动物行为学分析精选(九篇)

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第1篇：动物行为学分析范文

关键词：帕金森病；大鼠；6-羟基多巴胺

帕金森病（PD）是常见的中老年人中枢神经系统退行性疾病，其病因及发病机制目前尚不清楚， 研究认为可能与遗传、环境因素、线粒体功能障碍、兴奋性氨基酸、氧化应激、过多的自由基形成及神经生长因子缺乏等有关，是多种机制协同作用的结果[1-2]。偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD动物模型之一，其在症状、病理、生化方面的表现与人类PD有不少相似之处，但该模型的损伤程度因6-OHDA的剂量、浓度、注射位点不同而存有争议，特别是对损伤早期大鼠行为学方面的观察比较缺乏。本实验通过观察6-OHDA损伤早期PD大鼠行为学及黑质部位组织学的变化特点，验证损伤早期PD大鼠模型的稳定性及可靠性。

1资料与方法

1.1一般资料 选用健康雄性SD大鼠40只， 体重 250～300 g，由南通大学实验动物中心提供。6-OHDA、抗坏血酸干粉剂、盐酸阿朴吗啡（apomorphine）、抗酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase， TH）抗体均购于Sigma公司。

1.2方法

1.2.1实验动物分组 40只SD大鼠随机分为三组：①空白对照组（n=8）；②6-OHDA模型组（n=24）：分为24 h组（n=8）、7 d组（n=8）和28 d组（n=8）3个亚组；③假手术组（n=8）。

1.2.2动物模型 模型组大鼠用复合麻醉剂（含戊巴比妥钠、丙二醇、硫酸镁等，0.25 mL/100 g体重）腹腔注射麻醉，待大鼠后肢回缩反射及角膜反射消失后，将其头部水平位固定在脑立体定位仪上，剪除颅顶鼠毛，碘酒、酒精消毒皮肤，沿中线切开一长约2cm切口，充分暴露前囟，参照Paxinos & Watson（1996）《大鼠脑立体定位图谱》确定左侧前脑内侧束（mfb）三维坐标位置，选取mfb区坐标：前囟后2.8 mm，中线左侧2.0 mm，硬膜下8.2 mm。根据注射位点确定钻颅部位，手术刀尖小心钻开一直径约2 mm颅骨孔，微量进样器缓慢进针至靶点，留针10 min，以9 ng/s的速度注入2 μg/μL 6-OHDA 4 μL（含0.02%抗坏血酸），注射完毕后留针5min，以1mm/min的速度退针。手术完毕，用明胶海绵堵塞颅骨孔，适量青霉素涂敷创口，消毒缝合皮肤，放回笼中饲养。并于24 h、7 d、28 d分别检测大鼠行为学和组织学的改变。假手术组同法予含0.02%抗坏血酸的生理盐水4 μL，空白对照组不作任何处理。

1.2.3行为学检测

1.2.3.1跨步调节试验[3] 将大鼠身体的后半部分拖起 ，并使大鼠身体重量仅由一侧前肢支撑 ，记录10s内大鼠这一前肢走步次数 ，然后同法检测另一前肢的情况，以损伤对侧前肢行走次数所占比例（损伤对侧前肢行走次数/（损伤对侧前肢行走次数+损伤侧前肢行走次数））为评价指标。

1.2.3.2姿势不对称性试验[4] 握住鼠尾的中后部将其提起，悬空于实验台上方约10 cm处，使大鼠头向下处于垂直状态， 以其偏离垂直轴不超过10°为垂直位（标准位），记录大鼠头或上身左右摆动的情况，以摆动偏离垂直位并再返回到垂直位记数为1次。观察45 s内大鼠头或身体转动的方向和次数，以向损伤对侧摆动的次数所占比例（损伤对侧摆动的次数/（损伤对侧摆动的次数+损伤侧摆动的次数））为评价指标。

1.2.3.3阿扑吗啡诱发旋转试验 模型组分别于术后24 h、7 d、28 d于动物腹腔内注射阿扑吗啡0.5 mg/Kg 诱发大鼠向右侧（健侧）旋转，于阿扑吗啡注射后5 min开始记录，持续记录30 min。以24 h诱发旋转次数210次/30 min为合格模型。

1.2.4组织学检测

1.2.4.1动物灌注、固定、取材、切片 各组大鼠在最后一次行为学检测后，用复合麻醉剂麻醉，剪开大鼠胸腔，经主动脉快速灌注生理盐水（37℃）150～200 mL冲洗，至大鼠肝脏发白，流出液基本无色为止。随即灌注4%甲醛（4℃）先快速灌注 200 mL，再缓慢灌注300 mL，至头与四肢均已发硬。断头取脑，置于4%甲醛，放4℃冰箱固定4 h，再依次置入20%及30%蔗糖磷酸盐缓冲液内，存4℃冰箱至脑块沉入瓶底。取中脑黑质组织块进行冠状连续冰冻切片，片厚20 μm。

1.2.4.2抗TH染色 作漂片SABC法染色，具体步骤依次为：冰冻切片用0.01 M（pH7.4）磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次，5 min/次。0.3% H2O2抑制内源性过氧化物酶活性， 0.02 mol/L EDTA（95℃）复性（2 min），非免疫的正常羊血清，室温下孵育30 min，抗TH抗体（1∶1000，抗体稀释液稀释），37℃孵育4 h， SABC试剂，室温下孵育1 h， DAB显色（阳性产物为棕黄色）。以上各步骤之间均以0.01M（PH7.4）PBS漂洗3次，5 min/次，正常羊血清与抗TH抗体孵育之间不漂洗。显色后贴片，自然风干，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.4.3 TH阳性神经元记数 各组大鼠取包含黑质致密部最明显的中脑切片，在×100倍显微镜下计数两侧黑质有完整细胞体的TH阳性细胞，计算左侧与右侧黑质TH阳性细胞数的百分比（左侧黑质TH阳性细胞数/右侧黑质TH阳性细胞数×100% ）。参照蔡文琴等[5]介绍的神经细胞计数方法进行细胞计数。

1.2.5统计学分析 数据结果均使用 SPSS13.0软件进行统计学分析。数据资料采用均数±标准差（x±s）表示。单因素方差分析进行差异性检验，P

2结果

2.1行为学观察 对照组及假手术组大鼠经阿扑吗啡诱发后无旋转行为，也未出现非药物诱发的行为学改变。模型组大鼠在注射6-OHDA后数小时即出现损毁侧肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧缓慢旋转，不能进行直线或随意爬行。

2.1.1跨步调节试验 对照组及假手术组大鼠两侧前肢10 s内跨步次数基本相同，模型组大鼠在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h跨步调节试验评分出现有意义减少，7 d及28 d评分进一步减少，见表1。

2.1.2姿势不对称试验 在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，姿势不对称试验结果显示模型组大鼠头部和身体出现向右侧转动次数有意义增加，7 d及28 d姿势不对称试验评分进一步增加，对照组及假手术组大鼠头部和身体向两侧转动次数大致相同，见表2。

2.1.3阿扑吗啡诱发旋转试验 在注射6-OHDA后24 h，阿扑吗啡腹腔注射诱发大鼠以右侧后肢为支点，首尾相接向右侧旋转，30 min旋转次数210次/30 min，对照组及假手术组大鼠未诱发出旋转行为，见表3。

2.2组织学检测 抗TH染色结果显示，在左侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h，大鼠左侧黑质TH阳性神经元数目出现有意义减少，高倍镜下见少部分神经元出现胞体肿胀、核膜界限消失等变性征象，部分神经轴突断裂、错乱；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元几乎消失，残留的TH神经元表现出染色质浓缩坏死现象，神经轴突散在稀疏；模型组大鼠右侧黑质TH阳性神经元数目同时也有部分减少；对照组及假手术组大鼠两侧黑质TH阳性神经元无明显改变，见表4，图1。

3讨论

研究PD需要建立稳定可靠的模型。6-OHDA是一种选择性中枢儿茶酚胺能神经元毒性物质，具有很强的呼吸链抑制作用，偏侧6-OHDA损毁模型是目前使用最多的PD模型之一。1970年Ungerstedl[6]首先报道了应用6-OHDA成功制备大鼠偏侧PD模型，这种模型能够在多巴胺能药物的诱发下产生旋转行为，以便于判断模型成功与否。阿扑吗啡是多巴胺（dopamine，DA）受体激动剂，能够引起该模型向健侧旋转，这是由于损伤侧纹状体多巴胺含量下降，多巴胺D2受体代偿性大量增加，且敏感性增高，出现超敏现象[7]，此时应用DA受体激动剂使损伤侧兴奋作用占优势而产生向健侧旋转。

PD的神经保护治疗需要早期进行，评估6-OHDA损伤早期大鼠行为学变化，可进一步明确模型是否成功及神经保护性治疗是否有效。阿扑吗啡诱发旋转试验结合非药物诱发的行为学试验，其评估结果更加有效、可靠[8]。在偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后数小时，大鼠出现肢体动作减少，身体重心偏向损毁侧，并出现身体向损毁侧不自主旋转，不能进行直线或随意爬行，6-OHDA注射后24 h大鼠跨步调节试验和姿势不对称试验出现有意义改变，腹腔注射阿扑吗啡后可诱导大鼠在原地向健侧旋转，以健侧后肢为支点，首尾相接，形成环状，但旋转次数

偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后24 h大鼠出现行为学和组织学方面的变化，为检测模型的稳定性和可靠性，实验设立6-OHDA损伤后7d和28d组。结果显示：大鼠行为学改变较24 h组更加显著，阿扑吗啡诱发旋转次数>210次/30 min，符合成功PD模型标准；7 d和28 d时大鼠左侧黑质TH阳性神经元减少90%。偏侧前脑内侧束注射6-OHDA后，损伤对侧有部分DA能神经元丢失，可能与药物的渗透作用或经血液循环等有关。

综上所述，通过早期行为学检测，可为神经保护性研究确立合格的PD模型，避免了药物提前干预存在的药物显效与模型失败之间的争议。

参考文献：

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第2篇：动物行为学分析范文

关键词：银杏平颤方；MPTP；形态学；行为学；帕金森病；中药

中图分类号：R285.5

文献标识码：A文章编号：

1673-7717（2008）11-2348-04

Experimental Study on Treatment of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe

and Its Diffrent Combination on the Behavioral Test and Morphology in the Model

Mouse with Parkinson Disease

ZHANG Jun1,LI Qianjun1,SHUN Hongmei1,BAI Limin1,QIU Tingjian3

（1.Guangzhou University of Chinese Medicie,Guangzhou 510120,Guangdong,China;2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China;3.Hulin Hospital of TCM,Hulin 158400,Heilongjiang,China）

Abstract：Objective：To investigate the effect and its mechanism of Chinese herb recipe in the treatment of PD，to measure the effect of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe and its three similar prescriptions on the behavioral test and neurons in substantia nigra compacta（SNc）and striatum of model mouse for PD．Methods：The Parkinson’s disease model was established by consecutive administration of MPTP to C57／BL mice． The doses of Ginkgo Biloba Pingchan Recipe were respectively given for 2 weeks and 4 weeks in the treatment groups. Animals were examined behaviorally with the pole test consecutively. then killed，Taking out the forebrain and striate body were observed in morphology by HE.Results：(1)Ginkgo Biloba Pingchan Recipe(GBPR) and its three similar prescriptions improved the dyskinesia of PD mice and showed different disability in pole the test and decrease of spontaneous motor activity, the model group mice demonstrated dyskinesia, scores obtained from the behavioral test were increased significantly compared with Normal control group. While the scores in treatment groups showed a marked decrease to some degree (allP0.05).(2)GBPR and its three similar prescriptions protected neurons in SNc. The HE showed that, there were seldom neurons in SNc in model group;while there were much more neurons presented in the treatment groups than that in model group.Conclusion：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe plays role in improving disability in pole test and increased spontaneous motor activity and in protection the neurons．

Keywords：Ginkgo Biloba Pingchan Recipe;MPTP;behavioral test;morphology;Parkinson’s disease；Chinese medicine

帕金森病又称震颤麻痹，是一种好发于中老年人[1]的多巴胺能神经元功能降低引起的锥体外系慢性病，现在多数学者认为与氧化应激－自由基有关[2-3]。原发性帕金森病的主要临床症状和体征为静止性震颤、肌强直、少动和障碍。有时可出现面目呆滞、发音低、书写字体过小、唾液增多、皮脂外溢、体温增高、出汗增多、便秘、疲乏、手脚痉挛引起的疼痛、抑郁及情感方面改变等。延缓PD功能障碍的抗氧化治疗有诱发精神障碍的副作用[4-5]。为了研究探讨PD的发病因病机，建立了不同的动物模型。以往的研究已证实MPTP小鼠模型的生物化学和组织化学特征均与临床PD相似。因此，本实验采用以MPTP腹腔注射诱发PD小鼠模型，观察PD小鼠行为学、病理学的变化，研究中药银杏平颤方及其拆方对PD小鼠行为及DA能神经元形态结构的影响，以探讨其防治PD的机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物C57/BL6J小鼠，雄性，6～7周龄，体重（18±2）g，购于北京维通利华公司实验动物中心。动物自由进食饮水，动物房12h光、暗交替，平均温度22℃，相对湿度30%。

1.1.2主要仪器1510石蜡切片机：德国LETIZ公司。H-160万能研究显微镜：美国POLYVAR公司。Olympus BX5显微镜：日本Olympus株式会社。Image-pro Plus 5.0图象分析系统:日本Olympus株式会社。自制小鼠测试杆。

1.1.3化学试剂MPTP（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine）购于美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1中药制备乙醇提取法获得浸膏,溶于蒸馏水中，根据药理学方法计算小鼠给药量[6]，动物用药量根据成人6倍量计算，按照每次灌胃量0.5mL配制。0.1mPa灭菌15min，4℃保存备用。每次腹腔注射MPTP前40min给小鼠灌胃。

1.2.2小鼠PD模型的建立参照Nobutaka Arai,Kazuaki Misugi的实验方法[7]，略加修改，小鼠造模前采用爬杆法[8]进行筛选：动物给药前，先引导动物在15s内由杆顶爬至杆底，每只训练4次，训练完毕对其进行测定，选用0分C57-BL/6J小鼠（评分标准见表1），用生理盐水配制的0.3%MPTP（按30mg•kg-1•d-1）腹腔注射，连续5天。

1.2.3动物分组及处理选取0分小鼠随机分成6组,每组12只: ①正常对照组(简称正常组，Normal control，NC)：不作任何处理。②模型对照组(简称模型组，Model control，MC)：生理盐水每天灌胃0.5mL/只。③银杏平颤方全方治疗组(简称全方组,Ginkgo Biloba Pingchan Recipe,G)：灌胃全方中药每天约0.5mL/只(含生药量1.18g/mL)。④清热解毒方治疗组(简称解毒组,Jiedu Recipe,J)：解毒中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。⑤平肝熄风方治疗组(简称平肝组,Pinggan Recipe,P):平肝熄风中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。⑥化瘀通络方治疗组（简称化瘀组,Huayu Recipe,H）:化瘀通络中药灌胃每天约0.5mL/只(含生药量0.6g/mL)。第②～⑥各组从造模第1天开始灌胃，每次腹腔注射MPTP前40min给小鼠灌胃，各治疗组给予相应中药灌胃，模型组给予生理盐水灌胃。MPTP用生理盐水配制，每日30mg/kg腹腔注射，1日1次，各组连续用药5天。以上各组每日进行2次爬杆试验并进行评分，结果进行统计学处理。动物的存活期分别是造模开始14天和28天。

1.2.4小鼠行为学测试爬杆实验：所用工具为一直径13mm、高760mm的光滑不锈钢杆，垂直竖立，将小鼠头向下放置在金属杆的顶部，使其沿杆自然爬下，观察动物在下行过程中的行为，并按标准计分，评分标准见表1。实验前每只小鼠爬杆2次，选用爬杆行为计分为0分的动物用于实验，称重并随机分组。所有动物于注射MPTP前及末次注射后第1至第3周每日口服药物前后，均进行爬杆试验，每只鼠爬杆2次，积分并计算平均分，评分结果进行统计学分析。

1.2.5组织形态学观察①取材及材料处理：动物用10%的水合氯醛腹腔麻醉后，打开胸腔，先经左心室升主动脉快速推注生理盐水20mL，后缓缓推注10%福尔马林灌流固定，取脑、置于10%福尔马林固定1周。脑组织经常规步骤处理：脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，切片、片厚6μm，常温保存备用。

②HE染色法：石蜡切片烤干，脱蜡，脱苯，Ehrlich氏苏木精染，盐酸酒精分化，蓝化，伊红染色，脱水，透明、中性树脂封片。

③光镜下观察并摄片：根据小鼠脑立体定位图谱，每组每只动物选一张脚间核平面切片，取材部位见图1。

2结果

2.1小鼠行为学改变

2.1.1注射MPTP后 各组小鼠行为表现各组给药（MPTP）后10min小鼠都出现不同程度的肢体震颤，开始前肢抬举伴震颤，后肢僵硬，竖尾、竖毛及跳、蹿等动作，持续约30min后，又出现运动障碍，动作迟缓，短暂性活动减少，对外界刺激易产生尖叫，逃避反应慢；注射MPTP后1h，小鼠表现明显的运动减少，对外界刺激反应低下，之后逐渐恢复。但各组动物症状都于24h后完全消失。随着用药时间延长，动物运动障碍程度增加，症状持续时间和恢复时间延长。中药全方组和拆方各组均可不同程度改善PD小鼠出现的爬杆能力下降、时间延长和自发活动次数减少等上述小鼠行为学异常与模型组比较有显著性差异（P均

2.1.2中药银杏平颤方及其拆方对PD小鼠爬杆行为的影响正常组小鼠在给予生理盐水前后，爬杆测试无明显差异。MPTP 30mg•kg-1•d-1腹腔注射后当日及以后几天，协调能力明显降低，表现为快速下滑，甚至不能抱杆、坠落，持续4日后，于第5日末次注射MPTP后小鼠协调能力逐渐恢复，模型对照组1～4周评分结果与正常对照组相比升高且均有显著性差异（P

2.2病理学改变

2.2.1肉眼观察全部小鼠脑标本外观均未见明显异常，切面检查亦未见出血、坏死和软化灶。

2.2.2HE染色光镜观察正常组14天、28天脑黑质神经细胞形态正常，体积正常，结构清晰，密集成群。模型组14天、28天小鼠脑黑质神经细胞数量明显减少，部分神经元丧失，残留神经元呈大多角形或锥体形状，有的胞体变小，胞核固缩，胞核结构不清，有的胞核变大，核染色质疏松，有颗粒出现，核周围胞浆有溶解样改变；胞浆染色加深，胞浆内可见大小不等的嗜酸性颗粒并出现小空泡。大部分小鼠黑质区域内尚可见广泛的淋巴细胞浸润，部分淋巴细胞围绕在血管周围形成血管套。残存的神经元体积瘦小，结构不清晰，色素变浅，同时伴轻度胶质细胞增生；与模型组14天和28天比较，银杏平颤方全方及拆方各组14天和28天小鼠脑黑质神经细胞数量明显增多，神经元体积较饱满，结构较清晰；各中药治疗组14天黑质区神经元形态与28天各组相比基本相似，黑质区神经元数量未见明显减少，但有少数神经元变性，细胞呈圆形或卵圆形，胞浆内未见嗜酸性颗粒出现。但总的看来中药各治疗组与正常对照组比较神经细胞未见明显减少，无特异性改变；有的可见星形细胞轻度增多，胞核变大，偶见核分裂现象。解毒组28天2例黑质区有散在软化灶形成，病灶较小，灶内大多数神经元消失，残留的神经元胞体变小，胞核固缩。部分小鼠黑质区可见弥漫性淋巴细胞浸润，偶见淋巴细胞围绕在小血管周围但并未形成血管套。

3讨论

3.1模型的建立和银杏平颤方对PD模型小鼠行为学改善的作用

帕金森病又称震颤麻痹，临床以肢体震颤、木僵为典型症状，是一种好发于老年人的多巴胺能神经元功能降低引起的锥体外系慢性病，同老年痴呆一样是与衰老相关的神经退行性病。目前认为其脑内黑质纹状体的多巴胺能和胆碱能神经功能平和失调是运动障碍的主要原因，凡引起前者功能降低或后者功能亢进的因素均可以导致震颤。帕金森病人的行为变化为运动协调能力降低，在本实验中，用爬杆实验作为测定动物协调运动能力的指标。模型组小鼠协调运动能力明显降低，并且这种行为异常可持续数日，与正常组有显著性差异，这一结果与文献报道一致。

现在世界公认的两种帕金森病模型药物是6－羟基多巴（6-Hydrooxydopamine, 6-OHDA）和MPTP，6-OHDA是一种神经毒素，大鼠单侧纹状体注射微量的6－OHDA，能够造成多巴胺能神经元坏死，经阿朴吗啡诱导，动物可出现向健侧旋转的现象[9－10]，6-OHDA模型存在造模周期长、成功率低、症状不典型等问题，限制了它的应用。

MPTP是哌替啶的衍生物，可由脑中单胺氧化酶B催化生成MPP+，后者是一种选择性的神经毒素，可以损害人类和灵长类动物脑中黑质中的多巴胺能神经元，MPTP最初发现于吸毒患者的脑内，经分离获得该化合物，注射到猴体内可引起酷似临床震颤麻痹患者的几乎全部症状，并且严重程度与所用剂量和动物年龄成正比。最初认为啮齿类动物对MPTP的毒性不敏感，后来发现接受MPTP注射可能导致该动物出现震颤，但是种属差异很大，大鼠由于脑内MAO-B的活性或水平较低，MPTP不能被代谢成活性产物，因而大鼠对MPTP的毒性不敏感。MPTP注射给药可引起小鼠震颤，特别是C57／BL、BABC等，对注射MPTP产生的毒性极敏感， MPTP引起的小鼠行为学异常虽不像在灵长类动物上的症状典型，但造模周期短、重复性好，实验动物费用低，可引起脑内黑质纹状体的多巴胺含量降低，因此，MPTP小鼠模型被国外许多实验室广泛采用，这种模型为研究帕金森病的发病机理和药物治疗提供了条件[11-12]。

MPTP确可引起小鼠的行为异常，但其引起的小鼠行为变化，因采用的注射剂量、注射次数、注射途径的不同以及所采用的行为观察方法的不同而有所不同[13-16]。本实验采用的是最大剂量和最常用的注射途径，为缩短实验周期采用5次注射，得到比较明显的运动能力降低的效用。为了检查PD小鼠的协调运动能力，本实验选用爬杆试验，即让小鼠头向下倒竖于垂直的金属杆顶部，待其四肢握紧杆后，松手任其自由下行，此实验中，动物被动地下行，当协调能力降低时，行为发生明显改变。

实验结果显示， MPTP注射后，小鼠爬杆能力降低，并且这种行为异常可持续几日，以后逐渐恢复，这一结果与文献使用自主活动法观察的结果一致，采用此方法观察得到的银杏平颤方及其拆方对MPTP所致小鼠运动能力降低的改善作用这一结论是可靠的。

3.2银杏平颤方对PD小鼠DA神经元形态的影响

很多实验证实，MPTP对黑质DA能神经元具有选择性神经毒作用，其致病的过程是MPTP进入体内首先穿过血脑屏障，被星形胶质细胞、5－羟色胺能神经元摄取并在单胺氧化酶 B迅速催化下生成吡啶类代谢产物甲基－苯基吡啶离子（MPP+），MPP+与 DA的化学结构极为相似，故可以被DA转运体（DAT）识别并载入DA能神经元内，然后通过线粒体外膜上能量依赖性转运机制进入线粒体集中起来，之后阻断线粒体NADH氧化呼吸链，最终造成ATP衰竭和细胞死亡[17]，故直接损害DA能神经元的是MPP+。因MPP+和铁离子一样与神经黑色素有很高的亲合性，而黑质DA能神经元含有较高浓度的神经黑色素，所以 MPP+选择性地损伤了SNpc的 DA能神经元，中枢神经系统内其它部位的DA能神经元，如腹侧被盖区DA能神经元损伤则很小[18]。笔者在HE染色和TH免疫组化染色实验中也得到同样结果。DA合成限速酶TH与PD的关系很早就受到了普遍关注。TH已经成为DA神经元的标志酶。大量研究证明，PD动物模型及PD病人体内TH从基因表达、酶蛋白含量及分布到酶活性都存在广泛的异常改变，笔者的另一实验观察了各组小鼠中脑TH阳性黑质神经元，结果显示：模型组小鼠中脑SNpc内TH免疫组化观察到大量DA能神经元脱失，因而经黑质－纹状体通路投射到纹状体的DA神经递质减少，从而引起小鼠多巴胺和乙酰胆碱系统平衡失调而产生行为学障碍；HE染色结果与银杏平颤方全方及拆方各组小鼠行为改变成正比，而且黑质区神经元的变性、退化及坏死程度较模型组均明显改善，仅个别小鼠有轻微的软化灶形成。HE染色和TH免疫组化染色结果相吻合，这表明中药可减少多巴胺神经元的丢失、增加多巴胺神经元内TH的表达，各组中药在不同的时间疗效各不相同，就减少多巴胺神经元丢失的数量而言，在14天以解毒组最明显，28天以全方组最明显；就增加TH的表达而言，14天全方组和解毒组较明显，28天化瘀组较明显。这些变化说明中药银杏平颤方全方及拆方能使黑质神经元的损伤程度减轻，结构和功能接近正常，进一步从形态学方面证实了银杏平颤方全方及拆方可保护神经组织免受MPTP引起的自由基增多及氧化损伤所造成的损害，从而为PD的防治提供形态学依据。

以上结果从行为学和神经病理角度分别证明了模型成功。停药后小鼠行为恢复较快与脑内的表现不太相符，这与其他学者的报道一致[19]，具体机制尚不清楚。中药各给药组（14天，28天）小鼠行为障碍有明显恢复、TH免疫组化显示SNpc内DA能神经元数目较模型组明显增多，且全方组和化瘀组更为明显一些。这些结果提示银杏平颤方及其拆方能改善PD小鼠的行为障碍、对DA能神经元的正常形态及功能有保护作用。银杏平颤方及其拆方28天组治疗效果稍好一些，但与14天各组相比两者之间的差别并不很大，一方面提示银杏平颤方及其拆方对PD的治疗可能存在一定的量效和时效关系，同时也说明在短时间内银杏平颤方及其拆方即可达到满意的治疗效果。

参考文献

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第3篇：动物行为学分析范文

关键词：胶质细胞；丙戊茶碱；疼痛

现在大量研究表明，以往认为只有神经元参与了疼痛的产生和维持的观点是不完全正确的。在许多不同病因所致的疼痛中，胶质细胞的激活很可能是一个共同的作用机制。胶质细胞，特别是星形胶质细胞可以通过多种途径参与疼痛的调节，激活的星形胶质细胞可以产生大量的神经营养因子，如NGF、BDNF和GDNF等，NGF和BDNF均可促进神经损伤后的出芽、伤害性感受器的再生，而NGF拮抗剂可在一定程度上减轻动物模型中的炎性痛[1]，这表明胶质细胞在损伤后释放的神经营养因子参与疼痛的调节。胶质细胞表面表达有大量的和疼痛有关的细菌和病毒受体，以及大量神经递质和调质如GABA、Glu、ACh、5-HT等受体，鞘内注入细菌、病毒、神经递质和调质可以致痛[2]。此外，胶质细胞数量远远多于神经元数量，并且与神经元的解剖位置关系紧密，它们通过多种机制调节神经元的突触功能和兴奋性，在痛觉产生调节过程中具有重要的功能。

丙戊茶碱（PPF），一种甲基黄嘌呤的衍生物，是星形胶质细胞的活化抑制剂[3]，本实验通过侧脑室注射星形胶质细胞活化抑制剂PPF探讨胶质细胞在疼痛中的作用，希望为新的镇痛药物的研究和开发提供全新的思路。

1资料与方法

1.1一般资料 健康雄性成年SD大鼠，体重（250±10）g，由河南省实验动物中心提供，所有动物都在自然光暗周期的环境中饲养，自由觅食、饮水。

动物随机分为两组（n=8）：正常对照组和丙戊茶碱组。对照组侧脑室注射生理盐水（10μl）；丙戊茶碱组侧脑室注射丙戊茶碱（30mM，10μl）。侧脑室注射后饲养1w进行痛评分实验。

1.2福尔马林致痛模型 把大鼠放入观察台上透明玻璃器皿中，下铺有干燥、松软的厚布，在安静、避光、干燥的环境中，适应30 min，用100μl微量注射器刺入右足跖部皮下，回吸无血迅速注入5%福尔马林100μl。

1.3侧脑室注射 用1%戊巴比妥钠40～50 mg/kg麻醉大鼠，然后将麻醉的大鼠固定在脑立体定位仪（ST-3ND，成都仪器厂）上，颅骨，根据Paxinos and Watson图谱定位侧脑室位置（坐标：P1.2 mm，R1.5-2 mm，H3.0 mm），用大鼠颅骨钻钻孔，用10μl微量注射器将药物注入到侧脑室，留针5min，然后缝合皮肤。饲养一星期后进行痛评分实验。

1.4痛评分实验 侧脑室给药1w后，在大鼠右足跖部皮下注射福尔马林。根据Dudisson评分对大鼠右后足的行为进行评估，指标包括：第一部分为抬起注射甲醛足的次数（Flinches），第二部分为甲醛足抬起走动时不着台面的时间（Lifting）和舔、咬、抖动甲醛足的时间（Biting）。福尔马林试验数据采取参照Abbott等方法，分别测定注射福尔马林后第一时相（第0～5min）及第二时相（第15～30min）内的Flinches诱发炎性痛行为的次数、Lifting与Biting行为痛持续的时间总和[4]。

1.5统计学分析 实验数据均用均值±标准差（x±s）表示，统计学处理用SPSS12.0软件包，实验结果用采用单因素方差分析（ANOVA），组间比较采用LSD-t检验方法。

2结果

侧脑室注射药物大鼠的疼痛行为学评分：第一时相丙戊茶碱组的Flinches次数和Lifting+Biting时间较对照组均有显著性差异（P

丙戊茶碱组Flinches与对照组比较*P

3讨论

实验结果中，各组大鼠脚底注射福尔马林后，观察到大鼠出现抬脚、舔足等行为学反应，可见本实验福尔马林疼痛模型得到了成功复制。福尔马林致痛模型产生的行为学反应是双相的[4]。双相疼痛第一时相是由于福尔马林对局部感受伤害的感受器的化学刺激所引起的；第二时相是由于局部炎症以及伤害性刺激产生炎症致痛物质，通过持续的C纤维刺激使腰骶部脊髓中枢致敏所致。表现为脊髓背角神经的过度兴奋：如神经元的反应阈值下降，兴奋期延长以及自发性放电等[5]。

侧脑室注射实验显示，丙戊茶碱在疼痛模型的第二时相均起到抑制疼痛的作用，而第二时相是痛觉中枢致敏有关。文献显示，丙戊茶碱可抑制胶质细胞活化而产生抗伤害性刺激作用[6]。它抑制星形胶质细胞机制可能通过抑制分解环磷酸腺苷的磷酸二酯酶亚型Ⅳ，从而增加细胞内的环磷酸腺苷来发挥作用[6]。推测丙戊茶碱通过抑制星形胶质细胞来起到抗炎性痛的作用。可见，胶质细胞活化、表达及信息交流与炎症性疼痛的产生和维持关系紧密。

综上所述，胶质细胞在实验性炎性痛的发生和维持中起到关键作用，但其具体作用机制还有待进一步研究。

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第4篇：动物行为学分析范文

【关键词】 帕金森病；炎症；环氧合酶2；前列腺素e2；核因子nfκb；人参皂甙rg1

0引言

帕金森病(parkinsons disease，pd)是一种常见的中枢神经系统变性疾病. 有研究［1］认为,炎症可能在pd发病过程中起重要作用, 环氧合酶2(cyclooxygenase2，cox2)及其介导的炎症反应可能参与pd发病过程［2］. 核因子(nuclear factorκappab, nfκb)在炎症反应过程中发挥重要作用，近期的研究显示nfκb的激活与pd发病有关［3］. 但有关nfκb是否参与pd模型中cox2表达调控的报道少见. 本研究采用1甲基4苯基1,2,3,6四氢吡啶（1methyl4phenyl1, 2, 3, 6tetrahydropyridine,mptp）制备亚急性pd模型,观察模型动物中脑黑质nfκb和cox2及其产物前列腺素e2（prostaglandine2，pge2）表达与小鼠黑质区酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，th)阳性神经元数量关系及给予人参皂甙rg1后对上述变化的影响,探讨nfκb在pd发病过程中的分子机制，为探索pd有效防治措施提供线索.

1材料和方法

1.1材料健康雄性c57bl/6n小鼠45只，8~12 wk龄，体质量25~30 g［北京维通利华实验动物技术有限公司scxx(京)20020003］,小鼠均自由进食饮水,室温（25±2）℃，单笼喂养，自然光照. mptp(美国sigma公司)；兔抗人pge2 mab(美国cayman公司)；小鼠抗人th mab(美国chemicon公司)；人参皂甙rg1（吉林大学基础医学院化学教研中心）；兔抗人cox2 mab,兔抗人nfκb（p50）多克隆抗体, 浓缩型免疫组织化学超敏ultrasensitivetmsp试剂盒(福州迈新生物).

1.2方法

1.2.1动物分组和模型制备实验随机将小鼠分为3组，每组15只. 模型组(pd组)：给予mptp 30 mg/kg,盐水溶，腹腔注射,1次/d,连续5 d. 人参皂甙rg1干预组 (rg1组)：除给予pd组相同的mptp处理外,mptp注射前3 d定时给予人参皂甙rg1 10 mg/kg,盐水溶，腹腔注射，并在mptp注射前2 h注射人参皂甙rg1. 溶剂组（对照组）：注射与pd组和rg1组等体积的盐水. 上述动物均于mptp第5次注射后24 h处死. 于每次注射药物后观察小鼠是否出现静止震颤、肌肉僵直、运动迟缓等pd行为学表现, 判断pd鼠模型是否成功.

1.2.2免疫组织化学检测小鼠麻醉后,行40 g/l多聚甲醛磷酸盐缓冲液常规灌注固定,迅速开颅取脑,40 g/l多聚甲醛固定48 h(4℃)后,石蜡包埋切片. 实验时取脑组织切片常规脱蜡至水后,用tbst(ph7.4±0.2) 洗涤；组织抗原行水浴法热修复；30 ml/l过氧化氢阻断内源过氧化物酶,正常非免疫动物血清室温孵育10 min；同一组织相邻切片分别加入一抗即兔抗人cox2 mab(1∶100)、兔抗人pge2 mab（1∶300）、兔抗人nfκb（p50）多克隆抗体（1∶100）、小鼠抗人th mab(1∶400), 4℃过夜；tbst洗涤后,加入生物素标记第二抗体室温孵育；tbst洗涤,加入链霉素抗生物素蛋白过氧化酶室温孵育20 min,dab显色,中性树胶封固,光镜下观察照相.

1.2.3western blot小鼠麻醉后取脑,分离中脑黑质部分,置入细胞裂解液中,低温匀浆,4℃震荡30 min后,12 000 g 4℃离心15 min,取上清,-80℃保存备用. 实验时取标本蛋白定量后加入4倍体积样本缓冲液,95℃变性5 min. 取20 μg样品在100 g/l十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（sdspage）上电泳后,电转至硝酸纤维素膜,以标准蛋白marker为参照，依mr大小切取条带,取相应条带分别加入cox2一抗(1∶400)，pge2 一抗（1∶600），nfκb（p50）一抗（1∶200）和th一抗(1∶1000), 4℃过夜,tbst冲洗后,分别与生物素标记的羊抗兔/小鼠igg抗血清(1∶200)室温震荡孵育2 h,tbst洗涤后,与卵白素辣根过氧化物酶复合物室温下孵育0.5 h, dab显色. 将特异性蛋白条带扫描后,在同一条件下应用cmias真彩医学图像分析系统测定条带平均灰度值.

统计学处理:选定黑质所在区域,采用cmias真彩色医学图像免疫组化自动分析系统进行阳性细胞计数. 各组每只动物的3张脑片数值相加后取平均值,实验结果采用spss11.0统计软件进行统计学分析. 组间比较采用单因素方差分析和snkq检验，两变量间关系分析采用简单线性相关分析法. p<0.05为差异具有统计学意义.

2结果

2.1行为学观察pd组小鼠于第1次注药后10~ 20 min均出现不同程度的震颤、竖毛、翘尾,mptp第5次注射后,pd组小鼠出现步态蹒跚、活动减少、动作变慢等症状；对照组未出现上述行为学变化；rg1组与pd组相比较，上述行为学症状明显减轻.

2.2免疫组化检测

2.2.1黑质区th阳性神经元数量变化对照组黑质致密部可见大量的th阳性神经元,且排列整齐,呈条带状(图1a)；pd组（57.2±12.1）与对照组（169.7±24.6）相比较,th阳性神经元的数目减少约60%(图1b),rg1组（145.8±28.4）th阳性神经元的缺失较pd组明显为轻,仅较对照组减少约32%(图1c).

2.2.2黑质区cox2，pge2和nfκb阳性细胞数量变化pd组与对照组相比较，黑质区可见大量cox2（28.2±5.1 vs 1.0±0.3），pge2(36.1±4.2 vs 3.2±0.4)和nfκb（34.6±5.6 vs 2.5±0.8）阳性细胞（图2a，c，e）；rg1组黑质区cox2(1.9±0.7)；pge2(4.6±0.3)和nfκb(4.9±2.1)阳性细胞较pd组有显著减少（图2b，d，f）. 图像分析结果显示，pd组，rg1组和对照组间差异均有统计学意义（p<0.01）. 同时cox2，pge2间存在正相关关系（r=0.576，p<0.05）；cox2和nfκb间也存在正相关关系(r=0.588, p<0.05).

2.3western blot检测在预染蛋白标准分子质量20×103，72×103，50×103和61×103处,分别可见pge2，cox2，nfκb和th特异性蛋白条带. 灰度分析发现,pd组与对照组相比，th的表达下降约为65％，而nfκb和cox2，pge2的表达则明显升高(p<0.01)；rg1组与对照组相比较，th表达量下降约为36％，nfκb，cox2和pge2的表达较模型组均显著降低(p<0.01)；对照组仅有少量nfκb，cox2和pge2的蛋白表达（图3, 表1）. 表1各组小鼠中脑黑质th，cox2，pge2和nfκb蛋白表达水平

3讨论

pd是一种常见的中枢神经系统退行性疾病,主要病理改变是中脑黑质da能神经元进行性变性缺失. 我们采用mptp复制的小鼠模型具有pd典型行为学表现；western blot结果显示腹侧中脑th蛋白的表达下降,提示此模型存在da能神经元大量丢失,说明本实验pd模型符合实验要求［4］.

近年来有研究表明,pd中存在炎症,是pd患者黑质da缺失重要原因［5］. 炎症介质pge2及其合成限速酶c0x2可作为炎症反应的重要生物学指标［6-7］. 实验中我们检测了三者表达情况，发现pd组cox2，pge2均大量表达，同时伴有中脑腹侧th表达水平急剧下降，这些都提示pd组小鼠脑内存在严重的炎症反应，并可能与da能神经元丢失有关［2］，说明cox2可能通过介导炎症反应,而参与da能神经元丢失过程. 因此，研究cox2表达的调控机制，将对探讨da神经元的保护机制起重要作用. 有研究［3］发现，nfκb作为促炎症基因表达的枢纽之一,可诱导cox2表达，且nfκb的激活与pd的病理机制有关. 为明确nfκb是否参与cox2表达及与da能神经元变性丢失的关系，我们观察了上述三者在中脑黑质区的表达情况，结果发现pd组nfκb，cox2表达明显升高，且两者间存在正相关关系(r=0.5838, p<0.05),th表达明显下降（p<0.01）. 我们推测，在本实验条件下mptp可能激活nfκb,继而促进cox2和pge2的表达,从而影响da能神经元的变化，其结果与文献报道一致［8］.

人参皂甙rg1具有抗炎、抗氧化等作用. 有报道称rg1对mptp致黑质区da能神经元的损伤有一定保护作用［9］. 为探讨人参皂甙rg1对da能神经元的保护途径,我们对小鼠给予人参皂甙rg1干预，发现nfκb阳性细胞以及蛋白水平较pd组有明显减少，相应黑质区th阳性细胞数量和蛋白水平较pd组降低程度减轻. 可能的原因是rg1通过减少nfκb表达来抑制cox2表达,减轻其介导的炎症反应,使黑质da能神经元免于mptp诱导的损伤，最终起到保护da神经元作用［10］.

综上所述，核因子nfκb可能是mptp所致亚急性pd模型中脑黑质cox2表达及其介导的炎症反应的重要上游事件；人参皂甙rg1可对核因子nfκb产生影响进而对黑质da能神经元起一定的保护作用.

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第5篇：动物行为学分析范文

关键词：中药YN-3号；慢性应激；GR；NMDAR

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2008)04-0727-03

体内糖皮质激素的分泌具有自身逆反馈调节的特点，其分泌主要受HPA轴（下丘脑-垂体前叶-肾上腺皮质轴）调节，糖皮质激素在血液中浓度的增加反过来又可以抑制下丘脑和垂体前叶，从而减少糖皮质激素的分泌。海马中富含GR（糖皮质激素受体），可以抑制应激条件下HPA轴的过度反应。创伤性应激和慢性应激均可导致海马GR含量改变，报道中创伤性的应激主要引起海马GR表达的升高[1]；慢性应激损伤实验显示，应激早期海马内GR表达增强，慢性应激后期阳性表达减少[2]。海马GR除了可以自我调节，还受到NMDAR (N-甲基-D-天冬氨酸受体)的影响，两者都对HPA轴和LTP(海马神经元长时程增强效应)有影响，参与应激和学习记忆[3]。本实验观察慢性应激对大鼠一系列行为学活动的影响效应，包括自主运动、强迫运动和学习记忆活动，同时观察中药YN-3号对这一过程的干预作用。

1对象和方法

1.1实验动物与分组

雄性SD大鼠，体重160～180g（北京维通利华实验动物养殖中心），筛选40只，随机分为4组，每组10只，分别为：空白组（control）、模型组(model)、YN-3组(YN-3)、氟西汀组(Prozac)。

1.2主要实验器材和药品

Noduls Ethovision软件及摄像系统（荷兰Noldus information technology 公司,型号：NOVELBAC）；MG-3Y迷宫刺激器（张家港生物医学仪器厂）；氟西汀(百优解，片剂，美国礼来公司，批号A019602）。

1.3模型建立

造模各组孤养并每日随机给予以下刺激的一种：断食（24h）、断水（24h）、昼夜颠倒（24h）、夹尾（3min）、束缚（3h）、10℃冷水游泳（5min）、电击足底（电压为30V，电击5s，间歇5s共进行300s），共21天。

1.4治疗组处理方法

YN-3组灌胃，使用前按照灌胃剂量煎药浓缩,浓度1.00g/mL，贮存于4 ℃冰箱中备用，用前加热。氟西汀组于每日进行应激刺激前1h灌胃给药，用药量为1.8mg/kg，按1mL/100g给药，共21天。

1.5行为学检测

1.5.1Open-Field实验使用Noduls Ethovision软件及摄像系统对大鼠3min内在小箱中进行的总路程、站立次数进行记录。每只大鼠行为的检测在区域为80cm×80cm的开放场内，由红外摄像系统和视频合成器记录大鼠的活动情况, 计算机分析系统分析大鼠的运动轨迹。

1.5.2强迫游泳实验

1.5.3“Y”型电迷宫实验应用MG-3Y迷宫刺激器，测试成绩分为学习成绩和记忆成绩。宫箱设有3条通道，每臂末端有信号灯，箱底通以交流电。灯光指示为安全区，不通电。将大鼠置于一支臂端，另两支任意一支给灯光信号，示安全区。适应1min后给予电击，以大鼠直接逃至安全区为正确反应，否则为错误。学习成绩以大鼠达到连续9次以上正确反应时所需的电击总次数为准，记忆成绩以学习完后再电击10次中正确反应的次数（N/10）为准，于应激前后记录测试成绩。

1.6GR NMDAR免疫组化染色和图像分析

断头后迅速取脑并切取含海马脑段，浸入4％多聚甲醛液中固定，石蜡包埋，额状连续切片，片厚5μm，每只动物间隔取片，每个指标取3张，常规SABC法染色：常规脱蜡和水化，兔抗GR、NMDAR单克隆抗体（1∶100，北京博奥森生物技术有限公司）室温60min，生物素标记二抗室温孵育15min，链霉菌抗生物素－过氧化物酶溶液室温15min，DAB溶液显色（以上SP超敏试剂盒由福州迈新生物技术开发有限公司）。光镜下，归类每张切片海马CA1、CA2、CA3、齿状回等4个亚区的阳性细胞强度，以每100个细胞中阳性细胞个数为标准，分为阴性(n=0)、弱阳性(0

1.7统计学处理

行为学成绩均用均值±标准差(±s)表示，用独立样本t检验(Independent-Samples T Test)做组间差异显著性分析；图像分析结果用多个样本比较的秩和检验(Kruskal-Wallis法)和多个样本两两比较的秩和检验(Nemenyi法)。

2结果

2.1中药YN-3号对大鼠Open-Field实验的影响

3min内大鼠活动的总路程和站立次数见表1。结果显示：与空白组比较，模型大鼠活动总路程显著下降(P

2.2中药YN-3号对大鼠强迫游泳实验的影响

强迫游泳实验成绩见表2。结果显示与空白组比较，应激使模型大鼠的游泳不动时间显著下降(P

2.3中药YN-3号对大鼠“Y”型电迷宫实验的影响

学习和记忆成绩见表3。结果显示应激使模型大鼠的学习、记忆能力大幅度下降(P

2.4中药YN-3号对大鼠海马内GR阳性表达强度的影响

光镜下可见海马细胞阳性表达呈褐色,位于细胞质内，多见于锥体细胞层，个个亚区都有一定表达，但主要分布于海马CA1区。具体表达情况见表4，查χ2界值表得P

2.5中药YN-3号对大鼠海马内NMDAR阳性表达强度的影响

表达情况基本与GR一致，但阳性表达密集的区域主要有CA1、CA3区，具体情况见表5。查χ2界值表得P0.05；χ2m,N＝29.36，P

3讨论

过度的应激会引起HPA轴亢进，机体出现应激紊乱，会导致严重的继发性损害，例如对周围事物的兴趣降低、生存欲望和学习记忆能力下降等。海马内富含两种肾上腺皮质激素受体：盐皮质激素受体(MR)和糖皮质激素受体(GR)，MR主要参与基础水平的HPA轴的调节，GR则抑制应激条件下HPA轴的过度反应[4]。GR的调节与NMDAR介导的突触传递有着某种密切联系。从应激的角度看，海马是HPA轴调节的高位中枢，是应激累及的敏感部位；从学习记忆的角度来看，海马是参与学习记忆的重要部位，而海马的这些作用均有GR和NMDAR的介入[5]。

本文研究慢性应激下GR与NMDAR之间的作用关系，结果显示慢性应激使大鼠海马内GR的表达强度降低，而同时NMDAR的表达强度也降低。对于GR表达降低的解释可能是一种过度刺激的产生的脱敏反应，就是当机体受到应激原的刺激的早期，内源性GC（糖皮质激素）水平升高，而GR也随之增高，当应激原持续存在，累计强度过大、持续时间过长时， GC始终保持较高水平，导致GR敏感度降低，免疫强度减弱，继而耗竭而表达减少。海马GR表达降低，使得其对HPA轴的负反馈作用减弱，加重机体的损伤反应。

既往报道认为急性应激或创伤性应激时GR的降低受NMDAR受体通道活性增强的影响[6-7]，表现为在阻断NMDAR通道之后，GR表达降低的程度明显减弱。本次实验的结果并不支持在慢性应激的情况下GR表达降低的同时NMDAR的活性增强，而是出现相反的结果。虽然两种受体在海马各个亚区的分布情况较为一致，但NMDAR的表达强度呈现出下降的表现。这一结果提示如下问题：在慢性应激的条件下是否存在另一条通路可以影响GR的含量下降，并且NMDAR通道的一系列病理性效应，如兴奋性毒性，在应激的后期是否还继续存在。但无论答案怎样，中药YN-3号在本次实验中的抗抑郁学改变的作用表现的很明显，且对两种受体的表达有趋向正常组的调节作用。

参考文献

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第6篇：动物行为学分析范文

[关键词]开心散类方；阿尔茨海默病；阿尔茨海默病小鼠模型；Tau蛋白

[Abstract]The efficacy of Chinese herbal formulas in treating Alzheimer has been proved in many studies In this study， six different Kaixin San formulas were compared to investigate their effects on learning and memory decline， brainderived neurotrophic factor （BDNF） in the hippocampus， tau protein， acetylcholinesterase （AChE） and Nterminal probrain natriuretic peptide （NTproBNP） Kunming mice were selected and established a mouse model of Alzheimer′s by intraperitoneal injection of Dgalactose and sodium nitrite， continued intragastric 4 weeks， using the ability of learning and memory in Morris water maze test to evaluate the animals in each group； the content of BDNF in the hippocampus of mice with Western blotting detected； ELISA method for the detection of each group of mice hippocampal tau protein，pTau protein， Aβ，Ach，AchE and serum NTproBNP levels The results showed that， Kaixin San of Qianjin Yaofang three dose recorded significantly improved learning and memory ability of mice； increased the content of BDNF and Ach in the hippocampus； decreased the content of Aβ， Tau protein， pTau protein in the hippocampus； high， middle dose significantly decreased the serum NTproBNP and AchE in hippocampus， the effect is most significant Part dose of Kaixin San of Yixin Fang， Kaixin Wan of Yimen Fang， Dingzhi Xiaowan of Beji Qianjin Yaofang and Dingzhi Wan of Guji Luyan could improve the learning and memory ability evaluation indicators， significantly increased BDNF and Ach in the hippocampus of AD model mice， reduced the Aβ， Tau protein， pTau protein in hippocampus of AD model mice， decreased the NTproBNP and AchE in serum of AD mice， the effect is more significant Three does of Buxin Tang of Qianjin Yi had no effects of treatment in Alzheimer′s disease The results showed the treatment in AD of Kaixin San of Qianjin Yaofang is the most significant

[Key words]Kaixin San formulas； Alzheimer； Alzheimer disease mouse model； Tau protein

doi：10.4268/cjcmm20160718

阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种进行性中枢神经系统退行性疾病，其主要临床表现为记忆力减退、认知障碍及人格改变等。据流行病学研究表明，该病的发病阶段与年龄有着一定的联系，而随着我国人口寿命的延长和社会老龄化的加剧，阿尔茨海默病的发病率明显上升，其致死率仅次于心脑血管疾病、肿瘤和脑卒中，成为威胁老人健康的最严重疾患之一[12]。

开心散类方始载于唐代孙思邈的《千金要方・卷十四》，由远志、人参、茯苓、石菖蒲4味药材组成，还包括了《医门方》之开心丸、《备急千金要方》之定志小丸、《古今录验》之定志丸、《医心方》之开心散和《千金翼》之补心汤，主要有益智、调节情志、防老抗衰等功效，其药方组成完全相同但配伍比例不同，功效亦有不同（表1）。 前期的研究表明，6种开心散类方对Aβ2325损伤的 PC12细胞均有保护作用，有潜在治疗阿尔茨海默病的作用，《千金要方・卷十四》之开心散作用最为显著[3]，《备急千金要方》之定志小丸可明显改善东莨菪碱所致小鼠学习记忆障碍，增强小鼠学习记忆的能力[4]。

AD的发病机制尚不明确，主要有胆碱能学说、β淀粉样蛋白学说、Tau蛋白学说、血管因素学说等。本文将通过观察6种开心散类方对AD模型小鼠的学习记忆能力的影响，以及对与AD可能的发病机制相关学说进行初步探讨，如海马中脑源性神经营养因子（BDNF），乙酰胆碱（Ach），乙酰胆碱酯酶（AchE），Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，血清中N端前脑钠肽前体（NTproBNP）的影响，评价6个类方对阿尔茨海默症模型小鼠的影响。

1材料

健康SPF级昆明小鼠210只，雌雄各半，入组时体重18～22 g，中国人民总医院动物中心提供，合格证号11400700084097。

人参、远志、茯苓、石菖蒲购自北京同仁堂药材有限责任公司，6种开心散类方粉剂均由中国中医科学院中药研究所制剂中心提供，《千金要方・卷十四》之开心散011 g干粉/g生药、《医门方》之开心丸019 g干粉/g生药、《备急千金要方》之定志小丸021 g干粉/g生药、《古今录验》之定志丸023 g干粉/g生药、《医心方》之开心散017 g干粉/g生药和《千金翼》之补心汤021 g干粉/g生药，使用时按比例配成药液；石杉碱甲胶囊（批号130501）由上海复旦复华药业有限公司生产；D半乳糖（批号20140117）购于国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠（许可证号XK1320100153）购于西陇化工股份有限公司；BDNF一抗（货号SC546）购于Senta公司；Tau蛋白，pTau蛋白，Ach，AchE，Aβ，NTproBNP ELISA试剂盒均购于R&D公司。

Morris水迷宫（上海移数公司）；DNM9602G酶标分析仪（北京普朗新技术有限公司）；3K15低温离心机（美国Sigma公司）；VC150超声破碎仪，涡旋混合仪（SCI logex公司）；UVP凝胶成像系统EC3 Imaging System（美国BIORAD公司）。

2方法

21分组、造模及给药所有小鼠适应环境3 d后，通过Morris水迷宫实验排除个体差异，筛选出170只小鼠（雌雄各半），随机选取10只作为正常组，其余小鼠作为AD模型组。正常组动物腹腔注射等体积生理盐水，模型组动物每日腹腔注射D半乳糖120 mg・kg-1和亚硝酸钠45 mg・kg-1，连续60 d后，将模型小鼠随机分为模型组，阳性对照组，以及6个开心散类方高、中、低剂量组，正常组和模型组每天灌胃25 mL・ kg-1蒸馏水，阳性对照组给药剂量为005 mg・kg-1，各开心散类方给药组高剂量为每天3570 g・kg-1，中剂量为1785 g・kg-1，低剂量为0892 g・kg-1，Morris水迷宫测定期继续给药，共给药35 d。模型组与各给药组给药同时每日进行腹腔注射D半乳糖120 mg・kg-1和亚硝酸钠45 mg・kg-1，正常组腹腔注射等体积的生理盐水。

22Morris水迷宫训练及测试造模60 d后和给药30 d后的第1天至第4天为Morris水迷宫训练，每天训练1次，于第5天进行定位导航试验，利用行为学分析软件记录小鼠60 s内找到平台所需的时间（即逃避潜伏期）；第6天撤出平台，进行空间探索试验，记录小鼠在60 s内穿越原平台所在位置的次数（穿越平台次数）、第3象限（即目的象限）游泳路程及游泳总路程。计算得出目的象限游泳路程百分比=目的象限游泳路程/游泳总路程。

23采集样品及相关物质测定行为学试验结束后，立即对小鼠麻醉进行摘眼球取血，迅速在冰上剥离海马，置于冻存管中，-80 ℃冻存，待测。将血在室温静置一段时间后，4 ℃ 3 000 r・min-1离心10 min，取上层血清置于-80 ℃冻存，待测。Western blot法测定各组动物海马中BDNF的表达水平，用BCA试剂盒进行蛋白定量检测。将各组蛋白调成等浓度，并加入上样缓冲液，用12% SDSPAGE分离胶和5% SDSPAGE浓缩胶电泳分离后，转移到02 μm BVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，孵一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗室温摇床90 min，TBST洗膜3次，每次10 min，用UVP凝胶成像系统得出条带，并计算目的蛋白与内参βacting的吸光度（A）比值；按ELISA试剂盒说明书测定各组动物海马中Tau蛋白，pTau蛋白，Ach，AchE和Aβ的含量以及各组动物血清中NTproBNP的含量

24数据统计处理实验数据使用SPSS 200统计软件处理，采用单因素方差分析，组间差异采用Dunnet′s检验，计量资料数据用±s表示，以P

3结果

31对各组小鼠定位导航试验的影响腹腔注射D半乳糖和亚硝酸钠后，模型组小鼠的潜伏期明显升高，与正常组相比有显著性差异（P

32对各组小鼠空间探索试验的影响Morris水迷宫空间探索试验结果显示，腹腔注射D半乳糖和亚硝酸钠后模型组小鼠穿越平台次数和目的象限游泳路程百分比均明显小于正常组（P

33对各组小鼠海马中BDNF含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中BDNF表达明显降低；

与模型组相比，阳性组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组，《医心方》之开心散中剂量组，《医门方》之开心丸中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸高、中剂量组均能不同程度降低AD模型小鼠海马中BDNF相对含量，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（图1）。

34各组小鼠海马中Ach，AchE含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中Ach含量明显降低，具有统计学意义；与模型组相比，阳性对照组，《古今录验》之定志丸中剂量组，《医门方》之开心丸高、中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸中剂量组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组均能不同程度升高小鼠海马中AchE活性，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（表3）。

与正常组相比，模型组小鼠海马中AchE含量明显增加，具有统计学意义；与模型组相比，阳性对照组，《古今录验》之定志丸中剂量组，《医门方》之开心丸中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸中剂量组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组均能不同程度降低小鼠海马中AchE活性，具有统计学意义，而各组低剂量均未表现出显著性差异（表3）。

35各组小鼠海马中Aβ含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中Aβ含量明显增加，具有统计学意义（P

36对各组小鼠海马中Tau蛋白、pTau蛋白含量的影响与正常组相比，模型组小鼠海马中Tau蛋白含量明显增加，具有统计学意义；与模型组相比，

阳性对照组，《医心方》之开心散中剂量组，《医门方》之开心丸高、中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸中剂量组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组均能不同程度升高小鼠海马中AchE活性，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（表4）。

与正常组相比，模型组小鼠海马中pTau蛋白含量明显增加，具有统计学意义；与模型组相比，阳性对照组，《医心方》之开心散中剂量组，《医门方》之开心丸高、中剂量组，《备急千金要方》之定志小丸高、中剂量组，《千金要方・卷十四》之开心散高、中剂量组均能不同程度降低小鼠海马中AchE活性，具有统计学意义，各组低剂量均未表现出显著性差异（表4）。

37对各组小鼠血清中NTproBNP含量的影响与正常组相比，模型组小鼠血清中NTproBNP含量明显增加，具有统计学意义（P

4讨论

本实验采用腹腔注射D半乳糖联合亚硝酸钠模型，D半乳糖可造成急性亚衰老模型，亚硝酸钠可使全身脏器缺氧导致记忆力下降，在一定程度上模拟了AD的发病特点[58]，较多的与AD相关的研究均使用了类似模型，该模型需连续腹腔注射60 d，治疗时连续给药35 d，给药期间持续腹腔注射造模，避免动物自然恢复。本实验造模后动物的行为学研究结果显示，模型组的逃避潜伏期比正常组明显增加，而穿越平台次数和目的象限路程百分比明显减少，并且模型组小鼠普遍出现掉毛、毛色无光泽的衰老现象。给药35 d后，与模型组相比，各给药组逃避潜伏期有所减少，穿越平台次数和目的象限路程百分比有所增加。实验结果中，各类方低剂量与模型组相比均无显著性差异，因此不作为重点研究对象。

AD的发病机制非常复杂，涉及神经营养、胆碱能、β淀粉样蛋白、Tau蛋白、血管因素等多方面。BDNF是神经营养因子家族的一个重要成员，广泛分布于中枢神经系统，脑内BDNF水平下降是AD早期的信号之一[9]；乙酰胆碱（Ach）是中枢胆碱能神经系统主要的神经递质，是维持学习记忆正常进行的必要条件[10]；Aβ的集聚被认为是AD发病的环节之一，多种因素均可导致β淀粉样前体蛋白（APP）的主要代谢途径失衡而产生不溶性Aβ，通过一系列途径产生神经毒性，从而参与AD的病理[11]；以磷酸化Tau蛋白为主要成分的神经元纤维缠结是阿尔兹海默症主要病理表现，同时也是AD中发生认知和记忆功能障碍的重要原因[12]。NTproBNP是心率衰竭常见的检测指标，研究表明，NTproBNP水平升高可能预示着认知功能下降[13]。

本研究除观察6种开心散类方对AD模型动物的学习记忆能力的影响外，还选取了上述较有代表性的相关靶蛋白BDNF，Ach，AchE，Aβ，Tau蛋白，pTau蛋白，NTproBNP进行了作用机制的初步研究。结果表明，6个类方对AD模型小鼠相关靶蛋白均有不同程度的影响，但各有侧重。将相关靶蛋白指标运用主成分分析转化为权重[14]，首先用分析软件得出2个主成分，求出各个指标在各主成分线性组合中的系数，利用各主成分的方差贡献率将系数归一化，由此得出各个指标所占权重。结果显示，BDNF占007，Ach占019，AchE占008，Aβ占019，Tau蛋白占021，pTau蛋白占005，NTproBNP占020，由此得出Tau蛋白所占权重最多，因此，开心散类方治疗阿尔茨海默病模型小鼠的作用在Tau蛋白方面可能较为突出。

6个开心散类方对AD模型动物的作用不同，可能与它们的配伍比例不同、发挥作用的有效成分含量不同有关。《千金要方・卷十四》之开心散人参、茯苓、远志、石菖蒲的比例为1∶5∶1∶25，其重用茯苓与石菖蒲2味药材，表现出较明显的治疗AD效果；与之相比，《医心方》之开心散和《医门方》之开心丸减少了茯苓的配比，治疗AD的效果有所减弱。有研究证实去茯苓开心散对AD模型动物的学习记忆能力没有改善作用或作用减弱[15]；而本实验室前期关于6个开心散类方对抑郁的作用研究中表明《备急千金要方》之定志小丸对抑郁大鼠的影响最为明显，《千金要方・卷十四》之开心散在抑郁动物模型上未见显著的治疗作用，进一步针对入血成分的研究中表明《备急千金要方》之定志小丸的入血成分中人参和远志的有效成分明显较《千金要方・卷十四》之开心散多，说明人参和远志的含量对于抗抑郁作用的发挥至关重要[16]。结合以上分析，本研究中《千金要方・卷十四》之开心散在AD小鼠模型中的作用最佳，且该方重用茯苓和石菖蒲，提示茯苓和石菖蒲可能是其发挥治疗AD作用的主要因素之一，其进一步的作用及机制，需更深入的研究。

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第7篇：动物行为学分析范文

【关键词】 P2X3受体；神经病理性疼痛；L5前根切断；背根神经节

［Abstract］Objective: To observe the P2X3 receptor expression in lumbar 5 dorsal root ganglion（L5 DRG）with lumbar 5 ventral root transection (L5 VRT). Methods: Thirty male SpragueDawley rats were randomly pided into 5 groups， group A 3 days after L5 VRT， group B 7 days， group C 14 days， group D 21 days and group E of sham operation， whose left spine cords were exposed by hemilaminectomy. Rats in each group were respectively perfused with paraformaldehyde and materials were taken from L5 dosal root ganglions and the changes of expression of P2X3 receptor were observed with immunofluorescence staining. Results: (1) Compared with the control group， rats after operation could generate bilateral mechanical allodynia which could persist for at least 4 weeks (P

［Key words］P2X3 receptor; Neuropathic pain; Lumbar 5 ventral root transection; Dorsal root ganglion

神经病理性疼痛是由于外周或中枢神经系统的直接损伤或功能紊乱所致，在损伤修复后疼痛仍可能长期存在，它以自发性疼痛、痛觉过敏、异常性疼痛为特征，其机制复杂，目前认为与外周和中枢敏化相关［13］。背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）作为痛觉传入的第一级神经元，在痛觉的外周机制中起着极为重要的作用。近年来研究表明，DRG神经元在炎性痛和神经源性痛的情况下可发生显著的可塑性变化，如神经肽、受体、酶和细胞表面分子的表达都发生了不同水平的上下调变化。P2X3受体属于嘌呤受体（purinergic receptors），它选择性地表达在DRG神经元中与疼痛感觉相关的中、小神经元［4］。L5前根切断模型（L5 VRT）是一种较新的疼痛模型，该模型在椎管内切断L5的前根，而不影响感觉神经，但是会出现很明显的机械痛敏和短暂的热痛敏，并且会出现明显的镜像痛［5］。本文通过观察该模型中背根神经节P2X3受体表达的变化，探讨其机械痛敏的产生机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料及器材

手术器械（无菌手术刀、有齿镊、咬骨钳、线剪、眼科剪、三棱针、玻璃分针等）；Von Frey Filament（stoelting，USA）及相关设备；动物灌注装置（自制）；冰冻切片机（leica CM3050，德国）；荧光显微镜 （leica DFC 350FX，德国）；10%水合氯醛（购自中山大学第一附属医院）；兔抗 P2X3 受体血清（neuromics， Minneapolis，MN，USA)；羊抗兔的IgGcy3（chemicon）；正常羊血清（北京中山金桥）；牛血清白蛋白（北京中山金桥）；多聚甲醛（sigma，USA）；TritonX100（sigma，USA）。

1.2 动物及分组

选用SpragueDawley（SD）雄性大鼠，体重180～220 g，由广州中山大学实验动物中心提供。实验随机分为5组（n=6），L5 VRT术后3 d（A组）、7 d（B组）、14 d（C组）、21 d（D组）模型组和假手术组（E组），E组仅行半椎板切除术暴露左侧脊髓。

1.3 L5 VRT模型的制作

用10%水合氯醛麻醉（3.5 mL/kg，i.p.）大鼠，按照Li 等［5］描述的方法对大鼠行L5 前根切断手术。先在L4 至L5间进行半椎板切除术，暴露脊髓后，用三棱针轻轻划破外侧脊膜，然后用一特制的玻璃分针轻轻从背根下方提起前根，用虹膜剪剪去2～3 mm 的前根，分层缝合。假手术组仅行半椎板切除术，暴露脊髓，不行前根切断。

1.4 行为学测试

用Von Frey纤维丝测定大鼠的机械刺激撤足阈值（paw withdrawal threshold，PWT）。测试时将大鼠放置于测试的有机玻璃箱中，采用Chaplan等［6］报道的UpDown方法，检测大鼠50%的机械刺激撤足阈值。选8根强度呈对数递增方式的Von Frey Filament（0.41、0.70、1.20、2.04、3.63、5.50、8.51、15.14 g）分别对大鼠后肢左右脚足心部进行机械性刺激，每次刺激持续时间为6～8 s。首先用力度为2.04 的Von Frey Filament 开始测试，测试时Von Frey Filament 垂直，微弯，在大鼠足心部保持6～8 s，出现快速撤足为阳性反应，若撤足反应为阴性则选用刺激强度呈对数递增的相邻von Frey filament 继续刺激，若撤足反应为阳性，则选择相邻递减的刺激强度给予刺激。如此反复，以第一个转折点的前一点为起点，连续6次的刺激结果为最终的撤足反应模式（撤足反应呈持续阳性则为5 次刺激，撤足反应呈持续阴性则为4次刺激，刺激次数最多为9 次）。

1.5 动物灌注及标本处理

大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉，开胸暴露心脏，灌注用针经左心室置入主动脉灌注生理盐水至流出液不含红色，然后灌注含4%多聚甲醛约400 mL，固定30 min，取大鼠同侧及对侧L5 DRG后，放入4%的多聚甲醛中固定3 h，再转入4 ℃ 30%蔗糖溶液经24～48 h至组织沉底。用恒冷冰冻切片机（Leica CM3050，德国）切片，DRG切片厚度为16 μm，置于含有0.01 M PBS 的24 孔板内，4 ℃短暂保存。

1.6 免疫荧光染色

DRG冰冻切片用0.01 M PBS液洗3 次，每次 5 min，然后在室温下加封闭液，1 h 后吸去封闭液并加入兔抗大鼠P2X3抗体（1∶1 000；Neuromics，USA），置在 4 ℃ 冰箱24～48 h，吸去一抗，用0.01 M PBS 液洗3 次，加入标记Cy3 的羊抗兔二抗（1∶200，chemicon，USA），避光室温下作用1 h，再用0.01 M PBS液洗3 次，随机挑选切片贴于载玻片上，立即于荧光显微镜（德国Leica DFC 350FX）下观察并拍照。

1.7 数据分析及统计学处理

行为学测试结果均采用非参数检验进行分析。同一组大鼠不同测试时间点的数据用配对的秩和检验（Wilcoxon matched pairs test）；两个不同实验组某个测试日间的数据比较采用u 检验（MannWhitney u test）。

免疫荧光染色结果处理方法：每只大鼠随机（用随机数表法）挑取双侧L5 DRG切片各6张，在荧光显微镜下计数每张切片上的P2X3 阳性细胞百分比，并由此算出每只大鼠P2X3阳性细胞百分比的均数，每个实验组共计数6 只大鼠，最后计算出每组P2X3阳性细胞百分比的均数±标准误（Mean±SEM）。先用单因素方差分析处理数据，然后用Tukey post hoc test检测组间差异。统计学分析通过SPSS进行，所有数据用均数±标准误（Mean±SEM）表示，P

2 结果

2.1 一般行为学及足部形态的观察

在L5前根切断手术后的观察时间内，所有大鼠均保持良好的健康状态。体重增加正常，没有明显的伤口感染征象，总体活动状态与正常大鼠没有明显的差别。但L5前根切断侧的足趾并拢，足呈轻度的外翻状。见图1A、图1B。

2.2 L5 VRT模型组与假手术组大鼠机械痛敏比较

Von Frey纤维测定手术侧及对侧后肢50%撤足阈值。手术前动物对这种轻微的机械性刺激反应微弱，大部分的动物对最粗的Von Frey纤维（15.14 g）的刺激毫无反应，而术后几乎所有的动物对实验中所用的2.04 g的机械刺激撤足反应均为阳性，部分痛敏明显的动物对0.41 g的机械刺激都有明显的撤足阳性反应。

从图2可发现，L5 VRT术后不同时间机械痛敏明显，与假手术组相比差异有统计学意义（P

2.3 L5 VRT模型大鼠同侧L5 DRG的P2X3受体的表达变化

A 组的双侧L5 DRG的P2X3表达与E组相比无明显变化（P>0.05）。B组及C组、D组的对侧L5 DRG的P2X3受体的表达与E组相比无明显变化（P>0.05），但同侧L5 DRG的P2X3受体的表达与E组相比明显增加，差异具有统计学意义（P

3 讨论

本实验通过建立L5 VRT大鼠疼痛模型，应用免疫荧光技术观察了该模型中不同时间点的P2X3受体在大鼠的DRG上的表达，P2X3受体主要表达在DRG的小神经元和中等神经元上，与文献报道［4］一致。

在疼痛的基础研究中，既往很多外周神经损伤的模型，如CCI（chronic constriction injury）、SNI（spared nerve injury）、SNL（spinal nerve ligation）、PLSN （partial ligation of the sciatic nerve）等都是损伤轴突或初级感觉神经元，从而模拟损伤区异位放电而研究疼痛的机制［7］。近年来很多研究表明，邻近未受损的神经元也参与了疼痛的发生和维持［8］。在本实验研究中，我们采用的是一种比较新的疼痛模型，即L5前根切断的模型，其主要特点是不损伤感觉纤维的初级感觉神经元及轴突，术后次日行为学测试发现双足明显的机械痛敏，这种痛敏状态可持续至少4周，与Xu等［9］的研究一致，这可能是因为切断前根后局部的神经纤维脱髓鞘，感觉神经元完全暴露在华勒变性的环境中，从而通过细胞因子、炎性介质等作用于初级感觉神经元，引起初级感觉神经元异位放电同时伴有胶质细胞激活，而产生明显的病理性疼痛。

外周神经损伤可以调节P2X3受体的表达，其变化程度取决于损伤的类型。被ATP活化的P2X3受体在伤害性神经元上有表达，在CCI模型中P2X3受体在DRG小神经元中的表达是增加的［10］。Tsuzuki等［11］用原位杂交的方法发现神经损伤后在未受损的神经元中的P2X3 mRNA表达增加，但神经纤维被切断的神经元P2X3 mRNA表达下降。在L5 SNL（the L5 spinal nerve ligation）术后3 d直至整个实验观察期间未发现L4 DRG P2X3 mRNA 表达的改变［12］。这意味着在不同的神经病理性疼痛模型中，未受损的神经元中存在着不同的表型变化和病理机制。在我们的实验中发现不同时间点同侧L5 DRG中P2X3受体的表达增加，主要考虑L5 DRG受到邻近的神经损伤引起华勒变性的影响。Fukuoka等［12］认为，直接损伤的神经元其周围的胶质细胞激活，神经元释放的神经递质和胶质细胞释放的细胞因子等的协同作用，可能对这种邻近未受损的神经元中的P2X3受体表达的增加起了相当的作用。

实验中我们发现行L5前根切断后，能产生明显的双足机械痛敏，即镜像痛。有研究指出镜像痛的产生可能与脊髓背角中间神经元的交互作用、胶质细胞激活及细胞因子（TNFα、IL1β及IL6等）的参与有关［9，13，14］。而在我们的实验中观察到手术对侧P2X3 受体的表达无明显改变，说明在该模型中手术对侧的机械痛敏的改变与该侧P2X3 受体的表达无明显相关性，具体的机制仍有待进一步研究。

总之，我们的实验通过建立L5前根切断的大鼠疼痛模型，产生双足的机械痛敏，在此基础上，应用免疫荧光染色的方法观察了L5 DRG中P2X3 受体的表达特点，其同侧L5 DRG中P2X3 受体表达的时间规律性可能参与了该模型痛敏发生发展的机制。预先给予选择性的P2X3受体拮抗剂A317491，再观察L5 VRT大鼠的机械痛敏，进一步明确在该模型中P2X3 受体的影响作用，这将是我们进一步研究的问题。

致谢：本实验大部分工作在中山大学疼痛研究中心完成，得到各位老师及同学的帮助，特此表示感谢。

【参考文献】

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［12］Fukuoka T， Tokunaga A， Tachibana T， et al. VR1， but not P2X3， increases in the spared L4 DRG in rats with L5 spinal nerve ligation ［J］. Pain， 2002， 99(12): 111120.

第8篇：动物行为学分析范文

【关键词】 隔山消

摘要：目的探讨隔山消对药物所致小鼠空间学习记忆障碍的作用，并初步探讨其作用机理。方法50只昆明小鼠随机平均分为空白对照组、模型组、阳性对照组(刺五加注射液)、隔山消高、低剂量组，各组动物在作相应的处理之后，于Morris水迷宫实验中测试其潜伏期。各组动物完成行为实验后颈椎脱臼处死。在低温下取其脑组织，用羟胺比色法测定脑组织中Ach含量和Ach-E的活性。结果模型组动物达岸时间(即潜伏期)明显延长，表明空间学习记忆产生障碍；阳性对照组，隔山消高、低剂量组潜伏期均明显低于模型组，且第3天成绩好于空白对照组。三者相互比较，隔山消高剂量组第3天成绩最好。隔山消高，低剂量组的Ach含量明显高于模型组，而隔山消高低剂量组的AchE活性均略高于模型组，且均低于阳性对照组。结论隔山消对于药物所致的空间学习记忆障碍有一定的作用。

关键词：隔山消； 空间记忆障碍； Morris水迷宫实验； 小鼠

The Effects of Cynachum uilfordii (Maxim) Hemsl on the Learning Memory Disorder Caused by Drug in Mouse

Abstract:ObjectiveTo investigate the effects of Cynachum uilfordii (Maxim) Hemsl on the mouse space learning memory disorder caused by drug and to investigate the mechanism of effection.Methods50 mouse were randomly pided into blank matched group，model group，positive control group(manyprickle acanthopanax root injection)，Cynachum uilfordii high dosage group(15 g/kg) and low dosage group (7.5 g/kg).Each group was deal with severally，then measured the latent periods in Morris Water Maze test.The mouse of each group were put to death by dislocating their cervical vertebras after the behavior tests.The brain was hydroxylamine colorimetric method.ResultsThe reachingbank time (latent period)of model group prolonged obviously，which showed the space learing memory disorder;The latent periods of positive control group，Cynachum uilfordii high dosage group and low dosage group prolonged control group，Cynachum uilfordii high dosage group was the best of the three above.The content of Ach of Cynachum uilfordii high dosage group and low dosage group was visibly high dosage group and low dosage group were appreciably higher than that of model group，and both of them were lower than of positive control group.ConclusionThe results indicated the Cynachum uilfordii(Maxim)Hemsl has effect on the space learing memory disorder caused by drug.

Key words:Cynachum uilfordii(Maxim) Hemsl; Learning memory disorder; Morris Water Maze test; Mouse

学习记忆属高级神经活动。学习和记忆的基本过程大致可分为三个阶段：获得，巩固和再现。了解学习记忆过程，提高学习记忆能力，无疑是当今社会一个值得关注的课题。根据学习记忆的生理生化基础，目前多选用一些化学药品致记忆损伤。从而复制出学习记忆障碍模型，以研究各种药物对某些药物所致的学习记忆障碍方面的改善作用。近年来，我国传统的中药越来越受到重视，中药在许多疾病的治疗上，显示出的优越性是许多西药所不及的。隔山消Cynachum uilfordii(Maxim)Hemsl又名白首乌，是祖国传统中药，具有养血益肝，固肾益精，乌须黑发和延年益寿的功效。现在研究发现白首乌中含有多种有效成分，具有抗肿瘤，抗衰老等多方面的药理活性，其主要成分为羟基马甾烷酯苷，其中富含磷脂类成分，可以抗肿瘤抗衰老，而且对脑细胞具有保护作用。据此设计本实验，研究隔山消对药物所致小鼠学习记忆障碍的影响，并测定其大脑中Ach含量和Ach-E活性的改变，以初步探讨其可能的作用机理。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物与药品选用成年健康的昆明种小鼠，雌雄各半，体重20～30 g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。隔山消，中药原材料，购自湖北省中药材公司，由湖北中医学院药学部进行加工粉粹过筛120目，实验时取7 g粉末，加入45 g纯净水，文火加热至沸腾，静置10 min后，过滤两次取其过滤液。4℃保存，灌胃前适当加温。刺五加注射液(有效成分黄酮5 mg/ml，批号ZZ5397黑卫药准字(1990)第200416号)，黑龙江乌苏里江制药有限公司。戊巴比妥钠粉剂，上海试剂分购度试剂厂，批号：860603，用蒸馏水配置成1.5%溶液，供腹腔注射。溴化乙酰胆碱，其他试剂均为市售分析纯或化学纯。

1.1.2 仪器Morris水迷宫系统：水桶直径76 cm，桶高36 cm，水深12.9 cm，安全岛高：11.4 cm，计算机软件系统：泰盟Bio2000实验系统；摄像机；SONY；台式高速冷冻离心机TL16R(上海离心机研究所)；722型分光光度计；上海申化仪表自控公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与模型的建立将50只小鼠随机分为5组，每组10只，①空白对照组：不给予任何药物，于每次训练前1 h灌胃(NS，0.5 ml/20 g)②模型组：于实验前3 d开始每天腹腔注射戊巴比妥钠1次(剂量：1.5 mg/ml，0.1 ml/10 g体重)。开始实验后，每次训练前30 min戊巴比妥钠腹腔注射(剂量同上)③阳性对照组：于实验前6 d开始每天腹腔注射1次刺五加注射液(剂量：1.5 mg/ml，0.1 ml/10 g体重)。开始实验后于训练前1 h腹腔注射剌五加注射液，剂量同上。④隔山消低、高剂量组：实验开始前6 d开始每天灌胃(隔山消，7.5，15 g/kg)实验开始后每天提前1 h灌胃。其中，阳性对照组，隔山消低、高剂量组在实验开始后，于每天训练前30 min腹腔注射戊巴比妥钠1次(剂量：1.5 mg/ml，0.1 ml/10 g体重)。

1.2.2 行为学实验方法用过圆心的两条相互垂直线分水迷宫为A，B，C，D 4个象限，安全岛位于A象限，位置固定。每天将小鼠依次从B，C，D区面朝桶壁放入水迷宫中，记录其自下水到抵达并停留在安全岛(A区)上所用的时间，即潜伏期。以120 s为限，若此时间内动物不能到达安全岛，在将此小鼠安置于安全岛上10 s，让其熟悉环境。

1.2.3 Ach含量和Ach-E活性测定实验结束后，于冰台上以颈椎脱臼法处死，并迅速取出全脑，去其脑干及小脑，用水生理盐漂洗，滤纸吸干后称重，样品以冰生理盐水配制成20%匀浆液，4℃ 4 500 r/min离心5 min，取其上清液，按羟胺比色法进行Ach含量，Ach-E活性测定。

转贴于

1.3 统计学处理实验数据用±s表示，各组间差异用t检验进行统计学分析。

2 结果

2.1 隔山消对戊巴比妥钠所致小鼠学习记忆障碍的影响连续3 d的水迷宫试验发现，模型组的潜伏期成绩明显延长，说明模型复制成功。阳性对照组第3天的潜伏期明显缩短，与模型组比较(P＜0.05)；隔山消高剂量组第3天的潜伏期与模型组比较(P＜0.01)；隔山消低剂量组第3天的潜伏期与模型组比较(P＜0.05)。结果见表1，图1。

表1 隔山消对戊巴比妥钠所致小鼠学习记忆障碍的影响(略)

图1 隔山消对戊巴比妥钠所致小鼠学习记忆障碍的影响

2.2 隔山消对小鼠脑组织Ach含量，Ach－E活性的影响在低温下取小鼠脑组织匀浆，用羟胺比色法测定各组小鼠脑组织中Ach含量及AchE活性，其结果显示：隔山消高，低剂量组小鼠脑组织中的Ach含量明显高于模型组小鼠脑组织中的Ach含量(P≤0.01)，隔山消高，低剂量组小鼠脑组织中的AchE活性均高于模型组。结果见表2，图2～3。

表2 隔山消对戊巴比妥钠所致学习记忆障碍（略）

3 讨论

隔山消，又名白首乌，是传统补肾良药，具有养血益肝，固肾益精，乌须黑发和延年益寿的功效。经研究发现该中药含有多种有效成分，具有抗肿瘤，抗衰老等多方面的药理活性，其主要成分为羟基马甾烷酯苷，其中富含磷脂类成分，可以抗肿瘤抗衰老，而且对脑细胞具有保护作用。中医认为“肾藏精，精生髓，通于脑”，“脑为髓海”，故脑功能与肾精盛衰密切相关。补肾可益精生髓，健脑促智，中医药临床上运用补肾法延缓衰老，防止脑功能减退有悠久历史。而用隔山消对抗药物引起的空间学习记忆障碍尚未见报道。

图2 隔山消对戊巴比妥钠所致学习记忆障碍小鼠脑组织Ach含量的影响

图3 隔山消对戊巴比妥钠所致学习记忆障碍

小鼠脑组织AchE活性的影响本实验从动物行为学实验和生化测定实验两方面探讨隔山消在对抗药物引起的空间记忆障碍的作用。先用药物造成小鼠空间学习记忆障碍，即制作动物一种记忆障碍的模型，采用水迷宫实验方法，观察药物对动物行为功能的影响，同时用生化测定方法，初步分析药物作用机制。为获得稳定可靠的模型，需注意以下问题：实验环境对实验结果有非常大的影响。本实验宜在隔音或半隔音室内进行，同内温度，湿度光照度应适宜并保持一致。实验室内物品摆放及实验人员在实验中所处的位置保持一致。本实验观察到上午与下午进行的测试会有所差别，可能与上、下午小鼠分泌的激素或神经甾体的量有关。光线的强弱、室内物品的摆放，和实验人员站位对小鼠测试也有较大影响。小鼠在一定的空间、光线下训练，经条件反射形成记忆，改变上述实验条件，会影响条件反射的形成，从而使实验结果有较大差异。通过水迷宫实验发现，阳性对照组(刺五加组)和隔山消组(高、低剂量组)对小鼠寻找平台的潜伏期均明显小于模型组。结果显示，隔山消对药物所致的空间学习记忆障碍，有明显改善作用。Ach是脑内的经典神经递质，与认识、学习、记忆等大脑高级神经功能有关。学习记忆任务的完成伴随着脑内的Ach的变化。AchE是Ach的分解酶，它的活力变化可间接反映脑内Ach含量的关系。本实验采用羟胺比色法测定脑组织乙酰胆碱和胆碱酯酶的含量，结果提示，模型组小鼠脑组织中Ach含量和Ach-E活性均低于正常对照组和给药组鼠，隔山消组小鼠脑组织中Ach含量及AchE活性明显高于模型组。表明隔山消对戊巴比妥钠所致的小鼠学习记忆障碍的改善可能与影响中枢胆碱能系统功能有一定关系。大脑的空间学习记忆能力涉及到多种机制参与，而不是单一的胆碱能系统来发挥作用的，因此有关其他作用机理有待进一步研究。

参考文献

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第9篇：动物行为学分析范文

现代质谱技术作为蛋白质组学支撑技术之一，在蛋白质和肽段的鉴定、定量和结构分析方面起着非常重要的作用。质谱分析进行蛋白质鉴定和序列测定的基本原理是使用电喷雾离子化和基质辅助激光解吸离子化的软电离方法，经酶切后的蛋白质肽段或完整蛋白质带上电荷，然后根据不同离子间的质荷比的差异来分离并确定相对质量。样品分子进行上述方法电离时能保留整个分子，确保了完整性而不会形成碎片离子，称为肽质量指纹图谱（PMF）技术。PMF是一种现在运用最广的用来鉴定2-DE分离出来的蛋白质和肽的方法，伴随着现代质谱技术的不断发展，其在蛋白质组学中的应用将越来越广泛。

高效液相色谱及多维液相色谱高效液相色谱（HPLC）技术最初被用于分离蛋白质或多肽。现在，HPLC已成功应用于蛋白质组学研究中，它是基于样品分子在固定相（柱填料）和流动相（淋洗液）间的特殊相互作用而实现样品分离的。无须变性处理样品，可实现上样收集及在线分析的自动化。利用液相色谱结合电喷雾质谱（ESI-MS）而不依赖于2-DE，也可以分析磷肽或糖肽，先由特异性的胰蛋白酶消化，产生的多肽由强阳离子交换柱和反相HPLC分离后经ESI-MS/MS分析。液相色谱与MS联用，采用高速且高灵敏度的色谱分离法来代替耗时的2-DE蛋白质分离法，故其与经典的2-DE-MS法相比，具有快速、样品需要量少和多肽分离的通用性强等优点，将会在不同酪蛋白形式的分子特性描述中得到更进一步的应用。但由于层析填充物对许多蛋白质组分有吸附作用，且难以实现多组分蛋白质样品的多维层析，因此仅适用于研究单一蛋白质或简单样品蛋白质组。多维液相色谱（MLC）则是利用与串联质谱联用，可以检测低丰度肽段，是目前蛋白质组学研究最新的技术，可快速并高通量鉴定复杂蛋白质混合物。

蛋白质组学技术在畜禽动物营养学中的应用

传统肉类生产中的饲养管理、饲料结构、饲喂方式和饲养密度在基于动物营养和饲料工业的现代肉类生产的出现后，发生了本质性的改变。同时，大规模的现代肉类生产影响到了饲养动物的生理学、行为学和生物化学过程，随之导致了肉品品质的下降。同时生产者为了增大产量和减少疾病风险，在养殖过程中滥用抗生素等化学药物，加剧了肉类品质的恶化。此外，为了追求提高肉类的某些性能，忽视了饲养动物的体质健康、外部形状与内在机能的协调，生理学的平衡和整体适应性，从而导致现代肉用动物（猪和鸡）对周围环境条件的高度敏感性，最终导致了肉品的食用品质，如：色泽、风味和嫩度等下降，PSE肉的比例升高，肉中的抗生素残留现象极为突出。鉴于此，对肉品品质进行评价并对其进行可能的等级标注及对其生产过程控制，对于现代肉品生产至关重要。蛋白质是肌肉组织的重要组成成分，研究表明：肉类品质研究与功能蛋白质的结构研究间密不可分，蛋白组变化可能与肉的嫩度相关。肌纤维分红肌纤维和白肌纤维2种类型，这2种类型在代谢水平上存在着结构和功能的差异。纤维类型与肉质性状，如：性、风味和嫩度等的关系存在着很多争议，尤其是纤维类型对肉嫩度的影响仍然不清。Lametsch等首次利用蛋白质组学分析屠宰后猪肌肉的变化情况，采集了刚屠宰至屠宰后48h的肌肉蛋白质组样品，这些肌肉蛋白质相对分子质量介于5000~20万不等，pH在4~9，结果发现蛋白质组模式发生了15种显著的变化。此后的研究中Lametsch等最终确定了可作为肉品质标记的20多种蛋白质，包括结构蛋白质（肌动蛋白、肌球蛋白和肌钙蛋白）和代谢酶（肌激酶、丙酮酸激酶和糖原磷酸化酶）。在这些标记蛋白中，人们发现肌动蛋白和肌球蛋白重链与肌肉的剪切力间存在极显著的相关，这就清楚地表明屠宰后肌动蛋白和肌球蛋白重链的降解会影响肉的质量。Remignon等直接对肌肉蛋白质片段进行分析，认为蛋白质的改变很可能是导致家禽PSE肉综合征的直接原因。Molette等研究发现火鸡屠宰后胸肌糖酵解的速度比较快（屠宰后每20minpH比正常的多下降0.5），从而使得肉品质发生改变，如：系水力下降、加工产量降低和嫩度降低等。同样报道了糖酵解快的动物肉的系水力低，并且提取到的肌浆蛋白含量低，这表明当pH下降的速率加快时蛋白质功能发生了改变。

蛋白质组学技术在水产动物营养学中的应用

蛋白质组学方法在水产动物营养特别是鱼的品质鉴定中已有应用，目前也被广泛应用到了对虾和海蜇等的品质控制中。随着对鱼类水产品的需求日益增长，保障和控制其安全生产具有重要的意义。在以数量增长为主的水产集约化养殖、运输和销售过程中，拥挤应激是常见的影响水产品食用品质的因素，解冻程序同样深刻地影响水产的品质。近年来，蛋白质组学已被广泛地应用到了水产品品质控制。Inger等利用2-DE技术研究新鲜的鳕鱼与死后鳕鱼肌肉，发现有11个蛋白质点的丰度发生了变化，其中8个蛋白质点的丰度显著增加，后续分析表明：这些蛋白质点是肌原蛋白、肌浆蛋白和肌肉纤维等肌肉组织的分解产物。由此可见，蛋白质组学技术对评价鱼肉鲜度等品质具有重要的现实意义。Kjaersgard等通过对11种不同冷冻储存条件下对鳕鱼肌肉蛋白质图谱进行研究分析，发现不同冷冻储存温度对蛋白质图谱并无显著影响，但经过不同的冷冻储存时间（3、6和12个月），肌浆球蛋白轻链、磷酸丙糖异构酶、醛缩酶A和2-α肌动蛋白片段等蛋白质的质量浓度发生了显著变化，从而导致鱼肉的质地和味道发生了变化。Martinez等通过研究人工养殖的鳕鱼与野生的鳕鱼，比较发现人工养殖的鳕鱼2-DE图上蛋白质相对分子质量在3.5万~4.5万间存在显著差异。然而目前蛋白质组学技术在水产养殖和贮藏加工过程中的研究还处于起步阶段，随着相关技术的发展，将在水产动物营养中起到更加重要的作用。