基因重组精选(九篇)

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第1篇：基因重组范文

9月24日晚间，一则来自平安银行的公告引爆资本市场。这则公告称，董事会于9月21日收到董事长肖遂宁、行长理查德·杰克逊的辞呈，两人的职位拟分别由平安集团副董事长孙建一及刚刚离职的民生银行副行长邵平接任。

一夜之间将相齐换，平安集团二号人物孙建一进驻银行顺理成章，而“空降”的新任行长邵平则是民生银行的“宿将”。令人意外的是，直至平安公告之后，民生银行才发出公告，确认邵平已从该行副行长任上离职，在此之前无论是民生方面还是平安方面都没有透出风声。本刊记者第一时间联系肖遂宁和理查德·杰克逊，但两人都对去职一事三缄其口。

该来的一天还是来了。

只不过，很多深发展老员工和资本市场都没有预料到，如此重要的两项人动会在同一时间。这样的组合，对于刚刚稳定的平安银行如何引入“平安”基因和“民生”凶悍作风，带来种种遐想。

平安嫡系

对于肖遂宁及理查德的去职，市场早有预期。平安银行整合深发展进程数年以来，深发展原副职至最近已经换血完毕，原平安银行相关高管陆续入掌深发展相关业务部门，行长及董事长一职的撤换也在情理之中。至此，在现任平安银行的高管中，只有主管公司业务的副行长胡跃飞是深发展的“老人”。

不过，新平安银行董事长和行长两大核心职位同时撤换，还是展现出平安一贯强势的行事风格，同时也标志着平安全面主导时代正式到来。

此次变动中，孙建一出任平安银行董事长一职并不意外。自从80年代被马明哲从人保挖到平安之后，孙建一一直是马的左膀右臂，过去平安通过几步战略逐渐组建起合并前的平安银行的过程，孙建一也长期扮演一线的操盘者，也曾担任过合并前的平安银行的董事长。

孙建一在平安集团内部一直是“忠厚老者”的形象，为人柔和，处事平衡，擅于拿捏关系。在平安集团当年的多次关键性谈判中，均是由他带队出席，并取得了不错的效果。

在此之前，由于马明哲负责替集团制定目标和战略，作为平安集团副董事长的孙则较多地把时间花在对外和具体业务的沟通协调上，在内在外都是平安集团的二把手。

在平安银行整合深发展的过渡阶段，孙建一在两者的企业文化融合上所下功夫颇多。2011年，他就和深发展党委书记王骥以党建工作为名，一起跑遍了深发展的各个省级分行，意即安抚各位地方大员及“推销”平安文化，减少进一步整合可能引起的文化摩擦。

在他的努力下，平安深发展换标一事最终朝着预想的方向前进，并于今年8月顺利走完了流程。

以孙建一作为新平安银行的董事长，不但是平安加强对银行掌控的常规步骤，也显示平安集团对这块目前受托资产管理规模万亿以上的领域异常看重。

作为平安金控架构最后完成整合的板块，平安的一些其它部门诸如信托和产险，都期待与平安银行的深度合作，而孙建一正是充分释放板块协同效应、提升平安银行盈利能力的合适人选，其在集团内长期积累的权威和擅于协调的个性也有助于银行在平安的金融综合协作大版图中话语权的提升。

民生血统

与孙建一的顺理成章相比，邵平的“空降”有些让人惊讶。根据民生银行8月底刚刚公布的半年报，作为民生排名第二的副行长，邵平的任期原本至2015年。他亦担任总行风险管理委员会主席一职，主要负责银行的风控工作。

从履历上看，邵平可谓民生银行名副其实的创业元老，1995年即参与民生银行筹建，历任信贷部总经理、上海分行行长、总行行长助理，直至总行副行长，并亲身参与了股份制商业银行的创建、改革、转型、发展、壮大的全过程，资历深厚。

根据一位民生员工的讲述，可能与主管的是风险管理相关业务，邵平平日里为人比较低调，讲话较少，“但还是比较有威信的。”

据知情人士透露，此前浦发银行总行曾经开展过一轮行长竞聘，邵平就是行长候选人之一，但是因为种种原因未能成行，不过此番进驻平安担任行长，也可以说是“失之东隅，收之桑榆”。

事实上，现在回头看来，民生银行对于高管层的变动似乎有所准备，管理层原有四位副行长，除邵平以外，还有邢本秀、赵品璋和毛晓峰，但是几个月前民生中高层已经进行了一轮人事调整，聘任授信评审部总经理石杰、金融市场部总裁李彬和公司银行部总经理林云山担任行长助理，对未来管理层的新老更替做好准备。

一位股份制银行人士称，银行业金融机构中，平安和民生在风格上有相近的地方，比如都比较崇尚“狼性”文化，也不是特别按照常理出牌。而两位当家人马明哲和董文标的个人特点非常鲜明，并极大地投射到企业特色中，“这对邵平入主平安银行有一定的帮助作用，在对平安企业文化的理解和磨合方面，也许会比旁人更加得心应手。”

不过，长期掌管风控的邵平能否适应平安银行加速发展的战略需求，同样有待于时间和市场的检验。

第2篇：基因重组范文

生长激素的作用

生长激素是由大脑垂体分泌的，rhGH与人自身合成的生长激素相同，其主要功能一是刺激软骨细胞的增殖和分化，促进骨骼的生长，从而加快身高增长速度；二是通过它以及它作用于肝细胞合成的胰岛素样生长因子，调节人体代谢，促进蛋白质的合成以及脂肪的分解。

哪些矮小者可以用rhGH

rhGH是治疗各种原因引起的生长激素缺乏症(GHD)的首选药物，包括特发性GHD或继发于颅脑肿瘤、炎症、外伤、发育不良等病变以及放射治疗的GHD。对这一类矮小患者，rhGH的疗效非常显著，如一般第一年的连续治疗可使患者长高约10厘米，经连续治疗数年，可明显改善患者的成年身高（终身高）。rhGH对于因特纳综合征（一种性染色体疾病）、慢性肾功能不全所导致的矮小，也具有肯定的疗效。另外，rhGH对宫内发育迟缓所致的矮小，对遗传性、家族性或其他病因不明的特发性矮小，在治疗期间具有明确的加快生长的功效，但关于增加成年身高的作用，虽已有肯定的报道，至今国际上仍然没有定论。

什么时间开始治疗好

总的原则是确诊后越早越好。从疗效来讲，骨龄越小，骨骼生长的潜能越大，因而身高追赶的空间也大。从费用考虑，由于rhGH的治疗剂量是根据体重来计算的，同样增高1厘米，体重轻者所花的钱自然就少。必须指出的是，慢性肾功能不全的矮小患者的治疗只能在肾移植之前进行，而肿瘤患者必须在原发疾病得到控制的前提下，才可以开始治疗。

疗程要多长

生长激素的促长作用只表现在用药期间，换一句话说，你用药时就长得快，不用药时，又回到原来的速度（刚停用后的短时间内生长还可能较治疗前快）。因此，影响疗程长短的因素有多个。首先，从医疗的角度，一般疗程越长疗效越好，以GHD为例，连续治疗3年以上，才能取得比较满意的结果。其次，迄今为止，rhGH的治疗费用还是十分昂贵的，对药费的承受力也决定了疗程的长短。再次，患者对治疗的依从性、患者自身及其家人对最终身高的期望值、患者开始治疗的年龄等都与疗程有关。但是，当患者治疗期间的生长速度低于每年2.5厘米，或骨骺已闭合则应停止使用。

治疗中需注意的问题

一是诊断。因为生长激素并不能治疗所有的矮小症，所以明确的诊断对于制定治疗方案、调整治疗剂量、预测疗效、权衡治疗结果与治疗费用都是很重要的。如垂体功能减退患者除生长激素外，还需补充其他的垂体激素。又如，治疗不同原因引起的矮小时，使用的剂量是不同的，因特纳综合征患者所需的剂量较GHD大。

第3篇：基因重组范文

00：41

相比前代车系，全新思域的外观设计显得更加大胆、年轻化，激进的前脸配以流畅的车身线条，极大地提升了整车运动感。值得注意的是，新一代车型较上一代车型增宽了约50mm、车身高度降低了25mm，轴距则拉长约30mm。在突显运动性的同时，进一步扩充了后排空间。车体重量经过轻量化改进后减重30.76kg。

01：45

内饰方面，全新思域更加体现了以驾驶员为中心的座舱设计理念，方向盘、仪表盘造型不仅更加动感，车内质感也得到了提升。另外，多媒体配置水平与雅阁保持一致，这其中就包括了中控台上的7英寸触控屏幕，其可以在智能手机的对应功能上全面支持Apple CarPlay与Android Auto系统。

02：25

全新思域的安全性也得到进一步加强。本田Sensing主被动安全科技被引入，包括降低碰撞损伤的CMB预警式煞车系统、RDM车道偏移警示以及支持可低速跟车行驶的新一代ACC主动式巡航系统等，均保证了驾驭安全性。乘坐空间方面，新一代思域后排腿部空间增加了约51mm，同时行李厢容积也得到了提升。

03：28

全新思域拥有最大功率116kw的2.0L自然吸气发动机与最大功率127kw的1.5T直喷涡轮增压发动机可选。前者可匹配6速手动或CVT变速器，后者则匹配的是一款专门针对涡轮增压发动机研发的CVT无级变速器。

03：47

这款2.0L自吸发动机并非之前1.8L发动机的后裔，而是跟本田那台在前几年一举创下量产汽油发动机的最高热效率记录的LFA型发动机沾亲带故。在国内涡轮发动机愈发火热，并且2.0L和1.5T最大功率相近的情况下，预计2.0L发动机并不会在未来的国产版车型上出现，而1.5T地球梦直喷涡轮增压发动机将会引入国内。

第4篇：基因重组范文

（贵州师范大学荞麦产业技术研究中心／生命科学学院植物遗传育种研究所，贵阳 550001）

摘要：以贵州师范大学荞麦产业技术研究中心建立的两个甜荞（Fagopyrum esculentum）重组自交系群体（Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1）的亲本为研究对象，选取了5个多态性好、带型清楚的随机引物进行RAPD分析，计算了每对亲本之间的相似度系数，并构建了各亲本的RAPD指纹图谱。结果表明，在Homo×甜自100和Lorena－3×甜自21－1的亲本中，平均相似度系数分别为39．13％和42．69％；在构建的RAPD指纹图谱中，有29条谱带为Homo（P1）所独有，27条谱带为甜自100（P2）所特有；有26条谱带为Lorena－3（P1）所独有，25条谱带为甜自21－1（P2）所特有。荞麦特异谱带可以作为品种鉴定的分子标记。

关键词 ：甜荞（Fagopyrum esculentum）；RAPD；多样性；DNA指纹图谱

中图分类号：S517 文献标识码：A 文章编号：0439－8114（2015）02－0284-05

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.008

甜荞（Fagopyrum esculentum）为荞麦大粒组类群7个生物学物种之一［1］。Chen［2，3］的试验研究表明，普通荞麦中存在着大量的形态变异，而对这些变异进行深入研究将在很大程度上有利于遗传育种。基因控制着生物体的性状表达和变异，研究DNA分子的多态性也会促进对形态变异的进一步探索，并在遗传育种中为选择强优势组合的亲本进行杂交和荞麦资源的鉴定提供科学依据［4］。

RAPD技术是以PCR为基础的一项检测物种DNA多态性的分子技术［5］。该技术的优点是DNA样品需求量小；无种属和基因组结构特异性，一套引物可用于不同生物基因组分析；试验成本低；试验技术简单，检测速度较快。RAPD在荞麦中应用主要集中在荞麦的遗传多样性和种间系统关系研究方面［6］。通过建立RAPD指纹图谱，寻找每个种类的恒定谱带和独特谱带，可以迅速准确地对荞麦种类进行鉴别。近年来，RAPD技术已应用于多种植物杂交组合后代鉴定［7，8］和种子纯度的检测等。Ohinshi等［9］、Tsuji等［10］利用AFLP和RAPD技术研究苦荞栽培品系和天然种群间的系统发育关系。Sharma［11］应用RAPD技术研究了荞麦属14个种之间的遗传多样性。Kump等［12，13］采用RAPD技术进行了苦荞33个栽培种之间遗传关系的分析。许瑾等［4］利用RAPD技术对荞麦属的9个品种进行基因组指纹图谱分析。谭萍等［14］采用RAPD方法对国内10个荞麦栽培种进行基因型分析，并建立了指纹图谱。Pan等［15］以F． esculentum Moench， F． esculentum var． homotropicum 及其杂交所建立的 225 株 F2代分离群体为材料，进行了 RAPD 与 STS 标记分析和重要形态性状遗传分析，并由此构建遗传标记连锁图谱，共涉及87个RAPD标记，12个STS标记。覆盖基因组长度655．2 cM。总的说来，由于普通荞麦自交不亲和，相关研究主要以荞麦品种或品系为材料，主要运用RAPD等标记。

在重组自交系中，利用亲本DNA样品进行RAPD 标记引物筛选，并将重复性好的引物进行其可育F2代分离群体样本的PCR扩增，用以分析甜荞RAPD标记多态性和构建起分子遗传连锁图谱。本研究对普通荞麦重组自交系群体亲本组合（Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1）的亲本用5种随机引物的RAPD谱带进行多态性分析和指纹图谱建立，以期为其F2代自交系群体的进一步研究打下基础。

1 材料与方法

1．1 试验材料

本研究选用了甜荞重组自交系的4个亲本甜荞种，分别为Lorena－3、甜自21－1、甜自100和Homo。重组自交系的亲本组合为：Homo×甜自100，Lorena－3×甜自21－1。甜荞品种由贵州师范大学荞麦产业技术研究中心提供。

1．2 DNA提取

取2～3周苗龄的新鲜健康叶片约300 mg置于研钵中，倒入液氮，研成粉末。将该粉末直接转入装有预热的含有15 μL β－巯基乙醇的1 000 μL 2％ CTAB提取缓冲液（质量浓度2％ CTAB，100 mmol／L pH 8．0 Tris－HCl，50 mmol／L EDTA－Na2，1．4 mol／L NaCl，质量浓度2％ PVP）的5 mL离心管中，轻轻摇动使其充分混匀，置于65 ℃水浴中保温60 min（每隔20 min轻轻颠倒混匀1次），加入酚／氯仿／异戊醇混合液（25∶24∶1，V／V／V），充分混匀，常温下静置10 min，10 000 r／min 离心10 min。将上清液加入氯仿／异戊醇混合液（24∶1，V／V），轻轻混匀，室温下10 000 r／min离心10 min。将上清液转移到干净的离心管中，加入2倍体积－20 ℃冰冻的无水乙醇，轻轻颠倒离心管直至出现白色絮状沉淀，将离心管放在 －20 ℃中沉淀10 min。离心沉淀DNA并将沉淀用 －20 ℃冰冻的体积分数为70％的乙醇洗涤两次，在室温下使DNA沉淀干燥。加入600 μL TE缓冲液，完全溶解后，置于－20 ℃冰箱保存备用。

1．3 引物

共使用了5个随机引物，各引物序列见表1。该引物从贵州师范大学荞麦产业技术研究中心设计的25个引物中选取，以亲本间多态性好、电泳带型清晰、重复性好为主要筛选原则。

1．4 PCR反应体系

试验中，RAPD检测使用的PCR反应体系见表2。PCR反应程序为：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性1 min，Tm（引物不同温度不同）退火1 min，72 ℃延伸2 min，38个循环；72 ℃延伸10 min。

1．5 统计分析方法

扩增产物于0．8％的琼脂糖凝胶中电泳，在BioSenSC805型全自动凝胶成像系统的Analysis工具栏中，点击消除背景图标以消除图像本底的干扰；点击自动检测所有泳道的条带图标以进行各泳道内条带检测；点击相对分子质量计算图标，以Marker泳道内的Marker条带的相对分子质量为标准设定相对分子量曲线图，关闭Marker窗口，则会显示各个条带的相对分子质量，统计各泳道内的条带数。

参考文献［16］，采用条带相似度系数分析条带的多样性。相似度系数SD＝（2nAB）／（nA＋nB），nA为A泳道内的DNA条带数，nB为B泳道内的DNA条带数，nAB是A、B泳道内共有的条带数。

2 结果与分析

2．1 亲本甜荞的RAPD电泳图谱

不同引物扩增的亲本甜荞的RAPD电泳图谱如图1和图2所示。

2．2 亲本甜荞RAPD标记的多样性分析

根据筛选出的5个随机引物的RAPD扩增结果，可以对每对杂交组合中的两个亲本进行扩增条带的多样性分析，两对杂交组合亲本中各引物的扩增情况与相似度系数见表3和表4。

由表3可知，对亲本Homo（P1）×甜自100（P2）的组合进行RAPD扩增，5个引物共扩增出92条谱带，平均每个随机引物产生了18．4条谱带。这些引物的扩增产物为17～20条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物R1182，共有20条谱带；其次为引物R52和R428，均为19条谱带；最少的为引物R41和R353，扩增出17条谱带。

对亲本Homo（P1）×甜自100（P2）组合的所有随机引物的RAPD标记多样性进行检测，结果（表3）表明，在5个随机引物获得的92条谱带中，有18条谱带在两亲本间表现为相同谱带，RAPD标记的相似度系数为39．13％（36／92）。对于每一条引物的相似度系数来说，其变化范围为31．58％（6／19）～50．00％（10／20）。其中RAPD标记的相似度系数最高的引物是R1182，达到了50．00％，引物R428的标记相似度系数最低，为31．58％（6／19）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Homo（P1）×甜自100（P2）在基因组DNA水平上存在较低的RAPD标记相似度系数，即DNA水平上条带的多样性较为丰富。有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。

由表4可知，对亲本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的组合进行RAPD扩增，5个引物共扩增出89条谱带，平均每个随机引物产生了17．8条谱带。这些引物的扩增产物为15～20条谱带，其中扩增条带数目最多的是引物R1182，共有20条谱带；而后依次为R52、R353、R41、R428，扩增出的谱带数分别为19、18、17、15。

对Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的亲本组合所有随机引物的RAPD标记多样性进行检测，结果（表4）表明，在5个随机引物获得的89条谱带中，有51条谱带在两亲本间的表现存在差异性，RAPD标记的相似度系数为42．69％（38／89）。对每条引物的标记相似度系数来说，其变化范围为40．0％（6／15）～47．06％（8／17）。其中RAPD标记的相似度系数最低的引物为R428和R1182，相似度系数为40．00％，R41的标记相似度系数最高，达47．06％（8／17）。因此，本研究所采用的杂交组合亲本Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）基因组DNA水平上同样存在较低的RAPD标记相似度，也存在较高的多样性，将有利于其子代群体获得更为广泛的性状变异。

2．3 亲本甜荞的RAPD指纹图谱

根据全部随机引物扩增产物的数据统计分析结果，将能在亲本组合中稳定扩增出现的、且具有差异的特异性谱带用来构建亲本组内P1和P2的RAPD标记指纹图谱。在Homo（P1）×甜自100（P2）的亲本中，共扩增出56条差异性谱带（表5）；在Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）的亲本中，共扩增出51条差异性谱带（表6）。

由表5和表6可知，Homo（P1）×甜自100（P2）和Lorena－3（P1）×甜自21－1（P2）组合亲本RAPD指纹图谱存在较明显的差异性。前者中有28条谱带为Homo（P1）所独有，27条谱带为甜自100（P2）所特有；后者中有24条谱带为Lorena－3（P1）所独有，24条谱带为甜自21－1（P2）所特有。因此，在每对杂交组合中，存在差异的谱带可看作是两亲本的特征性谱带，而由RAPD指纹图谱所反应的这些特征谱带可以作为鉴别亲本的依据，也可为进一步对杂交组合中亲本的DNA多态性及其他分子遗传研究打下基础。

3 讨论

Deng等［17］利用7个随机引物对19个荞麦（包括甜荞和苦荞）品种进行RAPD分析，结果表明其平均多态性达94．89％，而本研究结果表明，甜荞重组自交系的两对亲本组合的平均相似度系数分别为39．13％（Homo×甜自100）和42．69％（Lorena－3×甜自21－1），再次在DNA水平上说明荞麦种间的多态性远高于种内多态性。同时，对同属甜荞品种的两个亲本组合而言，其低于50％的相似度系数也从DNA的角度解释了甜荞异花授粉、自交不亲和等生殖学特征所带来的物种基因重组的多态性现象。在对荞麦进行种类划分的研究中，部分种类难以从形态学上进行识别，分类特征也常存在较大变异，难以把握。本研究在DNA水平上进行的RAPD遗传标记分析可对荞麦品种鉴别和遗传歧化研究提供依据。

此外，本研究以重组自交系亲本为研究对象进行RAPD分析，发现自交系群体亲本之间存在较多的特异RAPD谱带，也可为以重组自交系为研究对象进行的相关农艺学特征遗传及分子标记研究奠定基础。

参考文献：

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［5］ WILLIAMS J G K，KUBELIK A R，LIVAK K J，et al． DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］． Nucleic Acids Res，1990，18：6531－6535．

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第5篇：基因重组范文

【摘要】 目的 构建细粒棘球蚴铁蛋白基因的重组表达质粒ferritin/pET-28a，表达、纯化出重组蛋白，并对重组蛋白的免疫学特性进行初步研究。方法 将目的基因亚克隆至表达载体pET-28a，转化入大肠杆菌BL21(DE3)plysS，加入IPTG对其进行诱导表达。通过Ni2+的His-bind树脂柱纯化出重组蛋白，用50μg/100μL免疫ICR小鼠，获得抗血清，通过western-blot及ELISA对重组铁蛋白的免疫学特性进行初步研究。结果 表达并纯化出分子量约19kD重组铁蛋白，western-blot显示重组蛋白免疫制备的抗血清可识别纯化的重组蛋白及抗原囊液、原头蚴，位置大致相同，约19kD。ELISA结果显示实验组小鼠与对照组小鼠血清中IgG的OD值有统计学意义(P＜0.01)。结论 细粒棘球蚴重组铁蛋白Eg.ferritin具有较好的抗原性及免疫原性，具有成为包虫疫苗候选分子的潜能。

【关键词】 细粒棘球蚴；重组铁蛋白；纯化；免疫特性

铁蛋白(ferritin)是普遍存在于生物体内的一种保守性较高的多功能多亚基蛋白，其作用是储存铁，对生物体内铁含量进行调控，在生物体内铁含量过多时起到解毒作用［1-2］，它的存在保证了生命体的正常活动。本实验中心已构建了重组表达质粒ferritin/pGEX-6p-1，但由于重组蛋白ferritin/GST以包涵体形式存在于细胞中，无法通过亲和层析柱纯化出单一的Eg.ferritin［3］。只能通过切胶纯化的方法获得融合蛋白Ferritin/GST，虽然试验结果说明该融合蛋白具有较好的抗原性及免疫原性，但影响蛋白特性的因素较多，不能很好的反映蛋白的实际特性，因此本次试验将铁蛋白基因重组到表达质粒pET-28a中，pET-28a是个高效表达载体，能纯化变性及非变性的蛋白，通过表达纯化可获得较纯的Eg.ferritin，以便更好地研究蛋白的特性，为铁蛋白能成为包虫病候选疫苗提供依据。

1 材料与方法

1.1 质粒与菌种 Eg.ferritin/pGEM-T/JM109及E.coli BL21(DE3)plysS由本室保存；pET-28a表达载体购自Novagen公司。

1.2 试剂 T4连接酶、限制性内切酶BamH I、Not I、IPTG、N'N'N'N-四甲基乙二胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺购自Promega公司；β-巯基乙醇、二甲基亚砜、弗氏完全(不完全)佐剂、过硫酸铵、Tween-20等试剂购自于SIGMA公司；考马斯亮蓝购自BIOMOL公司；酵母提取物、蛋白提取物购自OXOID公司；蛋白预染Marker购自北京赛百盛；卡那霉素、TMB、4-氯-1-奈酚购自AMRESCO；羊抗鼠HRP-IgG、质粒DNA提取试剂盒等购自北京华美公司；DNA纯化回收试剂盒购自北京赛百盛生物有限公司；标准蛋白分子量Marker 购自中国科学院上海生物化学研究所；含Ni2+的His-bind树脂纯化试剂盒购自Novagen公司；其它常用试剂为国产分析纯。

1.3 实验动物 ICR小鼠，6～8周，(18±2)g，雌性，由宁夏医科大学实验动物中心提供。

1.4 Eg.ferritin/pET-28a重组质粒的构建及鉴定 取Eg.ferritin/pGEM-T/JM109菌株划板接菌［4］，并挑单个菌落进行培养，通过碱裂解法提取重组质粒；同时取适量的表达载体pET-28a，将两者分别用BamH I，Not I进行双酶切处理，用1%的琼脂糖凝胶电泳分离带有双黏性末端的目的片段和表达载体，切胶，经DNA回收试剂盒纯化目的片段及载体。目的片段与表达载体在T4连接酶的作用下，16℃连接过夜。继而将连接产物转化到已制备好的感受态菌BL21(DE3)plysS中［5］，经含卡那霉素终浓度为50μg/mL的LB固体培养基筛选阳性菌株［6］。挑取阳性菌株含卡那霉素的LB培养基中振荡培养，经质粒提取试剂盒纯化重组质粒，用限制性内切酶BamH I，Not I进行酶切鉴定。

1.5 重组铁蛋白的表达、纯化

1.5.1 重组蛋白的表达 将重组菌接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的3mL 的LB培养基中，37℃ 200 r/min 振荡培养数小时，按1∶50接种于50mL培养基中，37℃，220 r/min，培养至OD600=0.5时，加入IPTG至终浓度为0.05mmol/L，继续振荡培养6h，4℃ 4000r/min 离心15min，弃上清，收集细菌沉淀，SDS-PAGE观察表达情况。

1.5.2 表达产物的鉴定 将样本与2×SDS-PAGE样本缓冲液混合，经12% SDS-PAGE，180V电压，电泳至溴酚兰指示剂到胶底为止，用0.2%考马斯亮蓝R250染色2h，用含7%冰醋酸5%甲醇的脱色液脱色至本底无色。

1.5.3 重组抗原的纯化及制备 对细胞进行裂解，发现重组蛋白以包涵体的形式存在，按照Novagen公司His-bind树脂纯化试剂盒说明书中的包涵体大量纯化方法进行纯化，然后将纯化好的包涵体蛋白放入透析袋中，用1×PBS透析去除尿素。

1.6 动物免疫及特异性抗血清的制备

1.6.1 动物免疫 ICR小鼠分两组，即免疫组与对照组，每组10只。1)免疫组每只注射弗氏佐剂与重组抗原Eg.ferritin的乳化剂50μg/100μL。对照组注射弗氏佐剂和PBS的乳化剂100μL。根据Bio-Rad公司的Gel Doc1000凝胶分析系统对纯化的抗原进行定量。2)免疫方法 每组小鼠在0、2、4周各免疫1次，共3次，第1次基础免疫用弗氏完全佐剂，以后2次为加强免疫均用弗氏不完全佐剂。采用背部皮下多点注射免疫，每次注射量为100μL/只。分别于0、2、4、6周断尾采血，共4次，8周眼眶取血并处死小鼠。

1.6.2 特异性抗血清的制备 将血液4000r/min 离心 10min，提取血清，-20℃保存。

1.7 血清特异性识别 纯化的重组抗原Eg.ferritin、天然可溶性抗原囊液、原头蚴通过10%分离胶及5%的浓缩胶，180V电压下进行SDS-PAGE电泳 1h。在30mA下对硝酸纤维膜进行印迹转移1h。然后将硝酸纤维膜浸入5%的脱脂奶粉溶液中，37℃ 封闭1h，以PBS-T(PBS中含0.5‰ Tween-20)溶液洗3次，每次5min。再将硝酸纤维膜剪开分别浸泡于1∶100稀释的Eg.ferritin免疫的特异性小鼠抗血清及对照组鼠血清中，4℃ 过夜。次日将膜用PBS-T溶液洗3次，每次5min，然后与1∶1000稀释的羊抗鼠IgG-辣根过氧化物酶(HRP)结合，37℃反应1h。再以PBS-T溶液洗4次，每次10min。加入新配制的底物液(6mg 4-氯-1-奈酚，2mL冷甲醇，10mL的TBS，12μL的H2O2)37℃显色5min，最后用蒸馏水冲洗终止反应。

1.8 抗血清中IgG的测定 采用ELISA法，用纯化的Eg.ferritin 5μg/mL包被酶标板100μL/孔，4℃过夜。次日，PBS-T洗3次，5％牛奶封闭100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗3次，取0～8周的免疫组及对照组小鼠血清作为一抗，按1∶100稀释，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，羊抗鼠HRP-IgG为二抗，按1∶1000稀释，100μL/孔，37℃ 1h，PBS-T洗4次，加入显色剂100μL/孔，待对照孔显色时，加入2M H2SO4 50μL/孔 终止反应。以包被抗原及进行牛奶封闭的孔为空白调零，置酶标仪450nm波长处测OD值。

1.9 统计学方法 应用SPSS11.0统计学分析软件，采用两样本t检验的方法对测定的OD值进行分析。

2 结果

2.1 表达质粒Eg.ferritin/pET-28a的酶切鉴定

将构建的重组表达质粒Eg.ferritin/pET-28a 用限制性内切酶BamH I和Not I 双酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳检测到插入片断大小约560bp，与目的基因片段相符。M1.Lambda DNA/HindⅢMarker；1.pET-28a空质粒；2.Eg·ferritin/

2.2 Eg.ferritin 的纯化

含Ni2+的His-bind树脂亲合柱纯化Eg.ferritin/pET-28a表达的蛋白，经SDS-PAGE，根据标准蛋白分子量可知，纯化蛋白的分子量约19kD.

2.3 特异性抗血清识别纯化蛋白和天然抗原

纯化Eg.ferritin免疫小鼠制备的抗血清可特异性识别未纯化的重组Eg.ferritin，纯化的Eg.ferritin 及天然抗原(原头蚴、囊液)，识别蛋白条带的位置大致相同约19kD(见图3)。

2.4 小鼠血清IgG水平变化

根据对小鼠血清IgG水平在0～8周变化趋势的检测及对免疫组和对照组小鼠血清IgG的比较发现，小鼠血清中IgG的水平随着免疫次数及时间的延长呈上升趋势，免疫4周以后同一时期的免疫组小鼠血清中的IgG水平明显高于对照组(P＜0.01)。表1 两组小鼠免疫不同时间血清IgG水平变化

3 讨论

本实验将细粒棘球蚴铁蛋白基因重新克隆到表达载体pET-28a上，主要考虑：① pET-28a表达载体具有高效表达的能力［7］；② pET28a质粒在插入目的DNA后表达的蛋白N 末端含6个组氨酸，它作为His标签蛋白，可与Ni2+鳌合，使得重组融合蛋白在变性或非变性状态下均可被含Ni2+的His-band 树脂亲合柱纯化，即使被纯化的重组蛋白含量很低也能被有效地纯化出来。克服了本中心已经构建的重组表达质粒ferritin/pGEX-6p-1表达的重组蛋白ferritin/GST不能通过GSTTrapTMFF亲和层析柱纯化的弊端［3］；③重组蛋白是标签蛋白His和目的蛋白共同组成的融合蛋白，为获取目的蛋白，本应通过相应的剪切酶将标签蛋白剪切下来，但由于N-末端组氨酸所表达的蛋白分子量很小，它的存在不改变目的蛋白的活性，所以无须去除。这不仅能减少实验步骤，降低纯化蛋白在酶切过程中的损失，同时还可节省用来购买剪刀酶的费用，为后续研究提供了较好的实验材料。基于此我们得到了一个高效表达且易于纯化重组蛋白的基因工程菌株，并得到了较纯的重组蛋白，进行动物实验。通过实验说明Eg.ferritin作为抗原可诱导动物产生较强的的体液免疫应答，证明其有良好的抗原性；免疫血清与细粒棘球蚴天然抗原(囊液和原头蚴)的Western blot实验结果显示，免疫血清能够较好地识别天然抗原中位于19kD处的条带，说明Eg.ferritin具有较好免疫原性，由此推测中国大陆株细粒棘球蚴铁蛋白基因具有作为包虫疫苗候选分子的潜能，为进行重组铁蛋白对宿主的免疫保护性及保护性机制等方面研究的可能性提供了依据。

参考文献

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［2］ 白霞，周金林，陈天印，等.微小牛蜱铁蛋白编码基因的克隆和分析［J］.畜牧兽医学报，2005，36(1)：66-69.

［3］ 王娅娜，赵嘉庆，丁淑琴，等.细粒棘球蚴中国大陆株铁蛋白基因分子克隆和序列分析［J］.宁夏医学院学报，2005，27(4)：253-255.

［4］ 王娅娜，丁淑琴，王健，等.细粒棘球蚴铁蛋白基因的克隆重组高效表达及免疫学初步研究［J］.中国人兽共患病学报，2006，22(5)：399-402 .

［5］ FM奥斯伯，RE金斯顿，JG塞德曼，等.精编分子生物学实验指南［M］.第4版.北京：科学出版社，2005：27.

第6篇：基因重组范文

【摘要】 目的 应用细菌内同源重组高效制备p53基因重组腺病毒。方法 设计引物扩增p53基因，在上下游引物分别引入Xhol和HindⅢ酶切位点，将p53基因亚克隆连接到经相同酶切的p shuttle-cmv转移质粒上，转化DH5α筛选卡那霉素抗性菌落构建重组腺病毒转移质粒p shuttle-cmv-p53用Pmel酶切线性化采用两步法进行同源重组：先将腺病毒骨架质料pAdEasy-1转化氯化钙法制备的BJ5183感受态细菌，筛选得到链霉素和氨苄青霉素抗性的AdBJ5183转化菌；再将线性化的p shuttle-cmv-p53转化氯化钙法制备的AdBJ5183感受态细菌，在细菌内进行同源重组，挑选卡那霉素抗性菌落培养并提取质粒，琼脂糖电泳挑选大片断的重组质粒pAdBJ5183-P53分别用限制性内切酶PacI和BstXI及PCR法鉴定。结果 成功构建了p53基因重组腺病毒表达载体。结论 采用简化的两步氯化钙化学转化法可以取代电穿孔法高效构建重组腺病毒表达载体。

【关键词】 腺病毒载体；同源重组；p53基因

【Abstract】 Objective To construct recombinant replication-defective human adenovirus serotype 5 vector carrying wt-p53 gene by simplified two-step homologous recombination protocol in bacteria.Methods wt-p53 gene was firstly subcloned into a transfer vector p shuttle-cmv and the positive recombinant p shuttle-p53 was linearized by PmeI.Then the simplified two-step homologous recombination protocol was employed for the construction of recombinant adenoviral vector.In step one，adenoviral skeletal plasmid pAdeasy-1 was transformed into BJ5183 competent cells by calcium chloride chemical methed to obtain pAdBJ5183;and in step two，linearized psh-p53 plasmid was transformed into pAdBJ5183.The possible positive adenoviral plasmids were selected by agarose gel electrophoresis and indentified by PacI as well as BxtXI cleaved pattern.Results Replication-defective recombinatant adenovirus containing human p53 gene was successfully constructed.Conclusion The results indicated that the calcium chloride chemically simplified two-step homologous recombination protocol can replace the co-transformation by electroperforation and may have broaed utility in system that involve homologous recombination in bacteria.

复制缺陷型腺病毒可以高效介导基因的体内外转移；感染细胞范围广，不但可以感染分裂期细胞，也可感染静止期细胞；感染细胞时其DNA不整合到宿主细胞染色体中，安全可靠。因此成为基因治疗中常用的载体。重组腺病毒载体的构建方法有真核细胞内质粒重组法、酵母人工染色体克隆系统、Cre/loxp定点重组系统、末端蛋白-DNA复合物共转染法等［1～3］。以上方法牵涉到的步骤和环节较多、工作量大、实验周期长。1998年He等［4］建立了细菌内质粒共转化同源重组方法，该法简便快速、实验周期短，但是共转化需要电穿孔仪，且同源重组成功率不到20%。笔者在实际工作中对该法进行了改进，采用简化的两步氯化钙化学转化法代替电穿孔共转化法构建了p53重组腺病毒表达载体。

1 材料与方法

1.1 实验材料 pAdEasy-1、pshuttle-cmv质粒，BJ5183、

DH5α大肠杆菌，PmeI酶购自Qbiogene公司；携带p53基因的质粒由马延高教授惠赠；PacI酶购自New England公司；PCR Premix、DL2000Marker购自TaKaPa公司；λDNA·HindⅢMarker购自Promega公司；其他分子生物学工具酶购自MBI公司。

1.2 重组转移质粒的构建 设计扩增p53基因的上下游引物分别为：

p53-up:5 atg tct cga gat gga gga gcc gca gtc aga 3 （30bp），

p53-down:5 aag taa gct ttc agt ctg agt cag gcc ctt 3 （30bp），在上下游引物分别引入XhoI和HindⅢ酶切位点，由上海生工合成。采用上述引物以携带p53基因的质粒为模板进行PCR扩增p53基因片断。PCR参数为：94℃变性5min;94℃30s、56℃30s、72℃50s，共30个循环；72℃延伸10min。用XhoI和HindⅢ酶切PCR产物，琼脂糖凝胶电泳回收，连接到同样经XhoI和HindⅢ酶切回收的pshuttle-cmv转移质粒中；转化DH5α感受态菌，卡那霉素抗性平板筛选。

1.3 重组转移质粒的鉴定 挑选卡那霉素抗性平板筛选菌落培养，碱裂解法提取质粒，用XhoI和HindⅢ酶切鉴定，并以能酶切出与目的基因片段大小相符的质粒为模板，用上述引物进行PCR鉴定。得到的重组转移质粒命名为psh-p53。再用上述引物由上海生工公司测定psh-p53中目的基因片段序列。

1.4 两步法细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒

1.4.1 step1:用氯化钙法制备BJ5183感受态细菌 将腺病毒骨架质粒pAdEasy-1转化BJ5183感受态细菌，接种在链霉素和氨苄青霉素抗性平板筛选，挑取菌落培养并抽提质粒，以pAdEasy-1为对照，用BstXI酶切鉴定，得到的阳性菌命名为AdBJ5183菌。

1.4.2 step2:同源重组 用氯化钙制备AdBJ5183感受态细菌；将序列正确的重组转移质粒psh-p53用PmeI酶切线性化，不需灭活PmeI酶，也不需回收，直接取大约30ng酶切线性化质粒转化AdBJ5183感受态细菌，卡那霉素抗性平板筛选，挑取菌落培养并抽提质粒，0.8%琼脂糖电泳初筛分子量大于30kbp的质粒，以pAdEasy-1为对照，分别用PacI、BstXI酶切鉴定，对酶切图谱符合的质粒采用前述扩增目的的基因片段的引物进行PCR鉴定。得到的阳性菌命名为AdBJ5183-p53菌。相应的阳性重组腺病毒质粒为pAdBJ5183-p53。再将AdBJ5183P53转化DH5α得到pAdp53。

2 结果

2.1 重组转移质粒psh-P53的构建及鉴定

（1）重组转移质粒psh-P53经XhoI和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳观察，出现一条约7.4kg的转移质粒带和一条约1.2kb的p53目的基因带，见图1。

（2）以能酶切出与目的基因片段大小相符的质粒为模板，用扩增目的基因的引物进行PCR鉴定。可以得到约1.2kb大小的片断，见图2。

（3）测序结果经Vector NTI软件分析正确。

2.2 重组腺病毒表达质粒的构建及鉴定

（1）将腺病毒骨架质粒转化BJ5183感受态菌，抽提链霉素和氨苄青霉素双抗性的质粒，对照骨架质粒pAdEasy-1，用BstXI酶切鉴定。pAdEasy-1质粒有6个BstXI酶切位点，可以产生6个片断。电泳结果显示，AdBJ5183质粒与pAdEasy-1图谱一致，见图3。

（2）线性化的重组转移质粒psh-p53转化AdBJ5183感受态细菌进行同源重组后，抽提卡那霉素抗性的质粒，0.8%脂糖电泳发现有2种质粒：其一分子量约34kb，为可能的重组腺病毒质粒；另一分子量约9kb，为重组转移质粒psh-p53。可以很直观方便地初筛出可能的大片断重组腺病毒质粒（图略）。

PacI酶切分子量约34kb的质粒可出现一条约30～35kb的大片断和一条4.5kb的特征性片断见图4。与预期结果相符。

BstXI酶切鉴定重组腺病毒质粒 PAdEasy-1质粒有6个BstXI酶切位点，可以产生6个片断，依次为11921bp、8237bp、5251bp、4254bp、2379bp、1399bp。其与线性化的psh-p53在BJ5183中发生同源重组的位置只引起片断2的改变。本实验采用Pshuttle-cmv为转移质粒，同源重组后片断2将漂移至11～12kb左右，与片断1重叠，只可以观察到5条带。与预期结果相符。结果见图5。

以酶切鉴定正确的重组腺病毒质粒为模板进行PCR，可扩增出与目的基因大小相符合的片断，见图6。

3 讨论

传统的构建重组腺病毒的方法是在293细胞内进行质粒间同源重组，这些方法存在细胞类同源重组效率低、实验周期长等缺点，给研究工作带来了诸多不便；利用生长周期快、操作方便的大肠杆菌实现质粒间同源重组产生腺病毒的方法具有重组效率高、病毒基因组高度一致、不需蚀斑纯

化筛选纯系病毒等优点。在进行细菌内同源重组时，最初的方法是将腺病毒骨架质粒和线性化的重组转移质粒电穿孔共转化大肠杆菌BJ5183，这种方法需要电穿孔仪，而且重组效率相对较低；Zeng等［5］采用两步法进行了改进，先用电穿孔法将骨架质粒PAdEasy-1转化电穿孔感受态大肠杆菌BJ5183，得到BJ5183AdEasy，再将线性化的重组转移质粒电穿孔法转化电穿孔感受态大肠杆菌BJ5183AdEasy进行同源重组，由于该法是将转移质粒转化到已携带有骨架质粒的繁殖能力强的BJ5183菌中，避免了将转移质粒转化到有缺陷或复制能力弱的细菌中，因而成功率提高到94%（16/17），但该法仍然需要电穿孔仪，一般实验室难以推广。笔者将该两步法的电穿孔部分改为传统的氯化钙化学转化法，而且线性化的重组转移质粒不需经过热灭活PmeI酶及凝胶电泳回收，直接用于转化，也得到了较高的重组率（6/8）。本研究正在进行p53基因重组腺病毒生物学特性的研究及对肿瘤细胞作用的研究。

1 顾建人，曹雪涛.基因治疗.北京：科学出版社.2001，197.

2 Ng P，Parks RJ，Cummings DT，et al.A high-efficiency Cre/loxP-based system for constrction of adenoviral vectors.Hum Gene Ther，10:2667-2672.

3 Kamen A，Henry 0.Development and optimization of an adenovirus production process.J Gene Med，2004，6:184-192.

第7篇：基因重组范文

关键词Nef基因；SW480细胞；G418；稳定细胞系

艾滋病（AIDS）全称为“获得性免疫缺陷综合征”，是一种由人免疫缺陷病毒（HIV）引起的，以全身免疫系统严重损害为特征的传染性疾病.RNA干扰（RNAi）是细胞内序列特异性抑制靶基因表达的机制，具有高效性、特异性和副作用小的特点，将其应用于抗HIV1 治疗研究是近来研究热点[12].RNAi抑制HIV1的复制，最直接的方法就是利用RNAi方法直接干扰HIV1病毒的RNA，据文献报道几乎HIVl的所有基因都可作为干扰的靶点：如LTR[3]〖KG-*6〗，gag[45]〖KG-*6〗，pol[6]〖KG-*6〗，vpu[7]〖KG-*6〗，vif[5]〖KG-*6〗，tat[8]和env[9]等基因.RNAi还可以将干扰的位点靶定到细胞上与HIV病毒感染密切相关的受体蛋白、辅助受体蛋白或其他的一些细胞因子[10].

负调控因子（negative factor，Nef） 是人免疫缺陷病毒（ HIV） 附属蛋白之一，相对分子质量小，柔韧性大，核心结构呈球形.Nef 不具酶活性，具有衔接蛋白的作用，可下调 CD4，主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ），主要组织相容性复合体Ⅱ（MHC Ⅱ）和 CD28 分子，在对抗宿主免疫应答过程中发挥重要作用.Nef 可增强病毒的复制和感染性，抑制 HIV 感染细胞的凋亡，在 HIV 致病机制方面也发挥关键作用.基于Nef在体内的致病机制，多种抗HIV1病毒策略被提出，使Nef成为潜在的HIV1靶点.本文试图构建稳定表达HIV1型Nef蛋白的SW480细胞系，为研究RNAi在艾滋病治疗方面的应用提供细胞模型.

1材料和方法

1.1材料

大肠杆菌TOP10感受态细菌、pEBMultineomyc质粒、pNL43质粒、SW480细胞（人结肠癌细胞）均由本实验室保存；RNA提取试剂TRIzol和LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司； Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶BamHⅠ与NotⅠ购自ThermoFisher公司；DNA胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒和去内毒试剂购自广州东盛生物科技有限公司；G418购自Sigma公司；小鼠源Antimyc抗体、内参蛋白actin抗体和HRP标记羊抗小鼠IgG均购自Santa Cruz公司；细胞培养所用的DMEM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司；其他常规试剂与耗材均购自于上海生工生物科技有限公司.

1.2引物设计合成

参照pNL43质粒上HIV1型Nef基因序列，利用Primer Premier 5 以及Nebcutter 2.0软件设计的引物如下：Nef正向引物，5′CGCGGATCCGGGTGGCAAGTGGGTC3′；Nef反向引物，5′ATTTGCGGCCGCTCAGCAGCTCTTGAAGTAC 3′.分别在上游引物和下游引物5′端加上了BamHⅠ和NotⅠ酶切位点和相应的保护碱基，引物由上海生工生物有限公司合成.

1.3HIV1型Nef片段的扩增

以pNL43质粒为模板，使用Ex Taq DNA聚合酶，采用PCR扩增全长HIV1型Nef基因编码区，全长640 bp.PCR扩增体系（20 μL）：10× Buffer 2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，0.5 g/L pNL43质粒 1 μL，正向引物和反向引物（10 nmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.25 μL，ddH2O 14.5 μL.PCR 的扩增条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共进行32个循环，72 ℃继续延伸10 min.得到的PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定后，根据片段大小用DNA纯化试剂盒进行切胶回收.

1.4HIV1型Nef真核表达载体构建

将上述PCR产物和pEBMultineomyc质粒分别用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切后， 1%琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收纯化，经T4 DNA连接酶过夜连接后转化E.coli TOP10感受态，卡那霉素LB固体培养基筛选培养，挑取阳性克隆扩增后，进行菌液PCR鉴定，提取质粒进行酶切和DNA测序鉴定.

1.5重组表达载体的瞬时表达及Western Blot检测

SW480细胞培养于添加10%胎牛血清和100×青霉素链霉素双抗混合液的DMEM培养液中，在转染前，将细胞接种于6 cm培养皿，接种量为2×106个细胞，过夜培养使其密度达80%～90%.参照LipofectamineTM2000转染试剂产品说明书，将8 μg pEBmycnef重组表达质粒转染SW480细胞，以转染空载体pEBMultineomyc质粒的SW480细胞为对照，48 h后收集细胞.冰上收获细胞，经裂解后离心取上清，加入上样缓冲液和DTT煮沸10 min.用10%SDSPAGE胶分离细胞蛋白，上样20 μg.110 V恒压80 min转至PVDF膜上.将转膜后的PVDF膜用含5%的脱脂奶粉过夜封闭.再孵育小鼠抗myc的抗体，充分洗膜，随后孵育HRP标记羊抗小鼠IgG，充分洗膜.然后各取1 mL ECL化学发光试剂A和B液混匀，5 min后平铺于膜的蛋白面，〖HJ2.1mm〗通过显影仪（Tonon公司）显影拍照.

1.6SW480细胞G418最低致死浓度的测定

将SW480细胞接种于96孔培养板中，在CO2培养箱中37 ℃培养.待细胞密度达到80%后，使用不同浓度G418（0，100， 200，300，400，500，600，700，800，900，1000 mg/L）的DMEM完全培养基培养细胞，每天更换培养基，连续观察12 d，确定全部细胞死亡的最低浓度，即为最佳的G418Y选浓度.

1.7稳定表达Nef基因的SW480细胞株的筛选和鉴定

SW480细胞接种于24孔板，培养16 h，细胞贴壁生长至汇合度达80%时，将0.8 μg pEBmycnef质粒在20μL脂质体Lipofectamine 2000TM介导下转染SW480细胞.48 h后将细胞1∶10稀释转种24孔板，同时加入终浓度为900 mg/L的G418，同时设pEBMultineomyc质粒转染对照.2～3 d换液1次，待大部分细胞死亡之后，改用450 mg/L G418的培养液维持压力筛选3周，挑出单个细胞集落，有限稀释到96孔板进行单克隆筛选，筛选出的单克隆细胞依次于48孔、12孔、6孔板及6 cm和10 cm培养皿扩大培养.扩大培养到一定量后，进行冷冻保存.剩余的一些细胞连续传代60 d以上（约30代），取一部分细胞进行Nef的RTPCR检测和Western Blot检测，确保细胞株的稳定性.

2结果

2.1HIV1 Nef基因PCR扩增结果

使用PCR方法扩增Nef基因产物，将20 μL PCR反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，可见1条约640 bp大小的片段（如图1），片段大小符合预期，说明已成功扩增出HIV1 Nef基因.

2.2真核表达载体pEBmycNef的鉴定

2.2.1转化菌中Nef基因的PCR鉴定将上述过夜连接的产物转化E.coli Top10感受态细胞，卡那霉素LB固体培养基筛选培养，挑取4个克隆扩增后，进行菌夜PCR鉴定，结果如图2所示，琼脂糖电泳可见一条约为640 bp大小的Nef目的基因条带，与预期的条带大小吻合.

2.2.2重组表达质粒pEBmycNef的双酶切鉴定

重组载体pEBmycNef经BamH Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后，琼脂糖电泳可见一条约为640 bp大小的Nef目的基因条带，一条为10 223 bp大小的pEBMultineomyc条带（图3），说明载体构建正确.

PCR扩增的Nef全长DNA序列插入pEBMultineomyc载体，测序结果与pNL43质粒报道的Nef序列相符，表明Nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.

2.3SW480细胞G418最低致死浓度的测定

使用G418终浓度分别为0～1 000 mg/L的DMEM培养液培养SW480细胞，观察细胞的死亡情况. 实验发现，加药后1 d，细胞形态正常，未出现明显的变化；持续筛选7 d，大量细胞开始脱落死亡，贴于培养皿底部的细胞逐渐变圆；至12 d，细胞全部死亡（图4）.确定SW480细胞全部死亡的最低浓度为900 mg/L.

2.4Nef基因在SW480细胞中的瞬时表达

将重组质粒pEBmycNef和载体质粒pEBMultineomyc分别转染SW480细胞，收集细胞，裂解后上样进行Western Blot检测，结果如图5所示.重组质粒pEBmycNef转染细胞中在约29 000处有特异性条带，而载体质粒pEBMultineomyc转染细胞中没有，表明HIVl Nef基因在SW480细胞中进行了表达.图中actin蛋白为内参蛋白.

2.5稳定表达Nef基因的SW480细胞系的鉴定

pEBmycNef质粒转染SW480细胞后，经G418抗性筛选3周后，在显微镜下挑选出了4个细胞集落，经传代扩增后，用Western Blot技术检测到Nef的表达，而空载对照SW480细胞则未检测到Nef基因的表达（图6），并且在连续传代60 d后，通过RTPCR技术和Western Blot技术，仍可以检测到 Nef基因的转录（图7）与表达（图8）.以上结果表明，已筛选到稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞株.

3讨论

RNAi通过降解mRNA或抑制蛋白质来沉默基因这种技术在生物学研究领域具有极重要的意义，RNAi不仅可以作为基因功能研究与评价的方法工具，它还可以作为一种基因治疗的手段.2001年Tusehl研究组开创了RNAi技术治疗人类疾病的新途径.将RNAi用于病毒性疾病的治疗和预防研究取得了一些显著的效果，比如乙肝病毒（HBV）[13]、丙肝病毒（HCV）[14]、人瘤病毒（HPV）[15]、EB病毒[16].将RNAi应用于艾滋病治疗的文献也不计其数[17]，这些研究都为HIV1的基因治疗提供了很好的参考依据.但是RNAi还无法应用于临床治疗艾滋病，阻碍这一进程的是RNAi的传递模式.

2006年，向双林等提出利用修改过的非治病性细菌在体内及体外定向传递shRNA到靶细胞中以发挥干扰作用.他们将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术称之为TransKingdom RNAi （tkRNAi）[18].该研究的最终目的是将这种依赖细菌进行的RNAi传递技术应用到干扰艾滋病病毒的基因研究中，试图探寻更有效的RNAi传递方法，为将RNAi应用到临床上治疗艾滋病提供理论依据.由于HIV病毒基因的RNAi干扰实验在体内无法进行，构建能够稳定表达HIV1型病毒蛋白的细胞模型显得至关重要.

本实验从pNL43质粒上扩增出Nef基因，随后与pEBMultineomyc质粒共同经BamHⅠ和NotⅠ双酶切，连接并转化构建成pEBmycnef真核表达质粒.通过菌液PCR验证、双酶切验证和DNA测序分析证明nef全长编码区DNA成功插入到pEBMultineomyc质粒中，且插入方向和阅读框架均正确.利用 LipofectamineTM 2000将重组质粒转染SW480细胞，培养48 h后，裂解细胞，收集蛋白，利用Western Blot技术检测到 Nef蛋白的瞬时表达.然后利用G418筛选建立稳定表达细胞系的方法，首次建立了稳定表达HIV1型Nef基因的SW480细胞系，为研究tkRNAi在艾滋病治疗方面的应用提供了细胞模型.

⒖嘉南祝

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第8篇：基因重组范文

【关键词】 急性心肌梗死；心力衰竭；基因重组人脑利钠肽

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2017.17.053

心力衰竭在21世纪已经成为医疗卫生行业的重点关注疾病， 在过去的40年中， 心力衰竭死亡患者数量出现了急剧增加。并且心力衰竭患者集中在中老年， 心力衰竭作为一种较为严重的心内科病症， 其常见致病疾病为心肌梗死， 患者出现急性心肌梗死后会进一步出现心脏排血量的异常， 同时患者的组织器官灌注不足， 从而导致患者出现瘀血综合征[1]。本研究就本院接诊的急性心肌梗死合并心力衰竭患者进行分组， 探究基因重组人脑利钠肽的应用效果。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取2015年9月～2016年9月在心内科挂号住院诊治的急性心肌梗死合并心力衰竭患者80例作为研究对象， 所有患者均已确诊病情， 患者服用硝酸甘油不能有效缓解病情， 同时患者的心电图检查显示有两个及以上的ST段抬高， 患者的心肌损伤标志物升高， 同时排除有心源性的休克以及收缩压

两组患者年龄、性别等一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05）， 具有可比性。

1. 2 方法 对照组患者在治疗中实施常规治疗， 对患者进行常规抗血小板凝集、斑块稳定以及心肌重塑逆转治疗， 患者的硝酸甘油起始剂量为5 μg/（kg・min）， 患者每10分钟进行剂量调整， 保证患者的血压稳定， 对患者进行连续的静脉滴注， 同时对有溶栓指标的患者进行阿替普酶的静脉滴注[3]。观察组患者则应用基因重组人脑利钠肽进行治疗， 其首次负荷剂量为1.5 μg/kg， 进行匀速静脉滴注， 然后进行持续的静脉滴注， 持续3 d， 维持剂量为0.0075 μg/（kg・min）， 在此过程中要保证患者的血压稳定。

1. 3 观察指标及疗效判定标准 对比两组患者的临床治疗效果以及患者治疗后的尿量、左室射血分数。疗效判定标准[4]：显效：患者的心功能改善≥2级；有效：患者的心功能改善1级；无效：患者的心功能改善

1. 4 统计学方法 采用SPSS18.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验；计数资料以率（%）表示， 采用χ2检验。P

2 结果

^察组治疗显效12例、有效24例、无效4例， 总有效率为90.0%；对照组治疗显效9例、有效16例、无效15例， 总有效率为62.5%。观察组患者临床治疗总有效率明显高于对照组， 差异具有统计学意义（P

3 讨论

急性心肌梗死是由于冠状动脉内部出现不稳定斑块的破裂， 导致冠状动脉内部受到刺激而出现血小板凝集的血栓， 随着血栓的累积堵塞管腔， 导致患者的管腔狭窄或者闭塞， 从而引发心肌缺血和供氧不足。相关研究指出对于心肌梗死患者其梗死面积越大则心肌的收缩能力越差， 患者的状况越差， 导致心脏功能出现衰竭， 患者很容易引发呼吸困难以及肺水肿等合并症， 病情控制不当很容易引发心力衰竭， 对患者的生命安全带来巨大威胁。脑利钠肽是上世纪从猪脑组织中提取出来并检测到的一种内源性激素， 是由左心室的心肌细胞合成并分泌， 其具有较为明显的利尿降血压作用。在心力衰竭患者体内， 其脑钠肽的分泌有出现代偿性增加， 对患者的心脏功能进行代偿性增强[5]。

本研究结果显示， 观察组治疗总有效率为90.0%， 高于对照组的62.5%， 差异具有统计学意义（P

总之， 急性心肌梗死合并心力衰竭患者在临床诊治过程中应用基因重组人脑利钠肽治疗对患者的病症有很好的改善， 同时提升治疗效果， 值得在临床治疗中推广应用。

参考文献

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第9篇：基因重组范文

【摘要】 目的：观察ompL17基因表达产物的免疫原性以及该表达蛋白在动物模型中的分布情况。方法：提取钩端螺旋体017株基因组DNA，扩增出ompL17基因，与表达载体pGEX4T1重组，诱导表达OMPL17蛋白，分析该基因在017株中体外不同温度的表达情况。结果：PCR和酶切分析证实构建成功了表达载体，SDSPAGE分析证实诱导表达出OmpL17蛋白；体外不同温度下发现该基因不表达蛋白。结论：成功表达出ompL17基因的蛋白，体外不同温度未发现该蛋白的表达，为赖型钩体的分子机制的阐明奠定了基础。

【关键词】 钩端螺旋体；克隆；表达；体内分布

钩端螺旋体病（简称钩体病）是由钩端螺旋体引起的一种人兽共患自然免疫源性疾病，严重危害人类的健康和农牧业生产。赖型钩体56601和哥本哈根型的测序完成[1，2]为钩体基因组学及其功能蛋白学的研究提供了一个新的契机。ompL17基因作为本研究室从赖型钩体强毒株中独立获得的基因，经过基因打靶技术初步断定为毒力相关基因。生物信息学分析结果表明，OmpL17属于外膜蛋白，可能与钩体毒力相关。因此选择ompL17基因进行克隆表达，分析其在大肠杆菌中的表达以及赖型钩体017株中不同温度下的表达研究，探讨该基因是否体内诱导表达，将有助于钩体致病的分子机理的解释。

1 材料与方法

1.1材料

问号钩端螺旋体赖型017株（Leptospira interrogans serovar Lai strain 017）由成都生物制品所提供，本室保存，连续在豚鼠中传代培养以保持毒力。实验用菌株于Kornthof培养基28 ℃培养7 d，菌数达1010条。pGEX4T1载体购自PROMEGA 公司，大肠杆菌JM109株由本室保存。限制性内切酶BamHI、HindⅢ，T4 DNA连接酶、牛小肠碱性磷酸酶、MassRulerTM DNA Ladder、蛋白质分子量标准均为MBI公司产品；ELISA 检测试剂盒由晶美生物工程有限公司。BCA Protein Assay Reagent Kit为PIERCE公司产品，其余试剂均为国产或进口分装（分析纯）。

1.2方法

1.2.1 引物设计参照ompL17基因全序列设计钩体ompL17基因，P1：5’ GTC GGA TCC CGT ATG ACC CTA GAG TCC TTG–3’；P2：5’ GCG GAA TTC GTT TAT CAA AAA GGC CAT CG3’，序列中引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点 。

1.2.2钩体ompL17基因的扩增回收、酶切及纯化：参见Terpstra 等方法[3]并稍作修改进行钩体基因组DNA的提取与纯化。以纯化的钩体017株基因组DNA为模板，反应体系如下: 模板2 μl，Taq 0.5 μl，dNTP 4.0 μl，P1 1.0 μl，P2 1.0 μl，Sterile H2O 38.5 μl，10×PCR buffer 5.0 μl。循环参数：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30sec，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30循环，72 ℃延伸6 min。扩增产物电泳鉴定后以PCR产物纯化试剂盒（Roche）纯化回收，操作程序参照试剂盒说明书。然后用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切该产物，纯化后备用。

1.2.3 重组表达载体的构建PCR产物与质粒pGEX 4T1的连接及转化[4]：提取质粒pGEX 4T1，加入BamHⅠ和EcoRⅠ37 ℃进行双酶切，纯化后与同样酶切过的ompL17基因混合，在T4连接酶作用下连接。然后转化大肠杆菌JM109株，取转化后的菌液均匀涂布于含氨苄青霉素50 μg/ml LB平板上培养过夜。重组质粒的筛选与鉴定：从转化后生长后的平板上挑取白色单菌落于含氨苄青霉素的液体LB培养基中增殖后提取质粒DNA，通过酶切分析、PCR扩增鉴定以及测序筛选出正确重组子。

1.2.4重组质粒pGSTOmpL17在大肠杆菌中的诱导表达分别挑取含空质粒pGEX4T1和含重组质粒pGSTompL17的菌落接种于LB培养液培养过夜，次日取菌液按比例接种于LB液体培养基，培养2小时后加入IPTG至终浓度1 mmol/L，在诱导前及诱导后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h时收集菌液，菌体悬于含溶菌酶的PBS中，经反复冻融裂解细菌至菌液清亮，取裂解液上清、沉淀及收集的细菌培养液进行SDSPAGE电泳，分析OmpL17蛋白的表达量及表达形式。

1.2.5赖型钩体在体外不同温度OmpL17蛋白表达分析[5]赖型钩体017和双曲钩体PatocⅠ培养好后，将赖型钩体017放在28 ℃、30 ℃和37 ℃三种温度条件进行培养24小时，然后将上述钩体离心分钟集菌。菌液沉淀用PBS洗涤，再用离心收集沉淀。将沉淀用PBS溶解，用纯化蛋白做阳性对照，用PatocⅠ做阴性对照，SDSPAGE操作同前，电泳后的凝胶利用半干法将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜上。TTBS洗膜后加入含辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG的TTBS液中孵育后再用TTBS洗膜，加入底物二氨基联苯胺（DAB）液显色，直至有条带出现时用蒸馏水洗涤终止反应。

2结果

2.1 ompL17基因的PCR扩增及序列测定

以赖型017株为模板，用引物P1、P2在适宜条件扩增出约900bp左右的特异片段见Fig.1。

2.2pGEX 4T1质粒DNA的提取与纯化

碱裂解法提取pGEX 4T1质粒，电泳结果显示质粒DNA有超螺旋、线性、环状三种形式的条带出现，无蛋白和RNA的污染（Fig.2）。

2.3 重组质粒的克隆及鉴定

赖型钩体基因ompL17的PCR片段与载体pGEX 4T1质粒纯化后经BamH I和EcoR I双酶切，连接酶作用下经转化转入大肠杆菌JM109中，挑取菌落在LB中培养后，提取质粒DNA，以凝胶电泳初步检测比pGEX 4T1 DNA分子量大的质粒。酶切分析显示BamH I 和EcoR I双酶切产生4.9 kb和900 bp 两条酶切条带提示该重组质粒已包含-900 bp的插入片段（图3）。以该重组质粒pGSTOmpL17为模板，以引物P1、P2进行PCR扩增，能扩出约900 bp条带，而以空质粒为模板未扩出相应条带，进一步证实重组质粒pGSTompL17构建成功（图4）。

2.4 重组质粒pGSTOmpL17在大肠杆菌中的融合表达

在变性聚丙烯酰胺凝胶上，经IPTG诱导的pGEX4T1表达产物在26KD处出现GST蛋白带，而未经IPTG诱导的pGEX4T1没有26KD条带出现；经IPTG诱导的pGSTompL17表达产物在54KD处出现浓的蛋白带。用不同剂量IPTG和改变IPTG诱导时间，可提高融合蛋白的表达量。SDSPAGE 结果见Fig.5。

2.5 赖型钩体017在体外不同温度OmpL17蛋白表达分析

分别取赖型钩体017株在28 ℃、30 ℃、37 ℃三种温度下表达蛋白和patoc在28 ℃表达蛋白和阳性对照进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜和Western–blotting检测，结果阳性对照在约54KDa处检测到阳性杂交信号，而赖型钩体56601和patoc无杂交信号（Fig.6）。

3讨论

钩端螺旋体外膜研究一直是钩体分子生物学研究的重点和热点。但是，目前钩体外膜在致病过程中的作用机制仍不十分清楚。1993年，外膜蛋白的研究才有报道，首先Haake等从外膜蛋白纯化分离入手，克隆测序了外膜蛋白OmpL1[6]，以后几个膜脂蛋白LipL41[7]，LipL36[8]，LipL32[9] 用同样的方法得到分离。研究表明这几个外膜蛋白可能与钩体致病和免疫保护有一定的相关性。本研究结果表明ompL17基因可以进行重组表达，但是该基因在赖型钩体017中体外不同温度下的蛋白表达情况表明，该基因在赖型钩体017的培养液中在28 ℃、30 ℃、和37 ℃培养都不表达，结合本研究者已做的免疫组织化学染色结果表明该蛋白在赖型钩体中是体外不表达而是在体内诱导表达的蛋白质。

目前，国内外已经确认的钩体毒力因子为钩体的溶血素蛋白，同时溶血素[10]有三种类型：酶类，成孔蛋白类和表面活性剂类。问号状赖型钩体测序完成后[1]，通过全基因组ORF分析，发现9个基因与GenBank/NCBI或EMBL数据库中登录的溶血素基因相似或者相同。目前已发现[11]钩体的又一种新的溶血素基因，它是鞘磷脂酶样的蛋白质，同时发现它是钩体体内诱导表达的蛋白质，而钩体在体外培养不表达该蛋白质，还发现该蛋白质对马肺内皮细胞有细胞毒性，同时对马和兔的红细胞有一定的溶血活性。OmpL17作为一种在体内诱导表达蛋白质，或许在钩体致病过程中起着重要作用，但是其在钩体致病中的具体作用以及是否与钩体是否相关有待于进一步的分析和探讨。

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