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【摘要】
目的利用膜分离技术分离纯化白藜芦醇，减少污染。方法虎杖苷液态发酵后浓缩，用60%的乙醇以1∶8的料液比在常温下提取，过滤得到滤液，然后将滤液用两级膜进行处理，用高效液相色谱（HPLC）法检测白藜芦醇的纯度。结果经微滤膜处理后白藜芦醇的纯度达30.5%，再经超滤膜处理，纯度达55.8%。结论该方法可降低生产成本，不使用有毒有害的溶剂，实现清洁生产。
【关键词】 膜分离技术； 白藜芦醇； 清洁生产
Abstract：ObjectiveThe membrane separation technology used in the purification of resveratro and reducing pollution were studied. Methods After liquid state fermentation， resveratro was extracted by 60% ethanol at room temperature， solid/liquid ratio 1:8， the filtrate was obtained by filtering， and dealt it with two membrane equipments ， the purity of resveratrol was detected by HPLC . ResultsThe purity of Resveratro reached 30.5% after the microfiltration membrane， and after the ultrafiltration membrane the purity of resveratro could reach 55.8%.ConclusionThis method can reduce the cost of production without toxic and harmful solvents and it can realize clean production.
Key words：Membrane separation technology； Resveratro； Clean production
虎杖苷是蓼科蓼属虎杖干燥根茎中的一种有效成分，也可称为白藜芦醇苷。虎杖苷在植物中分布广，含量高，具有较强的生物活性。虎杖中的虎杖苷的含量在2%左右［1］。白藜芦醇也是虎杖的有效成分之一，其含量在0.1%～0.2%之间，属于多酚类化合物。白藜芦醇有化学抗癌活性，同时具有抑制血小板凝聚、保护缺血器官、抗氧化及抑菌等重要的作用［2］，是目前世界上一种最新的药用保健活性物质。目前，该产品国际市场需求量大，具有良好的市场前景。传统纯化白藜芦醇的方法主要是大孔树脂吸附，这种方法主要存在原料消耗大、产品纯度不高、生产周期长、使用有毒化学物质多、污染大等缺点。本实验利用膜分离技术纯化白藜芦醇。报道如下。
1 材料和方法
1.1 仪器、原料、试剂和设备虎杖苷粗提物（粉末状，虎杖苷含量14.78%）；白藜芦醇标准品（成都思科华有限责任公司）；乙醇（工业纯）；HPLC：戴安VWD3100(配有：紫外检测器单通道LPG3400四元梯度泵真空脱气机自动进样器柱温箱浙大化学工作站)； AN0298分析天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）； 膜设备HGDM-1（湖北工业大学膜技术研究所研制）； 膜设备HGDM-2（湖北工业大学膜技术研究所研制）。
1.2 方法
1.2.1 白藜芦醇的HPLC法检测色谱柱C18柱（4.6 mm×150 mm）， 柱温25 ℃；流动相甲醇-水为40∶60；流速1 ml/min；进样量20 μl；检测波长305 nm。根据标准样的峰面积和进样浓度作回归曲线，白藜芦醇的回归方程为Y = 1.40×108X +1.21×104，相关系数r=0.999 913，在20 ～100 μg/ml范围内和峰面积呈线性关系；虎杖苷的回归方程为Y=9.61×107X-1.84×105，相关系数为r＝0.999 82，在20 ～100 μg/ml范围内和峰面积呈线性关系。
1.2.2 实验过程白藜芦醇分离纯化流程见图1。
图1 两级膜分离纯化白藜芦醇流程图（略）
虎杖苷液态发酵后浓缩，用60%的乙醇以1∶8的料液比在常温下提取，过滤得到滤液，然后将滤液连续投入微滤膜装置中，收集其滤液，再将滤液投入超滤膜装置中，收集其滤液。超滤膜的浓缩液中含有大黄素，可以回收利用。实验过程中分别记录时间、操作压力、温度、膜通量等数据。
1.2.3 膜的清洗本实验完成后，微滤膜和超滤膜需要清洗，以恢复膜的水通量。先用复合清洗剂清洗 ，然后用次氯酸钠漂洗，最后用清水洗至中性。观察膜清洗前后的通量变化情况。
2 结果
2.1 微滤膜除杂的结果取物料5 kg进行提取，得到提取液79 kg。取一定量的提取液烘干，再用HPLC检测，白藜芦醇的纯度为8.7%。将提取液连续投入微滤膜装置中，出料71.4 kg，用时5.88 h，平均通量为60.70 L·m-2·h-1。我们考察了微滤膜在进口压力为0.9 MP，出口压力为0.7 MP，操作温度控制在45℃左右，流速为4.0 m/s的条件下，膜通量随时间的变化关系。见图2。
由图2可以看出，开始运行时，膜的通量为124.2 L·m-2·h-1，由于冷的料液的加入，系统的温度有所降低，所以通量有所下降。随着运行时间的延长，温度恒定，由于滤饼的形成和膜的压实作用或膜被污染、膜孔被堵塞，造成水通量开始慢慢衰减。衰减到一定程度后，由于膜表面形成了稳定的凝胶层，通量趋于稳定。停机时通量为47.3 L·m-2·h-1。
微滤膜主要是截留脂肪、蛋白等一些大分子杂质。取一定量的滤液烘干，再用HPLC检测，白藜芦醇的纯度为30.5%，白藜芦醇的纯度得到了提高。
2.2 超滤膜浓缩分离的结果将微滤膜得到的滤液71.4 kg连续加入超滤膜装置中，出料60.9 kg，耗时3.2 h，平均通量为11.08 L·m-2·h-1。我们研究了超滤膜在进口压力为1.5 MP，出口压力为1.42 MP，操作温度控制在40℃左右，流速为3.5 m/s的条件下膜通量随时间变化的规律。结果见图3。
图2 微滤膜通量随时间的变化曲线（略）
图3 超滤膜通量随时间的变化曲线（略）
由图3可以看出，开始运行时，膜的通量为15.9 L·m-2·h-1 ，随着运行时间的延长，膜被污染，膜孔被堵塞，通量持续下降，80 min后，通量衰减比较缓慢，停机时的通量为9 L·m-2·h-1。取一定量的滤液烘干，再用HPLC检测，白藜芦醇的纯度为55.8%。
2.3 膜的清洗结果结果见表1。
表1 膜清洗结果（略）
由表1可以看出膜清洗后的通量可以恢复到99%以上，所以可以实现连续生产。
2.4 精制将超滤膜的滤液进行浓缩，回收酒精，将浓缩液用石油醚萃取再结晶，此时白藜芦醇的纯度可以达到95%以上。
3 结论
膜分离技术是21世纪的一项高新技术，包括微滤、超滤、纳滤、电渗析、反渗透、膜电解、膜蒸馏、膜萃取等各种技术［3］，具有能耗低、操作温度低、无相变、不改变体系的化学性质，结构简单、占地小、操作简便易于实现自动化、污染小等优点。
提取液烘干后，白藜芦醇的纯度为8.7%，采用微滤膜对其进行除杂处理，白藜芦醇纯度达到了30.5%。整个运行过程中，膜通量较高，平均通量为60.7 L·m-2·h-1。
采用超滤膜对微滤膜滤液进行浓缩分离处理，得到的白藜芦醇的纯度为55.8%。整个运行过程中，膜保持良好的通量，平均通量为11.08 L·m-2·h-1。
微滤膜和超滤膜经清洗后，膜通量恢复到原来的99%以上。
整个过程无废水产生，能耗低，可降低生产成本，实现清洁生产的目的。
参考文献
［1］ 高守红，杨少麟，范国荣.虎杖苷的研究进展［J］.药学实践杂志，2005，23（3）：145.
【关键词】
虎杖；白藜芦醇；提取分离；研究
虎杖为蓼科植物虎杖的根茎，主要含有[1]蒽醌类、二苯乙烯类、水溶性多糖和鞣质等成份。白藜芦醇和白黎芦醇苷是虎杖的主要功效成分。白藜芦醇作为一类亲脂性多酚物质，具有抗血小板凝聚，保护肝脏，抗肿瘤活性等药理作用，特别是对心脑血管系统具有较强的药理活性。本实验采用酶法实验，对虎杖中的白藜芦醇进行提取分离，本研究旨在为虎杖开发利用提供科学依据。
1仪器与试药
1.1仪器Agilent1100高效液相色谱仪；AG285分析天平；KS-600d超声清洗器；Delta320pH计；HHW420型三用恒温水箱。
1.2试药虎杖粉末，批号：20060829；纤维素酶，批号：F20071116；植物水解酶、植物提取酶；白藜芦醇对照品（中国药品生物制品检定所，批号：1535-200001，纯度：99.5%；甲醇、乙醇、磷酸、磷酸二氢钾（分析纯）；乙腈（色谱纯）；蒸馏水。
2方法与结果
2.1白藜芦醇的测定方法
色谱条件色谱柱ODSC18；流动相乙腈∶水（0.02%磷酸）30∶70；流速1ml/min；柱温30℃；检测波长303nm；20μl进样环。理论塔板数不低于3000；分离度大于1.5。精密称取干燥白藜芦醇对照品330μg，置10ml容量瓶中加甲醇制成浓度33μg/ml的溶液作为对照品溶液[2]。
2.2单因素考察①试样的制取：精密称取虎杖粉末若干份，每份约0.1g，再每份加入pH=5.0缓冲盐溶液5ml。摇匀，在45℃酶解18h后，加入20ml95%乙醇超声提取30min，取出放冷，定容至25ml，摇匀，过滤，取续滤液。②酶种类的筛选：取试样3份，1份不加酶，其他2份分别加入10mg纤维素酶和植物水解酶，并按色谱条件进行测定，对于没有加入任何酶的试样，虎杖中白藜芦醇含量为1.8/mg/g-1，加入纤维素酶试样中白藜芦醇含量为4.6/mg/g-1，加入植物水解酶的试样中白藜芦醇含量为9.1/mg/g-1。由测定结果可知，植物水解酶处理效果最好，白藜芦醇含量最高，与不加入任何酶的试样相比较，白藜芦醇含量提高了4倍。③温度的选择：酶的活性与温度有关，各种酶的温度需求不同。一般来说[3]，温度越高，酶的反应速度越快，但当温度过高时，部分酶可能会失去活性，一般酶的酶解温度是在30℃～60℃左右，故在实验中分别选取30℃、40℃、50℃和60℃四个温度段。取试样4份试样，分别置于不同的温度段中，30℃时，白藜芦醇回收率为0.82%；40℃时，白藜芦醇回收率为1.57%；50℃时，白藜芦醇回收率为1.49%；当是60℃时，白藜芦醇回收率为1.31%，由此可见，酶解的最适宜温度为40℃左右。④酶解时间的选择：根据酶的活性及温度需求，还要找出酶解的时间。取4份试样，分别进行3h，5h，7h，9h时间的酶解，经过不同的时间段后，3h后的白藜芦醇回收率为0.52%，5h后的白藜芦醇回收率为1.32%；7h后的白藜芦醇回收率为1.79%；9h后的白藜芦醇回收率为1.38%，由以上数据可知，酶解最适宜的时间为7h。⑤酶解pH值及酶量的选择：采用以上的方法步骤，实验后通过数据分析可知，虎杖专用酶最适酶解pH=3.0，酶含量为原药材的30.0%。
3讨论
近年来，随着科技及研究的不断进展，人们对虎杖白藜芦醇提取分离已取得了一定的进展，一些新的技术和手段不断应用于这一领域，为白藜芦醇提取提供了更科学的方法[4]。本试验采用的白藜芦醇测定方法，条件比较稳定，分离效果好，可用于虎杖及其制剂的含量测定。
参考文献
[1]江曙，朱蓉蓉，张芳，等.虎杖中白藜芦醇提取方法及工艺的优化.南京中医药大学学报，2006，22（3）：197-199.
[2]黄志芳，易进海，刘倩伶，等.酶解法提取纯化虎杖提取物中白藜芦醇的工艺研究.天然产物研究与开发，2009，21（6）：1061-1064.
[关键词] 4-羟基白藜芦醇甲基化物；3，4，5-三甲氧基苯甲酸；格利雅试剂；缩合反应
[中图分类号] R944.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）12（c）-0030-02
白藜芦醇（resveratrol，3，4′，5-trihydroxy-trans-stilbene）即反式3，4′，5-三羟基茋，广泛存在于虎杖、葡萄、花生等多种植物中。白藜芦醇作为一种重要的植物抗毒素，具有抗菌、抗氧化、抗癌、抗血小板凝聚、抗艾滋病等活性[1-5]，被誉为继紫杉醇后的第二大抗癌药物。4-羟基白藜芦醇（4-hydroxy resveratrol，3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯）是白藜芦醇的羟基衍生物，实验证明4-羟基白藜芦醇对癌细胞的生长有明显的抑制作用[6-7]，且抗氧化活性远强于白藜芦[8-10]，目前尚无天然动植物提取4-羟基白藜芦醇的报道，因此化学合成成为了制备4-羟基白藜芦醇与其衍生物的重要方法[10-12]。但是由于多羟基的存在不易保存，一般将其进行甲基化修饰，增强稳定性，增大其生物利用度。
茋类化合物合成方法主要有经三苯基膦的烯烃化反应[13]、以对甲氧基苯乙烯和3，4，5-三甲氧基苯基四氟化硼重氮盐经钯催化的芳基化反应[10]等，具有原料价格昂贵、来源不易、反应条件苛刻、溶剂毒性大等缺点。本文以3，4，5-三甲氧基苯甲酸为原料，通过还原、卤代制备3，4，5-三甲氧基氯苄，氯苄制成格利雅试剂与大茴香醛缩合制备了4-羟基白藜芦醇的四甲基化衍生物，该路线中试剂原料均价廉易得，反应操作简单，条件温和。合成路线见图1。
1 仪器与试药
1.1 仪器
旋转蒸发器RE-52A；循环式真空泵；X-4数字显示显微熔点测定仪；ZF7三用紫外分析仪；WQF-200型傅里叶变换红外光谱仪）；H-NMR（Varian Mercury 400核磁共振仪）；MS（Kratos MS-80型质谱仪）。
1.2 原料与试剂
3，4，5-三甲氧基苯甲酸（张家界贸源化工有限公司）；大茴香醛，BF3/Et2O（国药集团化学试剂有限公司）；NaBH4（天津市福晨化学试剂厂）；镁（湖南汇虹试剂有限公司）；SOCl（天津市科密欧化学试剂有限公司）；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 3，4，5-三甲氧基氯苄（3）的制备
参照文献[11-12]制备化合物（4）与（3）。3，4，5-三甲氧基苯甲醇（4）的收率为92.1%，折光率为1.514；IR：3 422.00（O-H），2 940.81（C=C-H），1 593.39（C=C），1 236.50（C-O-C），1 127.03（C-O），1 061.9伯醇（C-O），829.20（1，2，3，5-四取代）。3，4，5-三甲氧基氯苄（3）的收率为94.2%，mp.59～60℃（文献58～61℃）；1H-NMR（CDCl3，300 MHz），86.60（S，2H），4.42（S，2H），3.88（S，6H），3.85（S，3H）。
2.2 3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化镁（2）的制备
250 mL的三口烧瓶通入氮气使瓶内空气排尽，加入镁条碎片（1.2 g，0.05 mol），再加少量无水四氨呋喃（THF）覆盖镁条，加入碘晶一粒，至溶液微沸，加入3，4，5-三甲氧基氯苄的无水THF溶液，反应2 h，溶液呈灰绿色体系。灰绿色体系即3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化镁THF溶液 。
2.3 3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯（1）的合成
不经分离，在3，4，5-三甲氧基苯甲基氯化镁THF溶液中加入对甲氧基苯甲醛2.0 g，氮气保护，反应1 h，加硫酸，加热至沉淀溶解，二氯甲烷萃取，饱和碳酸氢钠、饱和食盐水洗涤，干燥，抽滤，滤液旋蒸除去溶剂，得白色产品，产品经柱层析得白色结晶3，4，5，4＇-四甲氧基二苯乙烯1.27 g，收率18.4%。mp.159℃（文献157℃）。1H-NMR（CDCl3）：δ 7.43～7.46（d，2H），7.0（d，1H），6.95～6.87（m，3H），6.72（s，2H），3.91（s，6H），3.87（s，3H），3.83（s，3H）；13C-NMR（CDCl3）：δ159.3， 153.4， 137.6，133.5，130.0，127.8，127.6，126.6，114.2，103.3，61.0，56.1，55.3；MS m/z 301。
3 讨论
本文以廉价的3，4，5-三甲氧基苯甲酸为原料，通过还原、卤代制备3，4，5-三甲氧基氯苄，再经制备格利雅试剂与大茴香醛缩合制备了目标化合物4-羟基白藜芦醇的四甲基化衍生物，总收率15.96% 。该路线能顺利实现4-羟基白藜芦醇甲基化物的全合成，原料价廉易得，反应条件温和，操作简便。但是（1）的合成收率较低，可能是卤代烃较活泼，在制备格利雅试剂时会生成偶联副产物导致。该路线能为全合成4-羟基白藜芦醇的甲基化物提供实验依据。
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[关键词]白藜芦醇；乙醇；自发运动；应激反应；行为
[中图分类号] R-332 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）08（b）-0015-04
乙醇是一种水溶性以及脂溶性都非常好的极性小分子，对包括血-脑脊液屏障在内的各种生物膜都具有很强的穿透力，对神经系统的功能有显著影响。动物研究实验表明，乙醇对机体的运动能力、感觉能力乃至包括学习和记忆在内的高级认知功能都有损伤作用[1-4]。
斑马鱼是一种在发育生物学以及遗传学研究中被广泛应用的模式生物，近年来在神经药理学研究中的应用也逐渐增多。急性乙醇处理对斑马鱼的神经系统功能以及相关的行为学指标也有显著的影响[5-7]。
白藜芦醇是一种主要来源于花生、葡萄、蓝莓、虎杖等植物的天然多酚类化合物，有明显的生物活性，具有保护心血管系统、延缓衰老以及抗癌等功效，同时对于乙醇导致的肝脏以及神经系统损伤具有一定的缓解作用[8-10]。
本研究以新兴模式生物斑马鱼作为研究对象，探讨白藜芦醇处理对斑马鱼幼鱼在急性乙醇作用下自发运动、受激运动的影响。
1材料和方法
1.1动物
野生型AB型斑马鱼来源于复旦大学附属儿科医院转化中心，按照Westerfield所著的书[11]中的方法进行养殖和繁殖，室温和水温均为（28.5±0.5）℃，每日14 h光照，10 h黑暗循环（亮灯时间：8∶00，暗灯时间：22：00）。
1.2试剂
乙醇为优级纯，国药集团化学试剂；白藜芦醇购自Vetec公司；链霉蛋白酶购自罗氏公司。
1.3药物制备
1.3.1链霉蛋白酶制备 取1 g链霉蛋白酶，用22.2 ml的灭菌水溶解于50 ml离心管，密封试管，置于37℃水浴45 min，轻柔震荡，制得浓度为45 mg/ml的链霉蛋白酶，分装置于超低温冰箱保存备用。
1.3.2乙醇溶液制备 分别量取乙醇0.2、0.4、0.8 ml，均使用系统水定容至20 ml，制得浓度（v/v%）为1.0%、2.0%、4.0%的乙醇溶液。
1.3.3白藜芦醇溶液制备 电子天平称取白藜芦醇粉末0.030 g，使用系统水定容至1 L，制得浓度为0.03 g/L的白藜芦醇溶液。
1.4仪器
电子天平：德国Sartorius公司；隔水式恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；体视显微镜：德国Zeiss公司；斑马鱼行为学分析系统：法国ViewPoint公司；细胞培养TC24孔板（每孔半径r=8 mm）：上海吉泰远成生物科技有限公司。
1.5白藜芦醇预处理
取自然繁殖的0 dPF鱼卵若干颗，用链霉蛋白酶进行脱膜处理。取成功脱模且状态良好的鱼卵300颗并均分为两组，即白藜芦醇处理组和白藜芦醇非处理组。白藜芦醇处理组鱼卵使用0.03 g/L的白藜芦醇溶液从0 dPF养殖到4 dPF，再将0.03 g/L的白藜芦醇溶液换成系统水，养殖至5 dPF。白藜芦醇非处理组鱼卵使用系统水从0 dPF养殖到5 dPF。
1.6行为学检测
将幼鱼转移至24孔板中，每孔1条幼鱼。向孔中加入1 ml不同浓度的乙醇溶液（0.0%、0.5%、1.0%、2.0%）。将24孔板放入行为学分析系统箱体中。
1.7开放旷场实验
斑马鱼幼鱼可以在每个孔中自由游动，由箱体内摄像机记录每个孔中斑马鱼幼鱼的游动轨迹。实验周期设置为40 min，分别是1～25 min处于光照适应期（正常环境）、26～30 min处于光照测试期（正常环境）、31～35 min处于黑暗期、36～40 min光照恢复（正常环境）。光照期：光照强度为100 Lux；黑暗期：光照强度为0 Lux。白藜芦醇处理组和白藜芦醇非处理组各测试3组，所有实验均在9：00～16：00完成。实验过程中，实验室周围保持安静，行为学检测的室温和水温均为（28.5±0.5）℃。
1.8统计学处理
采用Viewpoint软件分析开放旷场实验的视频，导出游动距离、平均游动速度、游动时间等运动参数，30 s/次，并输出相关数据。主要分析第26～30分钟光照w行分析，数据比较采用双因素方差分析和Sidak分析，统计学检验水平设为0.05，以P
2结果
2.1早期白藜芦醇处理对急性乙醇作用下斑马鱼幼鱼自发运动的影响
2.1.1光照期 双因素方差分析显示，F乙醇=45.96，P乙醇
2.1.2黑暗期 双因素方差分析显示，F乙醇=21.14，P乙醇
2.2早期白藜芦醇处理对急性乙醇作用下斑马鱼幼鱼对光照变化应激的影响
在2.0%乙醇作用下，白藜芦醇处理组和非处理组的光照游动距离与黑暗游动距离比值均显著增加（P均
3讨论
Karlsson等[12]给予小鼠不同浓度的乙醇，通过行为学测定发现低浓度乙醇能促进小鼠的自发活动水平，高浓度乙醇则出现自发活动水平被抑制的现象，这与成年斑马鱼对乙醇的反应基本一致，即在较低浓度乙醇的急性处理下表现出自发运动的增强，随着乙醇浓度的逐渐增高表现出运动的抑制，同时失去了对环境中刺激因素的反应[5]。本研究结果显示，在光照环境中给予斑马鱼幼鱼乙醇刺激，其自发活动水平随着乙醇浓度的增高而增加，这一现象与本研究的实验对象有关。5 dPF的斑马鱼幼鱼已经可以出现神经系统反应[6]，但与成鱼相比较，神经系统并未发育完全，对乙醇浓度的敏感性较低[7]，所以会产生2.0%乙醇作用的斑马鱼幼鱼在光照环境下自发运动水平上升的现象。
Emran等[13]的研究显示，在斑马鱼幼鱼发育到4 pPF时，野生型斑马鱼幼鱼对光线的刺激已经有相应的反应，即无论是光线突然从明亮变黑暗还是光线突然从黑暗变明亮，斑马鱼幼鱼都会出现惊吓反应，因此，当光线由明转暗时，斑马鱼幼鱼会出现游动的增加，这与光线变化所导致的应激作用相关。由于斑马鱼在黑暗中游动多，在光亮中游动少，因此光亮中游动距离与黑暗中游动距离的比值一般1，提示在高浓度乙醇作用下，斑马鱼幼鱼的应激反应已基本消失。
Liu等[14]的研究发现，白藜芦醇干预可以通过其良好的抗氧化作用缓解小鼠慢性温和应激导致的抑郁症状，从而提高小鼠的自发活动水平。本研究中，在中低浓度乙醇的作用下，白藜芦醇处理组的游动距离比值均高于非处理组，说明白藜芦醇预处理可以降低斑马鱼幼鱼因乙醇诱导的应激反应增加。Hu等[15]的研究显示，白藜芦醇可以缓解脑内因可卡因戒断导致的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）上升；而在高浓度乙醇作用下，白藜芦醇处理组对应激反应消失的作用并不明显，这可能与预处理的白藜芦醇浓度有关。斑马鱼幼鱼的给药方式主要通过皮肤吸收，因此斑马鱼生活的水环境是唯一的给药介质，而白藜芦醇作为天然单体化合物，其在水中溶解度较低，仅为0.03 g/L。本研究选择该浓度为干预浓度，已发现其对乙醇造成的行为异常有一定的缓解作用，在进一步的研究中可尝试提高白藜芦醇的给药浓度，从而进一步探索白藜芦醇对神经损伤的具体缓解途径。
本研究中，在相同浓度乙醇的情况下，白藜芦醇处理组的斑马鱼幼鱼游动距离均多于非白藜芦醇处理组，但差异无统计学意义。Pal等[16]在白藜芦醇对氟化物诱导的基因损伤的作用研究中发现，白藜芦醇干预后脑内多巴胺含量显著增加，这说明白藜芦醇可能会通过增加多巴胺含量来增加斑马鱼幼鱼的自发游动水平。在柳富平等[17]对多巴胺和运动能力的研究中也验证了多巴胺含量增加可以提高运动能力这一观点。
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[关键词] 白藜芦醇；椎间盘突出；盘髓核细胞；细胞因子
[中图分类号] R9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）08（c）-0057-02
腰椎间盘突出是一种慢性退行性疾病，其确切病因和病理生理机制仍不清楚[1]。目前，炎症因素在椎间盘退变中的作用日益受到关注[2]。参与椎间盘突出的炎症介质有很多，包括IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE2等[3]。IL-1β可以促使内皮细胞产生多种生物活性物质，还可以激活脑内的多种酶，如COX-2、iNOS等[4]。因此，以IL-1β作为炎症反应的诱导物，可广泛应用于各种细胞模型当中。该实验旨在探讨白藜芦醇对IL-1β诱导椎间盘细胞分泌细胞因子的影响，为研究椎间盘退行性病变的防治提供理论依据。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 主要实验试剂
白藜芦醇购自Sigma-Adrich公司（纯度>99%）。用DMSO配制成 0.2 mol/L 母液备用，使用前DMSO终浓度不高 0.1 %。IL-6和IL-8购自深圳欣博盛生物科技有限公司。IL-1β购自Sigma-Adrich。细胞培养板购自Corning。
1.2 髓核细胞的原代培养
将椎间盘手术患者术体内获取的椎间盘组织用D-Hanks液清洗，并将髓核组织与纤维环及纤维环交界区组织剪成1 mm3的小块， 反复洗涤后加入0.25%的胰蛋白酶消化15 min。离心洗涤后继续用0.2% II型胶原酶消化4 h。用完全培养基终止消化并用200目尼龙网过滤后，吹打成细胞悬液后接种于6孔板中，37℃、5% CO2条件下培养。
1.3 实验分组与处理
待髓核细胞生长至融合度为90%左右时，根据不同的实验目的分为组：①空白对照组：仅加入0.1% DMSO；②IL-1β组（阳性对照组）：加入5 ng/mL IL-1β作用2 h；③Res组：加入终浓度为5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L 3种浓度，按不同的实验目的分别作用 0 h、12 h、24 h、36或48 h。培养中止后收集细胞，进行测定。
1.4 ELISA检测IL-8和IL-6的产生
收集感染后24孔板中细胞上清液，按照ELASA 试剂盒说明书检测IL-8、IL-6的水平。即，100 μL细胞上清液加入到每个捕获抗体包被的微孔板中，室温孵育2 h。洗板后，加入100 μL检测抗体，室温继续孵育2 h。随后弃混合物，每孔加入100 μL streptavidin-HRP，室温避光孵育20 min。最后，每孔加入100 μL底物，室温避光孵育20 min，然后加入50 μL终止液，分光光度计检测450 nm处OD值。
1.5 统计方法
采用SPSS 15.0统计学软件处理数据，结果采用均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用one-way方差分析并行Student’s t检验。
2 结果
2.1 髓核细胞的分离与培养
人椎间盘髓核组织培养后4 h，细胞尚未完全贴壁，形态学表现为圆形，胞浆比例较大，细胞核清亮。继续培养5～7 d后，髓核细胞开始贴壁并转化为梭形原代细胞且呈单层生长。随后细胞间开始有突起相连接。15～20 d后融合成片。
2.2 不同浓度白藜芦醇对IL-1β诱导髓核细胞产生IL-6和IL-8的影响
髓核细胞未经任何处理情况下，产生的IL-6和IL-8较低。IL-1β作用2 h后，IL-6和IL-8产生显著增多。而细胞随后用5 μmol/ L、30 μmol/L、50 μmol/L白藜芦醇处理后，IL-6和IL-8含量随着白藜芦醇浓度的递增而逐渐降低。见图1。
2.3 白藜芦醇不同时间对IL-1β诱导髓核细胞产生IL-6和IL-8的影响
髓核细胞用5 ng/mL IL-1β作用12 h即可诱导较高水平的IL-6和IL-8表达。其峰值位于24 h。而采用50 μmol/L 白藜芦醇作用后，IL-8和IL-8水平明显低于IL-1β组。见图2。
3 讨论
随着对炎性因子的深入研究，发现其不仅在导致疼痛的过程中发挥重要作用，而且还参与了椎间盘的退变。IL-6是一种具有许多生物学功能的细胞因子，对多种细胞的生长、化及基因表达都有影响，在椎间盘退行性病变中起重要作用[5]。研究显示，突出腰椎间盘组织培养液中IL-6含量远远高于正常椎间盘组织.腰椎间盘中的IL-6可能是通过自分泌或旁分泌方式产生，并作用于椎间盘自身细胞从而产生一系列病理效应。和IL-6一样，IL-8作为重要的白细胞趋化因子，对特异和非特异的免疫反应细胞具有强烈的趋化作用，并能调节细胞同血管内皮细胞的粘附和相互作用[6]。目前发现IL-8是多种原因所致的缺血再灌注损伤过程和全身性失控炎症反应的主要炎症因子，同时也可能参与椎间盘组织的退变[7]。
该实验的研究结果显示，单纯的髓核细胞本身分泌IL-6和IL-8不多。给予IL-1β刺激后，其含量显著增高。而给予白藜芦醇预处理后，髓核细胞中IL-6和IL-8含量随着白藜芦醇浓度的增高而明显降低，这表明白藜芦醇落能够抑制退变椎间盘组织中IL-6和IL-8的异常表达，对阻止颈椎间盘退变具有良好作用。白藜芦醇通过阻止退变颈椎间盘炎性因子的渗出，从而阻断了炎性因子对颈椎体的破坏作用，但究竟其影响机制如何，尚需进一步研究。
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【摘要】 目的 探讨白藜芦醇（Resveratrol，Res）体外抑制U251、U87和SHG44脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的不同作用比较，验证Res确可导致U251细胞凋亡。方法 MTT比色法测量不同剂量的Res作用U251、U87和SHG44胶质瘤细胞24h后对增殖的影响及不同剂量的Res作用U251、U87和SHG44细胞6h、24h、48h后的影响。流式细胞仪用Annexin VFITC和PI双染检测U251、U87和SHG44细胞凋亡率。HE染色、Hoechst 33342荧光染色、透射电镜(TEM)观察U251细胞形态改变，流式细胞仪测定U251细胞的细胞周期改变。结果 Res明显抑制U251、U87和SHG44细胞的生长和增殖（P＜0.01）且对U87细胞的抑制作用最强，U251和SHG44细胞次之；对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应；Res所致的U251 、U87和SHG44胶质瘤细胞凋亡为浓度依赖关系，且对U87细胞的凋亡作用强于U251和SHG44细胞。U251凋亡细胞的细胞周期主要发生G1期阻滞。结论 Res对U251、U87和SHG44细胞生长抑制及凋亡作用以U87细胞更明显，对U251细胞的抑制作用呈浓度及时间依赖性反应并引起了其细胞周期改变。
【关键词】 白藜芦醇；胶质细胞瘤；细胞凋亡
Comparison Study on Resveratrol Suppressing Human Glioma Cells Growth and Inducing Apoptosis
Key words：Resveratrol； Glioma； Apoptosis
0 引言
Res是一种多酚类化合物，化学名为3，5，4’三羟基反均二苯代乙烯(3，5，4’trihydroxystilbene， C14H12O3)，分子量228.2 [1]。近年来对其抗肿瘤作用研究较广泛。本研究旨在证明Res可抑制人源脑胶质瘤细胞系U251生长并导致其发生凋亡及细胞周期改变，探讨生长抑制与剂量、时间及凋亡与剂量的关系，并与Res抑制U87及SHG44脑胶质瘤细胞生长及诱导凋亡的作用比较。
1 材料与方法
1.1 材料
Res购自Sigma公司，用DMSO溶解配成200 mmol/L贮存液-20℃冻存备用；U251、U87和SHG44细胞系由本研究所提供；DMEM培养基购自Gibico公司；胎牛血清购自灏洋生物公司；MTT、Hoechst 33342荧光试剂盒、Annexin VFITC和PI均为Sigma公司产品。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
U251、U87和SHG44细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2孵箱中培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.2.2 MTT法
实验首先进行3种细胞Res处理24h的生长状态比较，取对数生长期U251、U87和SHG44细胞，接种至96孔板内；实验按3种细胞分3组，每组将Res分7个不同浓度梯度，分别为5、25、50、100、200、300、400μmol／L的处理组及浓度为0μmol／L Res 的等量DMSO的对照组，每种浓度设6个重复孔，并以空白孔调零。各组细胞培养24h后，将培养液换成含不同浓度Res的培养液，继续培养24h，随后每孔加入20μl、5g/L的MTT，继续培养4h，最后每孔加150μl DMSO振荡10min，酶标分析仪检测490nm波长的光密度值(Optical density，OD)。其次按照同样方法进行Res处理U251、U87和SHG44细胞6h、24h、48h的分组及其细胞生长状态的MTT法OD值测量。所得数据用SPSS 10.0软件计算均数及标准差，并进行方差分析，组间差异采用Dunnettt 检验。
1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及Annexin VFITC 和 PI双染检测细胞凋亡率
消化收集200μmol/L Res处理24h的U251细胞及对照组细胞，调整细胞浓度1×106 /ml各取4ml，按常规细胞周期样品检测方法作程序性处理后进行流式细胞仪检测；分别消化收集300、150、50、5μmol/L Res处理24h组的U251、U87和SHG44细胞和DMSO对照组的细胞，加入5μl Annexin VFITC和5μl PI于细胞悬液中避光染色10min，流式细胞仪检测凋亡的百分比，数据用multicycle分析软件处理。
1.2.4 凋亡细胞的光镜观察
将U251传代细胞接种于盖玻片表面，培养24h后，换成含200μmol/L Res的DMEM培养液，继续培养24h后，HE染色，光镜观察。
1.2.5 凋亡细胞的Hoechst 33342荧光检测
200μmol/L Res处理24h的U251细胞按荧光染色试剂盒方法逐步进行后荧光显微镜下摄片。
1.2.6 凋亡细胞的TEM观察
消化收集200μmol/L Res处理24h的U251细胞，细胞计数1×106 ～107，1 500r/min离心15min后，4%戊二醛固定，按常规TEM样品作程序性处理，行TEM观察。
1.3 统计学分析
采用SPSS10.0统计软件进行分析，计量资料结果采用(±s)表示，组间均数的比较用t 检验分析和方差分析。
2 结果
2.1 Res所致U251、U87和SHG44细胞的细胞毒性效应比较
通过设计的MTT实验，首先比较了Res对U251、U87和SHG44细胞生长的抑制效果，见图1。随着Res作用浓度的增加、作用时间的延长，胶质瘤细胞受抑制作用越显著，从左到右的生长曲线分别为U87、U251和SHG44细胞，可以看到U87细胞在同种浓度下的受到抑制更明显，存活率更低；MTT法分析存活率，当前存活率=同一浓度处理组OD值均值/DMSO对照组OD值均值×100%，设DMSO对照组存活率为100%。
其次Res作用6h、24h、48h后的U251、U87和SHG44细胞的存活率见图2，Res引起的3种胶质瘤细胞生长抑制作用有浓度和时间的依赖关系，且有显著差异（P＜0.01）。
2.2 Res导致细胞凋亡的流式细胞仪分析
经300μmol/L、150μmol/L、50μmol/L Res处理24h后和DMSO对照组的U87、SHG44和U251细胞的凋亡率（包括早期及晚期凋亡）分别为52.2%、38.6%、24.4%、2.3%、40.5%、34.4%、22.7%、2.5%、43.8%、37.1%、23.3%、2.1%，有浓度依赖关系。3种细胞的凋亡率比较，可见不同浓度的Res作用后的凋亡率U87＞U251＞SHG44，与MTT法测得的抑制率结果相一致。DMSO对照组及150μmol／L Res处理组的U251胶质瘤细胞的凋亡分布图，见图3A、B。U251的细胞周期改变， G1、G2、S期的细胞对照组分别占69.5%、2.7%、27.8%，200μmol/L Res处理组分别占76.4%、2.2%、21.4%。G1期比例升高，S、G2期比例降低，见图3C、D。
2.3 形态学结果
2.3.1 HE染色
光镜下观察所见U251凋亡细胞，细胞变圆、细胞核固缩、深染，核染色质致密，形状不一、大小不等的团块边集于核膜。
2.3.2 Hoechest 33342染色
U251凋亡细胞的荧光染色高倍镜下观察结果，可见凋亡细胞，细胞核固缩，核染色质边集，荧光信号强，见图4。
2.3.3 透射电镜观察
凋亡的U251细胞表面绒毛消失，表面光滑，细胞膜表面有出泡现象，线粒体崩解，胞质浓缩，染色质晚期碎裂，边集。
3 讨论
Res是普遍存在于葡萄属植物中的一种物质，是一种多酚类化合物，已在72种植物中被发现。对Res药理作用的认识最早源自其具有抗脂质过氧化作用。近年对Res抗肿瘤活性机制的研究揭示，其在肿瘤启动、促进及发展3个阶段都有抗肿瘤功效。目前提出的Res抗肿瘤途径有很多种，但机制还不是很清楚。本实验证实Res对U251肿瘤细胞的抑制率大于凋亡率更大于死亡率，说明Res导致凋亡作用不是唯一途径。我们主要对Res导致U251细胞凋亡及引起其细胞周期改变进行研究，证实Res阻滞U251胶质瘤细胞的细胞周期从G0/G1期进入S期，导致了S期减少，并且根据文献报道Res可通过抑制人脑胶质瘤U251细胞 [2]、人乳腺癌MCF7细胞 [3]的细胞周期蛋白cyclin D1表达，导致细胞周期G0/G1阻滞，并应用周期素依赖性蛋白激酶抑制剂可以抑制Res导致的凋亡 [2]，由此考虑细胞周期的阻滞可能促进了Res导致的凋亡性死亡，引起了肿瘤细胞生长抑制，但是其确切的作用机制还有待我们深入的研究。
本研究证明Res对U251胶质瘤细胞的生长抑制呈浓度和时间依赖关系，这与我们以前对SHG44 [4]、U87 [5]细胞的实验结果一致，也与文献对RT2胶质瘤 [6]、乳腺癌 [3]、前列腺癌 [7]等的报道结果一致。同时，我们也证明了Res对人源U251、U87和SHG44胶质瘤细胞产生明显的凋亡作用，与其引起其他肿瘤细胞发生凋亡 [6，8]的结果有相似性，都有浓度依赖关系。本实验又证实Res对U251、U87和SHG44细胞生长抑制及凋亡作用以U87细胞最明显，这样我们以后可以采用更为敏感的U87细胞进行机制研究及动物实验。另外，实验中用于溶解Res的溶剂为稀释至1‰的DMSO溶液，对细胞不具有毒性作用，Res对正常细胞及3T3成纤维细胞没有明显毒性作用 [6，8]。
以上实验证明了Res确可抑制人源U251胶质瘤细胞增殖并诱导凋亡，并筛选出了对Res更为敏感的U87细胞作为以后机制研究的细胞系。我们认为加强Res的抗癌耙点研究，可以为临床开发新药物提供理论依据。同时我们认为Res作为一种天然药物比传统化疗药物有优势，有着很好的应用前景。（本文图4见第318页）
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[关键词]色谱法；葡萄酒；白藜芦醇
中图分类号：V750 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2017）16-0348-01
中草药在国家已经拥有数千年的历史，属于民族的瑰宝，但是仍需要经过大量的研究推动中药产业的进一步发展。白藜芦醇的化学分子式是C14H12O3，是非黄酮类多酚化合物，其相对分子质量是228.25，这是葡萄酒中的重要组成部分，因此有益于人体的健康。野生刺葡萄中的白藜芦醇含量很高，同时这样的物质还具有良好的抗癌抗菌效能，发挥出优质的药理作用，受到了国内外学者的广泛关注。白藜芦醇的化学结构具备反式和顺式两种构象，在自然界中的白藜芦醇主要是以反式构象为标准，这两种构象能够在一定条件下实现相互的转化，例如反式构象白藜芦醇经过紫外光照射之后可以及时转化为顺式异构体，这种顺式异构体的化学构象如图1所示。高效液相色谱技术就是在液相和气相色谱法发展的基础上，诞生出的具有分离和检测能力的技术，发挥出简便、快速、灵敏的特点，推动了这项技术的应用与发展，逐渐在生物工程、食品监测、医疗制药等多种领域投入使用。
1 材料和方法
1.1 仪器和试剂
1.1.1 仪器
Agilent1100系列的高效液相色谱仪器的色谱柱全部是从美国安捷伦科学技术公司引进，MILLI-Q超纯水纯化系统主要是从美国的Millipore公司引进，CSF-3A超声洗清器是从上海的超声波仪器厂购进。
1.1.2 试剂
白藜芦醇对照品、甲醇、冰醋酸、双蒸水、Triton X-100、氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、葡萄酒。
1.2 方法
1.2.1 样品制备
1.2.1.1 白藜芦醇对照品的配制
称取50g的白藜芦醇对照品，然后适当的加入100毫升的甲醇溶液，经过配制成500毫克每毫升的标准储备液，然后运用百分之五十的甲醇溶液和标准的储备液不同比例进行混合，配制为不同浓度的对照品溶液。
1.2.1.2 葡萄酒中白藜芦醇的提取
量取五百毫升的干红葡萄酒，适当的加入五百毫升的乙酸乙酯溶液，经过充分的振动，使其完全的融合，经过静置待其分层，把有机相旋转40摄氏度之后蒸发干，残留物应该加入甲醇溶液定容到100毫升溶解萃取之后避光进行保存，上机测定之前还应该超过0.45微秒滤膜去除相应的杂质，获取供试品溶液。
1.2.2 色谱条件
顺式白藜芦醇检测波长应该保持在305纳米，反式白藜芦醇的检测波长应该保持在320纳米，柱温控制在35摄氏度，流动相是甲醇和百分之一乙酸按照体积比值35：65配制，流速是1.0毫升每分钟，进样量是20微升。
1.2.3 平衡温度的影响
白藜芦醇需要在55摄氏度的平衡温度下才能获取到最好的萃取率，并且也能够获得最好的峰形，如果温度进一步升高，峰形可能会变得不对称，出现越来越宽的趋势，所以在实验中，应该选择55摄氏度作为平衡温度。
1.2.4 系统适应性试验
1.2.4.1 线性关系
通过量取浓度是500mg/ml的标准储备液和百分之五十的甲醇溶液配制出不同浓度对照品，浓度分别是0.2500、0.1250、0.0250、0.0125、0.0025mg/ml。通过明确量取配制好的不同浓度的对照品溶液20微升，测定出峰面积，通过进样浓度X和峰面积Y设置线性回归，由此得出相应的回归方程。
1.2.4.2 精密度试验
量取1.2.1.2中的供试品溶液20微升，在经历了五次的重复进样之后，测定出白藜芦醇的峰面积，计算出相应的标准偏差。
1.2.4.3 稳定性试验
通过量取供试品溶液的20微升，在间隔一小时测定一次之后，总计的进样是24次，在此之后测定出白藜芦醇的峰面积，计算出标准偏差。
1.2.4.4 重复性试验
量取供试品溶液共计五份，测定出白藜芦醇的峰面积，计算出具体的标准偏差。
1.3 数据分析
运用Markerlynx ApplicationManager Version件加以分析，把保留时间范围和偏差设置在1-30分钟、2秒，相对分子的质量范围和偏差分别设置为50-1000及50ppm，把最小强度设置为50。
2 结果
2.1 线性关系
所获得的回归方程是Y=9096.6X+13.806，r=0.9998（n=5）。通过分析相应的结果，可以发现白藜芦醇的浓度保持在2.50-255.00μg/m L时，和峰面积始终呈现出良好的线性关系。
2.2 精密度试验结果
供试品的峰面积相对标准偏差是0.76%。
2.3 稳定性试验结果
供试品的峰面积相对标准偏差是0.95%，表明了在二十四小时内稳定。
2.4 重复性试验结果
供试品峰面积的相对标准差是0.77%，证明了此测试的重复性较好。
3 讨论
中药属于一种相对复杂且未知的物质体系，因此其化合物的种类较多，数目不明确，不同的方剂含量差异较大，体现出复杂性。白藜芦醇广泛的存在于葡萄、百合与豆科植物中，体现出抗病毒的功效，因此被广泛的应用至心脑血管疾病的预防中。正是因为白藜芦醇在食品和医药方面发挥出的良好功效，让相应的研究人员更加关注。为了解决白藜芦醇中药现代化的问题，需要让中药得到国际的认可，因此才能有针对性的开展工作，通过运用合理的新方法解决新问题。高效液相色谱分离分析法在面对中药复杂的构成成分时，可以及时快速的完成分离纯化的工作，做到省时、高效、低耗的落实，并且能够有效的提供最佳液相色谱，二维分离方式明显的减少了离子的抑制效应，从而获取到更多的样品化合物信息，为更好的分析中药提供了较为广阔的平台。
此次研究主要是通过高效液相色谱分离分析法在葡萄酒萃取白藜芦醇的实验，体现出极好的精密度、稳定性和重复性，验证了高效液相色谱分离分析法已经成为了当前中药复杂体系研究中的重要技术，因此可以为复杂体系中药分离分析提供可靠的保障。
综上所述，白藜芦醇的浓度应该在2.50-255.00μg/mL的时候和峰面积呈现出最佳的线性关系，其中体现出的精密度、稳定性和重复性的标准偏差都在0.76%以上。由此判断，高效液相色谱分离分析法在葡萄酒萃取白藜芦醇中的应用效果显著，体现出广阔的发展前景。
参考文献
[1]昝川南，叶梁银.浅析高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景[J].化学工程与装备，2013，02：158-161.
[2]宋兰英. 浅析高效液相色谱分析法在各领域的应用及发展前景[J]. 科技创新与应用，2015，12：60.
关键词：肝癌；Ras相关区域家族1A；甲基化
肝细胞癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一[1， 2]。近年来DNA甲基化在肝癌的发病过程中日益受到重视，在DNA甲基转移酶（DNMTs）的作用下，胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶（CpG）[3]。DNA异常甲基化可导致多种癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活，与多种肿瘤的发生密切相关[4]。藜芦醇是广泛存在于各类植物中的一种天然多酚，研究显示其具有多重药理作用，包括心肌保护，抑制血小板凝集，抗炎、抗氧化作用以及血管舒张等。此外，白藜芦醇也能通过多种机制调节肿瘤细胞的增殖，侵袭以及凋亡，因此是一种潜在的高效肿瘤预防药物[5]。但其对肝癌细胞具有何种作用仍然不清楚。本研究旨在观察Rev能否影响肝癌HepG2细胞系中RASSF1A基因的表达和甲基化，以此为肿瘤肝癌的预防提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
白藜芦醇（纯度98%）为sigma产品；RASSF1A引物和其亚硫酸氢盐转化启动子区购于Integrated DNA Technology. M. SssI 甲基酶、S-腺蛋氨酸（3.2mmol/L）、10×保温缓冲液购于New England Biolab Inc，其余分析纯试剂主要购自生海生物工程有限公司。
1.2 细胞培养与活性研究
人肝癌细胞系HepG2用含10%牛胎儿血清、100U/mL的青霉素以及100U/ml的链霉素的DMEM培养基（pH7.4）中在37℃、5% CO2条件下培养。实验前将细胞密度调整至105/mL。实验分为阴性对照组和白藜芦醇处理组。其中对照组加入等量的DMEM培养基（含终浓度低于0.1%的DMSO）。处理组加入不同浓度的白藜芦醇在37℃下处理实验细胞24～72h。随后用于MTT分析，并计算抑制率。抑制率=（对照组OD值-实验室OD值）/对照组OD值×100%。
1.3 Western blot与甲基化活性分析
细胞处理完毕后，离心（
1.4 DNA提取和水解
获取1×107个Rev处理后的HepG2细胞，按照DNeasy Tissue kit （Qiagen）试剂盒操作步骤提取基因组DNA用于全细胞甲基化分析。DNA水解方法根据参考文献提供的方法进行[6]。
1.5 高效液相色谱- 电喷雾质谱检测
液相色谱包括HPLC 系统，色谱柱和预柱。流动相为0.1%甲酸-甲醇，流速为0.2 mL/min。电喷雾离子模式为正离子，扫描范围为m/z 100～2 000， 离子源温度450℃， 喷雾电压为415 kV，破簇电压为55 V，入口电压6 V。采用Sciex Analyst software软件处理数据。
2 结 果
2.1 Rev增加HepG2细胞RASSF1A mRNA和蛋白表达
如图1所示，HepG2细胞基础状态下RASSF1A表达水平较低，而经10 μmol/L 和30 μmol/L Rev处理后，能显著增强RASSF1A蛋白的表达。
图1. Rev对HepG2细胞RASSF1A mRNA和蛋白表达的影响
1.对照组；2.10 μmol/L Rev；3.30 μmol/L Rev
2.2 Rev能降低RASSF1A启动子区域以及全基因组和细核DNA甲基化以及DNMT1表达水平
高效液相色谱- 电喷雾质谱结果显示，30 μmol/L Rev处理HepG2细胞后，与对照组相比， RASSF1A启动子甲基化水平降低至32%，全基因组甲基化水平降低44%，与对照组相比，差异有统计学意义（P
2.3 Rev对肝癌细胞增殖的影响
HepG2细胞经Rev处理后，其增殖活性收到一定程度的抑制。其中10和30 μmol/L Rev作用后，细胞存活率降至36%和24%（P
3 讨 论
有证据表明Rev可能是肝癌的一种有效的预防和治疗剂。但是，Rev发挥作用的分子机制仍然不清楚。本研究中，我们首次证实Rev能上调肝癌细胞中因甲基化而失活的RASSF1A基因 mRNA和蛋白的表达。同时，RASSF1A的激活还与降低其启动子甲基化有关。此外，本研究也发现Rev对HepG2细胞增殖具有抑制作用。因此，Rev可能通过抑制DNA甲基化，从而抑制肝癌生长增殖。本研究发现Rev能在一定程度上抑制DNMT1的表达，从而通过降低RASSF1A启动子甲基化从而重新激活RASSF1A，这可能是其化学预防肝癌的一种新的分子机制。一些超甲基化沉默的抑癌基因，如GSTP1和MGMT，已经被认为在肝癌和其他癌细胞系中被外源性因素重新激活。这说明Rev能诱导DNA去甲基化以及重新激活由此沉默的抑癌基因。
尽管白藜芦醇具有多方面的正向生物学效应，但其在体内的转运和分布仍不清楚，由于它水溶性很低，因此白藜芦醇必须与相关蛋白结合后才能在血清中保持较高的浓度[7]。此外，对于治疗性的药物而言，其与转运蛋白的结合能力直接决定了其疗效。因此对于临床肝癌的治疗，其制作工艺还有待进一步完善以提高其药理动力学效应。
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1.厦门市第三医院神经内科，福建厦门 361100； 2.遵义医学院附属医院，贵州遵义 563003
[摘要] 目的 探讨反式白藜芦醇（TR，Trans-Resveratrol）对Aβ25-35损伤大鼠海马NMDA受体NR1、NR2A亚基表达的影响。方法 选择经莫式水迷宫(MWM)训练合格的大鼠，随机分为6组：假手术组；模型组；TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组、安理申对照组。模型组通过在大鼠海马内注射Aβ25-35制模获得，在模型组基础上分别用TR高、中、低剂量TR干预获得TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组，同时用安理申干预获得安理申对照组，每组6只，采用实时聚合酶链反应法(real time PCR)检测6组大鼠海马NMDA受体NR1、NR2A表达。 结果 在MWM中模型组逃避潜伏期比TR高、中、低剂量组、安理申组和假手术组明显延长，各组NMDA受体NR1表达分别为(0.14±0.04), (1.51±0.54), (0.22±0.06), (0.37±0.08,0.61) ± 0.15)(LOW)，(0.97±0.16)(安理申)。各组NMDA受体NR2A表达分别为(0.12±0.07)、(1.72±0.34)、(0.16±0.06)、(0.21±0.08)、(0.52±0.15)、(0.67±0.16)。结论 TR可能有下调海马NMDAR1 、NMDAR2A受体表达，从而减少海马细胞凋亡的作用。
关键词 反式白藜芦醇；痴呆；大鼠；NMDA受体
[中图分类号] R725 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）09（c）－0011-03
海马是学习记忆的重要脑区，是边缘系统的一个部分[1]。NMDA受体是谷氨酸受体的一种亚型，参与形成突触传递的长时增强过程，参与调解神经系统的发育，同时在癫痫、肿瘤等多种重要过程中发挥重要作用[2-3]。目前已经发现的NMDA受体多达7种，包括NR1、NR2（A、B、C和D4种）、NR3（A、B2种），NR2各亚单位之间具有很好的相似性，一般将其分为2种亚群[4]。研究表明，反式白藜芦醇(Trans-Resveratrol, TR)具有一定的抗氧化作用，在防止高血压、动脉硬化及提高机体免疫力方面有较好的效果[5]。
研究发现，利用基因敲除技术敲除NR1基因后，小鼠CA1区NMDA受体兴奋性突触后电位消失，痴呆大鼠的海马突触传递发生改变，其海马的NR2A表达轻度上调，NR1表达明显上调。经TR干预后海马及附近脑组织NR1、NR2A表达均下调[9]。因此，我们使用颅钻钻孔微注棒Aβ25-35注射损伤双侧大鼠海马[7-8] ,注射TR后，观察其对痴呆大鼠保护的效果，并检测NMDA受体NR1、NR2A的表达情况，以探求临床上痴呆病人理想药物治疗的实验研究方法，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
实验用36只雄性大鼠为本单位实验动物研究中心提供，体重208~225 g，平均体重215 g。反式白藜芦醇(TR)粉剂购自西安林禾生物技术有限公司。苦味酸购自生工生物工程（上海）有限公司，盐酸多奈哌齐（安理申）购自卫材（中国）药业有限公司，Aβ25-35购自SIGMA公司，逆转录试剂、荧光液Green Supermix等PCR试剂购自生工生物工程（上海）有限公司。
1.2 仪器
冷冻离心机（德国5417R）、紫外可见分光光度计（TU-1810）、湘仪 H1650-W离心机，Thermo Piko Real 96 Real-time system实时PCR仪，Bioer XP Cycler普通PCR仪、双臂脑立体定位仪（68002型RWD life science co）、颅钻（78001型）、超微量注射棒、Morris水迷宫等。
1.3 动物模型制备
选择经莫式水迷宫(MWM)训练合格的大鼠，随机分为6组：假手术组；模型组；TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组、安理申对照组。模型组通过在大鼠海马内注射Aβ25-35制模获得，在模型组基础上分别用TR高、中、低剂量TR干预获得TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组，同时用安理申干预获得安理申对照组。
1.4 NMDA受体NR1、NR2A表达检测
利用RT-PCR检测NMDA受体NR1、NR2A的表达，方法参照检测试剂盒进行，PCR反应条件采用两步法进行,具体步骤为：95 ℃，3 min； 65 ℃，3 min。
1.5 统计方法
应用spss18.0统计软件分析所有数据，计量资料以（x±s）表示，组间比较用Levene 检验分析。
2 结果
2．1 各组NMDA受体NR1、NR2A表达
各组NRI及NR2A的表达结果见表1，与模型组相比，各组NR1及NR2A的表达差异有统计学意义（P＜0.05），且高剂量组反式白藜芦醇干预组的NR1的表达明显减少，与中、低剂量反式白藜芦醇干预组相比效果好。
2.2 TR各剂量组海马凋亡细胞病理观察
TR各剂量组海马凋亡细胞病理切片结果如图1所示，TR高剂量组海马的凋亡细胞数明显低于TR低剂量组、对照组及模型组，TR低剂量组海马凋亡细胞数相对对照组及模型组较少。
3 讨论
海马是人类脑部的重要区域，具有调解神经系统的发育的重要作用，是边缘系统的一个部分，海马受损是引起阿尔茨海默病的主要病因[6-7]。
NMDA受体是谷氨酸受体的一种亚型，参与形成突触传递的长时增强过程，研究发现当海马神经元突触内NMDA受体被阻断时，细胞变性死亡将会增加[8-10]。海马中主要表达的NMDA受体有NR1和NR2A，NR1可以在细胞中单独表达有功能的同聚受体，但对激动反应很小，NR2A不能单独形成有功能的通道，只有和NR1组合才能表现活性，并使后者反应明显加强，所以把NR1、NR2A放一起研究并起互相印证的作用[11-13]，研究发现，谷氨酸可能在神经病理变化及痴呆症状中起重要作用，在有痴呆的大鼠甘氨酸结合能力降低,提示NMDA受体的功能缺损，Lu等[15]采用免疫印迹法分析AD 患者死后脑NR1下降39% ,NR2B下降40%，提示NMDA受体的功能缺失后, AD患者嗅内皮质中NR1mRNA含量较正常人下降34%，而用用高压液相色谱分析脑组织标本中的右旋- 天冬氨酸含量发现[16] AD患者的天冬氨酸较相同年龄正常对照组下降，但在神经病理变化较小的小脑中无明显变化，这些说明右旋-天冬氨酸的降低可能参与NMDA受体功能下调及记忆丧失的过程。Hasanein等[17]则发现AD患者神经受损区具有特异性，Aβ25-35 在AD患者脑内堆集、产生神经毒性可能是通过NMDA受体促进氧自由基的生成所引起的[18]，所以该实验通过检测NMDA受体含量变化，推测抗氧化药物白藜芦醇是否对痴呆大鼠有作用，结果发现随着TR剂量的增加，海马组织NMDA受体的表达减少，痴呆症状有所改善，TR对痴呆大鼠海马起到保护作用，TR对大脑海马的保护作用可能是通过下调海马中NMDA受体NR1及N2A的表达完成的，但其具体作用机制还需要进一步研究发现。
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