检材及处理 提取死者孙某全脑组织、心脏、部分左肺下叶、右肺上叶、左颈总动脉颈内动脉、部分肝左叶、脾脏、左肾脏等脏器组织，待送检做法医病理组织学检验。

3.5病理组织学检验 主要法医病理学诊断及所见

3.5.1左侧大脑散在蛛网膜下腔出血，对应部位脑实质多发散在灶状出血，呈外伤性蛛网膜下腔出血及脑挫伤改变；左侧大脑实质内多发散在血管内膜断裂、血栓形成伴血栓周围脑组织梗死灶形成；

3.5.2脑干中心部位大片状出血伴脑干水肿。

3.5.3左侧颈内动脉内膜损伤，内皮断裂、脱落，管腔内有混合血栓形成。

3.5.4心脏冠状动脉内膜轻度增厚，管腔未见狭窄；肺脏、肝脏、肾脏和脾脏镜下未见明显异常。

4讨论

4.1关于外伤性脑梗塞 外伤性脑梗塞是头部或颈部外伤引起脑血管堵塞或闭塞所致的脑组织缺血性坏死。其损伤原因和机制一般认为与以下因素有关：①血管痉挛。多为原有病变（如动脉硬化等）的脑血管，在外力作用、脑损伤或精神创伤刺激下引起反射性脑血管痉挛；②血栓形成。外力造成颈部动脉或脑内血管内膜损伤；③栓塞。栓子多为动脉内附壁血栓或动脉粥样硬化斑块。

它是外伤，尤其是颅脑外伤的一种较少见的并发症，主要表现为原发脑损伤不相符合的迟发性神经功能障碍，且易与病理性脑梗塞相混淆，在法医学鉴定中常引起争议。

4.2关于本例成伤机制 本例头颈部交通事故外伤史明确，伤后意识不清，出现左侧肢体瘫，肌力Ⅲ级，头部CT检查提示左侧多发大面积脑梗塞，经临床抢救无效于伤后50余h死亡。

本例尸表检验见头、颈部多处表皮剥脱伴皮下出血、挫裂伤，解剖头部可见左侧大脑少量蛛网膜下腔出血，左侧脑实质内多处散在脑挫裂伤灶，脑干实质内有处挫伤、出血灶，并于颅底左侧颅后窝颈内动脉管入口处可见一长约5.0cm疑似血栓样物附着，解剖颈部于颈总动脉、颈内动脉分叉处剪开颈内动脉管壁，可见血栓样物堵塞颈内动脉管腔，肉眼观察动脉管壁未见粥样硬化斑块形成。病理组织学检查所见左侧大脑可见多处散在外伤性蛛网膜下腔出血及脑挫伤改变，左侧大脑实质内多发散在血管内膜断裂、血栓形成伴血栓周围脑组织梗死灶形成，脑干中心部位大片状出血伴脑干水肿，左侧颈内动脉内膜损伤，内皮断裂、脱落，管腔内有混合血栓形成，心脏冠状动脉内膜轻度增厚，管腔未见狭窄。因此，可以认定本例左侧大面积脑梗塞不属于自身病理性脑梗塞，应属外伤性脑梗塞。

本例头颈部外伤造成颈部动脉和脑内血管发生牵拉、扭曲，造成内膜断裂、出血，血管内皮损伤后，内皮胶原纤维暴露，激活血液中凝血因子Ⅷ，从而激活内源性凝血系统，同时内膜损伤所释放的组织凝血因子又可以激活外源性凝血系统，促进血栓形成。此外，颅脑外伤后脑挫裂伤、脑内血肿、脑水肿，导致颅内压增高，使脑血管灌注量下降、脑血流缓慢、瘀滞，也有助于血栓形成。

4.3关于本例死亡原因 本例头、颈部交通事故外伤史明确，损伤致头、颈部多处表皮剥脱伴皮下出血、挫裂伤，解剖检见头皮下血肿，蛛网膜下腔出血，左侧多处散在脑挫裂伤灶，脑干出血，左侧颈内动脉血栓形成，导致大面积外伤性脑梗塞，脑内水肿，脑疝形成。死者孙某符合交通事故致头颈部外伤、颈内动脉血栓形成，导致大面积脑梗塞、继发脑疝形成造成严重的颅脑损伤而死亡。

第3篇：免疫学的定义范文

[关键词] 单向免疫扩散；流感病毒疫苗；血凝素；亚单位；去垢剂

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）02（c）-0049-03

Influence of detergent in the measurement of haemagglutinin content of influenza vaccine by single radial immunodiffusion

TIAN Wenli QI Ji GAO Yanyan CHEN Qun YANG Xu LI Xiaoqiang

Tasly & Jenner (Tianjin) Co., Ltd, Tianjin 300410, China

[Abstract] Objective To research the influence of detergent in single radial immunodiffusion (SRID) test for the assay of haemagglutinin on different influenza vaccine intermedia products, and to determine the disintegration terms treating with detergent. Methods Examined the haemagglutinin content by single radial immunodiffusion assay after treating whole virus and subunit vaccine intermedia products with a variety of concentration and taking time of detergent, compared and analyzed on the measurement data. Results Size of the subunit vaccine diffusion zones increased with increasing concentrations of Zwittergent reaching 0.125%, and kept consistent with detergent concentrations higher than 0.125%. However, size of the whole virus diffusion zones increased until the detergent concentrations reach 1%. The result of haemagglutinin content did not varied by treating with 1% Zwittergent for 30, 60, and 120 min, there were no significant difference among the detergent results. Conclusion Treating with 1% Zwittergent for 30 min is proper for either whole virus or subunit vaccine intermedia products in single radial immunodiffusion for haemagglutinin assay, it is good for increasing the job efficiency, decreasing the experimental error and saving the experimentation costs.

[Key words] Single radial immunodiffusion (SRID); Influenza vaccine; Haemagglutinin(HA); Subunit; Detergent

流感病毒的囊膜外层分布着两种主要的抗原物质：血凝素（haemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）[1-2]。研究表明，血凝素在流感病毒感染宿主细胞的过程中起着至关重要的作用[3]，是流感病毒亚单位疫苗中有效的免疫物质[4-6]。因此，血凝素含量的准确测定是流感病毒疫苗制品质量控制的关键。目前，国际上通用的流感病毒血凝素含量测定方法是单向免疫扩散法（single radial immunodiffusion，SRID）[7-12]，该方法不仅应用于流感病毒亚单位疫苗成品的血凝素含量测定，在疫苗制品生产的中间过程控制中也起着至关重要的指导作用。

在流感病毒亚单位疫苗的生产过程中，首先制备出大量的完整病毒，然后经裂解、纯化等若干处理后获得亚单位疫苗[13]。为了在疫苗制品的生产过程中对不同阶段的中间产品进行必要的质量控制，就需要对不同组成成分的中间产品进行血凝素含量的检测。这些中间产品既包括未裂解的完整病毒也包括经过裂解、纯化的亚单位产品。因此，确定一种能够同时对完整病毒和亚单位疫苗进行血凝素含量测定的单向免疫扩散法对于疫苗生产过程的质量控制具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 疫苗中间产品和标准抗原/抗血清

流感病毒疫苗中间产品：完整病毒液及亚单位疫苗原液由天士力金纳生物技术（天津）有限公司生产；标准抗原/抗血清均购自NIBSC。

1.2 主要试剂

琼脂糖（BIOWEST）；去垢剂：Zwittergent 3-14 Detergent（Merck）；染色液（0.4%考马斯亮蓝R250）；脱色液（无水乙醇∶冰醋酸∶水=29∶12∶59）。

1.3 抗原样本的处理

1.3.1 去垢剂浓度的比较 将A/Victoria/210/09（H3N2）（NYMCX-187）标准抗原、完整病毒液1、亚单位疫苗原液1三个抗原样本以抗原：去垢剂=9∶1的体积比分别加入浓度为0.375%、0.625%、1.25%、2.5%、5.0%、10.0%、20.0%（w/v）的去垢剂，以PBS代替去垢剂等体积加入，作为去垢剂浓度为0的对照。3组抗原样本各经八个浓度（终浓度分别为0、0.037 5%、0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%、1.000 0%、2.000 0%）的去垢剂在室温下裂解30 min后同时加至抗体凝胶板中进行SRID。

1.3.2 裂解时间的比较 取A/Victoria/210/09 （H3N2）（NYMCX-187）标准抗原和亚单位疫苗原液2，分别加入1/9体积的10%（w/v）去垢剂，在室温条件下分别放置不同时间进行裂解。其中，各裂解时间组的标准抗原均稀释为1、0.75、0.50、0.25倍浓度，完整病毒液2和亚单位疫苗原液2分别稀释12倍和15倍后进行裂解。所有抗原样本经处理后同时加至抗体凝胶板中进行SRID。

1.4 SRID实验

用PBS配制1%琼脂糖溶液，加热融化后降温至45℃，按说明书中的建议量加入标准抗血清，混匀后倾注在扩散板上（凝胶厚度为2 mm），待琼脂糖溶液凝固后用4 mm直径的打孔器打孔并除去孔内凝胶，即为抗体凝胶板。

向抗体凝胶板的各加样孔中分别加入18 μL处理后的抗原样本，将凝胶板置于湿盒内室温扩散至少18 h。凝胶经漂洗、压薄、干燥后进行染色、脱色，测量沉淀圈直径[8]。

2 结果

2.1 去垢剂浓度的比较

将标准抗原、完整病毒液1、亚单位疫苗原液1三个抗原样本分别以终浓度为0、0.037 5%、0.062 5%、0.125 0%、0.250 0%、0.500 0%、1.000 0%、2.000 0%的去垢剂于室温下同时裂解30 min后进行SRID，测量沉淀圈直径，然后根据三组样本的沉淀圈直径绘图，见图1。

从3条曲线的形态可以看出，去垢剂终浓度由0增加至0.125%时，3种抗原的沉淀圈均逐渐增大；当去垢剂浓度由0.125%增至2.00%时，标准抗原和亚单位疫苗的沉淀圈直径无明显变化，而完整病毒的沉淀圈仍随去垢剂浓度的增大而变大，直到去垢剂终浓度达到1%时，才不再增大。这说明不论是标准抗原、亚单位疫苗还是完整病毒，在进行SRID实验前都需要进行裂解；标准抗原和亚单位疫苗因为事先都经过了一定的裂解过程，故需要的去垢剂浓度较低（0.125%），而完整病毒则需要使用较高浓度（1%）的去垢剂才能够充分裂解。

图1中亚单位疫苗与标准抗原两条曲线几乎是平行的，这说明去垢剂浓度的变化对该亚单位疫苗与标准抗原的影响是一致的。经过终浓度不小于0.125%的去垢剂裂解后，利用SIRD的方法以标准抗原作为参考品来测定该工艺条件下生产的亚单位疫苗的血凝素含量能够得到稳定而准确的结果。去垢剂终浓度由0增加到2%时完整病毒SRID沉淀圈直径增加了5.2 mm，而亚单位疫苗与标准抗原的沉淀圈仅增加了2.9 mm和2.8 mm。可见，去垢剂浓度的变化对完整病毒的作用最为显著。当利用SRID的方法以标准抗原作为参考品来测定完整病毒中的血凝素含量时，样本处理所需要的去垢剂终浓度不应小于1%。

2.2 裂解时间的比较

标准抗原稀释为四个浓度与稀释的亚单位疫苗原液共同进行三组裂解时间的比较，SRID测得的沉淀圈直径见表1。

利用SRID的沉淀圈直径与抗原浓度呈线性的关系分别对3组裂解时间所得到的结果做标准曲线，然后将3组中分别测得的完整病毒液2和亚单位疫苗原液2的沉淀圈直径代入公式中，计算其血凝素含量，见表2。

由表1和表2可见，标准抗原和亚单位疫苗SRID沉淀圈直径均不随裂解时间的变化而发生显著变化。因此，在3组裂解时间下分别测得的完整病毒液血凝素含量（CV=0.2%）和亚单位疫苗原液血凝素含量（CV=1.3%）的结果都是一致的。

3 讨论

单向免疫扩散（SRID）实验应用于流感病毒血凝素含量的检测是一种非常成熟、有效的方法，该方法具有灵敏度高、精确性好、重复性好等优点，是《中国药典》2010年版三部中用于流感病毒疫苗血凝素含量检测的标准方法。而该方法中，样本裂解的充分与否是影响测定结果准确性的重要因素。

本文以流感病毒疫苗生产过程中不同生产阶段的中间产品作为样本，研究了利用单向免疫扩散法测定样本血凝素含量时去垢剂的影响。本研究的结果表明，完整病毒或亚单位疫苗以终浓度1%的去垢剂对抗原样本进行30 min的裂解处理后，均能在单向免疫扩散实验中得到稳定准确的结果。去垢剂浓度低于1%时，完整病毒裂解不充分，进行单向免疫扩散所得的沉淀圈偏小；而去垢剂浓度高于1%时，完整病毒和亚单位疫苗的SRID沉淀圈直径均不随去垢剂浓度的增加而发生变化。此外，裂解时间的延长不会对血凝素含量的测试结果产生影响。

完整病毒未经过裂解，抗原颗粒较大，在SRID中不易扩散；亚单位疫苗经过了一定的裂解处理，抗原颗粒较小，相对于完整病毒颗粒更易于扩散；而亚单位疫苗经去垢剂处理后可进一步裂解为颗粒更小的抗原物质，在SRID中最易扩散，裂解剂浓度比较的实验结果也充分证明了这一点。标准抗原与亚单位疫苗相似，也需要经去垢剂裂解后进行SRID。

在大规模流感病毒疫苗生产的质量控制工作中，经常需要对大量的不同阶段中间产品样本进行检测。利用本研究所确定的样本处理条件，可同时对多种待测抗原样本进行血凝素含量的测定，对于提高工作效率、缩小实验间误差、节约实验成本等方面都具有非常重要的意义。

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第4篇：免疫学的定义范文

[关键词] 电化学发光法；放射免疫法；甲状腺激素

[中图分类号] R446.62 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）03-0071-02

Comparing of measurement of thyroid hormones by ECLIA and RIA

ZHANG Yuping

Deparment of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Xinyang Vocational and Technical College, Xinyang 464000, China

[Abstract] Objective To compare which one is superiority in result of reliability and methodology of convenience between ECLIA and RIA measurement. Methods The thyroid hormones were measured by ECLIA and RIA. The measurements were compared of precision, sensitivity, coefficient of recovery, linear range and others. Results Precision, sensitivity, coefficient of recovery, linear range of ECLIA have had an advantage over RIA. Conclusion ECLIA is an outstanding method applied in clinical laboratory.

[Key words] ECLI; RIA; Thyroid hormones

放射免疫法（RIA）检测成本低，但具有报告时间长、结果不稳定、同位素污染等缺点，渐趋于淘汰。近年来随着检测分析技术的发展，电化学发光（ECLI）分析法日益受到关注，本文分别采用2种方法对甲状腺激素标准品、质控品和20份患者血清甲状腺激素进行测定并对其评价，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

20份血清标本取自门诊患者，均为甲状腺疾病，血标本无脂血和溶血。标准品及质控品均为罗氏公司提供。

1.2 仪器与试剂

电化学发光免疫分析仪为美国罗氏公司生产的2010型；美国产全自动γ计数仪。电化学发光免疫分析试剂购于罗氏公司，放射免疫分析试剂购于天津九鼎公司。

1.3 方法

1.3.1 精密度 用两种方法分别对中、高值质控品进行测定，每份样品连测20次，计算批内CV值。每日测定1次，连续20次，计算批间CV值。

1.3.2 线性范围 将甲状腺激素标准品（FT3 40 pmol/L，FT4 45 pmol/L，TSH 100 mIU/L）及中、高值质控品按不同比例关系混合制成评价样品，重复测定5次。坐标图上预期值与实测值的直线所达的限值即为线性范围。

1.3.3 灵敏度 分别对空白零标准做批内20次检测，分别记录放射强度和发光强度并做统计，再计算检测低限（LLD）[1]。公式：LLD=均值BIK+2SBLK。

1.3.4 回收实验 将甲状腺激素标准品（FT3 40 pmol／L，FT4 45 pmol/L，TSH 100 mIU/L）作为基质，在其中分别加入中、高值质控品作为样品1和2 ，然后分别进行测定，计算均值并进行比较。

1.4 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件包，所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较计量资料采用t检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 精密度

观察两种方法测定甲状腺激素的批内和批间CV结果可见，两种方法均达到了临床检验的质量要求，但电化学发光法的精密度更高。见表1、2。

2.2 线性范围

2种方法检测FT3、FT4、TSH的可报告范围：电化学发光免疫法（0.26～115） pmol/L、（0.12～116） pmol/L、（0.08～90）mIU/L。放射免疫法为（1.14～65）pmol/L、（1.69～82） pmol/L、（0.23～58）m/L。

2.3 灵敏度

两种方法检测FT3、FT4、TSH的低限，电化学发光免疫法为0.12pmol/L、0.16pmol/L、0.09mIU/L；放射免疫法为1.11pmol/L、1.77pmol/L、0.24mIU/L。

2.4 回收实验

检测结果平均回收率见表。均有较好的回收率，比较后发现电化学发光免疫法优于放射免疫法（P ＜ 0.05）。

3 讨论

放射免疫分析始于20世纪60年代，其敏感度、特异性均较好，发生交叉反应少，准确性好、重复性好、批内批间误差低，但容易发生放射性污染，不能形成自动化，不能快速地检测、出报告[1]。电化学发光免疫法是电化学发光和免疫测定相结合的新一代标记免疫技术，近年来在国内一部分临床实验室相继应用。电化学发光免疫法不仅可用于检测激素类、肿瘤标志物类，还可用于传染病、血药浓度的监测，预计将来临床应用会更加广泛。电化学发光免疫法自动化强，可以24小时开机，能够随时满足现代医院的节奏和病人对医院的更高要求，如一些急诊项目；绒毛膜促性腺激素、肌红蛋白、肌钙蛋白等，随时检测，具有更大的临床应用价值[2]。

本组试验表明两种方法检测血清FT3、FT4、TSH的结果在精密度、线性范围、灵敏度、回收率等几方面均有显著性差异，显示电化学发光免疫法明显优于放射免疫法。电化学发光免疫法检测血清FT3、FT4、TSH时，被测抗原与抗体全部参与反应；而放射免疫法是竞争性反应，被测物和标准物都不能全部参与反应，最大结合时一般在50%左右，亦即抗体结合位点与标记抗原结合一半[3]。试验结果显示了电化学发光免疫法在可测定范围上要远胜于放射免疫法。

电化学发光可以最大程度消除样本底的干扰及对位量的散射，可以获得较高的灵敏度。另外电化学发光免疫法可以全自化，能够最大限度减少系统和随机误差。而且电化学发光免疫法试剂有效期长，检测快速准确，且安全无毒，不会出现同位素辐射污染的问题[4]。

因此，电化学发光将会成为微量法检测的发展和普及方向，可以替代放免法，使实验室的服务具有竞争力。

[参考文献]

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第5篇：免疫学的定义范文

[关键词] 化学发光免疫测定；生化检验；应用效果；放射免疫分析法；评价

[中图分类号] R446.1 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）05-0113-03

化学发光免疫测定法又被称为化学发光标记免疫测定法，国际上通称为chemiluminescent immunoassay，即CLIA。该方法通过磁场将抗原、抗体沉淀部分与游离部分进行分离，从而达到定量或定性检测的目的，广泛应用于临床病毒、肿瘤标志物、免疫系统疾病以及心脏疾病的诊治过程。本次研究以甲状腺肿瘤为主要研究方向，选取本院580例甲状腺肿瘤患者，就化学发光标记免疫测定法与放射免疫分析法在生化检验中的应用效果展开研究，并结合文献调研与临床经验，对化学发光免疫测定在其他疾病临检确诊过程中的应用进行了简要阐述，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2013年5月～2015年5月580例甲状腺肿瘤患者，按抛硬币法将其分为检测组和放射组各290例，其中检测组男142例，女148例，年龄7～85岁，平均（46.2±7.5）岁，病程1～6年，平均（3.2±1.3）年；放射组男151例，女139例，年龄9～83岁，平均（47.3±4.2）岁，病程1.5～8年，平均（4.3±1.7）年。本次研究在取得我院医学伦理委员会认证通过的前提下进行，所有患者均与我院签署《调查研究知情同意书》，符合《甲状腺病理诊断》（人民军医出版社，2011版）中的临床标准，排除心脑血管疾病、特殊情况过敏、肾功能严重障碍以及有精神病史或家族精神病史的患者。检测组患者性别、年龄、病程等一般资料与放射组比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

将各组人员进行编号并分别抽取3 mL静脉血，将患者血液中加入适量肝素（Glaxo Wellcome Production，国药准字J20090006）抗凝，离心分离，3500 r/min，取血浆冻存，检测患者甲状腺球蛋白，检测时间控制在4 h以内。

放射组患者采取放射免疫法进行检测，使用FJ-20003/50P型γ全自动双探头放射免疫计数仪（西安国营二六二厂提供）对患者甲状腺球蛋白进行检测。

检测组患者采取化学发光免疫法进行检测。MAGLUMI-4000型分析仪与配套化学发光试剂盒（深圳新产生业生物医学工程股份有限公司）进行甲状腺球蛋白检验，采用雅培i2000仪器与配套试剂（美国雅培公司）进行第三方验证。

1.3 观察指标

通过对各组甲状腺球蛋白检测结果进行分析，以假阳性和假阴性检出率为依据，对两种检测方法特异性和灵敏性进行比较。放射免疫法检测甲状腺球蛋白正常水平为11.45～20.25 ng/mL，化学发光免疫法检测甲状腺球蛋白正常水平为0.73～84 ng/mL。灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）×100.0%，特异性=真阴性/（真阴性+假阳性）×100.0%，符合率=（真阳性+真阴性）/总例数×100.0%。

1.4 统计学处理

文中涉及数据均在SPSS13.0中输入，计数资料采取率（%）表示，行χ2检验，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，行t检验，P

2 结果

2.1 两组检测结果比较

检测组实际阳性143例，阴性147例，检测出真阳性142例，真阴性142例。放射组实际阳性146例，阴性144例，检测出真阳性125例，真阴性118例。采用化学发光免疫法的检测组检测甲状腺球蛋白灵敏度、符合率、特异性等数据明显高于采用放射免疫检测法的放射组，差异有统计学意义（P

2.2 两组甲状腺球蛋白水平比较

检测组甲状腺球蛋白水平为（690.8±89.1）ng/mL，放射组为（631.2±51.3）ng/mL，两组比较差异有统计学意义（t=9.872，P

3 讨论

化学发光免疫测定技术最早应用于20世纪70年代，当时只作为示踪信号，且灵敏度与发光时间明显不足，局限了应用领域。随着医学仪器技术发展，到80年代中期，出现辣根过氧化物酶标记技术，大大提高了信号强度，延长了发光时间，解决了测定技术难题。化学发光通常被分为3大类型：第一种为发光酶免疫测定，即LEIA；第二种为发光物免疫测定，即LIA；第三种为发光辅助因子免疫测定，即LEIA。化学发光类型虽然各异，但其内在原理却能通用，化学发光均为通过化学发光物质通过化学反应从而产生光辐射[1]。本次研究所讨论的化学发光免疫测定方法与放射免疫测定方法具有一定相似之处，二者都可以用Ag-L+CRlight进行标示（Ag-L代表发光物；CR代表协同反应物）[2]。化学发光免疫测定用途十分广范，在医学领域中，化学发光免疫测定法常见于肿瘤测定过程之中，凭借其特有的光辐射，能对CA153、CA242、CEA、NES、AFP、PSA等十多种肿瘤进行测定。

本次研究结果表明，使用化学发光免疫测定对甲状腺球蛋白浓度进行检测，检测灵敏度、符合率、特异性均明显高于放射免疫检测，差异有统计学意义（P

此外，化学发光免疫检测还广泛应用于临床生化检验中，包括病毒检测、心脏疾病检测等。具体内容如：（1）梅毒螺旋体检测。临床常用方法为对患者体内非密螺旋体特异性抗体进行检测，之后再进行确证检测，根据结果才能确诊，常用的人工检测方法效率低且耗时长，操作复杂，无法满足临床要求，在何惠[3]等的研究中，采用化学发光免疫检测则可利用全自动分析仪，通过两步法进行定性检测，能有效降低假阳性率，提高临床检出准确率。（2）乙肝病毒标志物检测。在乙型病毒性肝炎传统检测过程中多采用ELISA法进行定性检测，无法满足临床定量的需求，由于目前多以HBsAg作为病毒感染的判断标志物，因此可采用化学发光免疫测定法对乙肝HBsAg抗原进行测定，达到定量与定性的双重标准，灵敏度可达100%，符合率和特异性分别可达97.61%，98.74%，且各检测指标均符合临床诊疗需求，在较大范围内线性良好。（3）肿瘤标志物检测。肿瘤标志物存在与细胞和组织当中，包括蛋白质、酶、激素等，国内外大部分学者通过化学发光免疫测定法检测肿瘤标志物，对肿瘤患者早期诊断和术后检测提供了有参考价值的指标，例如张国军等[4]人以化学发光免疫测定发对血清中鳞状细胞癌抗原以及cy-fra21-1浓度进行测定，从而实现了对食管癌的有效诊断和病情观察，效果良好。（4）心脏疾病检测。陈丽珠等[5]对心脏病患者心肌损伤标志物和肌红蛋白间的关系进行了数据分析，结果显示三者间有密切相关性，因此在心脏疾病临检过程中可利用化学发光免疫测定对临床标本进行检测，能实现对心脏疾病患者及时、准确、有效的诊断和临床症状监护。

在临床生化检验过程中，能有效满足疾病标记的抗原毕竟占少数，因此还需对检测方法进行充分优化，具体表现为：（1）有效提升分析结果的准确性和灵敏度，提高分析结果放大倍数，延长检验下限，扩大化学发光免疫检测的应用范围，使其发挥更大的临床价值[6-9]；（2）提高分析仪器的准确性，以促进仪器小型化、智能化转变为发展方向[10-12]；（3）化学发光免疫测定对发光物的生成和催化剂效果依赖较大，为有效扩大应用范围，提升检测灵敏度，还需研发出新型发光物和催化剂，同时还需修饰和增强化学发光反应效果，进一步探讨新型分析方法， 提升检验准确性[13-18]。

综上，化学发光免疫检测具有较高灵敏度与准确性，在临床诊断与治疗中应用效果显著，对准确诊断出患者病情意义重大，有一定的临床推广价值。

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第6篇：免疫学的定义范文

【摘要】

目的: 研制人血清中促甲状腺素（TSH）的化学发光免疫检测试剂盒。方法: 采用辣根过氧化物酶标记的抗TSHβ亚单位特异性单克隆抗体(mAb)， 与固相包被的抗TSHα亚单位的另一mAb配对， 以鲁米诺作为底物， 采用两步法建立了双位点夹心法人血清TSH的化学发光免疫定量分析法。结果: 该方法灵敏度为0.0788 mIU/L， 批内CV平均为4.7%， 批间CV平均为8.4%， 平均回收率为93.05%。该检测与LH、 FSH和HCG无交叉反应。部分实验样品的测试结果显示该试剂与国外同类试剂（雅培architect i2000）的测定结果明显相关(r＝0.984)。结论: 该方法具有较高的灵敏度、 重复性和准确度， 与其他同类产品相比简便、 快捷、 成本低， 适于临床检测和科研应用。

【关键词】 促甲状腺激素（TSH） 化学发光免疫分析法 试剂盒

促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone， thyrotropin， TSH)是一种由垂体前叶分泌的糖蛋白激素， 由α和β2个亚基组成， 相对分子质量(Mr)为28000[1]。TSH本身受下丘脑分泌的TSH释放激素TRH的调控， TSH的主要生理作用是调节甲状腺激素的合成与分泌， 血液中甲状腺激素水平与腺垂体分泌TSH的量之间有负反馈抑制关系[2]。甲状腺功能改变时， TSH的波动较甲状腺激素更迅速且明显， 是反映下丘脑垂体甲状腺轴功能的敏感指标， 因此采用灵敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析(chemiluminescent immunoassay， CLIA)是一种灵敏的免疫分析方法， 在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用[3]。本研究根据化学发光免疫分析法的原理研制了血清TSH的检测试剂盒， 与国内外同类产品相比具有简便、 快捷、 成本低等优点。

1 材料和方法

1.1 材料 TSH单克隆抗体(mAb)、 TSH标准品抗原和辣根过氧化物酶（HRP）为Sigma公司产品， 光免板为Thermo Electron公司产品， 化学发光底物为BioRad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 标准品的配制 将TSH抗原标定后溶于小牛血清中， 配制成含0.1， 1， 5， 20， 100 mIU/L的标准溶液。

1.2.2 抗体包被板的制备 将100μL含TSH mAb（0.5mg/L）的pH9.6碳酸盐缓冲液加至包被板中， 37℃包被2 h， 再用含10 mg/L BSA的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液于37℃封闭2 h后晾干备用。

1.2.3 酶标记物的制备 TSH的酶标记物采用过碘酸钠法制备， 然后经0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液透析过夜后， 加入等量的甘油于-20℃保存备用。

1.2.4 检测方法 将50 μL待测样品或标准品加入包被TSH的光免板中， 37℃温育30 min， 弃反应液， 用洗涤液（含0.5 mg/L Tween20的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液）洗5次， 加酶标记物50 μL， 37℃温育30 min后同样用洗涤液洗5次， 然后加入发光底物于5～10 min内测定各孔的发光值RLU。样本中的TSH浓度依据由标准品TSH浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。

2 结果

2.1 动力学性质 在HRP鲁米诺H2O2发光体系中， 将不同量的免疫复合物加入发光液中， 发光强度（RLU）随反应时间而变化。10 min后RLU接近峰值， 在5～15 min内RLU较为稳定， 随后开始缓慢下降。

2.2 反应条件优化

2.2.1 加样量对RLU的影响 样本和酶标记物的加样量分别为50 μL和100 μL考查标准品（0、 0.1、 1、 5、 20、 100 mIU/L）RLU， 发现加样量为100 μL与50 μL RLU相差不大， 说明50 μL的加样量反应能达到平衡(图1)。

图1 加样量对RLU的影响（略）

2.2.2 反应模式对RLU的影响 采用二步法。第一步: 加入标准品和待测样品后， 将反应体系在37℃分别温育15、 30、 45、 60 min; 第二步: 加入酶标记抗体后， 将反应体系在37℃分别温育15、 30、 45、 60 min。结果表明温育时间为30 min时反应皆能达到平衡(图2)。

图2 温育时间对RLU的影响（略）

A: 第一步温育时间对RLU的影响; B: 第二步温育时间对RLU的影响.

2.3 稳定性 将试剂盒放置于37℃ 6 d后， 比较与放置前参考标准品各点RLU值， 参考标准品各点RLU值未见明显降低， 且本底发光值无明显升高， 表明试剂盒标准曲线无明显漂移， 满足稳定性要求。

2.4 方法学评价

2.4.1 标准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下， 以标准血清的浓度（0～100 mIU/L）制作的标准曲线见图3。同时测定20个零标准， 用零标准均值加上2倍标准差， 计算出此方法的灵敏度为0.0788 mIU/L。

图3 TSH标准曲线（略）

2.4.2 精密度 取低(4.44 mIU/L)、 中(19.45 mIU/L)和高(79.23 mIU/L)3种TSH浓度各重复测定10次， 测定批内CV分别为6.2%、 3.3%和4.6%， 平均为4.7%。隔日分别进行5次独立试验， 测批间CV分别为8.3%、 7.6%和9.3%， 平均为8.4%。

2.4.3 准确性 在已知TSH浓度的血清中加入3种不同浓度的标准血清，测定加入回收率为93.05%。将TSH浓度为44.42 mIU/L的血清用标准零血清分别按1/2、 1/4、 1/8、 1/16稀释， 测量各稀释浓度的TSH含量， 测定稀释回收率为99.86%。

2.4.4 特异性 在已知浓度的血清样品中加入不同浓度的LH、 FSH和HCG后， 对TSH的测定无干扰。

2.4.5 与进口试剂的比较 将研制的TSH CLIA定量检测试剂盒与Abbott architect i2000全自动化学发光系统共同对30例正常人、 20例甲亢及80例甲低临床标本进行检测， 通过数据分析， 得出两个检测系统所得数值具有明显相关性(图4)。

图4 与Abbott全自动化学发光系统相关性曲线（略）

3 讨论

血清促甲状腺素定量检测的方法主要有放射免疫法、 酶联免疫法、 时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法等几种[4]。考虑到目前化学发光和时间分辨荧光分析仪器几乎全部为国外厂商生产， 而绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆绑销售的垄断模式， 并在仪器中人为设置排它性检测程序， 从而抬高了配套试剂盒价格， 增加了检测成本， 所以本工作旨在开发国产低价、 稳定、 通用的人血TSH CLIA试剂盒。首先对读数时间进行了动力学研究， 发现其在5～15 min内RLU处于平台期，反应时间选择10 min。其次对反应条件进行了实验摸索， 在不同的温育时间和加样量的条件下， 各RLU值相差不大， 因此选择了50 μL的加样量与两步共1 h的反应时间。

我们研制的TSH化学发光免疫测定试剂盒通过方法学鉴定表明无论是灵敏度、 准确性、 特异性等技术指标均达到了临床诊断的要求[5]; 同时该方法具有操作方便， 反应时间短和成本低等优点， 具有较广阔的市场应用前景。

参考文献

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第7篇：免疫学的定义范文

【关键词】 免疫血清

【Abstract】 AIM: To express human lrg in E.coli and to obtain an anti-Lrg immune serum. METHODS: lrg cDNA was cloned into pcTAT vector. The fusion proteins were expressed in E.coli and purified by Ni-NTA column and SDS-PAGE. Rabbits were immunized with preliminary purified Lrg protein and reinforced three times. The antiserum was collected. RESULTS: Antiserum against Lrg was obtained in immunized rabbits and its titer was more than 1∶1000 proven by ELISA and Western Blot. The purified Lrg protein could get across membranes of Papilla Dental Cells within 30 min. Immunohistochemical test with this antiserum showed that Lrg was a cytoplasmic protein and rabbit antiserum against human Lrg protein could be used in eukaryotic cell and normal tissues. CONCLUSION: The immune serum specific against Lrg is obtained， which can be used in normal tissues and cells.

【Keywords】 lrg; affinity purification; immune sera

【摘要】 目的： 在大肠杆菌表达人lrg，制备鉴定人Lrg免疫血清. 方法： 构建pcTATlrg重组表达质粒，并在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋白；对表达的融合蛋白采用镍柱和SDSPAGE纯化；以纯化蛋白作为免疫抗原，对新西兰白兔实施多次免疫（间隔时间分别为1 mo， 3 wk， 2 wk）. 结果： 获得兔抗人Lrg免疫血清. 经过ELISA和Western Blot检测，效价在1∶1000以上. 真核细胞实验表明，6HisTATLrg蛋白具有良好的穿透性，可以在30 min内从培养液进入细胞质; 免疫组化实验表明Lrg是一种胞质蛋白; 兔抗人Lrg免疫血清可有效应用于细胞和组织的检测. 结论： 制备得到兔抗人Lrg免疫血清，为lrg的功能研究打下基础.

【关键词】 人lrg基因；亲和纯化；免疫血清

0引言

人lrg基因是一种脂多糖应答基因. 系采用基于PCR的改良消减杂交技术［1］，用脂多糖刺激人牙髓细胞， 克隆得到并登陆GenBank的新基因［2，3］， 具体功能还不清楚. 生物信息学分析表明，人lrg基因的开放读框约558 bp， 预计编码的蛋白质包含186个氨基酸；编码的序列中包含2个相互重叠的亮氨酸拉链结构和1个螺旋-转角-螺旋结构［3］， 而亮氨酸拉链结构是DNA结合蛋白的特征性结构. 因此，对人lrg基因的研究既有线索可寻，又可以采用一些较新的方法［4］，来加快研究进度. 而深入研究Lrg在体内组织细胞分布特点及其功能，需要高效价的Lrg抗体. 为此，我们在大肠杆菌中融合表达了人Lrg蛋白， 并对6HisTATLrg初步纯化. 用纯化后的蛋白，免疫新西兰大白兔， 以获得高效价的抗Lrg血清.

1材料和方法

1.1材料

重组质粒pUC19lrg由本室构建［3］; BL21(DE3) 菌种和 pcTAT载体由本室保存. DNA marker DL2000购于TaKaLa 公司. PCR引物由上海博雅公司合成. 成年雄性新西兰大白兔1只(1.2 kg)由第四军医大学实验动物中心提供. HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz Biotechnology; DAB，NBT/BCIP 由Sigma公司提供. SABCFITC、免疫组化检测试剂盒由武汉博士德公司提供.

1.2方法

1.2.1人lrg的扩增和克隆PCR反应体系中上下游引物P1，P2各20 pmol， 上游引物P1为AAGGTACCATGAAACAGCAAGAAGTACAAC，含有KpnⅠ酶切位点; 下游引物P2为AACTCGAGCACATCAAGGAACCATCGTC，含有XhoⅠ酶切位点. 模板pUC19lrg 0.02 μg ， 10×PCR buffer 5 μL， 10 mmol/L dNTP 1 μL， pfu polymerase 34 nkat. PCR反应参数为95℃ 变性15 s， 56℃ 退火40 s，72℃ 延伸40 s，共30个循环.

1.2.2人lrg原核表达载体的构建利用PCR产物纯化试剂盒对上述PCR产物进行纯化. 纯化的扩增产物用KpnⅠ， XhoⅠ进行双酶切，pcTAT载体进行同样的双酶切. 16℃连接目的基因与载体片段， 转化感受态细胞， 挑克隆， 提取质粒， 进行KpnⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定.

1.2.3人Lrg融合蛋白的表达纯化和免疫血清的制备pcTATlrg 转化入BL21(DE3)感受态细胞， 用200 mL LB(Amp+)培养， 1 mmol IPTG 诱导4 h， 收集细菌. 120 g/L SDSPAGE分析. 用Ni柱对超声裂解诱导细菌上清进行纯化， 120 g/L SDSPAGE分析. 并用SDSPAGE分离纯化后的融合蛋白. 将切下的目的蛋白条带研碎，溶于生理盐水. 采用背部皮下多点注射，免疫新西兰大白兔(以下同)， 1 mo后加强免疫. 3 wk重新加强免疫. 2 wk后再强化1次. 于第4次加强免疫后7 d取兔血清.

1.2.4ELISA 检测免疫血清的效价［5］初步纯化的6HisTATLrg蛋白包被ELISA板， 间接ELISA法检测兔抗人Lrg免疫血清的效价. 一抗为1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(对照组使用未免疫兔血清); 二抗为1∶2000 HRP标记的羊抗兔IgG ; TMB显色，BioRad自动酶标仪测定.

1.2.5Western Blot 检测免疫血清效价［6］初步纯化的6HisTATLrg融合蛋白进行SDSPAGE分离，电转移法将相应蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上，用10 mL 50 g/L的脱脂奶粉封闭. 一抗为1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(对照组使用未免疫兔血清)，二抗为1∶5000碱性磷酸标记的羊抗兔IgG， 显色试剂为NBT/BCIP.

1.2.6SABCFITC染色检测免疫血清的效果爬片培养牙细胞，将初步纯化的6HisTATLrg融合蛋白加入到培养液中. 30 min后取出细胞爬片， PBS洗涤， 多聚甲醛固定、正常山羊血清封闭， 分别加入1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(对照组使用未免疫兔血清)、1∶2000生物素化的羊抗兔IgG， 荧光素染料SABCFITC， 奥林巴斯荧光显微镜观察.

1.2.7免疫组化检测免疫血清的效果对人组织进行常规石蜡切片，用免疫组化检测试剂盒进行染色. 一抗为稀释度1∶1000的兔抗人Lrg免疫血清; 二抗为1∶3000稀释的羊抗兔IgG. 未免疫兔血清作为阴性对照. DAB显色，常规脱水，透明，中性树脂封片.

2结果

2.1人lrg的扩增和克隆以pUC19lrg为模板，利用设计的引物PCR扩增lrg基因. 扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1000 bp目的条带（Fig 1），与预期大小相符.

2.2人lrg原核表达载体的构建融合表达载体pcTATlrg进行KpnⅠ和XhoⅠ酶切鉴定. 酶切产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析，可见约1000 bp的目的条带（Fig 2），与预期大小相符.

2.3人Lrg融合蛋白的表达纯化和免疫血清制备经IPTG诱导的转化pcTATlrg细菌表现目的蛋白Mr 为25×103，占菌体蛋白总量的42%（Fig 3）. 经Ni柱纯化上清蛋白后，该目的蛋白占菌体蛋白总量的46%（Fig 3）. 将Ni柱纯化后的蛋白进行SDSPAGE二次纯化（Fig 4），切下相应的目的蛋白条带，生理盐水溶解，免疫新西兰白兔.

2.4ELISA检测免疫血清的效价酶标仪测量A280 nm值(平均数)为: 空白孔0.035， 1∶1000抗体孔0.177. 二者之比大于5，参考试剂盒规定，表明免疫新西兰大白兔所产生的免疫血清效价在1∶1000以上.

2.5Westernblot 检测免疫血清效价诱导后的细菌有预期大小 (Mr为25×103) 的特异性条带(Fig 5)， 同时未免疫兔血清没有表达相应的蛋白条带.

2.6SABCFITC染色检测免疫血清效果与对照组(Fig 6A)相比，加入6HisTATLrg融合蛋白的牙细胞在胞质内呈现明显的绿色荧光(Fig 6B) . 表明6HisTATLrg融合蛋白在30 min内进入细胞，而本实验制备的免疫血清可有效应用于真核细胞的检测.

2.7免疫组化进行免疫血清的检测加未免疫兔血清的间质细胞胞质呈蓝色 (Fig 7A) ；加兔抗人Lrg免疫血清的间质细胞胞质内有棕黄色免疫反应阳性颗粒(Fig 7B). 说明Lrg蛋白位于正常组织间质细胞的胞质内.

3讨论

近年来内毒素血症的研究在危重医学领域中十分活跃，对其发病机制的认识也在不断深入. 脂多糖（LPS）是一种内毒素，大量实验表明，LPS、脂多糖结合蛋白(LBP)和脂多糖受体系统(CD14)参与了炎症反应的病理生理过程［7］. LPS在细胞表面以LPSLBPCD14三体复合物的形式活化TLR4信号传导途径，通过一系列胞内分子的相互作用，产生炎性因子（如IL1，TNF等），导致炎症反应，甚至出现DIC和MOD［8］. LPS是机体炎症反应的重要触发剂， 因此，探讨LPS刺激后应答基因的功能，尤其是新发现基因的功能，研究其在LPS信号传导途径中的作用部位和作用性质，有助于阐明炎症发生的分子机制.

我们课题组自从成功克隆lrg基因并登录GenBank［1，3］以来，对该基因的功能展开了初步研究. 生物信息学分析表明，lrg基因编码的蛋白可能是一种DNA结合蛋白. 本课题组的前期实验表明，lrg基因作为一种LPS应答基因，会对真核细胞的细胞周期发生一定影响（资料待发表）. 尽管实验取得了一定进展，但该基因更多功能尚有待阐明. 利用课题组设计的引物，PCR得到了长1000 bp的产物，与预期大小相符. 该片段不仅包括了lrg基因的编码区，也包括了lrg基因下游的非编码区序列. 为了进一步研究lrg基因的功能，需获得针对Lrg蛋白的特异性抗体，本室采用初步纯化后的6HisTATLrg融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得了兔抗人免疫血清. ELISA和Western Blot检测表明，其效价在1∶1000以上; 并且具有比较高的特异性.

我们采用的原核表达载体是pcTAT. 该载体采用T7启动子，带有6His的纯化标签以及HIVTAT部分基因序列. HIVTAT的部分基因序列编码11个氨基酸，可以快速穿过所有哺乳动物的细胞膜［9-11］；6His基因编码6个氨基酸. 本实验成功地将Lrg蛋白与6His纯化标签以及HIVTAT蛋白的基因进行了重组，获得了6HisTATLrg融合蛋白的基因. 重组基因编码的融合蛋白含216个氨基酸. 预计该蛋白Mr 为（20～26）×103. SDSPAGE表明，本研究表达的融合蛋白与预期大小相符. 通过蛋白融合，6HisTATLrg同样获得了快速穿膜特性，可在30 min内迅速从培养液穿过细胞膜到达牙细胞的胞质. 这种快速穿膜特性对于研究该基因在真核细胞内的功能具有非常重要的意义. 我们采用NiNTA纯化系统［12］，专门用于纯化含有6His标签的重组蛋白，具有较高的纯化效率，初步纯化了Lrg蛋白. 初步实验表明，我们获得的纯化蛋白和免疫血清，纯度和产量足以应用于lrg的组织分布和功能研究. SABCFITC实验表明，在牙细胞中，加入的Lrg蛋白在胞质中均匀分布. 而上述结果与免疫组化实验显示的Lrg在组织的分布结果一致，从而验证了实验结果的可靠性.

【参考文献】

［1］ Chai YB， Zhao ZL. Improved PCRbased subtractive hybridization， a shortcut to clone cell differential expression novel genes ［J］. Biotechniques， 2000;29(2):310-313.

［2］ Zhao ZL， Chai YB. Direct cloning of cell differential expression genes with full length by a new strategy ［J］. J Biotechnol， 1999;73(1):35-42.

［3］ 柴玉波. 脂多糖刺激人牙髓细胞所得新基因的批量克隆［D］. 西安： 第四军医大学生物化学和分子生物学教研室，1999.

［4］ Du KJ， Chai YB. The dramatic discovery and development of RNA i technology ［J］. Med Philosophy， 2004；25(1): 14-16.

［5］ F.奥斯伯.精编分子生物学实验指南［M］. 科学出版社，1998: 415-416.

［6］ J.萨姆布鲁克. 分子克隆实验指南［M］. 第2版.科学出版社，1999: 880-898.

［7］ Adeline MH， Robert KE， Jeff HT. Human Tolllike receptors 4 recognizes hostspecific LPS modifications ［J］. Nat Immun， 2002；(3):354-359.

［8］ Shizuo A， Kiyoshi T， Tsuneyasu K. Tolllike receptors: Critical proteins linking innate and acquired immunity ［J］. Nat Immun， 2001；(2):675-680.

［9］ Hikaru N. Transduction of fulllength TAT fusion proteins into mammalian cells: TATp27kip1 induces cell migration ［J］. Nat Med， 1998；12(4): 1449-1452.

［10］ Steven RS. In vivo protein transduction: Delivery of a biologically active protein into the mouse［J］. Science， 1999；285(3): 1569-1572.

第8篇：免疫学的定义范文

在中医院校，《微生物与免疫学》是一门西医基础课程，必修考查，不易引起学生重视。但随着近年来SARS病毒、禽流感病毒等新病原微生物的出现，《微生物与免疫学》课程日益受到重视。本门课程与中医有密切的联系，如“正气与免疫功能”、“脾虚与免疫”；温病的发病原因与病原微生物，如“春温与脑膜炎球菌”、“夏温与乙脑病毒”、“湿温与伤寒、副伤寒杆菌”、“疫疹与斑疹伤寒立克次体”、“烂喉痧与猩红热”、“霍乱与霍乱弧菌”等，已经成为中西医结合的桥梁纽带之一。学好本门课程对于中医院校学生吸收现代医学成果、继承发扬传统医学具有重要意义，而教学方法的合理运用可以明显提高教学效果。

1 启发式教学的运用

启发式教学可以使课堂变得双向互动，激发学生的积极性。如“消毒与灭菌”，先让学生回忆“非典时期”的常见现象：带口罩、喷药、通风、空气过滤器等，然后引出消毒灭菌的目的和意义，使生活与理论有机结合起来，达到活学活用的目的。另外，启发式教学能够引导学生利用有限的实验课时学到更多的知识，如中药抗微生物实验，同样的操作而结果不同，引出影响中药抗微生物效果的因素。那么，如何使结果具有可重复性？让学生自己思考，寻找答案，充分调动学生学习的兴趣和积极性。

免疫学理论性强，内容抽象深奥，利用启发式教学，可以由浅入深，培养学生思考能力和逻辑思维能力。当介绍免疫的定义时，比较抽象，学生一般会望文生义。为了打破惯性思维，从现实中接种疫苗和过敏现象切入，通过讨论思考，使学生掌握免疫的利弊，对免疫的概念有全面的理解。

2 重视现代化教学手段

充分利用各种现代技术手段，是提高教学质量的捷径。《微生物与免疫学》内容丰富，学科发展十分迅速，在有限的课时内形象生动地将前沿内容介绍给学生，提高课堂教和学的水平，多媒体教学可以达到事半功倍的效果。

首先，建立电子化教案和讲稿。有利于提高备课的效率和质量，有利于在教学中随时根据实际需要增、减和更新授课内容，把教师从重复的教案抄写中解放出来，从而把更多的精力投入教学改革和科研，不断提高教学质量。其次，建立丰富多彩的资料库。通过互联网寻找国内外丰富多彩的数码资料，利用数码相机从其它教材、杂志、生活中收集生动的图片，使生活与学习有机结合起来，激发学生的学习兴趣。最后，结合传统的板书教学，对章节内容提纲挈领板书，结合幻灯片讲解，使学生能够整体把握重点，形成完整的知识结构。

3 合理调整授课内容顺序

在中医院校，《微生物与免疫学》课时少，为了使内容由浅入深，传统的教学顺序是先讲授微生物学概论，然后插入免疫学基础，但结果并不理想。由于大多数学生对考查科目没有有效的预习和复习，往往在学完免疫学基础后忘记了微生物学的基本原理；而且，有些学生还将免疫误解为是由于微生物感染所引起的。所以，我们吸收了西医院校的教学顺序，即先讲授免疫学部分后讲微生物学部分，使复杂的内容条理化，使初学者易于理解错综复杂的抽象概念，易于理清思路、提纲挈领地进行学习，学生对免疫学知识的理解度和总体优秀率有明显的提高。当然，先讲授免疫学，对于学生而言入门较为困难，但只要在授课时不断强化免疫学的相关内容，能够达到较好的教学效果。

4 移情在教学过程中的运用

教育学中的移情(Empathy)是指教师设身处地从学生的角度，用学生的眼光审视教学；在与学生的交往中，体会他们的所思所行，体察他们的各种需求和感情；根据教学的目标和要求，及时妥善地调整改进教学，激发学生学习和探索的内在动力，从而提高教与学的效果。《微生物与免疫学》所讲授的内容大多是看不见摸不着的，需要学生具有丰富的想象力，把一些看不见摸不着的概念放大、具体化。如把经典的实验引入教学内容，让学生体会到知识产生的过程，了解科学研究的艰辛和智慧；利用课间时间，交流教与学的心得，及时了解学生听课的体会和对所学知识的掌握程度，激发学生的学习热情和感情回馈。教师和学生在教学中的心理和角色是不同的，但在理智和情感上是平等的个体，教师通过移情，可以拉近师生的心理差距，形成良性互动，有利于提高教与学的水平和质量。

5 运用行之有效的考查方法

考查是督促学生掌握所学课程的基础理论、基本技能和分析解决问题能力的重要手段，也是反映教学质量的重要方法。采用定性与定量相结合的评价方式对学生进行测评，实施过程评价与终结评价相结合，针对不同的专业和层次设计不同的考查方法，重点考察学生掌握基本知识、运用知识分析问题和解决问题的能力。我们目前的考查方式是：理论闭卷考试成绩占70%，实验部分占20%，平时的作业和课堂发言占10%。

当然，也会根据实际情况选择考查方式，只要能够客观评价一个学生对所学知识的掌握和综合运用情况，可以根据实际情况灵活掌握运用。

第9篇：免疫学的定义范文

一、提问旧知，引入新课

教师在课前首先提问上节课的知识，“动物细胞融合的过程是什么？动物细胞融合过程中融合剂是什么？动物细胞融合的优点是什么？”学生回答后，教师总结，动物细胞融合技术最重要的应用就是制备单克隆抗体，从而引出本节课的教学内容――单克隆抗体的制备。

二、讲授新课

1.分析题目

教师首先引导学生分析题目，找到熟悉的词语，如“抗体”“克隆”，引导学生回忆关于抗体的知识，主要有三方面：（1）抗体的定义；（2）产生抗体的细胞；（3）抗体的作用。在此基础上，引导学生学习“单克隆”的含义，进而总结出单克隆抗体的定义，接着引导学生找出定义中的关键词，加深对定义的理解。

2.单克隆抗体的制备过程