微生物多样性分析方法精选(九篇)

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第1篇：微生物多样性分析方法范文

关键词：土壤；细菌；多样性；DGGE

土壤中微生物种类极其丰富，文献曾报道，1g农田土壤中就含有几百万细菌、数十万真菌孢子和数万个原生动物和藻类[1]。微生物以它所具有的各种生物化学活性 ，积极参与土壤中各种物质的转化过程 ，是土壤中各种生物化学和生理学过程动态平衡的主要调节者。目前在生态学和环境科学的研究领域，关于土壤微生物尤其是土壤中微生物多样性及其在生态系统中的作用的研究越来越受到重视；而传统的平板培养分离方法研究土壤微生物多样性有很大的缺陷，能够人工培养的土壤微生物的数量只占其总数的1%左右[2]，且这种分离培养方法不能很好地反映土壤微生物多样性的原始状态等[3]，这就使得采用新的技术和方法显得尤为必要。

变性梯度凝胶电泳技术（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）作为一种DNA指纹图谱技术，最先由Muzyer等于1993年将其应用于微生物生态学研究[4]，证实了该技术在研究自然界微生物群落的种群差异和遗传多样性方面具有明显的优越性。DGGE因其可靠、方便快捷、重现性好等特点，迅速成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具[5]。目前广泛运用于土壤、水体、食品、活性污泥等各种样品中的微生物多样性检测和种群演替的分析[6～9]。但昂贵的进口设备和比较复杂的操作，使得该技术在基层技术部门以及高等院校人才培养中的应用受到了限制。因此，选用适宜的引物，并对PCR及DGGE的实验条件进行优，以获得较好的分析结果显得尤为重要。本试验优化了DGGE电泳时间长度，筛选了最佳PCR引物，比较了两种染色方法，得到了在国产DGGE系统分析土壤微生物多样性的最佳条件。

1、材料与方法

1.1、试验材料

试验土壤样品21个，于2011年9月采自许昌市襄城县庾河村烟田。烤烟品种为当地主栽品种中烟100，种植方式为烟薯套种。对采集的土样自然风干，研磨过100#筛子，装袋标记，置于-20℃冰箱内以备用。

1.2、试验方法

1.2.1、土壤总DNA的提取

对处理过的土样采用本实验室优化方法提取土样总DNA。

1.2.2、PCR引物的设计和扩增体系的探索

（1） 引物合成

根据NCBI数据库公开的细菌基因组16S保守序列设计了4对细菌通用引物：引物对Eubac10F/Eubac1507R用于第一轮扩增，引物对BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3用于第二轮扩增，对样品总DNA进行巢氏PCR扩增。为了便于对污染源进行追踪，在PCR扩增过程中，都设立了阴性对照。对照除了不加模板DNA外，其它组分全部相同。引物序列均由北京博尚生物技术有限公司进行合成，详见表1：

（3）巢式PCR扩增条件：

引物对Eubac10F/Eubac1507R的第一轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 50s，52℃ 50s，72℃ 1min，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳。

引物对BV34F/BV56GC的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，52℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。

引物对BV67F/BV89GC的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，54℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。

引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5min，1个循环；94℃ 40s，57℃ 45s，72℃ 45s，28个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1%的琼脂糖电泳检测后用于DGGE电泳检测。

1.2.3、DGGE电泳时间长度的优化

采用北京君意公司的梯度胶制备装置（型号JY-TD331）进行垂直电泳。使用梯度混合器，配制聚丙烯酰胺凝胶的变性剂浓度梯度40%～ 60% （100%的变性剂为7mol/L的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物），凝胶浓度为6%，以引物对Eubac10F/Eubac1507R和引物对BV34F/BV56G的巢氏PCR产物为上样模板，上样50ul。设置电泳温度60℃，电压100V。电泳过程中，每2h上一次样。电泳结束后，用EB染色15min。染色后凝胶用BIO IMAGING（美国UVP GelDoc-It Imaging Systems）的凝胶成像系统拍照。

1.2.4、DGGE最佳引物对的筛选

配制聚丙烯酰胺凝胶的变性剂浓度梯度40%～60%，凝胶浓度为6%，以引物对BV34F/BV56GC、引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的相同样品的第二轮PCR产物为上样模板，根据上述已优化的电泳时间和条件进行电泳。电泳结束后染色照相。

1.2.5、EB和硝酸银两种DGGE染色方法的比较

根据上述已优化的电泳时间和最佳引物平行的跑两块变性梯度凝胶。电泳结束后，分别用EB和硝酸银两种方法染色。通过比较两种染色方法的DGGE条带的亮度和数目得出最佳染色方法。

2、结果与分析

2.1、巢氏PCR扩增结果

扩增结果表明，细菌16S区的第一轮PCR扩增条带亮度高，其大小约为1500bp，符合预期，且无非特异性扩增，阴性对照无条带。分别以BV34F/BV56GC、BV67F/BV89GC和BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮扩增得到的条带片段的大小都符合预期，且无非特异性扩增，阴性对照无条带，说明巢式PCR扩增效果好，能够满足DGGE上样要求。

2.2、DGGE电泳时间长度的优化

选取的3个样品的巢氏PCR产物（以10F/1507R和BV34F/BV56GC的巢氏PCR产物为例）每隔2h加一次样，以确定最佳电泳时间。从图1可看出，电泳时间8～10h时，DGGE条带没有完全分离；而电泳时间14h时，条带整体过于偏下方，因此确定12h为最佳电泳时间。

2.3、最佳引物对筛选

选取5个样品，分别以引物对BV34F/BV56GC、引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增产物为样品，根据上述已优化的条件平行跑三块变性梯度凝胶，三块胶除引物不同，其他条件完全相同。染色照相以观察样品条带。从图2可知，以引物对BV34F/BV56GC的第二轮PCR扩增产物的DGGE条带数量多且亮，而以引物对BV67F/BV89GC和引物对BacGC-P2/BacGC-P3的第二轮PCR扩增产物条带数较少并且亮度不高。因此，选用10F/1507R和BV34F/BV56GC为组合进行巢氏PCR扩增和微生物多样性测定。

2.4、EB和硝酸银两种DGGE染色方法的比较

选取5个样品，以引物对10F/1507R和BV34F/56GC的巢氏PCR产物为上样模板，根据上述以优化的DGGE条件平行的跑两块变性梯度凝胶。电泳结束后，两块胶分别用EB和硝酸银染色。试验结果如图3所示， EB染色图谱清晰，且操作简单，染色条件要求不是太苛刻；硝酸银染色方法虽然灵敏性较高，但是操作复杂，每一步都要求非常精确。因此，选用EB对变性梯度凝胶染色。

3、讨论

PCR—DGGE技术能够直观的体现出一个环境样本的细菌群落组成和多样性，推测出优势 种群，并可实现对多个样品的快速同时分析，这是传统的研究方法所无法比拟的。尽管DGGE技术存在一定的缺陷，但因其重现性强、可靠性高，可同时分析多个样品，提供了群落中优势种群信息，弥补了传统方法在分析微生物群落结构方面的不足，已成为现代环境微生物生态学领域一种重要研究手段。

注：文中1～10表示不同的土样

参考文献：

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[2] KIRK J L，BEAUDETIE LA，HARTM，et a1.Methods of studying soil microbial diversity [J].Journal of Microbiological Method，2004，58：169—188.

[3] Amann R I，Ludwig W.Schleifer K H.Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation.Microbio1.Rev.1995，59（1）：143～169.

[4] Muyzer G，Wall E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis an alysis of polymerase chain reaction amplified genes encoding for 16S rRNA[J].Appl Environ Microbiol，1993，59（3）：695—700.

[5] Muyzer G.DGGE/TGGE a method for identifying genes from natural ecosystems[J].Curr Opin Microbiol，1999，2（3）：17—22.

[6] 刘恩科，赵秉强.长期施肥对土壤微生物量及土壤酶活性的影响[J].植物生态学报，2008，32（1）：176—182.

[7] 柳栋升，王海燕，杨慧芬，等.DGGE技术在废水生物脱氮系统中的应用研究进展[J].安徽农业科学， 2011，39（19）：11695—11697.

[8] 李苗云，周光宏，徐幸莲.应用PCR—DGGE研究冷却猪肉贮藏过程中的优势菌[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008年56（9）：185～189.

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基金项目：河南省烟草公司科技攻关项目（项目编号HYKJ200814）。

第2篇：微生物多样性分析方法范文

Abstract： Polymerase chain reaction and denaturing gel gradient electrophoresis method （hereafter abbreviated as PCR-DGGE） is getting a larger range of application. China has a slow start in this field but it is still gradually taken seriously and researched and applied by people. This paper analyzes the application and prospect of this in the field of environmental engineering.

关键词： 环境工程；DGGE技术；污水处理

Key words： environmental engineering；DGGE technique；sewage treatment

中图分类号：X32 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2014）03-0100-02

0 引言

基因工程是现代生物技术最为核心的内容，属于DNA的重新组合技术，也被称为遗传工程。该技术自问世以来已经在诸多领域被广泛研究和应用，这其中就涉及到环境工程。技术核心原理是一系列的DNA重组、拼接，实现该技术是在研究对象的细胞之外进行的。其目的是通过人为干涉来改变基因的组成。合理的使用该技术，能产生原有物质本身不具备的特性；产生新的物种；合成能力更加强大。基因工程技术已经在环境项目中得到较好的应用，取得了相应的成果。

1 DGGE实现的基本原理

DNA指纹技术就是变性梯度凝胶电泳技术。属于众多的多态性分析技术中的一种。研究对象的DNA使用具有化学变性剂梯度的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，所使用的凝胶能有针对性的解链PCR的扩增产物。由于DNA虽然长度相同，在碱基序列上却存在很大的差异。在DNA进行电泳时，双链的解链所需要的变性剂浓度不同。在相应的变性剂浓度下序列不同的DN段发生变性，产生其空间构型上的变化。双链DNA在开始的时候会以线状移向正极，当变性剂浓度逐渐增加后，G+C含量低含量的序列的部分会逐渐被打开，G+C高含量的部分仍然是双链状态。一旦DNA的双链解链后，其分子端部的叉状、中间的环形会发生部分熔化。此时，点用速度在聚丙烯酰胺凝胶中将会急速降低甚至停留在相对应的变性计对应的位置。经过染色之后以分开的条带形式呈现于凝胶之上。以上步骤可实现同长但有序列差异的DAN分子有效分开，形成变性的梯度主要用尿素和甲酰胺。

2 DGGE技术在环境工程领域中的应用

PCR-DGGE技术能有效的避开传统微生物技术的局限性。当DGGE技术进入环境工程的微生物生态领域之后，这种新生技术很快变为研究微生物群落结构最主要的技术手段之一。在活性污泥与生物膜等生物处理系统中，微生物具有多样性。在进行相关的检测、微生物鉴定以及种群演替研究的时候，DGGE技术已被广泛应用。

2.1 污水生物处理中的应用方法 污水微生物群在CR-DGGE技术改变下与既有技术有很大差异，在这个过程中研究人员有了新的认识。

污水中的好氧细菌群落结构和功能在温度升高时会发生很大变化。运用DGGE技术我们可以分析出，不同温度环境会存在不同的细菌群落。

在同等的工作环境下，使用PCR-DGGE技术，跟踪分使用低温菌、常温菌分别接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构，进行及时动态观察。在相同工艺条件下，对低温菌群与常温菌群进行相同的操作，结果是：产生的微生物群结构有很强的相似性。随着时间的推移，这两类菌群在结构上的相似度越来越强。

去除污水中的氨和氮主要使用硝化方法。在这种硝化作用过程中氨氧化细菌负责将氨氧成亚硝酸盐。这种实现亚硝化作用过程是硝化过程中重要的步骤。所使用的氨氧化细菌具有生长速度低、相对生物种群较少的特点。传统的细菌分离、培养、分析方法，会消耗工作人员大量的时间。采用PCR扩增16SrDNA、功能基因并且随机克隆测序等相关技术手段。在高浓度氨氮废水处理系统的不同时间，分析并且处理活性污泥样品、氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性。御用PCR-DGGE相结合的技术，针对样品将总细菌群进行差异性研究。实验证明，PCR-DGGE技术可以使我们更为深入、全面的了解氨氧化细菌的类群及其相关功能。

应用PCR-DGGE工艺对城市污水处理与完全混合的传统式处理工艺进行了相关的实验对比。在同一反应器的不同位置，微生物群的分布、不同工况下的微生物种群结构进行了相关的分析、研究。研究表明，这两种污水处理工艺中的微生物种群都具有很强的多样性，区别是：两者种群的结构差异巨大。

采用生物滴滤反应器与生物滤池处理相同的污水，然后采用PCR-DGGE研究不同反应器或反应器的不同位置中氨氧化细菌菌群的组成。种群对反应器的形式或者位置的差异没有任何依赖性，不会随这些因素变化而变化。

2.2 PCR-DGGE技术在废气生物处理中的应用 生物滤池与生物滤塔是处理臭味、异味行之有效的好办法，这种生物过滤技术可以对恶臭与挥发性油剂废气体很好的遏制，从而该技术能够很快的推广。

在除臭生物滤池中较强酸性与中性两种不同运行环境下，运用PCR-DGGE技术研究，可以发现：微生物种群的多样性与生物种群结构上发生的改变。利用扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，运用相关技术分析滤池内的种群变化。回收有研究意义的DN段，与PCR测序、T载体克隆测序有效的结合。最终确定众多种群中的优势菌群。微生物对强酸性环境有很大影响；中性条件下的微生物种群更为丰富。此外，滤池的层次上的差异，也导致了种群空间分布的差异性。实验证明，除臭过程中硫氧化细菌占有相对明显的优势。

影响生物滤塔处理效率以及反应器的稳定运行的主要因素是塔中的微生物种群的结构，以及微生物的多样性。我们可以采用DGGE技术，对处理含氨废气的生物滤塔中的微生物进行多样性研究。随时间的推移，对反应器不同填料、不同时期微生物多样性比对研究。证明：微生物的多样性与反应器运行时间的长短有直接关系，随着时间的不断延长其多样性会有所降低；将填料方法进行对比可知：如果是堆肥填料，其微生物多样性更为丰富，反应器也能达到很好的效果。

2.3 PCR-DGGE技术在污泥生物处理中的应用 污泥的稳定化在污泥处理过程中是一个相当重要的过程。在此过程当中，微生物的稳定对于整个污泥系统的稳定起到了至关重要的作用。专家们采用DGGE指纹图谱技术，研究污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化和种群的多样性。研究证明：生物法污泥堆肥时间不大于8d。采用DGGE指纹图谱与相似性系数Cs值对污泥堆肥各工艺环节样品进行相关分析，可以发现，反应时间的持续，导致了微生态结构的Cs值逐渐增高。这说明：微生物种群结构会逐渐趋于稳定状态。污泥微生态种群可以迅速进行选择，进而调整内部细菌种群数量和结构。

采用PCR-DGGE技术，可以科学、直观的研究出环境中细菌群落及多样性。我们需要避开DGGE技术的先天缺陷，这就需要我们的科研工作人员，在该领域继续加大研究力度，为环境工程做出更大贡献。

参考文献：

[1]王超，曾玉香.环境影响评价中公众参与的问题和对策探讨[J].环境科学与管理，2010.

第3篇：微生物多样性分析方法范文

关键词：环境工程；分子生物；微生物；应用

前言：作为集环境监测、环境工程、保护学以及微生物学于一体的学科，微生物学在不断发展中逐渐衍生出较多亟待解决的问题。尽管近年来有较多先进理念与技术被引入该学科中，但对于部分环境监测或环境净化等问题，所取得的效果并不理想，要求充分发挥分子生物技术的优势。因此，本文对环境工程微生物中分子微生物技术的应用分析，具有十分重要的意义。

1分子生物技术的相关概述

1.1测序技术

细胞中的rDNA本身表现出明显的高突序列、保守序列以及稳定特征，但其是分类微生物中的指标之一。通常测序分析中，为使微生物种群得以分析，对分离物或分类单元进行确定，便需借助rRNA分析方式。从该基因序列的类型看，有较多如16SrRNA、23SrRNA与5sRNA，其中后两者包含的含核苷酸分别过多与过少，很难为测序分析提供指导。所以在原核生物系统研究中，可考虑将16SrRNA引入。具体测定中，会在如TA克隆试剂、PGEM-T克隆试剂等载体应用下，克隆PCR产物，完成文库构建过程，在此基础上结合16SrRNA基因测序结果，可通过其与文库中的序列做好对比，判断是否有相对应或相似微生物种类。另外，也可对rDNA多样性利用电泳分离进行显示，或直接通过RFLP对扩增产物做好分析。通过这些测序方法的应用，对微生物系统发育的研究可起到重要作用[1]。

1.2核酸技术

核酸技术在分子生物技术中极为常见，可具体细化为PCR-SSCP、PCR-DGGE与PCR-RFLP等技术。以其中PCR-SSCP技术为例，其以往运用中多局限在基因突变方面，是临床医学中的常用方法，经过不断发展被引入到微生物生态学中。从其实现原理看，主要以单链DNA空间折叠构象为基础，若其中有碱基出现变化，空间构象会随之发生变化，配合聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用，使DNA谱带得以生成。以16SrRNA测序在废水生物中的表现为例，便可借助PCR-SSCP，对细菌群落受培养基变化的影响进行分析。再如PCR-DGGE，应用中一般强调将基因组DNA从环境样品内被提取，在此基础上将PCR扩增技术引入，可达到扩增DNA的目标，此时可将聚丙烯酰胺凝胶与扩增产物相结合，通过电泳作用分离双链DN段，最终生成的将为单链DNA谱带。最后便可对谱带中展现的碱基序列与文库内序列做好对比分析，完成微生物种属的界定。由于该技术具有较好的分离效果，操作较为简便，所以在微生物分析中的应用较为常见，如对微生物种群在活性污泥中的情况判断，将该技术引入，可起到良好的效果。另外，在PCR-RFLP技术方面，其主要借助核酸特异位点、DNA识别序列，对双链DNA进行切割，配合溴化乙锭凝胶的应用，无需通过放射性标记形式，便可达到DN段分析目标。如土壤中微生物的判断，便可借助该技术实现。

1.3基因探针

目前分子生物技术中，基因探针的引入主要借助荧光染料、放射性同位素，对样品内核酸进行识别分析。对于该技术，也表现在核酸印迹、荧光原位以及放射性标记探针等技术方面。其中放射性探针应用下，尽管对于寡核苷酸、RNA或单链DNA等都可进行标记，但其涉及的同位素具有较高的成本，很容易危害人体健康，所以使用中受到较大的限制。而对于荧光原位，应用中一般可做好细菌空间位置标识或定量定性判断细菌情况等工作。另外，在核酸印迹方面，其适用对象集中表现在PCR扩增产物方面，对微生物风度、多样性检测都可起到重要作用[2]。

2环境工程微生物领域中分子生物技术的应用分析

2.1微生物群种丰度与多样性的分析

现行环境工程领域中，通常需检测的对象多表现在底泥、土壤、生物膜以及污泥方面。从现行较多实践研究都可发现，若将16SrRNA从菌落中提取出来并开展测序工作，可对微生物种群在活性污泥中的情况被测定，并将聚光激光扫描、荧光显微以及FISH等技术引入，可定位生物膜中的微生物或检测其活性。再以城市地区垃圾填埋细菌的分析，可在ARDRA方法的运用下，使细菌多样性情况以及细菌结构被有效判断。这些都可充分说明微生物丰度、多样性都可在分子微生物技术应用下被有效判断，通过定量或定性检测得到的结果，能够为环境工程中较多工艺操作、构筑物设计提供参考。

2.2指示微生物与致病菌的有效检测

环境工程研究中，可发现在土壤、水体或空气等媒介作用下，致病菌很可能对人体造成较大威胁，如典型的SARS。对此，便可借助分子微生物完成致病菌测定工作，如部分学者将16SrRNA基因、PRC-DGGE技术共同引入，对垃圾场、污水处理厂以及大学校园中的空气环境进行测定，可发现在以往微生物培养下，很难测定气溶胶微生物情况。另外，对于水体内是否有大肠杆菌等DNA存在，也可借助分子微生物技术进行判断。这些都可充分说明，对于指示微生物、致病菌的检测，分子生物技术应用效果都较为明显。

2.3功能微生物的培养

由于当前化工行业发展步伐较快，其带来的过多有机化合物也成为环境工程领域面临的难题，很多有机化合物如含苯环类型，很难实现快速降解目标。对此问题，大多学者通过实验方式，发现分子生物技术应用下可使这种现状得以改变，如对甲苯质粒、降解萘利用DNA印迹杂交形式，可使这两种质粒微生物被判断。此外，对于其他难以降解的有机物，都可采用质粒如工程、基因重组等方式，使功能群被构建，使有机物难以被降解的问题得以解决[3]。

3结论

分子生物技术的应用是现行微生物研究的重要保障。实际引入该技术中，应正确认识分子生物技术的实现原理，包括测序技术、基因探针以及核酸技术等，在此基础上将其融入致病菌检测、功能微生物培养以及微生物多样性分析等方面，能够推动环境工程微生物学的进一步发展。

参考文献

[1]石琛,王璐.环境微生物领域分子生物技术的应用进展[J].中国科技信息,2013,16:135+139.

[2]张凤.在环境工程微生物领域中分子生物技术的应用[J].绿色科技,2013,08:192-194.

第4篇：微生物多样性分析方法范文

[论文摘要]：对细菌分类学研究的目的简单论述。对分类学研究中的多相分类方法包括经典分类，化学分类，分子分类，数值分类进行了详细的介绍，从而为临床和科研中细菌鉴定方法的选择应用提供参考依据。同时对分类学发展的研究趋势进行了简单的总结。

1.细菌分类学研究的目的

原核微生物系统分类是科学地研究微生物多样性及它们之间相互关系的基础学科[1]。细菌是原核微生物的重要成员，当前主要从两个方面进行细菌分类学的研究，一是为了实用的需要，建立各种细菌的信息库，从而更有效地开发利用细菌资源及有效地控制有害细菌。许多种细菌是微生物药物活性物质的重要来源。包括假单胞菌属(Pesudomonas)、微球菌属(Microcoeeus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Eneturbacetrium)和别单胞菌属(Atleromonas)等。早在1966年，Burkholder从含溴假单胞菌分离到抗生素硝吡咯菌素(Pyornlirtin)[2]。二是建立反映细菌进化关系的自然分类系统，以揭示各种细菌的本质特征和相互关系，丰富生物多样性研究的内容。

2.细菌分类学研究方法

多相分类法是目前广泛使用的细菌分类学方法。在方法学上主要包括以下几种。

2.1经典分类

经典分类主要指依据形态特征和生理生化特征等表观分类学指征进行分类学研究，是多相分类研究的基础。

2.2化学分类

化学分类是根据生物细胞中某些特定化学物质的特征对生物个体进行分类的方法，是细菌属划分的主要特征之一。目前常使用的化学指征包括以下几种。

2.2.1磷酸类脂分析

磷酸类脂与蛋白质、糖等共同构成细胞膜，对于物种运输、代谢及维持正常的渗透压都有重要作用。具有分类学意义的磷酸类脂是：PE、PC、PME、PG和GluNus等五种。

2.2.2脂肪酸组分分析

脂肪酸的链长、双键位置和数量及取代基团在细菌中具有分类学意义。脂肪酸定性分析结果限于属和属以上的分类；脂肪酸定量分析结果可为种和亚种分类提供有用的基本资料。

2.2.3全细胞蛋白电泳分析

高度标准化的SDS-PAGE是对大量密切相关菌株进行比较归类的有效方法，研究证明全细胞蛋白组分和DNA-DNA杂交有很好相关性[3]。此法用于种或种以下分类单位的研究。

2.3分子分类

分子分类是在分子水平上对生物个体的DNA、RNA和蛋白质进行研究分类的方法。目前经常使用的分子指征包括以下几种。

2.3.1G+Cmol％测定

G+Cmol％主要用于验证已建立的分类关系是否正确。通常认为：种内菌株间G+Cmol％相差不超过4％，属内菌株间相差不超过10％。

2.3.2DNA同源性分析

分析DNA同源性的有效手段是DNA-DNA杂交，适用于种水平的分类学。1987年，国际系统细菌学委员会规定，DNA同源性≥70％为细菌种的界限。DNA-DNA杂交常用的方法有液相复性速率法和固相膜杂交等。

2.3.3DNA为基础的分型方法

以DNA为基础的分型方法指可将种分为不同型的技术。其中早期的RFLP，缺点是图谱复杂，难于比较。选用专一识别6－8个碱基序列的限制性内切酶，DN段数量就大大减少的LFRFA被认为是目前分辨率最高的DNA分型法之一。但这样切出的DN段太大，只能用脉冲场凝胶电泳分开。RAPDA、ARDRA、AFLP等技术多用于种水平的研究。

rep-PCR所采用的分类信息来自于全基因组。该方法分辨率高、重现性好，在一定程度上与16SrRNA基因序列比较结果相一致，可作为一种快速鉴定的方法[4]。

2.3.4rRNA同源性分析

现在一般认为，rRNA是研究系统进化关系的最好材料。它广泛存在，功能稳定，由高度保守区和可变区组成。最初人们通过rRNA-DNA杂交和寡核苷酸编目法间接研究rRNA的同源性。DNA-rRNA杂交反映的是属与属以上水平的信息[5]。

研究rRNA同源性最直接可靠的方法是rRNA核苷酸序列分析。目前，以16SrRNA序列分析的应用最为广泛。

2.3.5特异引物PCR

16SrRNA特异引物的设计是建立在大量序列分析基础之上的。若能设计出一系列特异引物，如属特异引物，则菌种筛选过程将大为简化。种特异的引物主要用于鉴定，结合属特异引物联合应用则可能发现新种。

3.细菌分类学发展的研究趋势

今后细菌分类学的发展将集中于以下几个方面：

(1)分析方法的标准化

有研究表明，细菌的脂肪酸、磷脂与醌类组成及含量随着培养条件的变化而不同[71]。所以化学分类必须建立标准化的方法，这样定量才有意义，更准确，更具可比性。

(2)多相分类方法的广泛应用及分子分类法的发展

由于各种分子生物学技术方法在分类学中的应用，细菌分类学家的研究重点已不仅是对某个分类单元的分类鉴定，而是通过分子分类的方法把分类与进化紧密的结合起来。在未来几年内16SrDNA/rRNA作为重要的系统发育分子仍将发挥主导作用，但是其它保守分子将更多的用于系统发育研究，如RNA聚合酶P,HSP60基因，延伸因子Tu,23SrDNA/rRNA,rDNA转录间隔区等。

(3)“在线分类”的发展

现代细菌分类研究越来越依赖于Internet，我们不仅需要大量的分子生物学和系统发育分析软件，更离不开网上丰富的信息资源。因此，Oren和Stackebrandt于2002年提出了原核生物“在线分类”(onlinetaxonomy)的概念[6]。

(4)分类学研究与细菌资源研究结合

很多科研单位己注意到将系统分类与细菌资源的开发研究相结合，例如日本的北理研究所、理化研研究所、明治制药等。

参考文献

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第5篇：微生物多样性分析方法范文

关键词: 香蕉；内生细菌；DGGE；群落结构；多样性

中图分类号：S668．1 文献标志码：A 文章编号：1009－9980（2012）02－0235－06

Analysis of entophytic bacteria community structure in banana by PCR-DGGE technique

LIU Fei-fei，LI Chi*，LIU Yong-qin，YU Li

（College of Agriculture， Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088 China）

Abstract: The total genomic DNA was extracted from various tissues of both the healthy bananas and the ones which were infected with Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC）. Then the 16Sr DNA V3 fragment polymerase chain reaction products amplified from the total genomic DNA were analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）. The results of sequence analysis of the 18 DGGE dominant bands showed that the population abundance of endophytic bacteria contained in the healthy banana plants and the infected plants was different. The most abundant population was found in roots ，the middle in the bulb tissue and the least in leaves; The abundance of endophytic bacteria increased after infection with FOC; And most of the sequences were phylogenetically close to Cyanobacteria， Chloroflexi， Actinobacteria， Proteobacterium， Bacteroidetes， Firmicutes and Chlorobi； But the homology for one of the sequences was only 91%. It may represent a new taxon.

Key words： Banana； Entophytic bacteria； Denaturing gradient gel electrophoresis （DGGE）； Community structure； Diversity

植物内生细菌是一类在健康植物栖居，对植物无害并与植物建立和谐关系，广泛存在于植物根、茎、叶、花、果实和种子等器官中的微生物群落[1]。植物内生细菌具有宿主特异性，同一宿主植物的不同器官、生育期及宿主所处的环境条件的不同，其内生细菌群落结构也不同[2]。目前，内生细菌的研究主要集中在内生细菌的分离鉴定、植物病害的生物防治、对宿主植物的促生作用以及内生细菌种群多样性研究等领域[3-5]。在研究方法上以传统的分离培养方法为主，但是由于培养条件的限制，可培养细菌种群数量仅占细菌总数0.1%~10%，90%以上的微生物不能进行人工培养[6]。所以，分离培养技术不能全面、准确反映微生物种群多样性概况。PCR-DGGE技术是近几年发展起来的一种技术，在分析微生物群落结构和多样性的研究中具有检测极限低，分离快速、简便、重复性好和同时分析多个样品的优点。目前PCR-DGGE技术在湿地[7]、污水[8]、海洋[9]等领域微生物多样性的研究应用比较广泛，在植物内生微生物多样性的研究中也有应用[10]。

在香蕉内生细菌多样性的研究中，国内付业勤等[11]对健康香蕉植株可培养细菌进行了研究，明确了可培养细菌在香蕉植株不同器官中的数量分布，不动杆菌属（Acinetobacter）等9种内生细菌对香蕉枯萎病菌有抑制作用。潘羡心用16S rDNA序列分析法证明了香蕉根部具有丰富的内生细菌[12]。我们采用非培养方法，利用PCR-DGGE分子生物学技术，研究香蕉内生细菌群落多样性，揭示香蕉不同器官健株与病株组织内生细菌群落结构的差异，对了解香蕉和开发新的微生物资源具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 材料

供试菌种: 2009年从湛江硇洲岛采集香蕉枯萎病害标本，经过分离、鉴定，获得的纯化菌株Fusarium oxysporum f. sp. cubense （FOC），菌株编号HMGDOU40928，保存在广东海洋大学植保科技中心。

供试香蕉苗: 香蕉苗株高30~40 cm，5~6片叶子，品种为巴西蕉。

1.2 主要试剂

DNA marker、DNA Taq 聚合酶、DNA纯化试剂盒、pMD18-T载体试剂盒、大肠杆菌DH5感受态细胞，购自TAKARA；PCR引物338F-GC、518R、338F、M13-47和M13-48，由上海生工生物技术有限公司合成。

1.3 香蕉苗接种及表面消毒

香蕉苗进行伤根接种[13]，孢子浓度为106 cfu・mL-1，每个处理香蕉苗30株，以无菌水为空白对照。各处理的香蕉苗，置室温常规盆栽。40 d后的香蕉苗根茎叶各组织进行表面消毒处理[14]，同时将最后一次冲洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培养72 h，检测表面灭菌效果，然后用于提取植株组织总DNA。

1.4 组织总DNA提取与纯化

参照沈洪等[15]改良的CTAB法提取香蕉根部、假茎、叶片的总DNA。总DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，以Hind III DNA Marker做分子质量DNA，用Gel Red染色后在紫外凝胶成像系统（美国Bio-Rad GelDoc XR+）中观察，拍照。

1.5 16S r DNA V3区PCR的扩增

以降落式PCR[16]扩增细菌16S rDNA的V3区片段。选择细菌的16S rDNA的V3区通用引物338F-GC（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG GCGGGG GCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’） 和518R（5’-ATTACCGCGGCTG CTGG-3’），提取得到的总DNA适当稀释后做模板进行PCR。PCR体系: 10×PCR buffer 5 μL，dNTP 4 μL（2.5 mmol・L-1），引物各1 μL（10 μmol・L-1），模板DNA 2 μL，Taq酶 0.5 μL（5 U・μL-1），加双蒸水至50 μL。PCR反应条件: 94 ℃变性10 min，94 ℃变性1 min，65 ℃（-1 ℃/循环）退火1 min，72 ℃延伸2 min，共10个循环，然后94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共20个循环，最后再72 ℃下延伸10 min。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行检测，后用于DGGE分析。

1.6 各组织的DGGE电泳及图谱分析

DGGE（南京，DGGE-1102）条件为: 聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，电泳缓冲液为1×TAE，设置凝胶变性梯度为45%~70%[17]，每孔上样量为20 μL PCR产物与8 μL 10×加样缓冲液。电泳温度为60 ℃，A段电泳电压60V，45 min，B段电泳电压120V，10 h。银染后拍照分析。

所得的DGGE图谱用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0软件处理，对各个组织样品条带进行分析。根据各个样品在DGGE图谱中的显示，对其相似性进行聚类分析，来比较各样品中的细菌落结构和多样性。

1.7 DGGE条带克隆测序及系统发育树的分析

将优势条带进行切胶回收，4 ℃无菌水中浸泡过夜。以上清液为模板，引物338F（不带GC夹子）和518R进行16S rDNA V3区的PCR扩增，扩增产物用纯化试剂盒进行纯化。纯化后的产物与pMD18-T载体16 ℃连接3 h，再用热激法转化进大肠杆菌 DH5感受态细胞。在含有X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB培养基上，37 ℃过夜培养，筛选出具有氨苄青霉素抗性的白色菌落转化子。利用载体通用引物M13-47（5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’）和M13-48（5’-AGCGG ATAACAA TTTCACACAGGA-3’）进行菌落PCR检测，筛选出阳性菌落后，进行摇菌培养，送到上海博尚生物技术有限公司测序。

序列通过分析比对后去掉载体序列提交到Gen Bank进行blast比对。选出同源性最高的序列作为参照菌株，用软件Clustal X比对后，用MEGA 5软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 样品总DNA的提取和16Sr DNA V3区的扩增

采用改良后的CTAB方法提取香蕉组织样品的总DNA，具有较为完整的细菌基因组DNA。且最后一次淋洗水150 μL涂于LB平板上，28 ℃培养72 h，无菌落生长。选择细菌的16S rDNA的V3区通用引物338F-GC和518R对纯化后的各样品的总DNA进行PCR扩增，所得到的DN段均为单一条带（图1），片段大小约为180 bp，说明扩增产物无明显的非特异性扩增现象。

2.2 DGGE的图谱及分析

对香蕉植株在感染FOC前后各组织内生细菌的种群多样性的DGGE图谱（图2-I）采用Bio-Rad QUANTITY ONE 4.3.0软件进行分析，结果见图2-II。

从DGGE电泳图谱中可以看出植株各组织中内生细菌种类丰富，且差异性较大。健株的根、茎、叶组织中至少存在22、20和15种不同的内生细菌，病株中至少存在30、27、24种，且感病植株内生菌种类明显比健康植株丰富。1号、2号等条带较亮，代表健康植株和发病植株中均存在的优势菌种。5号为病株根部特有条带，9号、11号、13号为病株假茎特有条带，17号为病株叶片特有条带（图2-I）。

不同组织样品间条带的异同，反映了组织之间细菌群落的相似性和差异性。表1列出了各样品之间内生细菌相似性结果: 各样品间的细菌群落相似性系数各不相同；同一植株不同组织相似性系数差异性显著，根、茎、叶内生细菌群落相似性系数都依次降低，健株分别为66.9%、55.0%、43.6%，病株为70.3%、58.0%、46.2%。健株和病株的同类组织的相似性系数较高，根、茎、叶组织内生菌相似性系数分别为75.5%、78.9%、72.0%。

2.3 优势条带的系统发育分析

将DGGE图谱上比较亮的18个条带进行回收、克隆、测序，所得序列大小为180 bp左右。通过用BLAST与GenBank数据库序列比对分析，17个条带所测序列与数据库中序列相似性在94%~100%（表2），分别归属于蓝细菌门（Cyanobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、放线菌门（Actinobacteria）、变形杆菌门（Proteobacterium）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和绿菌门（Chlorobi） 7大类；另外，4号条带序列与GenBank登陆号为GQ243083的Proteobacterium关系最为密切，相似率只有91%，推测香蕉内生细菌群落中可能存在新的种群。

从系统发育树可见，7个序列归属于蓝细菌门Cyanobacterium，占所测序列的38.9%，相似性在98%~100%。7号条带为拟杆菌门的新鞘氨醇杆菌属Novosphingobium sp.，是18个阳性克隆中唯一的可培养细菌。绝大多数为不可培养细菌，占94.4%。由图2-I分析出，1号和2号比较亮的条带分别与放线菌属（Actinomyces sp.）、绿弯菌门（Chloroflexi）同源性较高，2者是健康与发病的香蕉植株都存在的优势菌群。

3 讨 论

在研究植物内生细菌时，为避免表面其他微生物的污染，减少腐生细菌DNA残留问题[15]，应对材料进行严格的表面消毒，尽量取植物的内部组织进行总DNA的提取，同时将最后一次冲洗水进行涂平板检测表面消毒效果，直到培养至无菌落出现为止，这样才能保证DGGE电泳产生的条带能反应出组织内生细菌种群的多样性。

内生细菌在香蕉根、假茎、叶片中的菌落丰富度和种群数量存在差异。各组织中细菌丰富度为根部>假茎>叶片，呈递减趋势，根部内生细菌数量最丰富，与罗明等[18]文献研究结果一致。这可能与土壤中栖息着丰富的细菌种类并可以进入香蕉根部有关。从DGGE电泳图谱中可以看到感病植株组织内生菌种类比健康植株丰富，与王爱华等[19]研究结果一致，可能与植株感病后的自身抵抗力降低，细菌容易侵入有关。同一植株根、假茎和叶片内生细菌群落相似性系数依次降低，推测大部分内生细菌群落是由根向茎再向叶扩展分布的，也就是说内生细菌可能是种苗携带或者通过根部侵入。

研究表明细菌数量超过群落细菌数量1%才可以通过PCR-DGGE检测出来[20]，因此系统中的弱势菌群有可能被漏检，所以香蕉植株具有丰富的内生细菌资源并可能存在未被认知的新物种。对18条带进行切胶回收并克隆测序，分别属于7个细菌类群，其中变形杆菌门（ Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）类群与胀果甘草内生细菌的菌群比较相似[21]。放线菌是一类重要的生防菌类群，曹理想等[22]用传统分离方法研究香蕉内生放线菌和真菌多样性，共分离156株内生放线菌，优势菌株与本研究结果不同，本研究所测序得到的放线菌类中是否存在香蕉枯萎病菌的拮抗放线菌，仍需深入研究。绿弯菌门（Chloroflexi）等几个类群均为不可培养细菌[23]，香蕉内生细菌研究中还未见报道。在所得香蕉植株内生细菌中，蓝细菌门Cyanobacteriu的有关菌占35%，为优势菌群。研究中发现香蕉植株发病后所出现的特征条带，分别为5、9、11、13和17号带，这些特有条带80%为蓝细菌门（Cyanobacteri）的细菌。有报道称蓝细菌与苏铁[24]、小叶满江红[25]等低等植物形成共生固氮体系，蓝细菌与香蕉的相互关系还未见报告。蓝细菌门（Cyanobacteri）、变形杆菌门（ Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、绿菌门等不可培养内生细菌的作用及与寄主植物之间的相互关系，还有待进一步研究。

PCR-DGGE方法研究植物内生细菌多样性，初步揭示香蕉植株感染枯萎病菌前后的内生细菌的种类以及不同组织种类的变化情况。这种PCR-DGGE的方法可用于确定不能进行纯培养的内生细菌的种类，与以往分离培养直接形态观察的方法相比，扩大了人们对内生细菌的研究视野，丰富了内生细菌资源，可以提供更多的内生细菌种群信息。DGGE的方法有助于深入了解病原菌与内生细菌之间在寄主植物中相互作用的关系，从而为植物病害的防治提供新的思路。

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第6篇：微生物多样性分析方法范文

2002年召开的《生物多样性公约》第六次缔约方大会上通过的VI/7A号决定，要求各缔约方制定关于把与生物多样性相关问题纳入环境影响评估及战略环境评估立法或进程的准则[1]。2006年召开的《生物多样性公约》第八次缔约方大会上通过了“关于涵盖生物多样性各个方面的影响评估的自愿性准则”的第VIII/28号决定[2]。我国是最早签署《生物多样性公约》的国家之一，政府积极采取措施履行公约规定的义务。2003年9月1日起施行《中华人民共和国环境影响评价法》（以下简称《环评法》），首次提出对规划进行环境影响评价。要求“国务院有关部门、设区的市级以上地方人民政府及其有关部门，对其组织编制的土地利用的有关规划，区域、流域、海域的建设、开发利用规划，应当在规划编制过程中组织进行环境影响评价，编写该规划有关环境影响的篇章或者说明”；“对工业、农业、畜牧业、林业、能源、水利、交通、城市建设、旅游、自然资源开发的有关专项规划，应当在该专项规划草案上报审批前，组织进行环境影响评价，并向审批该专项规划的机关提出环境影响报告书”。这就意味着国家正式把针对规划的战略环境评价放在了重要位置[3]。2009年10月1日起施行的《规划环境影响评价条例》（以下简称《条例》），是在《环评法》的法律框架下，从规范管理的角度出发，对法律不明确之处予以明确，对法律的原则规定予以细化，通过进一步完善规划环评程序，明确实施主体，落实相关方的法律责任、权力和义务。《条例》的出台，表明国家对规划环境影响评价的执法力度将进一步加强[4]。其中直接归属农业部门的有农业、畜牧业专项规划，涉农的有土地、区域、流域、海域等有关规划。2010年9月环保部发文“中国生物多样性保护战略与行动计划（2011—2030年）”，在条目五“生物多样性保护优先领域与行动”中设立优先领域二“将生物多样性保护纳入部门和区域规划，促进持续利用”，要求“开展生物多样性影响评价试点”[5]。我国是生物多样性大国，生物多样性居世界第八位。我国又是世界上人口最多、约85%左右的人口在农村的农业大国，对生物多样性具有很强的依赖性。农业部门制定的农业规划以及其他部门制定的涉农规划，绝大部分是在农区实施的。农区是由原本丰富多样的生物地理就界开发而来，农区边际土地仍然是生物多样性相对富集的区域，农区生物多样性也是国家生物多样性的重要组成部分。开展农业规划环评生物多样性影响评价是农区生物多样性保护与管理的基础，也是环评不可缺少的内容。

2生物多样性影响评价基本内涵与主要内容

2.1基本内涵

生物多样性保护是生态和环境保护的核心内容之一，而环境影响评价是从源头保护生物多样性的重要途径。农业规划环评中生物多样性影响评价的基本内涵就是：农业规划实施对规划区域的遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性和景观多样性可能带来的影响进行分析、预测与评估，提出避免、预防或减轻不良影响的对策和措施，建立监测机制并跟踪评价，持续改进达到保护目的。

2.2主要内容

农业规划生物多样性影响评价的主要内容有4方面：

（1）分析预测规划实施可能会影响到实施区域生物多样性的哪些方面。关于生物多样性影响评价的分析尺度，目前比较公认的是遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性。随着景观生态学的发展，将景观生物多样性纳入生物多样性保护的层次；

（2）对影响可能造成的后果加以评价包括短期影响、长期影响、直接影响、间接影响、累积影响等，影响是否有利，是否可恢复等。

（3）针对生物多样性各层次的影响，需要采取哪些预防和保护措施；

（4）建立长期监测生物多样性的机制，跟踪和预测生物多样性的变化趋势。

3农业规划环境影响评价中生物多样性影响评价基本程序

根据农业规划环评中生物多样性影响评价的基本内涵，其基本程序包括规划分析、现状调查与分析、影响要素识别、影响预测与评价、预防和保护措施、监测与跟踪评价等。

3.1规划分析

规划分析首先是规划的协调性分析，规划协调性分析可以帮助了解规划政策背景[6]，分析规划与相关政策法规的一致性、与产业政策的符合性、与国家及地方有关规划的符合性，同时避免不同部门、不同层次间规划缺少衔接以及冲突[7]。包括外部协调性分析和内部协调性分析。外部协调性主要是分析规划目标的合理性与限制性，内部协调性是分析规划界定的主要内容之间是否存在冲突等。其次是分析规划的有关内容，包括规划的编制背景、规划的目标、规划的对象、规划的具体内容、实施方案、实施范围、实施期限等。第三是分析规划的不确定性[8]。各级政府和部门编制的规划其协调与衔接状况对规划的实施具有不确定性、规划本身的远期不确定性、规划的具体项目的不确定性、污染物排放量的不确定性等。

3.2现状调查与分析

根据生物多样性的层次及保护需要，调查农业规划实施区域生物多样性历史演替过程和现状。重点调查分析以下区域的生物多样性：（1）具有生态学意义的保护目标；（2）具有美学意义的保护目标；（3）具有科学文化意义的保护目标；（4）具有经济价值的保护目标；（5）重要生态功能区和具有社会安全意义的保护目标；（6）生态脆弱区；（7）人类建立的各种具有生态环境保护意义的对象等[9]。

3.3影响识别、预测与评估

生物多样性影响识别是在分析农业规划目标及总体方案的基础上，通过一定方法找出农业规划所确定的某个项目或活动对生物多样性影响的各种变化指标，说明生物多样性影响的性质、程度及可能的影响范围。影响识别主要包括以下3方面：（1）影响主体识别。识别农业规划的目标、指标和总体方案及其执行主体，主要是可能给生物多样性带来影响的农业规划活动等具体的规划实施内容以及这些规划实施内容具体的执行主体。（2）影响受体识别。识别规划区域内主要的生物多样性资源：包括遗传多样性与重要农业种质资源、物种与生境多样性、生态系统多样性，如自然保护区、风景名胜区、湿地、农田、水土流失重点治理区等的组成结构、面积和分布等；景观多样性，包括景观类型多样性、斑块多样性、景观异质性和稳定性等。特别应了解该区域农业生产活动的历史与现状、是否产生过或者现在仍然存在一些严重的生态问题，因为这些生态问题往往与生物多样性直接相关。（3）影响效应识别。识别主体（农业规划）与受体（生物多样性）的相互关系，确定农业规划对生物多样性的显著影响及关键影响因子。对生物多样性影响的强度，关注影响发生的背景。影响强度包括影响范围、影响过程和影响性质（包括有利/不利、可逆/不可逆）；影响发生的背景包括产生地点、影响时间以及受影响者的具体情况。在上述影响识别的基础上，结合规划的总体目标及在不同的阶段或期限予以实施的情况，预测规划实施的不同阶段或期限可能造成的生物多样性影响并进行评估。

3.4预防措施与保护方案

由于农业规划实施范围较大，具有宏观性，规划环境影响评价的生物多样性保护也需从大的范围和宏观上进行把握。制定具体的预防措施和保护方案，应依次按照预防措施、最小化措施、减量化措施、修复补救措施、重建措施序列原则进行[9]。物种及其生境（栖息地）是各层次生物多样性表现形式和基础，对于重要物种的保护要以就地保护为主，迁地保护为辅。物种与其生境具有不可分割的联系，保护原生境及其里面的生物资源是保护生物多样性及其资源永存的最符合自然规律的手段，也是“生态系统方法”的基本原理之一。迁地保护措施也很重要，但它是在原生境遭到严重破坏和就地保护已经不可靠的情况下的辅助手段。

3.5监测与跟踪评价

由于生物多样性影响的表现具有滞后性特点，应建立长期监测机制，对生物多样性保护目标动态变化进行跟踪监测，分析生物多样性变化的趋势，预防可能产生不良影响的因素，及时调整保护措施，确保生物多样性保护的有效性。

4农区生物多样性影响评价层次及特点

农业是一种直接利用生物多样性的产业，包括直接利用生物多样性的资源材料以及模拟生态系统的初级生产（植物种植业）和次级生产（动物养殖业）等全部生产过程；而且还包括进一步利用生态系统中的有机物腐解过程使之转化为农业经济作物（食用菌养殖、微生物造肥、生产沼气等）。考虑到农业规划主要是在农区实施，这里的农区不是仅局限于种植业区域的“小农区”，是包括农牧渔业生产活动范围的“大农区”，因此，就农区和农业而言，生物多样性可分为农区遗传多样性、农区物种及生境多样性、农区生态系统多样性、农区景观多样性、农业产业结构多样性几个尺度水平[10-11]。

4.1农区遗传多样性影响评价特点

遗传多样性是生物多样性的基本组成部分，是物种多样性和生态系统多样性的基础。它通常被认为是种内不同群体之间和一个群体内不同个体之间的遗传变异总和。遗传多样性是以物种为载体表现的，可以从形态特征、生理特征、细胞学特征、基因位点及DNA序列等不同方面来体现。农区遗传多样性影响评价应主要关注：

（1）农业活动使得生境破碎、消失引起物种种群缩小、消失导致遗传多样性丧失；

（2）外来物种入侵排挤当地种，使得遗传多样性丧失；

（3）农业新品种发展项目，对遗传多样性产生的影响；

（4）转基因作物可能引起的遗传多样性的变化及丧失[12]。由于受科学研究的限制，在现实中只对少量的物种进行过比较全面的遗传多样性研究，在遗传多样性层次评估生物多样性影响目前还不具有普遍意义。在环评工作中，建议把遗传多样性影响评价的内容与物种多样性、生态多样性影响评价融合在一起描述，更易于操作。

4.2农区物种及生境多样性影响评价特点

在我国几千年的农业栽培和养殖实践过程中，培育了大量食用与经济性能优良的作物、果树、家禽、家畜。我国栽培作物种和亚种有600多个，其中已知约237种为我国自古以来的土生栽培种，位居世界前列，被认为是世界三大农业起源中心之一。其中粮食作物30多种，蔬菜200多种，牧草与饲料作物约400多种。果树约300种，茶品种600多个，桑有15个种，共1000多个品种。家养动物品种和类群包括特种经济动物和家养昆虫在内，品种和类群有2000多个。除了农业经济物种外，在农田、湖泊与河流等湿地生态系统及荒山草坡生态系统中还有大量野生动植物物种和类群。稻田中野生动物主要以两栖类、爬行类动物和某些鸟类为主；重要杂草约有200多种。旱地生态系统中也生长着丰富的农作物伴生物种，如有记录的农田杂草有73科、560多种，对农作物有害的动物与昆虫约1300多种，天敌生物近2000种，其中仅棉田的重要天敌蜘蛛就有21科、89属、205种[11]。这些构成了我国农区物种及生境多样性。在环评实际工作中，对农业规划实施区域内的物种及生境的全部评价是不现实的，也不符合农业规划环评宏观性的特点。在满足农区生物多样性保护要求下，物种及生境多样性影响评价应针对区域关键物种及生境进行重点评价。

（1）保护物种。被国际、国家、地方、部门或保护组织明确列入保护名录的物种。主要评价保护物种分布状态、种群结构及现存数量、保护级别、濒危程度、生境特点、对环境的敏感程度、农业规划实施对保护物种的影响程度、就地保护和迁地保。护实施的可行性等；

（2）地方特有种。其分布范围狭窄、生境条件苛刻，当分布的区域环境改变，有可能造成这些物种灭绝。主要评价特有种的特有性（国际特有、国家特有、地方特有、区域特有）、濒危程度、生境特殊性、受影响程度、就地保护和迁地保护实施的难易程度等；

（3）重要的农业种质资源。是我国农业生产活动的基础，关注其受保护的状态，受影响程度，入库保存情况；

（4）栽培和家养生物的野生近缘种和野生类型。起源于我国的栽培作物不仅种类多，而且具有野生近缘种的也多，它们是农业生物多样性的宝贵遗传资源；家养生物的野生型是潜在进行品种改良的重要遗传资源。这些遗传资源的价值难以估量，在评价中应重点确认这些物种的存在、数量、生境条件、濒危程度、受影响和潜在影响程度、保护措施等；

（5）其他物种，规划实施区域受到较多关注的物种，具有文化及文物特点的物种等。

4.3农区生态系统多样性影响评价特点

我国农区生态系统按其基本类型可以分为6类：农田（水田与旱地）生态系统、种植园（水果、干果、蔬菜、茶叶、桑、药材、花卉和其他特殊经济作物）生态系统、草原与草地生态系统、水产水域生态系统（陆地水域和海洋水域，与湿地生态系统基本类同）、集约化养殖场系统和农区边际土地生态系统[11]。农业规划实施不确定性的特征，在对农区生态系统多样性影响的质（影响性质、影响类型、影响因素）和量（影响程度、时空规律、发生概率）上有更多不确定性。农区生态系统多样性影响评价主要是：

（1）生态系统类型结构和功能完整性；

（2）生态系统的脆弱性和整体变化趋势；

（3）生态系统的服务功能及生态承载力；

（4）农业规划实施可能的影响方式、范围、强度和持续时间；

（5）受影响强度、范围和持续时间，影响的结果是否有利、是否可逆；

（6）生态系统抗干扰的能力、恢复能力和生态系统的功能维系；

（7）预防与保护措施实施的可行性。

4.4农区景观多样性影响评价特点

景观多样性是继遗传多样性、物种多样性、生态系统多样性被提出的生物多样性研究的第四个主要层次。这4个层次之间的关系依次为遗传多样性产生了物种的多样性，物种多样性与生境多样性构成了生态系统的多样性，多样性的生态系统聚合并相互作用又构成了景观的多样性。农区景观范围多指大农业或是整个农业区域，因此对具有战略定位的农业规划进行景观多样性影响评价是非常重要的。农业规划实施对农区景观多样性影响，主要关注（1）对景观类型多样性影响，景观类型的分布面积和空间结构等发生明显变化、影响强度、指标物种濒危程度、变化是否可恢复；（2）对景观斑块多样性影响，镶嵌地块间生境的异质性、连通性是影响生物多样性的重要因素。农区残存的非农作性生境，包括农田边际土地、岛状野生生境、灌木带、林地、水塘、沟渠、荒地和休耕地等受影响的程度，这些生境破碎化程度，影响强度是否可逆；（3）对景观格局多样性影响，地块内物种的异质性和共生性影响物种多样性丰富程度。农业活动方式变化、人为干扰强度、外源性物质流入（农用化学品等）、外源性遗传物质入侵（转基因种植、外来物种入侵等）的影响。

4.5农业产业结构多样性评价特点

农业产业结构多样性用以描述包括农、林、牧、副、渔各业的组成比例与结构变化，它反映着某一区域农业生产的总体状况，这也是农业规划中重要的篇章。应重点分析农业规划实施区域规划实施前后，农、林、牧、副、渔各业的组成比例与结构可能产生的变化，这一变化对当地生物多样性可能产生的影响，分析影响的范围、强度持续时间、是否有利、是否可逆等，重点评估当地生物多样性变化可能带来的经济价值变化。

第7篇：微生物多样性分析方法范文

关键词 退化喀斯特森林；喀斯特生态退化；生态恢复

中图分类号 S718.55+1.1 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）02-0172-03

Abstract Karst forest refers to the forest climate background，the development of Karst landform on a fragile special forest ecosystem.The unreasonable development and utilization of human has led to a large area of Karst forest degradation.The paper introduced the definition of forest ecosystem degradation in Karst，Karst forest ecosystem degradation factors，restoration principles and theories，the recovery process，the recovery assessment and recovery technology were reviewed.

Key words degraded Karst forest；Karst ecological degradation；ecological restoration

我国分布有大量喀斯特（约3.443亿km2），其中型喀斯特面积90.7万km2，主要分布于贵州、 广西、云南等西南地区。在南方喀斯特山地典型脆弱区中，贵州喀斯特面积最多，占全省土地面积的 73.8%[1-4]。随着人口增加，资源开发，经济发展，以及人类的不合理开发利用，喀斯特森林大面积退化，甚至形成“石漠化”，严重威胁农业生产环境乃至人类生存。由于生态环境问题对人类生存和社会的发展构成了严重的威胁，已经引起了当前国际社会上对生态环境安全越来越多的讨论[5-6]。喀斯特生态系统退化被学术界定为世界上主要的生态环境脆弱地区之一[7]。因此，对生态退化的研究，已经成为各国政府和学者共同的关注，退化喀斯特森林的恢复与重建具有重要的理论意义和实现意义[8-10]。

1 喀斯特森林研究概况

国外对喀斯特森林的研究始于1973年 Le Grand在美国《科学》杂志上发表了关于喀斯特地区的森林退化及水文行为对喀斯特地区造成独特的生态问题[11]。我国对森林生态系统恢复的研究，起步较早，研究的深度较广。从1959年开始，研究人员在广东沿海侵蚀地上开展了热带、亚热带退化生态系统恢复与重建[12-13]。相对于常绿阔叶林的研究而言，对我国退化喀斯特群落的研究较少，20世纪 40 年代郭魁士等开始对我国南方退化喀斯特群落进行研究[14]。80年代朱守谦在荔波茂兰地区开展了喀斯特森林群落物种多样性的初步研究，进入20世纪90年代，贵州大学、南京林业大学、贵州师范大学、中科院华南植物研究所相继开展了对喀斯特森林生态系统的研究，其研究的焦点主要为喀斯特森林种群结构及种群动态特征[15-17]、喀斯特森林的生境特征、对顶级群落特点的论述、喀斯特森林生物量、植被的多样性、变化格局及分布格局，开展了对森林树种的组成生长特点的研究以及讨论了PV技术在树木水分生态中的应用[18-24]。同时，吴兴亮等对喀斯特森林真菌的种类组成及其生态分布作了研究[25]；张邦琨、龙翠玲等开展了对喀斯特森林土壤温度及小气候特征的研究[26-28]。喻理飞等将茂兰地区演替系列各群落中所有的种划分为5个适应等级种组，并提出以适应等级种组为相似元，种组重要值为属性，顶极适应值为权重进行相似性分析，进行了退化喀斯特群落自然恢复过程的研究[29]。进入21世纪，张忠华等、俞国松等对喀斯特森林土壤养分的空间异质性、其群落的种间分离特征进行了研究[30-31]；中科院华南植物研究所研究了地形和土壤因素对植物群落的分布影响，及通过长途基因传播空间遗传结构的推断对中国西南喀斯特森林濒危树种进行了研究[32-33]。同时期还有学者对喀斯特森林土壤微生物活性及土壤种子库进行了研究[34-39]。最近几年有学者就退化喀斯特森林自然恢复过程中的土壤进行了一系列的研究，其研究的焦点为喀斯特森林植被自然恢复过程中壤可矿化碳库特征、土壤微生物数量、土壤肥力、土壤抗蚀性、物种多样性的变化及恢复过程中的土壤生化作用及土壤有机碳库特征[40-46]。学者喻理飞等提出了退化喀斯特森林自然恢复途径并对自然恢复过程群落动态研究进行了评价[47-48]。

2 引起喀斯特森林生态系统退化因素

退化森林生态系统的实质是森林生态系统的原有结构被破坏并失去固有的平衡[49]，喀斯特森林生态系统退化受到以下因素的影响。

2.1 水分因素

喀斯特石漠化属于喀斯特地区极严重的生态问题，喀斯特森林生境中普遍存在不同程度的水分亏缺。王家文等通过对不同的土壤表层含水量数据统计分析的结果表明：干旱成为限制喀斯特森林植物生长的主要原因之一[50]。生境干旱是退化喀斯特森林的最显著特点，对水分亏缺的适应是喀斯特树种生存的前提[51]。喀斯特地区土层浅薄，蓄水保水能力差，极易形成季节性干旱[52]。

2.2 土壤养分和微生物

土壤是一定条件的水热和生物作用下，成土母质经过物理、化学、生物过程形成的产物[53]。在不同气候、地形、植被、人为干扰等许多自然、人为因素影响下，土壤理化性质呈现缀块性以及梯度格局[54-55]。土壤的空间异质性在调节植物群落组成、植被分布、植被生物量格局上有重要影响[56]。提供养分是属于土壤极为重要的生态功能之一，国内研究人员在不同气候区域、时空尺度分别研究了土壤养分空间异质性与环境因子之间的关系，其中发现地形因子是导致土壤养分异质，对植物分布产生影响的一个重要因素[57]。杨 珊等[58]研究了喀斯特石灰岩、砂页岩2种不同土地利用方式下土壤。其研究结果均证明了土壤养分差异对森林生态系统的退化会产生一定的影响。土壤微生物是森林生态系统中的重要分解者，在维持生态系统的结构与功能方面起着十分重要的作用[59]。

土壤微生物是森林生态系统中的重要分解者，对森林生态系统中的物质循环和能量流动起到作用，利于维持生态系统的结构与功能[60]。土壤微生物生物量碳的总量少，但却影响着进入土壤的所有有机质转化，是土壤组成的精华，是生态系统养分、能源循环的关键和动力[61-62]。土壤微生物有支持生态系统保持生产力的功能和调节喀斯特森林生态系统演替[63]。

2.3 植被因素

西南地区岩溶环境是一种典型的钙生性环境，许多喜酸、喜湿、喜肥的植物难以生长，即使能生长也是长势不良的“小老头树”。

2.4 资源不合理利用

喀斯特地区人口多，可耕地少，人均占有资源量少 。有资料记载大约在200年前，花江曾经是一个森林茂密、土壤肥沃的地方。但随着人类不合理的水土开发活动，现已不复存在。由于人地矛盾突出，人们对资源的不合理利用，毁林开荒，过度开垦，滥砍滥伐，牧地过度放牧，导致土壤退化，水土流失加剧，生态环境遭到严重破坏，原来茂密的乔灌木林，渐渐退化成了低矮的次生灌草丛林，甚至岩石，并最终导致该地区的生态环境退化[64]。

2.5 人为干扰

在喀斯特地区，由于人类对森林不合理的开发利用，使森林生态系统受到的人为干扰远大于自然干扰[65]。彭少麟认为人为干扰是引起喀斯特森林普遍退化的重要原因[66]，导致喀斯特森林发生退化的人为干扰的主要形式是火烧、开垦、放牧和樵采，据喻理飞等对人为干扰对喀斯特森林群落退化的研究发现，不同的干扰形式对喀斯特森林产生的退化的影响程度不同，其中火烧对喀斯特森林的产生的退化的影响最大，其次是放牧，开垦和樵采[67]。

3 退化喀斯特森林的恢复与重建

3.1 恢复与重建的基本原则

生态恢复与重建的原则一般包括自然法则、社会经济技术原则和美学原则等3个方面[68]。退化生态系统的恢复与重建要求必须建立在遵循自然规律的基础。

3.2 退化喀斯特森林恢复的理论

岑慧贤等[69]认为干扰和演替是生态恢复与重建的理论基础。彭少麟[70]认为，退化生态系统的恢复与重建需要生态学理论的指导。任 海等[68]认为主要是演替理论，但远不止演替理论，其核心原理是整体原理、协调与平衡原理、自生原理和循环再生原理。李明辉等[71]认为景观生态学理论如景观格局与景观异质性理论，干扰理论和尺度理论都能够指导退化生态系统的恢复实践，是生态恢复与重建的新的理论基础。

3.2.1 生态学基本理论。限制性因子原理：寻找生态系统恢复的关键因子；热力学定律：确定生态系统能量流动特征；种群密度制约及分布格局原理：确定物种的空间配置；生态适应性理论：尽量采用乡土种进行生态恢复；生态位原理：合理安排生态系统中物种及其位置；演替理论：缩短恢复时间，极端退化的生态系统恢复时，演替理论不适用，但具指导作用；生物多样性原理：引进物种时强调生物多样性，生物多样性可使恢复的生态系统稳定；缀块―廊道―基底理论：从景观层次考虑生境破碎化和整体土地利用方式[12]。

3.2.2 自我设计与人为设计理论。自我设计与人为设计理论是唯一从恢复生态学中产生的理论，该理论是 Vander Valk[72]提出的。自我设计理论认为：只要有足够的时间，随着时间的进程，退化生态系统将根据环境条件合理地组织自己，并会最终改变其组分。人为设计理论认为：通过工程方法和植物重建可直接恢复退化生态系统，但恢复的类型可能是多样的。这一理论把物种生活史作为植被恢复的重要因子，并认为通过调整物种生活史方法可以加快植被恢复。这2种理论不同点在于：自我设计理论把恢复放在生态系统层次考虑，未考虑到缺乏种子库的情况，其恢复的只能是环境决定的群落；而人为设计理论把恢复放在个体或种群层次上考虑，恢复的可能是多种结果[73]。

3.3 退化喀斯特森林恢复的过程

自然恢复的本质是群落演替[4]，喻理飞等的研究表明，喀斯特森林的退化是由顶极常绿阔叶林―乔林―灌乔林―灌木灌丛林―灌草群落―草本群落的逆向演替的过程，退化生态系统一旦停址干扰，便发生进展演替，向原群落方向发展，自然恢复过程是由先锋种经过渡种最终为顶极种替代的发展过程，恢复总是向结构更复杂、功能更完善的方面发展。退化喀斯特森林在恢复过程中群落的气候、土壤、组成、结构、生物量均会发生变化[74]。

卢永飞与李安定等对群落的气候变化研究表明：退化喀斯特森林在不同恢复阶段中群落的光照、气温、空气湿度、空气中CO2浓度等气候特征会发生变化[75-76]。通过对近几年退化喀斯特森林恢复过程中群落的动态研究的文献查阅发现对退化喀斯特森林恢复过程中土壤的变化的相关研究较多，退化喀斯特植被恢复过程中土壤微生物数量、土壤含水量及土壤酶活性的变化均为裸地阶段乔木疏林>人工林>草坡>坡耕地，坡耕地土壤抗蚀性能最差，不同恢复阶段石砾含量大小为：裸地>草地>灌木林>乔林[77-82]。

3.4 退化喀斯特森林恢复评价

恢复评价是恢复生态学中所要研究的重要内容，是检验人工恢复实践和自然恢复状态的技术手段[83-84]。喻理飞等在分析群落组成、结构、功能变化的基础上，提出评价退化群落自然恢复的3个指标，即退化群落自然恢复的潜力度（restoration potentiality，RP）、恢复度（restored degree，RD）和恢复速度（restoration speed，RS）[40-41]。高华端等通过对喀斯特生态系统植被恢复的研究，认为对喀斯特森林的恢复评价主要有以下几方面的指标：群落水平指标、综合指标、生理指标、种群及个体水平指标、物化指标等[85]。

宋利荣等人选择与喀斯特植被恢复紧密相关的群落高度、生物量、显著度、物种多样性指数、生态优势度、均匀度和盖度，7个因子构成评价指标，用层次分析法计算各指标的权重值，对植被自然恢复程度进行评价[86]。

3.5 退化喀斯特森林恢复技术

孙德亮等[87]认为喀斯特地区退化植被生态系统修复技术主要有：生物修复技术、植被自然恢复与重建技术、植被人工恢复与重建技术。等认为喀斯特地区石漠化治理的植被修复技术主要有：封山育林的植被恢复模式，乔灌混交防护林的植被恢复模式，生态经济林的植被恢复模式。喻理飞[51]等认为退化喀斯特森林的修复技术主要有：人工恢复技术和人工促进植被自然恢复的技术。梅再美等根据生态恢复的目标，认为喀斯特地区的植被恢复应采用人工促进植被白然恢复和人解除障碍因子，提高植被恢复和生态环境恢复的潜力、程度和速率。

4 研究展望

在退化喀斯特森林生态系统恢复方面，进行了对退化喀斯特森林生态系统退化原因、种组的耐旱适应性、恢复的过程及恢复过程中群落的动态研究，并提出退化喀斯特森林自然恢复途径和评价，但缺乏对导致喀斯特生态系统退化过程的诊断的研究。且目前所有的这些研究都是建立在退化喀斯特生态系统的自然恢复基础上，而对于喀斯特森林人工促进生态重建方面，缺乏对退化喀斯特森林恢复与重建的各种恢复途径及技术措施的研究恢复技术与整治模式研究。

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第8篇：微生物多样性分析方法范文

市政园林景观是城市的重要基础建设，其重要性主要表现在以下几个方面：其一，促进城市文明建设，市政园林景观绿化能够促进环境和人类的可持续发展以及城市文明建设，这不仅体现在提高城市环境质量，改善人们生活环境和提高人类身心健康方面，同时还体现了继承与弘扬本国文化、提高人们文化修养、行为道德、艺术美德以及陶冶情操等方面；其二，提高生物多样性，市政园林景观绿化能够人为的创造接近也自然生态环境的绿化场所，能够为鸟类、动物、植物以及微生物等提供适合居住的环境，为实现城市生物多样性奠定基础；其三，综合功能，园林植物综合功能为城市生态环境提供的综合功能是其他生态因子所不能提供的，例如能量流动产生的生态效益和生理活动的物质循环；通过植物景观创造的良好城市环境，为人们提供舒适休憩空间的社会效益；创造避灾场、减灾条件的城市安全效益；改善城市环境以及促进旅游发展的经济效益等；其四，环境资源保护作用，市政园林景观绿化能够通过模拟自然以及人工重建生态系统的方式，为城市创造接近自然的生态环境，对于城市原有生态环境的改造以及维护具有非常重要的作用，并且能够塑造自然资源在城市人工环境中的积蓄、再生以及可持续利用。

2市政园林景观绿化施工技术管理

（1）规划设计技术管理

市政园林景观绿化规划设计技术管理主要包括以下几个方面：其一，区域设计，二十一世纪市政园林景观绿化必须突出区域特征，重点改善生态环境以及生物多样性，实现城市区域社会、空间、环境、经济等的有机结合，保证景观规划设计符合可持续利用性、人居环境舒适性、野郊休闲性、生物多样性、生态性等，创建城乡一体化、城郊结合的生态绿地系统；其二，生态设计，市政园林景观的生态设计应该以环境、生物、人等的良性关心的目标和前提，通过合理的生态设计实现城市健康、安全以及可持续的良性发展，调整信息流、能流以及物流的良性循环，促使城市生态要素和绿地的密切耦合，保证整个城市生态系统能够更加高效、和谐的运行；其三，科学艺术设计，市政园林景观设计会受到艺术的影响，生态环境态度变化、人类生活方式以及信息社会转变，都会影响到市政园林景观的设计，因此应该科学的发展以及改善设计以及技术方法，实现艺术性以及科学性的高度统一，适应人的心理和行为需求；其四，文化设计，通过市政园林景观以及绿地植物的有机结合，能够实现城市总体形象的整合，创建形象鲜明、文化底蕴丰厚的特色城市园林景观，对于促进整个城市的文化建设和发展具有非常重要的作用。

（2）施工现场清理和整理技术管理

当市政园林景观规划设计完成之后，应该对施工现场进行全面的清理，主要包括：生活垃圾、建筑垃圾、杂草、石块等，防止造成物理性状差、养分含量低、土壤偏碱性等，影响绿地植物的正常生长和发育。对于施工现场的平整，应该严格的按照设计标准以及园林景观要求，将土方回填平整到设计标高，对施工现场进行翻挖，将表土破碎成符合设计要求的曲面或者平面，然后根据设计图纸的相关要求进行整坡、整势工作。

（3）植物配置技术管理

不同的绿色植物具有不同的特性，对于生长环境的要求也存在一定的差异，因此市政园林景观在进行绿化时，应该根据当地的条件（光照强度、湿度、土壤理化形状、气候特征等）与植物特性（植株高度、绿色期、开花期、花色、适应性等），严格的遵循适地种植合适植物的原则。市政园林景观绿化植物配置技术主要包括以下两种方式：其一，改地适植物，包括整地、施肥、灌溉、混交以及土壤管理等技术；其二，改植物适地，包括育种、选种以及引种循环等技术。根据绿地的不同功能和性质合理的选择相应的植物并进行配置，保证高度搭配的合理性，例如，花坛的边缘应该尽量选择一些更低的蔓生或者低矮的种类，这样能够衬托出花坛中花的艳丽；种植面积相对较小时，应该尽可能的选择低矮的种类；区域面积较大时，适当的种植灌木或者乔木，由于这些树种的上层开枝相对较小，可以在这些植被的下面种植一些高度适中的植物。此外，还应该重视色彩的搭配，植物的搭配应该重视色彩的对比以及变化，保证园林景观色彩的多样性。

（4）苗木选育技术管理

首先，应该创建苗木材料进场质量抽检和计划跟踪制度，认真的做好苗木材料的报验以及自检工作，对于苗木的品种、根系发育状况、土球大小、冠幅、形状、胸径、高度等进行严格的把关，选择根系发达、无机械损伤、无病虫害、生长健壮的优良苗木，保证进场的苗木都能够满足园林景观绿化设计的相关要求，避免不合格的苗木进场，影响整个园林景观工程的施工效果。

（5）苗木的种植技术管理

市政园林景观绿化的苗木种植技术管理主要包括以下几个方面：其一，草坪的播种施工以及草皮的铺种施工，草坪应该选择生长良好的草种，在大面积和坡地上，应该采用混播、喷播等相结合的方式进行施工；草皮应该选择长势良好、无杂草的草种，然后采用密铺的方式进行施工，当铺设完成之后还应该进行灌水和滚压，以此保证绿地和草地的充分结合；其二，地被以及低矮灌木的种植技术管理，模纹花坛应该先种植图案的轮廓线，然后再种植内部的花种；宿根花卉以及一二年生花卉应该采用混合种植的方式，先种植宿根花卉再种植一二年生花卉；高矮不同的花苗在进行混种时，应该采用先矮后高的顺序进行种植；坡势花坛应该采用由上向下的方式进行种植；独立花坛应该采用从中心向外的顺序进行种植；大型花坛应该采用分块、分区种植的方式；其三，大灌木、乔木的种植施工，大树苗在运到施工现场之前，应该对树形等进行严格的审视，调整好观赏面的朝向，再配合吊车，将树冠放正，对于裸根的树苗，应该在种植穴中用土填成锥形，然后再进行回填，进行分层夯实。

（6）后期技术管理

其一，合理浇水，苗木种植后必须立即浇透定根水，通常采用小水慢浇的方式进行，2-3天之后浇第二次水，每次浇水应该浇透；其二，施肥管理，为了保证绿化苗木能够达到设计要求，种植之前应该施足底肥，第一年不施肥，第二年根据具体状况适当的施加农家肥；其三，搭棚遮阴，为了保证绿化苗木在种植之后迅速的恢复并良好的生长发育，应该搭建遮阴棚，避免水分蒸发过快，这样既能够保证绿化苗木的成活率，又能够达到园林景观绿化设计的相关要求。

3结语

第9篇：微生物多样性分析方法范文

关键词 脱氮硫杆菌；自养反硝化；水产养殖；分子生态学

中图分类号 S949 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2012）14-0252-03水产养殖业是我国发展最为迅速的行业之一，对我国渔业经济的贡献很大。随着高密度、规模化的水产养殖的蓬勃发展，养殖生态环境质量日益下降，养殖环境污染不容忽视。一些传统的通过投加化学物质来控制养殖环境中的硫化物以及亚硝酸盐含量的方法收效甚微，且可引来诸如蓄积残留等更多的环境问题。近年来，人们开始尝试在养殖水体中使用生物降解转化方法来改善养殖水体的生态环境，以达到健康养殖的目标。因脱氮硫杆菌具有脱氮和脱硫的双重特殊性质，同时又是严格自养兼性厌氧型微生物，所以近年来受到了更多的关注。

1 养殖水体中的主要有害物质及控制

1.1 亚硝酸盐

氮在水体中以氮气、游离氨、离子铵、亚硝酸盐、硝酸盐和有机氮的形式存在。总氮和总磷一直被认为是引起水体富营养化的重要因子，而氨氮和亚硝酸盐氮是养殖过程中引起鱼类疾病的关键环境因子，尤其是亚硝酸盐浓度的超标（亚硝酸盐向硝酸盐转化不完全），是近年来鱼病发生的不可忽视的原因之一。养殖中发现，鱼类易患“棕血病”，这是因为亚硝酸通过鱼类鳃和体表进入到血液，与血红蛋白结合生成高铁血红蛋白，失去携氧能力，血液成棕色。作为强氧化剂，亚硝酸盐进入血液后扰乱氮排泄，降低氧合血红蛋白水平使各组织缺氧，低浓度时可使抵抗力下降，易患各种疾病[1]；我国淡水渔业用水标准规定，养殖水体中亚硝酸盐含量应控制在0.2 mg/L以下，集约化养殖技术能够成功的关键就在于对水体中亚硝态氮的控制[2]。目前用生物降解转化法降低养殖水体亚硝酸盐含量是颇为有效的方法。

1.2 硫化物

养殖水体中，大量残饵、死藻、养殖生物排泄物等沉到水底增加了底部有机物含量，从而增加了硫化物的含量。硫化物作为重要污染物之一，同时也是监测养殖水环境的重要化学指标，对鱼虾类的生长危害较为严重，毒性很大。水体中硫化物包括溶解性的H2S、HS-、S2-，以及存在于悬浮物中的可溶性硫化物和酸可溶性金属硫化物[3]。硫化物可与养殖生物血液中的血红蛋白结合产生硫血红蛋白，降低了机体中血液的携氧能力。同时，硫化物对养殖生物的鳃组织具有很强的刺激和腐蚀作用，可使组织产生凝血性坏死，引起生物呼吸困难，血液、肾中硫代硫酸盐水平增加，大于2 mg/L可致养殖生物死亡。故我国渔业水质标准中规定其在水质中含量不得超过0.2 mg/L。管越强等[4]发现日本沼虾中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活力随硫化物浓度的升高而增强，其免疫系统对硫化物有一定的耐受力，而当硫化物浓度过高时，沼虾的免疫能力降低，对机体抗氧化系统产生显著的影响。余 静等[5]以过氧化物酶（POD）和酚氧化酶（PPO）作为指标，研究了硫化氢胁迫对罗氏沼虾的影响，结果发现POD和PPO酶在低浓度硫化氢处理下的活性显著提高，可能是对虾体内免疫系统应激反应的表现，当硫化氢浓度超过耐受范围后，细胞就会造成严重损伤，POD和PPO酶活力降低，这与管越强试验研究结果相似。

1.3 养殖水体中主要有害物质的控制

目前控制养殖水体中亚硝酸盐氮和硫化物的方法很多，水培植物（如浮床栽培空心菜[6]、凤眼莲、水花生、莴苣等）异养反硝化、自养反硝化、异养和自养相结合的方法等均有报导。不足的是水培植物的脱氮效率很低，谭洪新等[7]在研究水栽培蔬菜对养鱼废水的水质净化效果时发现，水培蔬菜对硝氮的去除率只有3.7%；吴 伟等[8]通过在池塘水体中栽种以轮叶黑藻（Hydrilla verticillata）为主的水生植物，并添加活菌含量大于108 g/L微生物制剂，构建了水生植物—微生物强化系统，研究该系统对日本沼虾（Macrobrachium nipponense）养殖水体的生物净化效果。研究表明，当水体中添加的微生物质量浓度为1.0 mg/L时，适宜的水生植物覆盖率为40%，水生植物—微生物强化系统是一种良好的日本沼虾养殖水体生物净化系统。而水生植物与微生物相结合净化水体，效果虽然较为显著，但水生植物的栽培占面积较大，依然不是最理想的选择。故利用高效的具有反硝化脱硫功能的微生物净化养殖水质、控制亚硝酸盐和硫化物显得尤其重要。

由于水产养殖需要保持充足的溶氧量，所以厌氧反硝化菌脱氮无法发挥正常的作用。具有一定溶氧量的养殖水体更有利于好养或兼性反硝化菌发挥作用。好养或兼性反硝化菌将硝酸盐和亚硝酸盐转化成气态氮，且可将氨在好氧条件下直接转化成气态产物。

2 脱氮硫杆菌的性质和作用原理

2.1 脱氮硫杆菌的生长特性

1904年，Beijerinck首先分离得到脱氮硫杆菌（Thioba-cillus denitrificans），其属于硫杆菌属；具有代表性的硫杆菌属有排硫杆菌（Thiobacillus thioparus）、氧化硫杆菌（Thiobac-illus thiooxidans）、脱氮硫杆菌（Thiobacillus denitrificans）和新型硫杆菌（Thiobacillus novellus）。脱氮硫杆菌广泛存在于土壤、底泥、淡水和海洋沉积物、矿山排水、工厂、污水处理池和消化池；对温度和pH值的变化敏感，最适生长条件pH值为6.5～8.0，最适温度28～30 ℃。脱氮硫杆菌为革兰氏阴性化能自养细菌，电镜观察，菌细胞短杆状、单个、成对或短链状排列，具有单根极生鞭毛，无芽孢，菌体大小约为0.3～0.8 μm×0.8～3.0 μm。能在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和 S2-作为能源、以CO2作为碳源进行生长，厌氧条件下可以硝酸盐作为电子受体还原为N2。该菌生长缓慢，无明显的稳定期且稳定期持续时间较短，随后进入衰亡期[9-10]。

2.2 脱氮硫杆菌反硝化原理

脱氮硫杆菌能在好氧和厌氧条件下以硫代硫酸盐和S2-作为能源、以CO2作为碳源进行生长，厌氧（兼性厌氧）条件下可以硝酸盐作为电子受体还原为N2。正因为脱氮硫杆菌以二氧化碳为碳源，对鱼类有害的亚硝酸盐、硫化氢等均可被氧化为无毒的物质，同时减低了水体中的生物消耗量和化学耗氧量。其反硝化过程如下：脱氮硫杆菌胞内含1，5-二磷酸核酮糖羧化酶和5-磷酸核酮糖激酶，可通过卡尔文循环途径来固定CO2。脱氮硫杆菌以还原态硫作为电子供体，同时以硝酸盐作为电子受体，将其还原为N2，完成自养反硝化过程[11]。厌氧条件下，脱氮硫杆菌氧化硫的反硝化过程具体如下：

1.1 S+0.4 CO2+NO3-+0.76 H2O+0.08 NH4+0.08 C5H7O2N+0.5 N2+1.1 SO42-+1.28 H+ （1）

0.844 S2O32-+NO3-+0.347 CO2+0.434 H2O+0.086 NH4++0.086 HCO3-0.086 C5H7O2N+0.5 N2+1.689 SO42-+0.697 H+（2）

0.421H2S+0.421HS-+0.346 CO2+0.086 NH4++0.086 HCO3-+NO3-0.086 C5H7O2N+0.5 N2+0.842 SO42-+0.434 H2O+0.262 H+ （3）

从NO3-还原到N2，经一系列连续的4步反应完成：NO3-NO2-NON2ON2，分别由以下酶进行催化：硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶、一氧化二氮还原酶。通常细菌能否用于脱硫工艺的一个重要影响因素在于细菌产生的硫是积累在细胞内还是在细胞外。如果积累在细胞内，必然会产生大量的含硫细胞。这样硫的分离就比较困难，为此必须选择在细胞外形成硫的细菌，而脱氮硫杆菌即是具有这种特征的细菌。脱氮硫杆菌的优点：一是严格自养，不需要投放有机物作为碳源，节省开支，同时也不会引入额外的有机物，避免水体的二次污染；二是产生极少量的污泥，能将污泥处理量降低到最小[12]；三是不仅能在厌氧条件下生长，还可以利用硫化物。

3 脱氮硫杆菌的应用研究

鉴于脱氮硫杆菌具有脱氮和脱硫的特殊性质，近年来对脱氮硫杆菌的应用研究十分活跃。脱氮硫杆菌是典型的硫自养反硝化菌，有关研究主要集中在防腐应用、油田废水处理领域。作为微生物腐蚀的主要菌种之一的硫酸盐还原菌（SRB），脱氮硫杆菌能够与SRB共存，以氮源反硝化作用，抑制腐蚀性产物硫化物的产生，同时也在一定程度上抑制了SRB的生长，起到一定的防腐作用。汪梅芳等[13]利用静态挂片以及交流阻抗法（EIS）研究了脱氮硫杆菌对碳钢微生物的腐蚀影响，研究发现T. denitrificans的胞外高聚物增加了生物膜的致密性，阻碍了电荷传递过程，也降低了SRB的腐蚀。秦 双等[14]将脱氮硫杆菌经培养活化后用于抑制老化油储油罐污水及油田废水中微生物腐蚀及脱除硫化物，发现加入TD生物制剂后，污水中FeS的去除率可达42.85%；污水中无机硫化物的总量去除率可达91.05%。脱氮硫杆菌的加入降低了污水中腐蚀性硫化物的含量，进而减缓油水界面层对基体材料的腐蚀破坏，同时降低界面附近SRB的生长及活性硫化物的产生，从而抑制了恶臭污染物硫化亚铁对环境的危害。

近年来，利用脱氮硫杆菌来处理地下水和饮用水这一自养反硝化工艺也得到了广泛应用。Koenig等[15]在1997年进行了用脱氮硫杆菌处理垃圾填埋场渗滤污水，在填充不同粒径硫磺的固定床反应器系统来处理硝酸盐浓度高达400 mg/L的污水，为以后高浓度硝酸盐污水处理提供了可行的依据。张承中等[16]利用脱氮硫杆菌接种至生物滴滤塔用于净化硫化氢气体浓度高达2 000～3 000 mg/m3，对硫化氢的脱除率高达92%，为工业化应用中处理高浓度的硫化氢气体提供了依据。

同时脱氮硫杆菌在矿体地下水以及矿体围岩地下水中活动性强，而在一般岩石或松散沉积物的地下水中活动较弱。因此，脱氮硫杆菌可以作为指示性微生物，作为矿化的直接指标。

4 脱氮硫杆菌筛选驯化以及分子生态学水平上的研究

因脱氮硫杆菌生长缓慢，对温度以及盐度的耐受性不强等限制了其应用，对于养殖水体而言，从养殖水体污泥中有效的筛选、培养和驯化脱氮硫杆菌，因温度、pH值等是脱氮硫杆菌生长的主要影响因素，因而可通过建立温度、pH值梯度进行稳定性驯化培养。采用添加特殊指示剂的培养基对脱氮硫杆菌也可以进行初步筛选，通过反硝化过程碱度变化，相应指示剂颜色变化，即可在筛选平板上出现特殊颜色的菌落。牛建敏等[17]从湖水、底泥、土壤、厌氧污泥等不同环境中采集菌种从培养、分离得到10种脱氮硫杆菌菌株，不同环境中脱氮硫杆菌在生理生化上存在差异，通过比较它们的硝酸盐氮去除速率，以期获得活性更强以及工程应用价值最大的菌株。同时，深入探讨脱氮硫杆菌的基因组学、蛋白组学技术，利用基因重组、基因改组等分子生物学技术构建高效基因工程菌，从而提高其生物脱氮的效率，是行之有效的方法。

养殖水体单靠脱氮硫杆菌单一菌株想达到高效率的脱氮除硫效果，还是有很大困难的，如若将脱氮硫杆菌与其他具有不同净水功能的微生物菌株复合使用，根据治理对象的不同以及各种菌生理功能的差异，进行组合并采用多种工艺手段，以期达到治理大面积养殖水域的目的。目前，养殖水体中微生态制剂所涉及的微生物包括光合细菌、芽孢杆菌、硝化细菌、反硝化细菌等[18-20]。如养殖水体净化有关研究[21]，从富营养化的养殖水体中分离筛选得到具有不同生理功能的污染物治理菌株，如硫化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、光合细菌、生物絮凝菌等，经优化配伍成性能优良的复合功能菌，因它们在生长过程中能产生的有用物质及分泌物质成为相互或各自的生长基质，形成一种共生增殖关系，从而达到有效净化养殖水体的目的。徐军祥等[22]首先从高盐高硫废水中活性污泥中获取脱氮硫杆菌，在不同浓度梯度下进行耐盐能力稳定性驯化培养，以获得耐盐脱氮硫杆菌，并与硝化菌混合培养形成复合菌剂，采用生物强化技术原理投加至废水。结果发现投加复合菌能加快COD降解速度，增强耐负荷冲击能力，提高COD、NH3-N和硫代硫酸盐（THS）的去除率。所谓的生物强化技术（bioaugmentation）即是为了提高原系统的废水处理能力，向原系统中投加从自然界中驯化筛选的优势菌种或通过基因重组技术产生的复合菌，以去除某一种或多种有害物质的方法。该技术自20 世纪80年代以来被广泛研究。

近年来，固定化微生物脱氮技术在养殖水质的控制上应用广泛，其优点包括在污废水脱氮治理中能够长期保持活性；可重复使用，节省投资；易于固液分离；有利于屏蔽或减少土著微生物、毒性物质及外界环境变化的干扰，可使含氮污水达到更好的修复效果[23]。因此，尝试将脱氮硫杆菌固定化投放到养殖废水中以便高效利用也是未来研究工作中所要努力的方向。也有研究将脱氮硫杆菌与形成絮凝体的异养细菌一起培养使脱氮硫杆菌得到固定化，从而形成性能良好的絮凝物以除去H2S。

据统计，目前人们能够培养的微生物不足环境微生物总量的3%。近些年来，分子微生态学和现代生物化学的迅速发展推动着养殖水体微生物学的发展，人们逐渐通过分子生态学技术深入研究环境微生物如RLP技术用于研究环境微生物多样性；用DGGE 技术研究反硝化微生物基因多样性，车 轩等[24]PCR-DGGE技术从总DNA中扩增出目标16 S rDN断，再对扩增的16 S rDNA进行DGGE分析，对凝胶染色并进行条带统计分析和切胶测序，使用序列数据进行同源性分析并建立了系统发育树。其中，RT-PCR及实时荧光定量PCR技术研究环境反硝化微生物种群的定量研究。因为硫杆菌属种类较多，种间差异不大，因而用分子生物学手段对其进行分类鉴定，如运用16 S rDNA分析来鉴定脱氮硫杆菌，是更具优势的也是较普遍的一种方法。

脱氮硫杆菌作为氮素循环的重要微生物，其分子生态学上的研究不是很深入，因此提出了脱氮硫杆菌专一性PCR引物和探针，已经成为微生物生态学的迫切要求。赵阳国等[25]研究设计了脱氮硫杆菌在种级水平的专一性PCR引物/探针。脱氮硫杆菌专一性引物/探针的提出，将为不同生态环境中该种微生物的时空分布、结构动态以及实时定量等研究提供分子生物学工具。Robert S运用外源DNA探针从质粒库中分离出来2种转录脱氮硫杆菌1，5-二磷酸核酮糖的基因，并运用限制性酶分析2种基因的长度大小。此次研究也为脱氮硫杆菌在分子水平上的研究及应用奠定了一定的基础。

5 脱氮硫杆菌在水产养殖中的应用前景与展望

目前对自养反硝化菌脱氮硫杆菌的应用研究主要集中于饮用水、地下水、废水处理、防腐应用，而对养殖水处理的研究报道则较少。因循环水养殖系统具有节省空间、节约水资源、高产、高回报效益的优点的，作为我国水产养殖业现代化的支撑技术力量，该体系为工业化水产养殖提供了很好的技术模式。鉴于自养反硝化菌的诸多优点，有研究试着将脱氮硫杆菌运用到循环水养殖系统。自养反硝化过程会消耗一定的碱度，并且RAS系统水是循环使用的，所以长期下去可能有硫酸根的积累，而随着硫酸根浓度的升高反过来又会抑制脱氮速率。车 轩[26]综述了在循环水养殖系统（RAS）中运用脱氮硫杆菌除硝酸盐的可行性，他提出将产生碱度的异养反硝化与自养反硝化进行集成，具有极大的潜力。将二者集成的脱氮方法具有两大优势：一方面碳源的消耗远远低于完全异养反硝化脱氮；另一方面使硫酸盐浓度得到有效控制。因此，在养殖水处理的实际应用中具有极强的可行性。有研究采用硫酸盐还原菌、脱氮硫杆菌和异养反硝化菌在生物滴滤塔中的填料表面进行挂膜，进行同步脱除SO2和NO试验，通过不同菌种的协同作用，SO2气体平均去除率达到了97.6%，而NO气体的平均去除率达到了51.4%。

而Sora运用MSC（modified spent caustic）即改良的废碱液投加到以硫为电子供体自养反硝化过程中去以补充消耗的碱度，使反硝化进程能持续的进行；同时SC的应用证实了污水脱氮的高效性，即COD/N的比值较低。若COD和TN含量过高的话，还要考虑到SC的添加剂量问题。

6 小结

自养反硝化技术对养殖水体净化的应用方面较小。有关耐盐、耐高低温的脱氮硫杆菌菌株的筛选驯化研究还需进一步加强，对脱氮硫杆菌尤其是分子水平的研究还不够深入。目前，硫自养反硝化技术还处于实验室研究及中试阶段，如果考虑将脱氮硫杆菌等反硝化细菌应用于河流、湖泊、鱼虾等养殖水体或自然水体中，其在实际应用中的功能是否稳定将有待探讨，目前相关研究已经证明脱氮硫杆菌对养殖水体生物无害，但是否影响水体中其他有益微生物的生态位，还有待探讨未来致力于脱氮硫杆菌上的研究还很多，任务更繁重。

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