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在废水处理中,生物处理法是最为经济适用的废水处理方法,而微生物在生物处理过程中又起到至关重要的作用,利用微生物治理水污染有着广阔的发展前景。本文重点探讨微生物在废水处理中的应用。
关键词:
环保;微生物;应用
环境保护是我国的基本国策。随着水污染问题的日益严峻,水资源危机严重威胁人类的生存环境。在废水处理中,生物处理法是最为经济适用的废水处理方法,而微生物在生物处理过程中又起到至关重要的作用。随着现代分子生物学技术的发展,构建基因工程菌已成现实,所以,利用微生物治理水污染有着广阔的发展前景。本文重点探讨微生物在废水处理中的应用。
1废水中常见的微生物
2微生物在废水处理方面的应用
微生物处理废水的机理就是通过微生物的新陈代谢活动,把废水中的有机物质降解转化为稳定的、无害的物质,从而达到净化废水的方法。根据微生物新陈代谢过程中是否有氧的参与,废水的微生物净化方法分为好氧净化和厌氧净化。
2.1好氧净化在有氧的条件下,好氧微生物通过自身的分解、合成代谢,把废水中的有机物矿物化的过程。在这个过程中,微生物不仅自身得到了生长、繁殖。废水也得到净化。废水微生物好氧净化法就是模拟这个原理来净化污水的。目前常用的好氧废水处理法有:活性污泥法、生物膜法、氧化塘法等。活性污泥法:活性污泥其实就是废水中的好氧微生物生长、繁殖形成的一种絮状体。其生物组成为好氧微生物、兼性厌氧微生物和专性厌氧微生物、有机和无机固体等。活性污泥具有很强的吸附、氧化分解有机物或毒物的能力。活性污泥法处理废水就是利用活性污泥的吸附、氧化、分解、凝聚和沉淀等作用来净化水中的有机污染物。废水中的有机物的降解转化过程就是活性污泥中的好氧微生物的新陈代谢活动。为保证最佳净水效果,就要保证微生物良好的新陈代谢。氧的充足供应是好氧微生物进行正常生命活动的首要条件。所以,首先要保证氧的供应。此外,还要满足微生物生命活动最适宜的温度(15-30℃)和ph值(6.5-8.5)等。生物膜法:这种处理法的实质是使细菌等微生物和原生动物、后生动物等附着在滤料或载体上生长繁育,并在其上形成膜状生物污泥---生物膜。常见的生物膜法有生物滤池、生物转盘、生物接触氧化、生物流化床等。氧化塘法氧化塘中,废水中的污染物主要通过悬浮于废水中的有机菌藻共生作用、水中微生物代谢活动进行降解,水中藻类光合作用能增高溶解氧浓度,氧化塘废水中的细菌可将废水有机物分解变成二氧化碳、硝酸根等无机物,沉积于污泥中的有机物则可通过厌氧菌分解成甲烷、硫化氢等被藻类利用,从而使废水得到净化。
2.2厌氧净化在严格厌氧的条件下,微生物发酵和消化有机物产生水、二氧化碳、硫化氢、甲烷的过程。废水的厌氧处理法就是根据这一原理来净化污水的。因在处理过程中产生甲烷,又称甲烷发酵。废水中复杂有机物的厌氧降解过程分四个阶段,即:水解阶段、发酵阶段、产乙酸阶段、产甲烷阶段。不同的阶段有着不同的微生物优势种群。在水解发酵阶段中,废水中的大分子有机物,首先在细菌胞外酶的作用下,水解转化为小分子有机物后,被梭状芽孢杆菌属、丁酸弧菌属、双歧杆菌属和假单胞菌属等吸收、转化为更为简单的化合物分泌到胞外,主要产物是醇类、挥发性的脂肪酸、乳酸、二氧化碳、氢气、氨等等。在产氢、产乙酸阶段中,这些产物继续被互营单胞菌属、互营杆菌属、暗杆菌属和梭菌属等酸化细菌进一步转化为乙酸、氢气、碳酸及新的细胞物质。在产生甲烷阶段中,前一阶段的产物被甲烷杆菌属、甲烷球菌属和甲烷八叠球菌属等甲烷菌群利用转化为甲烷菌细胞物质,并产生甲烷气体。整个废水厌氧发酵过程涉及多种菌替作用,每种菌群都有不同的生活基质和生活条件要求,构成了一个极为复杂的生态系统。这种废水处理方法不仅菌群获得营养,废水得到净化,还能开发新的生物能源,所以倍受人们重视。
3利用分子生物学技术,人工构建基因工程菌处理废水
相比较于传统的微生物处理废水法,利用基因工程菌处理废水是当前用微生物处理废水的重要发展方向,它具有定向性和高效性的特点。构建的基因工程菌,不仅能在废水处理过程中快速繁殖、絮凝,满足数量需求,而且在高毒环境的水体中,也具有高效的分解、转化性能,甚至可以针对特异的污染物进行分解、转化,基因工程菌也可以广泛的分解污染物。随着基因工程技术和现代分子生物学技术的快速发展,基因工程菌对净化环境、保护人类健康将发挥越来越重要的作用,基因工程菌在废水处理中的应用也将越来越广泛。微生物法处理废水不仅具有效率高、成本较低的特点,而且处理后的水质好,可以直接排放到大自然中。在自然界,广泛的存在着大量的微生物。微生物具有易培养、易变异、繁殖快、适应能力强等特征。随着基因工程技术和现代分子生物学技术的快速发展,构建定向、高效分解污染物的微生物已成为现实。所以,利用微生物治理废水是今后环保产业的主攻方向,合理利用微生物处理废水具有非常广阔的发展前景。
参考文献
[1]陈秀丽《.微生物在废水处理中的应用》.中国西部科技,2007.
[2]黄小兰,陈建耀.微生物在城市废水污泥处理中的应用[A].2008年微生物实用技术生态环境应用学术研讨会论文集[C].2008.
药学专业主要课程 主要课程:基本原理、思想道德修养、法律基础、大学英语、高等数学、医用物理学、计算机基础、形态学概论、生理学、细胞生物学、分子生物学。
医学免疫学、病理生理学、医学微生物学、无机化学、有机化学、生物化学、定量分析、仪器分析、物理化学、基础化学实验、药物化学、天然药物化学、药剂学、药物分析、药理学、毒理学基础、药物的波谱解析、药事管理学、专业技能实验等。
药学专业就业前景 我国的药学事业的发展也是非常迅猛的,许多药品都得到了国际市场的认可,也与外国企业建立了合作关系,但在专业人才方面有稀缺,这表明药学专业有很广阔的发展前景。
社会对药学才的需求正在增加,本专业的大学生就业率高达95%。制药业发展较快,尤其是生活水平提高以后,人们对保健品的需求在增大,企业对药学人才比较青睐。还有一块就是生化药品,这是一个新兴也是尖端的行业,发展前景很好。
药学专业毕业生主要分配到制药厂和医药研究所从事各类药物开发、研究、生产质量保证和合理用药等方面的工作,也有很多人从事药品销售。
药学专业就业方向 本专业学生毕业后可可以到制药厂和医药研究所从事各类药物开发、研究、生产质量保证和合理用药等方面的工作,药学专业就业方向也有很多人从事药品销售。
从事行业:
毕业后主要在制药、医疗、新能源等行业工作,大致如下:
1 制药/生物工程;
2 医疗/护理/卫生;
3 新能源;
4 医疗设备/器械;
5 批发/零售。
从事岗位:
毕业后主要从事医药代表、销售代表、产品经理等工作,大致如下:
1 医药代表;
2 销售代表;
3 产品经理;
4 药剂师;
基于与业务主管部门和登记注册管理部门前期积极的工作交流,“人才联盟”落户海南进入加速实施阶段,相关人才项目的准备工作基本完成,现将近期工作汇报如下:
一、“人才联盟”申请成立进度
积极与相关领导深入沟通交流,在充分阐述“人才联盟”成立的初衷、即将开展的业务范围、广泛深远的社会经济意义以及发展前景的基础上,对可行性征询材料进行了系统的完善。
“人才联盟”筹备委员会已经在第一时间通知所有发起单位、会员单位以及捐资单位按照成立登记申请相关要求完成相关材料的整理,近期提交筹委会进行审核、报送社会团体管理处。
二、首批外籍院士工作站项目
为抓紧落实人才交流大会上关于“百位外籍院士入海南”的签约合作以及推进首批外籍院士工作站项目,“人才联盟”筹委会依托联盟平台优势整合国际人才资源,已经累计与24名外籍院士及2名重要领域博士确立合作关系,外籍院士及博士分别来自俄罗斯、乌克兰、哈萨克斯坦、乌兹别克斯坦和中国,涉及领域涵盖公共卫生、医疗、环境保护、新能源、可再生能源、生物科学、生态系统、农业技术、新材料、机械科学、电真空技术、船舶技术设计和物理化学等领域,分别为农业学、无线电物理学、低温物理学、声学、热物理学、光学、固态物理学、核物理学、雷达技术、电磁场与微波技术、高功率微波技术、超导体学、生物能源、新能源、综合医学、临床医学、病理学、神经生理学、血液学、免疫学、肿瘤学、高科技医学工程、微血管学、心脏外科、分子诊断、基因组学、蛋白质组学、系统生物学、生物化学、分子生物学、遗传学、天然及合成化合物技术、化学物理学、晶体量子化学、固体量子化学、高分子物理学、高分子化合物、纳米材料、复合材料、聚合过程动力热力学、动力工程学、爆炸物理学、核技术以及流体力学等学科的专家。2名外籍博士为各自所在领域的高端技术研究人才,所掌握技术为无线电应用和探地雷达领域核心技术,可填补国内在该领域的空白。
【关键词】生物催化技术发展化学制药研究
生物催化是指通过酶或生物有机体的催化作用实现生物的化学转化,故又被称为生物转化。随着科技的进步和发展,生物催化逐渐进入人们的生产生活,从根本上改善了人们的经济效益、能源消耗和原料来源,对环境保护也作出了积极贡献。生物催化技术是生物技术改革中的第三次浪潮,成为历年来生物技术中的标志性技术。
1.生物催化技术及其发展
(1)生物催化技术。经济合作与发展组织(OECD)指出,生物酶催化技术是目前工业发展中最有利于可持续发展的一项技术。生物催化技术主要涉及到化学领域和生物学领域,在医药化工领域中可通过酶或微生物的催化作用实现大规模生物的转化。生物催化技术在很大程度上促使衍生物往多样性方向发展,实现对复杂产物的结构修饰及简单分子化合物库的新建,产物在经过生物催化后能够延伸出现的生理活动物质。
先导化合物在生物催化作用下具有一定的优越性,主要体现在以下几点:①可能反应的产物范围大;②在反应过程中无需进行脱保护和基团保护,一步便可完成相关反应;⑧实现生产的定向立体选择和区域选择;④生物催化的反应条件温和,利于稳定复杂的分子结构;⑤在均一和温和的反应条件下可获取反应的重现性及实现反应的自动化;⑥由于酶具有固定化特性,故在生产过程中可反复循环使用催化剂。
(2)生物催化技术的发展。生物催化技术的提出是源于科学家对活体细胞成分的认识,一部分的专家和学者认为某些细胞成分可用于特定条件下的化学转化。例如苯甲醛从植物中提取后与氢氰酸结合可制成(R)一苯乙醇腈,半合成抗生素的生产则依靠G酞基转移酶的帮助。1980年后,随着科技的发展和进步,蛋白质工程技术得到空前的发展,使得酶的底物范围大大增加,实现了常见合成中间物的生物合成。在此科技背景之下,生物催化技术逐渐被运用于精细化化学和药物中间体生产领域。
(3)随着近年来基因合成、生物信息学、蛋白质工程和序列分析等观念的进步及电脑建模和生物学工具的更新,越来越多的专家学者在分子生物学的基础上对分子进行快速进化处理,极大的改善了原有的生物催化剂。生物催化剂经过改造后可稳定处:T-60℃的有机溶液中,在接受新的底物时可自动催化新的生物反应。
2.化学制药中的生物催化技术研究
在生物催化技术的发展背景之下,酶和微生物反应成为生物学领域的关注热点。许多长期研究微生物和酶的专家学者开始着手于有机合成的研究,促使生物催化技术逐渐发展成为一项不对称合成的生物技术。
(1)西他列汀游离碱。美国的Codexis公司和德国的Merck公司通过酶做催化剂实现西他列汀游离碱的生产。他们较早发现R构型选择性转氨酶的分子结构类似于西他列汀酮,其中一些分子质量较小的可阻断甲基酮并具有一定活性。而后Codexis公司对转氨-酶进行改造,实现了一种催化加氢路线的构建,且在生产过程中并不产生S丰勾型西他列汀酮。由于该生物技术具有一步到位的优点,故设备的生产能力和分子的反应能力得到有效提高,且在一定程度上降低了废弃物品的产出。
(2)阿伐他汀(立普妥)。6-氰3和5一二羟基乙酸叔丁酯是阿伐他汀(立普妥)生产过程中需要的活性中间体,美国Codexis公司通过生物催化实现此种活性中间体的生产。Codexis公司以分子重组为基础,采用了最先进的直接优化技术,开发了具有稳定性、选择性和活性的3种酶。前手性氯酮在2种优化酶手性选择性的催化作用下发生氢化反应,生成纯手性的氯乙醇。
(3)普瑞巴林。美国的Pfizer公司通过生物催化的方式实现普瑞巴林的生产。基于蛋白质工程技术进行改造的水解酶问世后,运用该水解酶会对S-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸的钾盐进行选择性水解,在温和条件下物质发生一系列水解反应,最终得到普瑞巴林。-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸在脂肪酶的选择性水解下产出-2-羧乙基-3氰基-5-甲基乙酸的钾盐,在此基础上进行化学合成,实现普瑞巴林的制备,可获取40%的最终收率,通过对目标产物的检测可得其ee值为99.7%。
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关键词 嗜盐菌;高盐浓度;细菌视紫红质
中图分类号:Q93 文献标识码:A 文章编号:1671-7597(2013)13-0009-02
1 嗜盐菌的嗜盐机制
1.1 嗜盐菌的细胞壁
1.1.1 成分的特异性
嗜盐菌细胞壁不含有肽聚糖,却有富含酸性氨基酸的糖蛋白,这些带有负电荷的氨基酸比如谷氨酸、天门冬氨酸等。这样在高盐浓度的溶液里面,钠离子会结合在嗜盐菌的表面,正好屏蔽掉这些氨基酸所带的负电荷。因此Na+对于嗜盐菌细胞壁的结构完整具有重要意义。
1.1.2 嗜盐菌细胞壁对一定盐浓度的依赖性
嗜盐菌在高盐的溶液里,钠离子会结合在嗜盐菌细胞壁表面,屏蔽其所带的负电荷。当溶液中的钠离子不足或钠离子被稀释时,蛋白质的负电荷部分就会互相排斥,细胞壁会一块一块地破碎,最终导致细胞裂解。
1.2 嗜盐菌的细胞膜
1.2.1 嗜盐菌细胞膜上的细菌视紫红质
嗜盐菌细胞膜上含有与视觉中的视紫红质相类似的蛋白质,被称为细菌视紫红质(bacteriorhodopsin,bR)。细菌视紫红质有光驱动质子泵功能。细菌视紫红质中视黄醛分子的结构一般是全-反式(all-trans),但是在光照条件下,视黄醛分子会发生13-顺式(13-cis)的结构异构化,H+经中间形态泵出膜外,最后细菌视紫红质返回初态B,这样就完成了光循环。随着质子累积在膜的外表面,质子驱动力增加,直到膜两侧的质子差可以驱动膜上的ATP酶时,ATP酶就可以开始ATP的合成。因此,嗜盐菌可以利用光能进行低速增长,使嗜盐菌更能适应一些能量不足的环境。
1.2.2 嗜盐菌细胞膜保钾排钠的功能
嗜盐菌细胞质中的Na+离子的浓度并不高,但是细胞质中的K+离子的浓度却很高,可以高达7 mol/L。这是由于某些嗜盐菌具有Na+/K+反向转运功能,而这种功能是正是利用了光介导的H+质子泵,它具有向外排放Na+和吸收和浓缩K+的能力。这样可以调节细胞内外的渗透压来对抗细胞外的高渗环境,提高它的耐盐性。
1.3 嗜盐菌的细胞质
1.3.1 嗜盐菌细胞质维持胞内渗透压平衡的方法
嗜盐菌主要依靠两条途径来维持胞内渗透压平衡,其一是细胞中聚集无机盐离子如K+,其二是聚集相容性物质如糖类、甜菜碱和四氢嘧啶等。嗜盐菌还能产生和积累一些相容性溶质,既能帮助正常的细胞代谢活动,又有助于平衡胞内外渗透压。比如在一种嗜盐外硫红螺菌(Ectothiorhodospira sp.)中发现环状氨基酸,它在细胞内含量可达0.25 mol/L,约占胞内全部有机溶质的10%,成为此类嗜盐菌的主要的渗透压调节剂,有助于稳定和保护菌体内酶的活性,使其能够在高盐浓度下正常生长。
1.3.2 嗜盐菌中酶与蛋白质的嗜盐机制
高盐溶液会使普通蛋白质的水膜遭到破坏,导致蛋白质间的疏水作用加强,使蛋白质空间结构发生变换,甚至失活变性。而在嗜盐菌的细胞质中,却含有高浓度的钾离子。这些钾离子不仅能够调节胞内外渗透压的平衡,也是嗜盐菌酶与蛋白质保持活性的条件。嗜盐菌的酶与普通蛋白质不同,它在酶的表面引入了酸性氨基酸的残基。酸性氨基酸能在蛋白质和酶表面形成一层薄薄的水保持层,阻止蛋白质分子与酶相互碰撞,从而避免了它们之间的凝集。同时,碱性氨基酸残基能与酸性氨基酸形成盐桥来消除盐离子的屏蔽效应。相反在低盐浓度下,由于电荷的排斥作用,酶和蛋白质就会变性失活。
2 嗜盐菌嗜盐机制的应用前景
2.1 细菌视紫红质在生物电子领域的应用
细菌视紫红质的非线性光学性、瞬态光电响应性和光致变色性等都特别优秀,因此它在很多方面都拥有广阔的前景,比如生物芯片、神经网络、人工视网膜和光信息存储等领域都有发展前景。另外,在太阳能利用方面,利用bR蛋白质的质子泵作用,可以研制天然的太阳能电池和对海水进行淡化。
2.2 利用嗜盐菌处理高盐度废水
高盐度废水大量含有无机盐离子和有机物质。过高离子浓度对微生物生长有十分强烈的毒性,因此高盐度废水给生物处理带来一定的难度。利用生物方法处理高浓度的污染物,就必须用到嗜盐菌。大多数专家认为,利用生物法处理高盐度废水在技术上是可行的,因为在高盐环境中嗜盐菌对污染物的降解作用十分有效。而嗜盐菌对于盐度的高低十分敏感,盐度对于嗜盐菌处理有机污染物的脱氮、除磷和降解都有或大或小的影响。因此想要用嗜盐菌处理高盐度废水的方法实施起来,还需要在很多方面进一步的研究和改进。
2.3 利用嗜盐菌研制工业耐盐酶
工业上使用的耐盐酶很多都是来自嗜盐菌。在以色列,Mevarechy领导的小组在大肠杆菌中将嗜盐二氢叶酸和苹果酸脱氢酶基因成功表达出来,这使得耐盐酶也能在大肠杆菌中生产。嗜盐菌在工业废水处理中也有很大的作用,嗜盐碱放线菌(Nocrdioides sp.M6)对于2,4,6-三氯酚有很强的降解作用,利用这一特性,可以来处理工业废水,还可用于环境治理等。
2.4 嗜盐菌相容性溶质的应用
嗜盐菌在高盐度的环境中,在胞内形成了很多相容性溶质。这些溶质包括甘氨酸甜菜碱、四氢嘧啶、谷氨酰胺和海藻糖等。羟基四氢嘧啶和四氢嘧啶可以作为稳定剂,它可以保护蛋白质等,使其抗冻、抗盐、抗干燥。在很多化妆品中,羟基四氢嘧啶和四氢嘧啶都是其中的重要成分,例如德国的莫克公司就曾经生产过一种化妆品,就利用它来抗衰老和抗干燥,作为保湿剂。
3 总结
嗜盐菌是极端环境微生物的重要类群,其深入的研究有利于阐明生物多样性形成的机制和与极端环境的适应机制,具有极为重要的科学意义。国内外研究内容涉及极端嗜盐菌微生物的资源调查、物种分析和生化适应分机理研究等,其应用研究主要集中在极端嗜盐酶类、生物表面活性物质和生物纳米材料“紫膜”等方面的开发利用。近年来,极端微生物分子生物学、基因组学和蛋白质组学等方面亦取得重要进展。嗜盐菌在高盐环境中经过长时间的进化,已经成功适应了并且依赖上了高浓度盐环境,拥有了自己独有的嗜盐方法与机制。我们应该加大对嗜盐菌的研究,从中我们可以发现很多生命的奥秘,同时可以开发其用途,进一步造福于人类。
参考文献
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[2]刘会强,张立丰,韩彬,等.嗜盐菌研究新进展[J].新疆师范大学学报(自然科学版),2005,24(3):84-88.
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[4]吕爱军,胡斌,温洪宇,等.极端嗜盐菌的特性及其应用前景[J].微生物学杂志,2005,25(2):65-68.
然而,生命的机制像是一种构件众多而构造复杂的偶合反应链系统,如果不能找到对其核心的基因组行之有效的分析技术,科学家们的诸多探索努力也不过零敲碎打、徒劳无功。
如何取得突破?福州大学生物科学与工程学院特聘教授蔡伟文创立福州大学应用基因组学研究所,在攻克世界公认的比较基因组杂交芯片技术后,继续带领团队,在基因研究这片神秘的天地努力探索。
求学
上世纪80年代,蔡伟文进入中山大学化学系。在那个以陈景润为科学偶像的火热年代,更多“天之骄子”愿意选择数学、物理专业。在老师的劝阻中仍然坚定地选择了化学系,是这个高分考生做出的第一个在人们意料之外的决定。“当时我说不愿意转到物理系,因为不喜欢随大流,如果千军万马都去做一件事情,那么也不一定有很多机会。”这话一出口,周围人就开始意识到,这个早慧又内敛的广东青年,藏着颗做大事的雄心。
1987年,蔡伟文研究生毕业后到华南理工大学,担任化学教师。用他的话来说,这是一段相对沉闷的时光,“不知道往哪儿走。一方面我看到的社会还很落后,很多人需要知识与技术。比如乡镇企业大多是农民办起来的,他们碰到很多技术问题,知识的匮乏会让人们面对非常简单的问题束手无策。另一方面,当时的研究体系还没有深入到为中小企业服务的程度。”在学校里,蔡伟文是没有条件做科研的,但他又心有不甘,于是他从工资里面拿钱买试剂做试验。“一个月工资加补助100多块钱,勉强支撑”。
留学政策稍微松动了一点,蔡伟文就在讲台上“出走”了,步履匆忙又曲折,但是难以撼动,也就是在此时,他做出了第二个“出格”的专业选择:“要去美国留学,我就在想要做什么呢?比我早出去几年的同行,都继续研究化学了,这个学科还是挺成熟的,但我还是想做一些新型研究,希望能有更广阔的发展前景,收获更大。”
凭着似乎与生俱来的科学敏感度,蔡伟文看到,生物技术未来将大有可为。“当时我对生物技术很感兴趣,自己也做了一些基础学习,感到能有所作为的机会比较多,但是由于我是化学背景,申请不到生物系,所以我就选了一所学校,它的化学系基本上研究生物相关方面的化学,比如蛋白质、核酸DNA这一类的研究。”
入行
1991年年初,蔡伟文获得奖学金进入美国纽约大学,师从国际知名的基因组分析技术专家David Schwartz教授攻读博士学位。“导师是专搞DNA研究的,当时就是核酸分析技术,这是分子生物学的一个核心的东西。我选择他的实验室时,很多人都劝我说专业不对口,但我还是去了,而且非常兴奋,因为他搞的东西和别的化学研究是不一样的。”这个在当时看来过于冒险的决定,让他惊喜万分。“像一位诺贝尔奖获得者说的那样,谁接触到DNA研究都会发狂,因为太多的科研方向值得深入研究了。”
蔡伟文果然“发狂”了,仅仅半年时间,他就完成了博士阶段的课题研究,此后不久,又创立了大分子DNA单分子限制性内切酶位点表面固定直接定位方法。这种方法的成功展示确立了DNA单分子物理定位方法的可行性,他的研究成果很快为纽约大学带来了校史上最大一笔工业界研究资助――约1500万美元。
“我的导师原来是搞电泳研究的,他发明了一种技术,就是脉冲电泳。以前电泳里是通过稳压电压直流跑,但他改用交替脉冲电流来跑胶,可让以前无法分离的大片段的DNA分离开。说得形象一点,DNA分子就像刘翔跨栏一样,凝胶就像是栏,大的跳得慢,小的跳得快,这样就能够分开。但是其中有一个问题悬而未决,就是我们的技术不能分离很大的东西,比如很大的核酸,这好比都在高速路上,没什么栏杆要跨,小车跟大卡车速度其实都差不多。所以,我的导师发明了一个技术,把它脉冲一下,我让它跑停、跑停再加速,大的肯定加速就慢,小的就加速快,将分子拉开。”蔡伟文提到,这项技术非常有用,解决了传统技术不能解决的很多问题,但是DNA分子为什么能够分开呢?导师给他布置了“作业”,成了他的博士论文题目。为了完成研究,蔡伟文决定模仿导师的做法,把整个过程录下来,把机理展示给人看。当时觉得很难,但事实上,他只用了半年时间,就基本上把过程拍得一清二楚了。
攻克了博士课题,蔡文伟有了更多的空闲时间,实验室里的其他同事正纠结于大分子DNA内切酶切点定位研究。自从1959年美国物理学家费曼在演说中提到,“倘若我们能按意愿操纵一个个原子,将会出现什么奇迹?”操纵单个分子、单个原子就一直是科学家们追求的目标,导师的整个实验室也都围绕着相关课题进行研究,眼看着不少同事耗费了大量时间一无所获,蔡伟文决定另辟蹊径,“想把内切酶定位放置在DNA分子链上后做物理图谱,是比较理想化了,一个小时才盯住看一个分子,基因组大概有两三万个片断,什么时候能把图谱都做出来。我们不过是要那个信息,完全可以切完以后再去看,不需要将整个酶切过程录像”。
“我也花了些时间研究DNA怎么粘,不粘DNA怎么把它固定,这个环节还不算难,难点在于,你要把DNA分子拉直并固定在表面上,同时酶还能把它切开。没人这样做过,我也不知道这样行不行。”
又是半年废寝忘食的反复试验,内切酶弄不开,切不掉,跟死在上面一样。蔡伟文耗尽了心力,终于发现,如果有足够的时间,这种思路是完全可行的。大分子DNA单分子限制性内切酶位点表面固定直接定位方法一旦取得突破,整个实验室就活起来了,论文迅速发表,资金投入进来,目前这项研究成果已经应用到仪器上,迈入了商业化轨道。
立业
杰出的科研成绩,让蔡伟文顺利拿到了博士学位。他又一次走到了专业选择的十字路口。
现实又坚硬的社会生态,让他更清晰地看到了美国城市的丛林法则,“工作岗位并不是一成不变的,竞争性很强,流动性很大,整个社会都在一个不断优化组合的状态中。所以我就想,做什么才是最有发展前景的”。
基因芯片很快吸引了他的注意力。此时,随着分子生物学相关学科的迅猛发展,越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定,基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得越来越重要。
而基因芯片的检测原理是核酸杂交方法的微型化,通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列检定的方法,在一块基片表面固定了序列已知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列,与基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时,通过确定荧光强度,获得样本中待检序列完全互补的探针序列的数量。蔡伟文介绍说,“我感到它特别适合我的研究背景,因为几年来,我就是在看DNA怎么固定在表面上,而做基因芯片的核心技术就是这样的。比对了一些已经发表的论文,我感到他们的的核心技术和我们的设想相比,有很大差距,所以就更加有信心了”。
1996年年底,蔡伟文获得耶鲁大学管理的Jane Coffin Childs纪念基金资助,并进入美国贝勒医学院分子与人类遗传系,师从国际知名的转基因技术专家Allan Bradley教授从事博士后研究。博士后研究期间,他顺利开发出了独特的生物芯片制备方法并获得专利,彻底解决了当时基因芯片技术应用中困扰学术界的非特异性表面荧光背景问题。不久之后,在关键技术的基础上,蔡伟文成功开发出实用的比较基因组杂交芯片技术,成为世界上第一个“吃螃蟹”的人。与此同时,他提出一种了创新的大基因组高效测序策略,并在贝勒医学院的人类基因组测序中心得到实施,用于多个基因组的测序项目中。
提及技术突破,蔡伟文中肯地说:“专门想搞技术为生的人非常少,原因有两个:第一,技术研究难度大;第二,发表东西十分缓慢,放在当下功利化的评价系统里面,它产出不是很高。我们做技术又经常遇到细节问题,卡在一个环节上,就很难推进,但是,如果想做前沿研究就意味着很多东西得从头做起。咱们中国古话说,工欲善其事,必先利其器。传统技术3年才能做到的事情,利用新技术可能我们几个星期就可以完成了,甚至能突破以前没法做到的事。”
同样是在2000年,蔡伟文被贝勒医学院分子与人类遗传系破格提升为终身教职线助理教授并兼任贝勒医学院的人类基因组测序中心助理教授,开始主持独立的实验室,围绕独创的比较基因组杂交芯片技术平台进行规模化技术开发和应用研究。这个实验室是全球唯一同时拥有覆盖人和小鼠的全基因组BAC克隆芯片的实验室。源于同一技术优势,蔡伟文的实验室最先观察到人类和小鼠的基因组中普遍存在的大片段DNA拷贝数变化的现象。目前对这一现象的研究已成为基因组学研究的一大热门方向。
丰硕的研究成果,让蔡伟文成为是国际公认的比较基因组杂交芯片技术的先驱者之一;两度任加拿大重大基因组项目评审专家;曾主持和参与近十项由美国NIH、NCI、能源部和宇航局资助的研究项目;在权威国际学术杂志发表48篇具有重要创见的学术论文,已获得6项美国授权专利,待授权专利多项。
拓路
2011年,蔡伟文受聘为福州大学生物科学与工程学院特聘教授,创立福州大学应用基因组学研究所,主要研究方向是将新一代DNA芯片技术和新的DNA测序技术相结合,对临床重大难题,如多种癌症和出生缺陷的基因缺陷特征进行广泛和深入研究,并致力于将现在国际上的前沿研究成果推向临床应用。为了加速度搭建国内的科研平台,他又做了一件史无前例的事情,花了数量可观的美金将美国实验室的整套设备自费买出来,以整体平移的方式置入福州大学。
提及这个细节,他说:“我回国的想法很简单,首先,我的技术在出生缺陷的产前筛查方面有比较好的应用前景。优生优育是我们国家的一个政策,但说实话,现在并没有什么特别好的技术。我在研究技术应用的时候,所有的环节都是考虑中国如何使用而设定的,如果技术推出去,首先希望造福自己的同胞。”除此之外,蔡伟文还对出生缺陷的相关基因研究十分感兴趣。在这一方面,国内也可以找到不少罕见的病例。
计算机科学技术的发展飞快,已经渐渐融入人们日常生活的点点滴滴中,快速发展中不免有些隐患,因此谨慎分析现状也是十分有必要的,对计算机科学的进一步发展也有着积极意义。如今,计算机科学技术作为一个生命力强、发展前景良好的科学技术,在个人、家庭、企业乃至国家各个层面区域的应用都很广泛,在开发成本、运行速度以及使用性能等方面都取得了不小的突破。同时,计算机科学的发展也带动了集成电路技术、网络技术、软件工程、材料科学等领域的快速发展,各个行业相辅相成,共同向前进步发展。在这个信息化的时代,计算机已经融入了千家万户的生活与工作中,在各个行业如工农业、文化教育行业、社会服务业等之中都发挥着不可代替的重要作用,对于社会来说已是不可缺少的一部分。其中最重要的则是计算机科学技术在社会生产方面的作用。随着全球信息化时代的进步,人与人之间、生活与工作之中,信息传递是格外重要的。而计算机科学技术则是通过互联网的作用改善信息传递的方式,加快其速度,从而促进了信息技术行业的发展。同时,人们对于信息的认识也与日剧增,从而对信息选择的要求也越来越高,精确性、有效性、及时性都是人们所追求的目标。由于计算机与网络的运行形势,使得人们的劳动方式与工作模式也得到了转变。秀才不出门,能知天下事。人们可以足不出户得完成工作与学习任务,节省了更多人力物力去完成其他的事情,对行动与思想方面也有一定的解放作用。这正是说明了科技乃人类社会第一生产力。另外,计算机科学技术带动了信息技术的发展,信息技术也推动着电子技术、生物技术以及新能源新技术的研发等领域的快速发展。
2计算机科学技术的发展前景
2.1生物计算机
早在1994年3月就有一位美国科学家提出了生物计算机这一设想。将DNA碱基序列当做信息的编码载体,利用当今的分子生物学技术,适当使用控制酶,改变DNA碱基序列并使信息有效反映出来,对数据进行运算。DNA计算机设想的出现有效拓宽了人类对计算机了解的视野,改变了计算机仅仅只是简单是物理性操作的性质,增加了操作方式。如今,英国生物信息研究院的研究人员做出的重大突破使得人们对信息储存的认识有了进一步的转变。科学家们将文学家莎士比亚的154首诗歌的音乐文件(mp3格式)以及相关的照片编制了DNA序列,使得储存密度大大增高,这一消息使得人们对生物计算机的构想进一步贴近现实。
2.2量子计算机
其特性即原子的同一时间点处于不同位置之间。在数据信息处理,数据储存两方面,量子位的能力较晶体管电子位来说都是存在很大进步的。
2.3光子计算机
光子计算机做出的重大突破即为可以利用光速来完成电子储存以及运算等工作,与传统的芯片计算机相比其运行速度大大增加。其实早在20世纪50年代后期就有科学家提出光子计算机这一设想,同时这一设想也在逐渐向现实发展前进着。1986年,戴维•米勒研制出小型的光开关,使得贝尔实验室的艾伦•黄研制的光处理器有了一定的基础,在1990年的1月,光计算机的工作正式开启。在元器件方面,光计算机有两种类型,即光电混合型与全光学型。贝尔实验室成功工作的光计算机采用的就是混合型元器件。然而相比全光学光子计算机,其运行速度还是有些逊色的。要想将全光学光子计算机成功的研发并制作出,必需研发出一种特殊的“晶体管”,这种晶体管能够用一条光来控制另一条光。然而现今存在的光学“晶体管”存在很大的问题,笨拙且较大的体积是无法适用在光子计算机里的。因此,对光子计算机的研发工作还需要很大的努力,还有很长的一段路要走。
3总结
基因扩增是分子生物学领域的常用研究手段,目前应用最广的是常规PCR和real-timePCR技术[1],因其灵敏度高,特异性强,已成为分子生物学领域的关键技术。但PCR方法的操作较复杂,对操作人员和仪器设备的要求都较高,不适合基层及现场的快速检测。随着分子生物学技术的不断发展和改进,新技术不断涌现,TsugunoriNotomi等[2]于2000年提出了LAMP,一种新颖的核酸扩增技术,利用该技术只需在恒温条件下(60~65℃)保温几十分钟就可快速完成核酸的扩增,无需购置昂贵的PCR仪,操作简单,快速,可用于现场的快速检测,近年来已得到广泛的应用。本文综述了LAMP技术的基本原理、相对于传统核酸检测技术的优点、产物的检测方法及其临床应用,最后指出LAMP目前存在的不足以及应采取的相应措施,并对其发展前景进行了展望,从而为LAMP技术在临床研究上的应用提供参考。
1LAMP法的原理及特点
1.1LAMP引物的设计LAMP技术的核心之一在于引物的设计,因此,设计出特异性强的引物是进行LAMP实验的首要任务。LAMP引物由一对内引物(FIP与BIP)和一对外引物(F3与B3)组成,其中FIP由F1c和F2组成,BIP由B1c和B2组成,严格针对靶基因3'端的F1c、F2c和F3c区以及5'端的B1、B2和B3区而设计[3],结构组成如图1所示。
1.2扩增原理DNA在65℃左右处于动态平衡状态,此时,任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时,另一条链就会解离,变成单链[4,5]。据此,LAMP反应被划分为2个阶段,即起始物合成阶段和循环扩增阶段。在第1阶段,内引物FIP首先与模板F2c区结合,启动互补链的合成,产生双链DNA。接着,引物F3与F3c互补配对,在BstDNA聚合酶的作用下,启动链置换反应,并释放出由FIP引导合成的单链,此单链的5'末端存在互补序列(F1c和F1),于是通过碱基互补配对形成一环状结构。以此链为模板,与FIP和F3类似,在BIP和B3的作用下,在DN段的另外一端产生了新的环状结构,于是整条链呈哑铃状结构[6],如图2所示,到此,第1阶段反应完成。循环扩增阶段,以哑铃状结构为模板,FIP与茎环区域F2c杂交,同时,F1c与F1结合,启动新一轮链置换反应,解离出由F1引导合成的双链核酸,并释放由F2引导合成的单链,此单链两端均成环状结构,BIP与茎环区域B2c互补,启动新一轮扩增。如此不断循环,茎的长度和环的个数都不断增加,最后的产物为茎-环状DNA与花椰菜状DNA所组成的混合物。
1.3LAMP技术的优点与普通PCR相比,LAMP具有许多优点:①特异性强,引物的设计须严格针对靶基因的6个区域,任何一个不匹配就会导致反应无法进行;②灵敏度高,可检测出1~10拷贝的模板,比PCR高出10倍的检测限[7];③反应时间短,只需在恒温条件下保温30~60min就可完成扩增;④设备简单,不需要昂贵的PCR仪和特殊的试剂,只需一台恒温设备就可进行;⑤产物易检测,只需用肉眼观察有无白色浑浊或有无绿色荧光,就可判断扩增是否发生。LAMP与普通PCR的比较结果见表1。
1.4LAMP产物的检测反应结束后,对结果进行判定常用琼脂糖凝胶电泳检测、浊度检测、荧光比色检测和荧光实时定量检测
1.4.1浊度检测随着核酸的大量生成,溶液中会发生如下反应:(DNA)n-1+dNTP=(DNA)n+P2O4–7P2O4–7+2Mg2+=Mg2P2O7(白色)由dNTP析出的P2O4-7与溶液中的镁离子结合,生成肉眼可见的焦磷酸镁白色沉淀,通过与阴性管比较反应液的浑浊情况,或用浊度仪检测其在400nm处的沉淀浊度,就可判断扩增的有无。
1.4.2荧光比色检测对LAMP产物进行荧光比色检测时,常用的染料有SYBRGreenⅠ、钙黄绿素、HNB、溴化乙淀和Picogreen等[8]。其中,SYBRGreenⅠ和HNB的检测灵敏度最高,是钙黄绿素的10倍[9],然而SYBRGreenⅠ不能在反应前加入LAMP体系中,否则会抑制反应[10],而反应后加就必须开盖,又违反了LAMP不开盖原则,造成气溶胶污染。HNB则是在反应前加入体系中,避免了开盖污染的问题,扩增结束后,阳性管呈紫色,阴性管呈天蓝色,由此,可判断靶基因的有无。
2LAMP技术的应用
LAMP技术自2000年开发以来,因其简便快速,操作简单等优点,已广泛应用于细菌、病毒、寄生虫和动物胚胎性别鉴定等检测中。
2.1细菌的检测YoshiteruAoi等[11]利用LAMP对环境中的氨氧化细菌进行了测定,结果可检测出10个拷贝数的DNA,具有与real-timePCR相同的灵敏度,且背景DNA对LAMP的检测干扰很小,可忽略不计。徐芊等[12]将LAMP用于检测副溶血弧菌,直接对食品样品进行检测,只用一台恒温水槽,65℃反应1h,即完成扩增反应,与传统培养方法相比,大大缩短了检测周期,检测限达到89cfu/g。叶宇鑫等[13]将原位荧光LAMP技术应用于食品中沙门氏菌的检测,与传统沙门氏菌检测方法和PCR方法相比,原位荧光LAMP无需破碎细胞提DNA,反应方便易行,耗时少;恒温条件(63℃)下反应,避免了原位PCR方法过高的循环温度(95℃)对细胞结构的破坏;在检测人工污染的样品时,结果没有受到杂质的影响,可以检测到样本中的单个细胞。张宏伟等[14]以荚膜脂多糖合成调控子resA为靶基因片段,设计了肺炎克雷伯菌特异性引物,建立了LAMP检测方法,灵敏度可达2.2~3.4CFU/100g,检测流程可缩短至2d,比PCR法更加快速。董培陪等[15]结合LAMP与横向流动试纸条技术(Lateralflowdipstick,LFD)建立起一种鳗利斯顿氏菌快速检测方法,能在30min内完成检测,灵敏度为7.7cfu/ml,比常规PCR方法高一个数量级,通过与横向流动试纸条检测技术结合,进一步克服了由非特异性扩增导致的假阳性。可见,将LAMP技术用于细菌检测时,其检测限比常规PCR更高,与real-timePCR法相比则具有相同的灵敏度,无需分离培养细菌,可直接提取感染动物组织基因组进行扩增[16],操作更为简单、方便,且不需要昂贵的仪器,该方法有望成为细菌检测的常规手段。
2.2病毒的检测
2.2.1DNA病毒TingCai等[17]利用LAMP方法检测血清样本中的HBV,并与real-timePCR法进行了比较,结果表明两者的检出率一致,且对于低浓度的样品,LAMP的准确率更高,更适用于临床检测。李明云等[18]根据对虾白斑综合症病毒(WSSV)的结构蛋白VP26基因序列,设计一套引物,建立了针对WSSV的LAMP检测方法,可检测到最低模板浓度为0.563pg/μl,灵敏度比常规PCR法高1个数量级,并且当模板浓度由10-5倍稀释到10-6倍时,PCR产物浓度显著降低,受模板浓度的影响较大,而LAMP的扩增产物浓度则基本不受影响。张侃等[19]将LAMP用于伪狂犬病病毒的检测,在45min内完成检测,其特异性与PCR方法一致,敏感性则是PCR的100倍,最低能够检测10个拷贝的目的基因。
2.2.2RNA病毒LeoL.M.Poon等[20]于2004年首先建立了针对SARS的RT-LAMP技术,通过对31例SARS患者的检测,检出率为64%,其灵敏度略低于实时PCR,但是比常规PCR法更高。TetsuoYoneyama等[21]用RT-LAMP法检测了粪便中的HAV,实验中加入了环引物,将检测时间缩短至50min,与RT-PCR法(需要2~3h)相比大大节省了时间;对HAV实验室病毒毒株的检测,灵敏度为0.4~0.8FFU/5μl,与侵染性实验法相当,且能检测到HAVⅢ型,比real-timeRT-PCR法的检测范围更广,可作为基层疫情监控的常规检测方法。聂凯等[22]采用一步法的RT-LAMP检测人甲型H1N1流感病毒基因,在反应体系中直接加入反转录酶,大大简化了LAMP技术用于RNA病毒检测的操作步骤。此外,LAMP技术在检测艾滋病病毒[23]、鹅细小病毒[24]、猪繁殖与呼吸综合症病毒[25]、人星状病毒[26]、单纯疱疹病毒Ⅰ型[27]、猪圆环2型病毒[28]等方面均有报道,无论是DNA还是RNA病毒LAMP都能做到快速检测,在检测RNA病毒时更是省去了RT-PCR法中费时的反转录步骤,在临床检测上显示出越来越重要的地位。
2.3寄生虫的检测HiromiIkadai等[29]将LAMP法用于巴贝斯虫的检测,证实LAMP具有与PCR和光学显微镜同样的敏感性,而且更加简便,快速。李群等[30]为提高牛巴贝斯焦虫病的检出率,采用LAMP法进行了检测,结果表明,LAMP检测体系特异性强,与双芽巴贝斯焦虫DNA不发生交叉反应;敏感性高,最小检测值为0.014fg,为一般PCR法的103倍。Jun-HuChen等[31]用LAMP法对间日疟感染患者进行诊断,在117例镜检呈阳性的血清样本中,LAMP检出115例,灵敏度和特异性与镜检法和nestedPCR法相近,但是操作更加简单,不需要昂贵的仪器,且对DNA的抽提要求不高,有望成为检验科或疟疾诊所的常规诊断方法。
2.4动物胚胎性别的鉴定LAMP在动物胚胎性别的鉴定方面也有应用,HirokiHirayama等[32]首次利用LAMP法检测牛胚胎的性别,鉴定的准确率为88.9%~94.4%,整个鉴定过程不超过1h。KhairyM.A.Zoheir等[33]也成功将LAMP用于牛胚胎性别的鉴定,以EB和CuSO4为指示剂,反应45min即可通过肉眼观察颜色的变化,从而鉴定出雌雄,准确率达100%,简单快速,成本低,可用于养殖场现场操作。
3不足与对策
3.1存在的不足对扩增产物定量检测时,需要购置昂贵的荧光定量PCR仪或浊度仪;LAMP法的扩增靶序列长度控制在300bp以下,对引物要求高,由在线软件设计的引物有上千条,要筛选出合适的引物需要耗费大量的工作;LAMP灵敏度高,一旦开盖容易形成气溶胶污染;传统PCR产物的电泳图都是呈现单带,而LAMP法阳性反应则是呈阶梯状条带,因此,若有非特异性扩增的产生,则不易辨别,造成LAMP容易出现假阳性。
3.2对策严格做好防污染工作,体系的配制一定要在超净台内进行,实验器材要进行消毒灭菌;BstDNA酶最后加入体系,若有必要可以在体系上覆盖一层矿物油;LAMP体系的配制和检测必须要严格分区,操作人员往返两区域进行实验时要更换实验服,同时要尽可能地避免无关紧要的人员流动,凡进入检测区的实验器材都不要再拿回配制区。由于开盖检测容易造成气溶胶污染,所以反应结束后最好不要打开PCR管,可采用反应前加入HNB染料的方法对扩增产物进行定性检测。一旦出现污染,应立即停止实验,每天给实验室通风,给超净台紫外灭菌并通风,一段时间后更换所有试剂再做。采用HidenoriTani等[34,35]提出的ABC-LAMP技术对LAMP产物进行定量,该方法主要是在反应体系中加入探针AB-QProbe和已知浓度的内标,探针的荧光值代表靶基因与内标的比值,随着反应的进行,靶基因与内标被同等程度扩增,通过测定反应终点两者的荧光值之比,结合内标的初始浓度就能对初始模板定量,从而实现了以较低的成本对产物的定量检测。