微生物方法学研究精选(九篇)

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第1篇：微生物方法学研究范文

关键词：功能基因组；高通量数据；生物信息学

中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）10-0190-01

功能基因组学（后基因组学），是在结构基因组所提供的丰富的高通量信息资源以及大量各类生成产物的基础上发展起来的基因组学的子学科。其通过在功能基因组水平或功能系统水平上全面地分析基因的功能，发展和提出了多种实验手段和分析方法，使得生物学的研究对象由单一基因或蛋白质转为多个基因或蛋白质组成的系统，进而得到关于基因表达、调控、功能以及生物的生长、发育的相关规律。

1 差异显示反转录PCR技术

差异显示反转录PCR（DDRT―PCR）技术是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝z电泳为基础的功能基因组学的传统方法。该方法的基本原理是：以1对细胞（或组织） 的总RNA反转录而成的cDNA为模板，利用PCR的高效扩增，通过5’端和3’端引物的合理设计和组合，将细胞（或组织） 中表达的基因片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出1对细胞（或组织）中表达有差异的cDN断。DDRT―PCR具有周期短，功能多，灵敏度高，所需RNA的量较少并且重复性较高等优点。但是，在实际施行过程中， DDRT―PCR技术存在着假阳性率高、凝胶中单条cDNA带成分不均一、所获cDNA仅代表mRNA 3’UTR（非翻译区）、一些低拷贝数mRNA不能有效呈现等问题。[1]

2 基因表达序列分析

基因表达序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一种快速高效地分析转录物的实验方法。其理论依据是：基因组中95%的基因可以由来自cDNA 3’端特定位置的一段9―11bp长的序列加以区分。这一段特异的基因序列被记作SAGE标签。基因表达序列分析通过对cDNA制备SAGE标签，然后将这些标签串联起来并对其进行测定，可以显示出各SAGE标签所代表的基因在特定的组织中是否有表达，同时还可以将SAGE标签所出现的频率作为其所代表的基因表达程度的指标。但是，应用SAGE技术有一个重要前提条件：GenBank中必须有某一物种足够多的DNA序列的资料（特别是EST序列的资料）。[2]

3 微阵列分析

DNA微阵列（microarray assay）技术包括cDNA微阵列和DNA芯片（DNA chip）两种方法，这两种方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA、EST或基因特异的寡核苷酸），该过程会用到光导化学合成、照相平版印刷和固相表面化学合成等技术。接着将寡核苷酸“探针”与来自不同细胞、组织或整个器官的用放射性同位素或荧光物标记的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交。最后对每个杂交点进行定量分析。定量分析的结果可以用于DNA测序、DNA突变和多态性分析以及对同一组织细胞在不同状态下或在同一状态下多种组织细胞基因表达水平的差异的检测，还可以发现新的致病基因或疾病相关基因等。微阵列分析的优点是可以同时对大量的基因，甚至是整个基因组的基因表达进行对比分析，并且在核苷酸杂交技术的各个方面应用。其在同时比较同一组织在不同状态下或各组织之间DNA序列分析以及基因的表达状况等方面具有极大的优越性。

4 反义RNA分析

反义RNA是能与靶RNA互补配对的，用来定点分析某一段DN段（基因）功能的小分子RNA。反义RNA分析即是利用反义RNA来进行功能基因组分析的方法。该方法首先分离基因片段的mRNA，合成其mRNA的互补RNA（反RNA）。然后给反RNA加上基因表达必需的元件（如启动子等），接着插入T-DNA。将其转化到植株中，那么合成的基因就会在植株中表达，并表现出相应性状。因为反义RNA与靶RNA碱基配对的结合方式，反义RNA可以在DNA复制、转录和翻译水平上对基因表达加以调控。

5 蛋白质组分析

蛋白质组分析方法主要涉及两个步骤：蛋白质的分离和蛋白质的鉴定。用于蛋白质分离的技术主要是双向凝胶电泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE），其原理是细胞抽提物在电泳过程中蛋白质个体首先依据所带电荷然后依据分子大小被分离。这种方法的最大缺点是重复性差，使得几乎不能同来自其他实验室的资料进行比较。

6 生物信息学

生物信息学将DNA和蛋白质作为研究对象，以计算机等计算工具为基础，发展更新各种软件，收集、整理和储存DNA和蛋白质的序列和结构数据，并加以分析进而发现藏在基因序列中的规律。应用生物信息学可以对功能基因组研究过程中产生的高通量，高维度的数据进行处理，应用数理统计的方法，以计算机的快速运算能力，找到功能基因组的相关信息。常应用生物信息学将未知DNA序列与数据库中收集的DNA序列进行同源性比较，或应用相关软件进行核苷酸及氨基酸序列的同源性比较，以此来获得未知DNA序列的功能信息。[3]

7 小结与展望

随着发展，基因组学由结构基因组学向功能基因组学发展，由此也产生了大量应用于功能基因组研究的工具和方法。这些方法从不同的角度和方向挖掘基因本身蕴含的丰富信息资源。功能基因组学无论是应用于获取大量基因功能信息，亦或是针对特定基因的研究都取得了突破性的进展，发展速度迅速。但随着各类研究的不断深入进行，这些方法的精确性和准确性会渐渐不再满足条件，同时各项技术尚未解决的一些问题也会被放大，单个方法或技术可能难以对新的问题有较好的应用。结合各种方法，扬长避短，综合应用各种技术可以对功能基因组有更全面、深入的研究。[4]

功能基因组学的应用十分广泛，从动物、植物到微生物群落分析都可以取得较好的研究成果，也可以应用于医药、毒理等领域。随着计算机技术的发展，将生物信息学应用于功能基因组学，借助计算机强大的计算能力，功能基因组学将能取得更大的突破。

参考文献

[1]赵锦荣，阎小君，苏成芝.差异显示反转录PCR 技术研究进展[J].生物化学与生物物理进展，2000，27（1）：28-32.

[2]常青山，余增亮.基因表达分析方法及其研究进展[J].生物技术通报，2002，（6）：27-31.

第2篇：微生物方法学研究范文

1 昆明制药集团股份有限公司，云南昆明650100； 2 昆明医科大学，云南昆明650500；3 昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明650224

【摘要】目的：建立灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法。方法：按照《中国药典》2010版要求，采用常规法对代表性的细菌、霉菌、酵母菌进行回收率测定，并对控制菌检查法进行方法学验证。结果：采用常规法，5种试验菌的回收率均大于70%。结论：可采用常规法对灯盏花乙素苷元进行微生物限度检查。

关键词 灯盏花乙素苷元；微生物限度检查；方法学验证

【中图分类号】R927 11【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517(2015)01-0032-02

灯盏花乙素苷元又名野黄芩素，是灯盏花乙素在人体内的代谢产物，具有抗血栓、抑制血小板聚集、增加脑血管血流量等药理活性，其生物活性是灯盏花乙素的5倍以上［1］。灯盏花乙素苷元天然存在于灯盏花等植物中，但含量极低，不到万分之一。我们以灯盏花素（主要成分为灯盏花乙素）为原料，采用人工半合成方法实现了灯盏花乙素苷元的批量生产［2］。本文旨在按照中国药典的要求［3］，建立灯盏花乙素苷元的微生物限度检查方法。

1仪器与材料

1 1仪器HTY-2000A集菌仪（杭州高得医疗器械有限公司）；开放式集菌器（北京牛牛基因技术有限公司）；303-6B隔水式恒温培养箱（南通科学仪器厂）；霉菌培养箱（上海跃进医疗器械有限公）。

1 2供试样品灯盏花乙素苷元（批号：201208025、20120826、20120827，昆明制药集团股份有限公司药物研究院）。

1 3培养基改良马丁液体培养基（批号：120327）、改良马丁琼脂培养基（批号：120319）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：120207）、营养肉汤培养基（批号：120122）、营养琼脂培养基（批号：111225）、胆盐乳糖培养基（批号：120415）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸(MUG)培养基（批号120622）均由北京三药科技开发公司提供。

1 4菌种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ［CMCC(B)63501］、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ［CMCC(B)26003］、大肠埃希菌Escherichia coli ［CMCC(F)44102］、白色念珠菌Candida albicans ［CMCC(F)98001］、黑曲霉Aspergillus niger ［CMCC(F)98003］均由中国药品生物制品检定所提供。

2实验方法

2 1菌液制备分别接种枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，于32～35℃培养24 h，用0 9%的无菌氯化钠溶液以10倍稀释法稀释至10-5～10-7，制成每1ml含菌数为50～100 cfu的菌悬液备用。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，于24～26℃培养48 h，用0.9%的无菌氯化钠溶液以10倍稀释法稀释至10-4～10-6，制成每1 ml含菌数为50～100 cfu的菌悬液备用。

取黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，于24～26℃培养7 d，用5ml 0 9%的无菌氯化钠溶液将孢子洗脱，取洗脱液以10倍稀释法稀释至10-4～10-6，制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。

2 2供试液制备取供试样品10g于灭菌容器中，加入pH7 0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 ml，混匀，得1∶10的供试液备用。

2 3菌落计数方法及验证

2 3 1菌落计数方法采用常规法对细菌、霉菌及酵母菌进行菌落计数，通过回收率测定进行方法学验证［3］。

2 3 2回收率测定试验组：取1∶10供试液1ml、含50~100cfu试验菌的菌液1ml加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于32～35℃培养48 h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于24～26℃培养72 h，观察记录菌落数。

菌液组：取含50~100cfu试验菌的菌液1ml加入平皿中，5种试验菌每种菌平行制备2个平皿。在加有枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌菌液的平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于32～35℃培养48 h，观察记录菌落数；在加有黑曲霉菌、白色念珠菌菌液的平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于24～26℃培养72 h，观察记录菌落数。

供试品对照组：取1∶10供试液1ml加入平皿中，共制备10个平皿。在5个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，待凝固后，于32～35℃培养48 h，观察记录菌落数；在另外5个平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后，于24～26℃培养72 h，观察记录菌落数。

回收率计算方法：试验组的菌回收率（%）=（试验组菌落数平均值-供试品对照组菌落数平均值）/菌液组菌落数平均值×100%。

2 4控制菌（大肠埃希菌）检查方法及验证

2 4 1控制菌检查方法采用常规法对控制菌大肠埃希菌进行检查。

2 4 2控制菌检查方法的验证试验组：取1∶10供试液10ml，含50~100 cfu大肠埃希菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。

阳性对照组：取含50~100cfu大肠埃希菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。

阴性菌对照组：取1∶10供试液10ml，含50~100 cfu金黄色葡萄球菌的菌液1ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。

供试品对照组：取1∶10供试液10ml，加入100ml胆盐乳糖培养基中，于32～35℃培养24h。

检查方法：分别取上述试验组、阳性对照组、阴性菌对照组和供试品对照组的培养物0 2 ml接种至装有5ml MUG培养基的试管内，32～35℃培养24h，在366nm紫外线下观察，若管内培养物出现荧光，为MUG荧光阳性；否则，为MUG荧光阴性。观察后滴加靛基质试液，若液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；若液面颜色无变化，为靛基质阴性。

3结果

由表1可见，采用常规法验证，枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉菌回收率均大于70%，说明灯盏花乙素苷元对上述5种菌株无明显抑制作用。由表2可知，灯盏花乙素苷元的控制菌检查可按常规法进行。

4讨论

灯盏花乙素苷元为人工半合成，不同生产工艺下得到的灯盏花乙素苷元产品，其所含杂质或溶剂残留成分往往不尽相同，其抑菌行为或抑菌作用的强弱程度也往往不同。因此，当灯盏花乙素苷元生产工艺或方法发生变动时，应对产品的微生物限度检查方法进行重新验证。微生物限度检查是药品质量检查的重要内容。在人工合成药物的研制过程中，一些研究机构或研究人员往往只注重产品本身的化学成分质量研究，而忽视或根本不进行产品的微生物限度检查或方法学研究，这是不科学、不合理的。按照《中国药典》的要求，应对用于非规定灭菌制剂的合成原料药进行微生物限度检查及方法学验证，检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。

灯盏花乙素苷元对枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉菌5种菌株无明显抑制作用，可采用常规法对其进行微生物限度检查。

参考文献

［1］车庆明，潘丽怡，陈颖，等．灯盏花乙素苷元的药动学研究［J］．中国药学杂志，2007，42(18)：1418-1421.

［2］周荣光，晏泽宇，赵加强，等．野黄芩素的制备、纯化与结构表征［J］．光谱实验室，2011，28(5)：2403-2406.

第3篇：微生物方法学研究范文

【摘要】 论述了体内药物分析实验教学的目标和教学特点，强调了实验规范操作的重要性，突出了探索性、方法学研究和掌握是教学的核心目标，提出重视实验教学与相关学科理论知识相结合的教学要求。初步探讨了体内药物分析实验教学的教学思路。

【关键词】 体内药物分析；实验教学

Abstract:This paper analyzes the teaching goals and characteristics of Biopharmaceutical Analysis experimentation. Emphasis is laid on the significances of canonical operation， focusing on the objectives of exploration， methodology and mastery， demanding the combination of experimentation teaching with correlative subjects of medicine， and offering a brief education consideration for the Biopharmaceutical Analysis experimentation teaching.

Key words:biopharmaceutical analysis;experiment teaching

体内药物分析（biopharmaceutical analysis）是一门研究生物机体中药物及其代谢物和内源性物质的质与量变化规律的分析方法学，通过分析的手段了解药物在体内（包括实验动物等机体）数量与质量的变化，获得各种药物代谢动力学的各种参数和转变、代谢的方式、途径等信息［1］。体内药物分析是一门理论与实际紧密相联的学科，实验是提高学生分析问题、解决问题能力，培养学生严谨科研作风的必不可少的教学环节。体内药物分析不只着眼于体外药物质量，更注重研究和了解药物在生物体内的表现。因此，体内药物分析实验教学不能看作简单的技能训练和培养，更不能简单地认为药学生开设了药物分析实验就可以忽视或省略体内药物分析实验课。体内药物分析实验课应是理论课的重要组成部分，体内药物分析的任务和特点应该在实验课中得到充分体现。我们结合自身教学实践， 对体内药物分析实验的教学内容和方法进行了一系列探索和改进，并有所心得。

一、明确教学目标和把握教学特点

体内药物分析是一门实践性很强的课程，体内药物分析的教学目标是（1）学生加深对体内药物分析基本理论和专业知识的理解，为从事临床药学研究奠定基础；（2）熟悉生物样本分析方法的建立步骤和方法验证的内容与要求；(3) 掌握生物样本预处理方法的特点及其应用；（4）了解药物动力学实验设计和药动学参数计算。因此，主要的教学目标还是靠实验教学来实现。而且，随着时代的进步和发展，从事新药研制和开发工作的要求以及药动学、生物药剂学、临床医学、临床药学服务的水平的需要使得社会对药学学生的要求越来越高。提高应用现代体内药物分析技术的能力，使药学生真正适应药学事业现实工作和未来发展的需要是社会提出的新的教学目标。

虽然体内药物分析的实验原理与药物分析的原理相同，但是教学方式和方法两者不能等同，体内药物分析的实验教学应该有自己的教学特点的。首先，教学目标的不同，药物分析实验培养学生的基本技能训练和实验操作的规范，而体内药物分析的实验教学更强调实验方法学的传授。所以，实验设计上验证性的实验少，综合设计性实验多；课堂上老师讲解少，学生集体讨论多；对学生方法的掌握、思维的引导关注多，对实验结果的强调少。其次，由于各种分析技术是体内药物分析学科的支柱，一些代表体内药物分析领域最活跃的前沿技术如液质联用（LCMS）、高效毛细管电泳法（CE）、液相色谱－核磁共振联用技术（LCNMR）应用于体内药物分析越来越活跃和成熟，这些代表分析技术发展的趋势的实验教学，应该多采用播放教学录像、多媒体教学等多种教学手段；也可带领学生到科研单位、医院参观、示教体内药物分析的方法及先进的仪器设备［2］。

二、强化操作的严格和规范

体内药物分析的特点主要是干扰杂质多。生物样品中除了所含的待测药物及其代谢药物外，通常还会有大量的内源性物质，如蛋白质、脂肪、尿素、色素等有机杂质以及钾、钠、钙、镁、铁、铜等无机杂质。同时这些内源性物质还可能与药物及代谢药物结合产生新的物质。因此，生物样品一般需经分离净化，排除干扰后才能进行测定。体内样品需经适当处理，才能用适当的方法进行分析。提取的方法有很多，如直接沉淀蛋白法、液－液萃取法、固相萃取法、膜过滤法等。提取是关键，提取的好坏直接决定结果的正确与否。然而，相比于药物分析的实验来说，体内药物分析提取步骤多，操作复杂、所用到的仪器多、耗时较长，往往增大了学生们操作失误的可能。同学们做出来的结果也容易五花八门，由于提取步骤多，实验失败的原因也难以分析。提取的工作多为一环扣一环的，当有的学生提取的后期出现较明显的失误时，会使得实验无法进行下去。我们以体内药物分析实验“差示分光光度法测定血浆中水杨酸浓度”实验教学为例：血浆样品的前处理经历了酸化、二氯甲烷萃取、离心、弃去上清、碱化提取、超声除气泡等步骤，同比于药物分析实验“差示分光光度法测定维生素B1片的含量”，样品提取只有经历了过滤，而两者的分析方法均为标准曲线法和差示分光光度法。由此可见，扎实的实验操作技能是体内药物分析的基础，而严格的实验操作和规范是体内药物分析实验教学取得成效的保证。

三、注重方法学的分析和掌握

当然体内药物分析实验开展的目的不是简单的为了让学生掌握基本的药典操作规范以及实验基本技能。体内药物分析是一门实践性很强的课程，并没有现成的方法去照搬。所以，体内药物分析的分析方法的建立和评价是实验课程的重点。体内药物分析重视方法的专属性、选择性、灵敏度，因此也一般选择仪器分析方法。并且分析方法应该从样品的种类、样品中待测物的浓度、待测物的稳定性、检测仪器的种类、待测物的检测方式等方面进行综合考虑。如“阿奇霉素制剂生物等效性”实验过程中［3］， 血样中阿奇霉素的浓度范围为5 ng/mL～1 μg/ mL， 其检测方法可采用HPLC法、LCMS 法和微生物法等数种方法， 若用HPLC法来检测该样品， 由于阿奇霉素的紫外吸收较弱， 必须对样品进行富集浓缩， 则样品的前处理方法采用液－液萃取法为佳; 若用LCMS法来检测该样品， 则由于LCMS仪器的灵敏度足以检测浓度为1 ng/mL以上的样品， 故样品的前处理只需采用蛋白沉淀法即可; 若用微生物法来检测该样品， 则样品连蛋白也不需沉淀， 直接上样即可。蛋白沉淀是体内药物分析的血样处理关键步骤。蛋白沉淀法中高氯酸沉淀法、甲醇沉淀法、乙腈沉淀法是最常用的方法，但从样品的稳定性角度考虑，阿奇霉素遇酸不稳定， 故只能采用甲醇沉淀法或乙腈沉淀法，如果测定的是血清中头孢拉定的浓度， 头孢拉定为β内酰胺类抗生素，对酸稳定，且酸有利于头孢拉定的提取，蛋白沉淀法的选择就要采用高氯酸沉淀法了。在实验教学过程中，这种方法学的建立和样品前处理方法的取舍才是老师传授的主题和学生需要重点理解的。以上例子不但说明了方法学的建立选择的重要性，也给出了体内药物分析实验课的一条基本教学思路－注重方法学的分析和掌握。

四、重视实验与相关学科的理论知识相结合

在体内药物分析中，被测物处于复杂的生物介质中，浓度呈微量、动态变化。而且药物在体内经过吸收、分布、代谢、排泄过程。这时各种分析的技术只是实验实践的工具，最终是为了药动学、生物药剂学、临床药学、及新药开发服务。体内药物分析必须与相关学科的理论知识相结合。如临床药理研究，常需进行血药浓度的测定，以了解血药浓度与药物效应之间的关系。如临床药学研究，常需进行治疗药物监测（TDM），提供准确的血药浓度测定值，以实行给药方案个体化。在新药研制过程中，按照国家新药审批的有关规定，应提供药物在动物和人体内的有关药代动力学参数，如血药浓度的峰值、达峰浓度的时间、药－时曲线下面积、表现分布容积、半衰期、生物利用度、肾清除率以及血浆蛋白结合率等基本数据。另外还要了解药物代谢产物学科和体内内源性物质等相关知识［4］。总之，体内药物分析也是一门综合性很强的学科，在实验教学实践过程中，一定要体现出体内药物分析与其他学科的交叉和融合。实验设计上应增加分析后的药动、药代、生物量效以及与临床相关指标的分析，尽量与实际学生今后的实习、工作实践接轨，拓宽学生的思路，提高分析问题解决问题的能力。

总之，开展体内药物分析实验课教学时要明确教学目标和把握教学特点，探索本科实验教学理念，我们认为严格规范的操作是实验教学的基本保证也是最低要求，分析方法的建立和评价是实验教学的核心也是教学主要目标，实验实践与相关学科的理论知识的结合是实现实验目标的需要也是教学与实践的必然要求。

【参考文献】

［1］李好枝. 主编. 体内药物分析［M］. 北京: 中国医药科技出版社， 2004.

［2］石娟， 陈慧娟， 杨群英. 药学专业应开设体内药物分析实验课［J］. 药学教育， 2000，16 （3）:30-31.

第4篇：微生物方法学研究范文

关键词：淋病奈瑟菌感染 实验室检测 研究 现状

【中图分类号】R-0 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2013）10-0069-02

淋病是目前世界范围内发病率较高的性疾病之一，它是由淋病奈瑟菌导致的一种泌尿生殖系统炎性疾病，其发病机制主要为：传染、尿道感染等，该疾病能够对直肠、眼角膜或咽喉部造成伤害，对女性来讲更会导致子宫内膜炎、输卵管炎，并导致不孕不育；男性患者则容易造成前列腺炎等[1]。除此以外，该疾病还能引发关节炎、脑膜炎等症状，对患者的危害极大。

及时对淋病奈瑟菌进行诊断非常重要，它有助于医生对患者的患病情况有进一步了解，是目前诊断淋病感染的重要标准，也被称作“金标准”[2]。随着现在淋病的流行，对淋病奈瑟菌感染的诊断和治疗变得更加困难。目前对该疾病已经采用高敏性、特异性、具有较强操作性的分子生物学检验技术进行诊断[3]，并初步取得了效果。现就检验技术在淋病奈瑟菌中的应用现状进行介绍。

1 淋病奈瑟菌的病原学检验

1.1 淋病奈瑟菌的培养和鉴定介绍。分离培养基也分成GC-Lect培养基以及Thayer-Martin培养基，下面进行详细介绍。

（1）GC-Lect培养基：GC-Lect培养基是对Thayer-Martin培养基进行改进，并有效提高其选择性以及分离灵敏度。根据相关检测结果显示：GC-Lect培养基上非目的菌生长率不到10%，其主要组成部分包括：牛血红蛋白、林可霉素、万古霉素等。这些成分有效提高了淋病奈瑟菌的临床分离率，因此值得在临床上推广应用[4]。

（2）Thayer-Martin培养基：由于淋病奈瑟菌的培养要求较高，在一般的血琼脂上不宜生长，因此可以在培养基上加上血红蛋白，提高培育成功率。然而，该培养基方法不能有效抑制表皮葡萄球菌以及一些肠杆菌，因此培养的效果要逊色于GC-Lect培养基。

1.2 淋病奈瑟菌的分离培养方法。在临床采样之后，将标本及时在专用的培养基上接种，并放置在4%-5%左右的CO2潮湿环境下培养48h左右，培养温度为35℃[5]。值得注意的是，细菌培养的特异性较高，是目前诊断淋病最有效的方法之一，且适用于各种临床标本。然而，由于淋病奈瑟菌在机体外的抵抗力较弱，且对化学消毒剂非常敏感，因此在进行标本采集、运输的过程很容易影响到检验结果。根据相关调查发现，可以在培养基中加入适当的葡萄糖，增加培养基的丰富程度，让淋病奈瑟菌更加容易生长[6]。

1.3 快速鉴定。

1.3.1 微量生化反应板法：由于淋病奈瑟菌的培养较为困难，且常规的生化检验不容易进行。因此，研究人员利用Superoxol中的H2O2，对淋病奈瑟菌中的过氧化物歧化酶进行检测，并应用微量生化反应板对淋病奈瑟菌中的血清型菌株进行研究。根据研究的结果表明，淋病奈瑟菌在使用微量生化反应板检测时具有方便、快捷等方面的优点，对检测口腔和直肠位置的淋病具有临床意义[7]。

1.3.2 荧光斑点法：由于产青霉素酶淋病奈瑟菌对青霉素等抗生素具有一定的耐药性，且主要由粒质构成，因此可以使用荧光斑点法进行检测。荧光显色剂的主要成本包括：含有11%甲醛的酒石酸钠缓冲液，其pH值为4.5，并使用藻酸钙拭子采集分泌物，并进行检测。然而根据相关调查显示：该检测方法对女性病人的诊断并不可靠，另外，在检测的过程中需要使用紫外光分析仪，这也一定程度上限制了该方法的使用。

2 淋病奈瑟菌的分子生物学检测方法

2.1 聚合酶链反应与细菌培养检测淋病奈瑟菌的比较研究。根据相关调查显示，细菌培养与聚合酶链反应在检测淋病奈瑟菌方面具有一致性[8]。曾有研究使用聚合酶链反应与细菌培养分别对100例感染者进行检测，而检测结果显示：两种方法都能够准确检测出患者出现感染。此外，根据相关研究发现，引物设计使用opa作为靶基因，能够有效提高淋病奈瑟菌检测的敏感性[9]，研究人员也可以选择一些耐药性相关的引物进行研究，并应用在PCR技术上，以增加淋病奈瑟菌的耐药性。

2.2 连接酶链反应对淋病奈瑟菌的检测方法。除了上述PCR检测方法之外，还具有一种名为连接酶链反应的快速DNA扩增方法[10]。与PCR方法不相同的是，该方法主要采用两对寡核苷酸探针进行检查，每一对寡核苷酸探针处于相邻位置，两者之间形成缺口[11]。其检测原理包括：通过变性与连接循环，靶DNA链片段呈指数扩增。根据相关研究发现，连接酶链反应的特异性要比PCR高。

某试验对23例患上淋病的女性进行尿液样本连接酶链反应检测，23例女性患者均经过连接酶链反应检测出阳性，有18例患者培养基检测出阳性。并对检测结果不一样的标本进行PCR检测，均显示为阳性[12]。有检测结果可见，连接酶链反应检测与拭子培养的敏感性分别为100%与78.26%。连接酶链反应检测方法方便快捷，并具有较高的敏感性和特异性[13]，因此可以使用于女性患者或大规模的STD检查。然而值得注意的是，在检查的过程中，依然要避免污染，否则会导致假阳性的检测结果。

2.3 自身淬灭探针荧光定量PCR检测法。以粒质作为标准品，可以设计出相关的技术来对淋病奈瑟菌进行检测，其中常见的是身淬灭探针荧光定量PCR检测法[14]。根据相关的研究表明，对自身淬灭当标准品的浓度为105ul时，使用该方法检测的线性关系较为良好。根据相关的结果显示，该检测方法主要适用于临床对分离的淋病奈瑟菌进行检测，其特异性和敏感性都较高。

2.4 膜基因芯片技术检测法。淋病奈瑟菌是性传播疾病的重要病原体之一，感染时经常出现多种病原体混合的现象，且多种病原体会出现互相激活或促进的作用[15]。因此，对淋病奈瑟菌所引起的性传播疾病进行检测和治疗是非常重要的。目前主要建立起膜基因芯片技术检测法，该检测方法能够有效对淋病奈瑟菌、沙眼衣原体等病原体进行有效的检测。根据检测的结果表明：膜基因芯片在检测的过程中无放射性污染，其敏感度较高，其中尼龙膜可以有效将增强单链和双链的DNA能力增强，并能进行循环再用。此外，该技术还能够对无症状的人群进行筛选检验，检验具有迅速的特点。

2.5 单管多重PCR技术检测法。由于性传播疾病有多种病原体混合，从而产生感染，根据相关研究发现，以单管多重PCR技术对多种感染源进行检测，如对淋病奈瑟菌、人型支原体、沙眼衣原体等病原体进行DNA检测，具有良好的检查的检测效果。该研究主要对200例疑似性传播疾病感染者进行检验，均使用单管多重PCR技术检测法进行检测，其检测结果显示，采用该技术进行检测与使用“金标准”进行确诊的结果相一致，这表明了检测技术的敏感性和特异性较高。

此外，该检查方法具有方便、快捷等方面的优势，因此该技术也与上述膜基因芯片技术检测法并列成为病原生物学基因诊断的重要诊断技术。

3 淋病奈瑟菌的免疫学检测分析

3.1 协同凝集试验法。SPA（葡萄球菌A蛋白）具有与人体IgG Fc断相结合的功能，且不会影响Fc断的活性。因此，可以利用SPA对淋病奈瑟菌进行检测，具有方便快捷的优点。

3.2 酶联免疫吸附试验法。该方法主要使用单克隆抗体固相酶对男性急性淋病奈瑟菌感染者进行检测，并具有较为准确的检测结果。然而该方法并不适用于女性以及感染部位为直肠或口腔的淋病患者。

3.3 斑点免疫金渗滤试验法。相关研究人员在研究过程中成功研制出抗淋球菌，并建立了斑点免疫金渗滤试验法以及生物素-链霉亲和素对淋病奈瑟菌进行进一步的检测。根据检查的结果显示：斑点免疫金渗滤试验法以及生物素-链霉亲和素能有效检测出淋病奈瑟菌的敏感性和特异性，分别为：96.52%、92.48%和96.27%、89.28%。根据数据表明，该检验方法能适用于淋病奈瑟菌的免疫检验，能够检测出淋病奈瑟菌的敏感性和特异性，并具有较高的准确性。

4 淋病奈瑟菌耐药性检测分析

淋病奈瑟菌的检测，对淋病的预防和控制、治疗等方面都具有重要作用。临床上将淋病奈瑟菌主要分为血清学分型、营养分型以及基因分型三种[16]。关于分型的方法，传统分型主要是根据淋病奈瑟菌菌毛的情况进行分型。而随着分子生物技术的不断发展，其分型技术的应用也较多，主要包括：随机扩增多态性DNA分型、OPA分型、PFGE分型等，这些分型法对产青霉素酶淋病奈瑟菌等具有耐药性菌株的分离鉴定有着重要的作用。

某研究将使用测定的200株NG，并对其进行质粒谱型分析，研究结果显示，NG具有抗生素耐药的特性，对其使用头孢曲松进行治疗的作用非常大。然而按照国际疾病预防提示，当其病原体对某抗生素的耐药率>5%时，该抗生素的疗效便大大降低，因此不建议以此作为首选药物。

5 结束语

目前国内淋病奈瑟菌的检验技术已经不断发展，从而大大提高了检测的准确性。尽管我国临床上对该技术的处理依然存在着各种不足，但随着科技的不断进步，实验条件不断改善以及试验的相关流程和规范建立起来，对淋病奈瑟菌感染的检测和诊断也会不断进步，诊断结果的准确性也会不断提升，并能广泛应用到淋病奈瑟菌感染以及其它性传播疾病的检验诊断当中，并具有较为广阔的研究前景。

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第5篇：微生物方法学研究范文

【摘要】 目的：利用尿素酶试验的方法对结核分枝杆菌的耐药性进行检测。方法：采用液体结核分枝杆菌的培养基加尿素和酚红指示剂，高压消毒灭菌，将分离纯培养的结核分枝杆菌接种其中， 再加入不同浓度的抗结核分枝杆菌的药物培养，分别设阳性和阴性对照。待阴、阳性对照结果完全清晰时，终止培养，观测结果。结果：结核分枝杆菌、在500 cfu/mL以上时，结果在3 d～7 d内显现;在500条以内时，其结果在培养7 d～10 d内显现；阳性菌株中，通过加温处死，其尿素酶试验均为阴性；与传统的绝对浓度法比较，差异无显著性（χ2=2.25，P＞0.10）。结论：尿素酶试验方法快速、简便，将对结核分枝杆菌耐药性检测提供一种新方法。

【关键词】 结核分支杆菌；尿素酶；耐药性

Abstract Objective:To determinate drug resistance of tubercle bacillus by employing urease test．Methods: The observed purified mycobacterium were inoculated into the specific autoclaved fluid mycobacterium medium with urea and Phenol Red， and incubated with different concentration of anti-tubercle bacillus drugs until the corresponding negative and positive results became apparent．Results: The results became apparent at 3 to 7 days when mount of the incubated mycobacterium is more than 500 cfu/mL， and 7 to 10 days when mount is less than 500 cfu/ml. To avoid the fake positive samples， the positive mycobacteriums were heating-killed and all tested as negative by urease test．Compared with traditional absolute concentration method， urease test method had no statistic differences (χ2=2.25，P＞0.05)。Conclusion: Urease　testing is a convenient and rapid method to inspect drug resistance of mycobacterium tuberculosis.

Key words Mycobacterium tuberculosis；Urease；Drug resistance

尿素酶是一种胞外酶，多数细菌含有该酶，可分解尿素，使环境变碱，所以，常用尿素酶试验来进行细菌的鉴定。分枝杆菌多数菌种含有尿素酶，如结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分枝杆菌均为阳性。而这些分枝杆菌是临床结核病的主要病原体。

尿素酶的存在是结核菌具有活性的标志之一，如果在培养中加入某种药，控制了该酶的产生，则说明某种药物对结核分枝杆菌有杀菌效果。否则尿素酶继续产生，利用该机制我们设计了结核分枝杆菌耐药性的尿素酶测定试验。现将我们的研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种：本室保存的耐药结核分枝杆菌菌株，临床标本常规处理后，分离培养鉴定结核分枝杆菌菌株。对照菌株购自中国生物药物鉴定所细菌室（菌株编号H37RV）。

1.1.2 培养基：绝对浓度法采用豆浸液改良罗氏培养基［1］；尿素酶法采用含尿素和酚红指示剂的结核分枝杆菌液体培养基（苏通氏培养基）。

1.1.3 抗痨药物：14种抗痨药物均购自上海医药集团有限责任公司信宜制药总厂，其中利福平(RFP)、 异烟肼(INH)、乙胺丁醇(EMB)、 利福定 (RFD)、利福喷丁(RFPD)、吡嗪酰胺（PAZ）、立刻肺疾、卷曲霉素(CPM)、环丝氨酸(CS)取得该厂的纯品药物；而卡那霉素(KM) 、对氨柳酸（PAS）、丁胺卡那、奥复星、链霉素(SM) 使用该厂的注射用瓶装药，取得了该厂此批药物的药物效价，并严格按照结核病诊断细菌学检验规程中，抗结核药物溶液配制及稀释的方法进行计量的折算［1］。

1.2 方法

1.2.1 含尿素结核分枝杆菌培养基的制备：成分：天门冬酸4.0 g，枸橼酸2.0 g， k2HpO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，0.1%酚红25 mL，枸橼酸铁铵0.05 g，甘油 60 mL，蒸馏水1 000 mL，尿素 12 g(0.12%)［1］，另外采用固体方法进行药敏试验时，培养基可选择改良罗氏培养基。其制备方法略有不同。

制备方法：将上述成分混合于蒸馏水中，加温溶解，调pH为6.8，过滤，分装三角烧瓶，每瓶装99 mL，121.3 ℃15 min，高压灭菌，4 ℃～8 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 琼脂绝对浓度法培养基的制备与药物的浓度：绝对浓度法严格根按照中国防痨协会，结核病诊断细菌学检验规程的方法操作［1］。

1.2.3 试验菌液的配制：将试验菌接种于豆浸液结核分枝杆菌培养基培养20 d，待生长至培养基斜面的1/3以上时，刮取菌落，粘磨，并用硫酸钡比浊管比浊，用Teen-80生理盐水配成5×105/mL～5×106/mL菌悬液，采用10倍递次稀释，待用。

1.2.4 药敏试验的操作方法：将分离培养、鉴定，并稀释配置成5×103 cfu/mL的浓度的结核分枝杆菌，分别接种在已分装好的，含有药物的14管培养基中，每管接种0.2 mL，使每管培养基中的细菌浓度约为500 cfu/mL，每种药物分别作高低两种浓度的试验，设空白对照各1管， 尿素酶阳性菌株对照1管，37 ℃培养7 d～10 d， 以阳性菌株的培养液呈现红色，为终止培养的判定终点。同时用传统结核分枝杆菌耐药测定法-绝对浓度法，进行接种作为对照，观测其该方法（尿素酶法）与传统法在耐药性检测中的相符性或有无显著的差异。

1.2.5 结果判断：培养基呈现红色为耐药，培养基呈现黄色为敏感，培养基呈现淡红色为中度敏感（或中度耐药）。

1.2.6 质控方式：每次均用结核分枝杆菌H37RV药物敏感株作对照，进行质量控制。

1.2.7 数学统计：采用配对资料的卡方检验以及符合率的计算。

2 结果

两种方法检测临床鉴定结核分枝杆菌耐药性的结果分析，见表1～表4。表1 两种方法检测结核分枝杆菌对14种抗痨药物耐药结果从表1的结果分析，尿素酶法检出耐药菌株173株，总耐药率24.3%；传统绝对浓度法检出耐药菌株180株，总耐药率25.7%。经卡方检验，尿素酶检测法与传统绝对浓度法，在对上述结核分枝杆菌的耐药性检测中，差别无显著性（χ2=2.25，P＞0.10）。说明尿素酶法在对结核分枝杆菌的耐药性检测方面具有可靠性，其检出结果与传统绝对浓度法具有可比性，两种方法无显著性差异。表2 两种方法检测167株结核分枝杆菌对利福定耐药性结果的比较表2的结果分析若以传统绝对浓度法检测的结果为判断标准，则尿素酶法检测RFD耐药性符合率为96.4%。 表3 尿素酶法检测50株对吡嗪酰胺耐药的结核分枝杆菌重复性试验结果比较

对临床分离鉴定的并用绝对浓度法测定的50株耐吡嗪酰胺的结核分枝杆菌，用尿素酶进行了耐吡嗪酰胺的重复性试验，首次检测耐药菌株数48株，敏感2株；再次检测，敏感菌株为1株，耐药菌株49株，符合率94%（47/50）。

武延隽等.利用尿素酶试验测定结核分支杆菌耐药性的方法学研究表4 两种方法检测5种规定必作药敏结果

药物尿素酶法测定结果传统绝对浓度法测定结果敏感株耐药株符合率(%)异烟肼（n=50）敏感株350 耐药株015100乙胺丁醇（n=50）敏感株450 耐药株05100链霉素（n=50）敏感株52 耐药株04396对氨柳酸（n=50）敏感株355 耐药株01090利福平（n=50）敏感株350 耐药株51090

用两种方法检测50株临床分离鉴定的结核分支杆菌对5种必作药物的耐药性，结果见表4。检测异烟肼药敏结果相符50株（100%）。不符0株（0%）；检测乙胺丁醇药敏结果相符50株（100%），不符0株（0%）；检测链霉素药敏结果相符48株（96%），不符2株（4%）；检测对氨柳酸药敏结果相符45株（90%），不符5株（10%）；检测利福平药敏结果相符45株（90%），不符5株（10%）。

3 讨论

尿素酶试验是鉴定性试验，应用于结核分枝杆菌的耐药性检测，主要是通过恢复性试验，观测尿素酶检测结果的敏感试验管和耐药试验管中细菌的存活情况，本文结果显示，在耐药试验管中的结核分枝杆菌，在无药的豆浸液罗氏培养基中生长，而敏感试验管中的结核分枝杆菌在该培养基中不生长。特异试验进一步证实，处死菌尿素酶试验均为阴性，而未处死菌均为阳性，表明通过尿素酶方法所检出的药敏试验的特异性。

在对结核分支杆菌的耐药性检测中，用两种方法检测异烟肼、乙胺丁醇相符率为100%；检测链霉素相符率为96%；检测PAS和利福平相符率90%。尿素酶检测法与传统绝对浓度法差别无显著性（χ2=2.25，P＞0.10）；说明尿素酶法与传统的绝对浓度法检出的结果具有可比性。然而，尿素酶法是利用细菌生理状态的改变，来确定细菌对某种药物的敏感性的，这种方法比绝对浓度法时间短，绝对浓度法的结果需要30 d的时间，而尿素酶法最长时间10 d；尿素酶法在培养基的制备，具体的操作上都比较容易，有利于临床推广使用。

应当指出的是：因有些分枝杆菌的尿素酶均为阴性，如戈氏分枝杆菌，蟾蜍分支杆菌，鸟分枝杆菌以及胞内分枝杆菌，尿素酶方法不能用于这些分枝杆菌株的耐药性的检测；该方法的灵敏度与噬菌体生物裂解法有一定的近似性，在500 cfu/mL时以上时，结果在3 d内显现;在500 cfu/mL内时，其结果在培养7 d～10 d内显现，所以当标本中菌数较少时一般不要做直接的尿素酶法的耐药性测定，直接对标本中的结核分枝杆菌进行耐药性测定的条件有待进一步研究；该试验所用的培养基的pH值对试验的结果有一定的影响，所以用弱酸弱碱处理过的试验菌一定要进行pH值的调整，应将pH值调整至6.8，否则影响试验结果。在试验所用的培养基中不可用天门冬素（L-天门冬酰胺），有该药的培养基经高压消毒灭菌后L-天门冬酰胺可破坏产生胺可使培养基的pH值改变，显示红色。

总之，尽管有多种因素可影响该试验的结果，但因本方法操作简便，省时，有一定的特异性和敏感性，所以将对结核分枝杆菌耐药性检测提供一种新方法。

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第6篇：微生物方法学研究范文

【关键词】 广藿香油；藿香油；综述

广藿香油又称百秋李油，是从唇形科刺蕊草属植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.中提取的挥发油，是广藿香的主要药用成分。藿香油是从唇形科藿香属植物(土)藿香Agastache rugosa (Fisch.et Meyer)O.ktze中提取的挥发油，是常见的天然香料。两者来源不同，但目前在应用上有人不加以区分。这一做法是否合理？两者是否可以混用？为此，笔者将从历史沿革、成分研究、药理研究和安全性研究进行简要综述，以期为广藿香油及藿香油的合理运用提供依据。

1 历史沿革

目前，广藿香油与藿香油出现混用的状况与历史上广藿香与(土)藿香的混用有很大关系，因此，有必要弄清楚中药材发展史上广藿香与藿香的关系。中医处方中的藿香，均以藿香名之，更未明确规定其品种[1-2]。一般认为，广藿香和(土)藿香是中药材藿香的2个不同品种。自宋金元以来，本草著作中记载的藿香均为广藿香，而明代以来一些本草著作中记载的藿香则为(土)藿香[3]。有学者则认为广藿香与(土)藿香混用是因为地方用药习惯不同而混淆药名[4]。目前，广藿香多以其挥发油或全草配合其他中草药组成复方使用。从历年版《中华人民共和国药典》(以下简称“《药典》”)收载情况来看，只有1977版《药典》同时收载(土)藿香和广藿香[5]，以后各版《药典》均只收载广藿香，而2005版《药典》更是将广藿香油列入植物油脂和提取物项下单独收载[6]。由此可见，广藿香才是药用藿香的正品。实际上，藿香在我国历史上最初并非作为药物，而是作为香料为人们所应用[3]。直至现代，广藿香油和藿香油作为天然香料亦受到国内外香精香料研究工作者的重视。为进一步开发广藿香油和藿香油，必须对两者加以深入研究。

2 成分研究

2.1 广藿香油

对广藿香油成分的研究分析开展较早，且随着气相色谱(GC)、气-质联用(GC-MS)技术的普及，挥发油的分析越发简便。张氏等[7]运用GC-MS法从广藿香挥发油中分出了55个成分，鉴定了其中24个，其中广藿香醇含量达31.86%。王氏等[8]运用GC-MS从高产广藿香挥发油中分出64个化学成分，并鉴定了其中31个，其中广藿香醇含量为31.66%，广藿香酮含量为23.58%。

随着研究的不断深入，研究者们分别对不同产地、不同采收期的广藿香挥发油进行了研究。罗氏等[9]运用GC-MS联用技术比较了不同产地、不同采收期的广藿香挥发油的主要成分含量，并根据挥发油成分的不同，将不同产地的广藿香分为2个化学型，即广藿香酮型和广藿香醇型。在广藿香挥发油质量控制方面也有相关报道，魏氏等[10]通过GC-MS法对不同采集期石牌广藿香及其他产地的广藿香挥发油进行比较分析，建立了石牌广藿香挥发油的指纹图谱。

以上文献及大量相关的研究表明，广藿香油的主要成分有2个，分别是广藿香醇(Pachouli alcohol)和广藿香酮(Pogostone)。两者在广藿香挥发油中的相对含量按品种和产地不同有一定的差异。其结构式如下：

2.2 藿香油

目前国内对藿香油的研究较少，而国外对藿香属植物的挥发油成分研究较多。Fujita等[11]对日本境内的藿香进行研究，发现在大阪、兵库县附近生长的藿香A.rugosa var.hypoleuca Kudo的挥发油成分主要为甲基胡椒酚(Estragole，占总量的90%)，在北海道采集的藿香A.rugosa var. methyleugenolifera Fujita挥发油的主要成分则为丁香酚甲醚(占总量的80%以上)。王氏等[12]采用GC-MS联用技术，分别对采自湖北巴东县、河南郑州郊区与河南栾川县的藿香A.rugosa挥发油进行研究，发现产自巴东及郑州的藿香挥发油主要成分均为甲基胡椒酚，而产自栾川的藿香挥发油主要成分则为丁香酚甲醚。通过研读国内外关于藿香挥发油研究的文献，可以认为，绝大多数藿香挥发油的主要成分均为甲基胡椒酚。其结构式见图3。

3 药理研究

3.1 广藿香油

国内对广藿香油的药理研究较为广泛，赵氏等[13]研究了广藿香油对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响和对醋酸引起扭体实验的影响，研究了广藿香油的抗炎、镇痛作用。有学者研究认为，藿胆丸中广藿香油具有抗炎、抗过敏的作用[14-15]。苏氏等[16]对11种真菌和5种细菌进行了体外抗菌实验，结果表明，广藿香油对黄曲霉和黑曲霉的抑制能力较差，但对新型隐球菌、球毛壳霉和短柄帚霉的生长抑制比较显著，其最低抑菌浓度(MIC)低于0.11 mL/L，预示其具有治疗艾滋病患者(AIDS)并发隐球菌感染及新型隐球菌引起的肺炎、慢性脑膜炎的前景；对能感染身体任何部位的白色念珠菌的抑制能力也比较好(MIC为0.14 mL/L)；而对小孢子菌的抑制有助于治疗表皮癣菌病。

在抗细菌实验中，除大肠杆菌外对4种细菌都较为敏感，表明广藿香油具有较强的抗菌活性。刘氏等[17]对以广藿香油为主要成分的藿香正气水进行的药理研究表明，广藿香油对豚鼠离体十二指肠自动收缩及对组胺、乙酰胆碱(Ach)、氯化钡所致的回肠收缩均有良好的抑制作用，也能对抗垂体后叶素引起的子宫平滑肌收缩。国外对广藿香油的研究也散见于相关文献。Osawa等[18]报道，广藿香油可抑制放线杆菌属、梭杆菌属、噬二氧化碳细胞菌属、埃肯菌族及类杆菌属等多种牙周病菌。Pattnaik S等[19]发现，广藿香油对20种细菌和12种真菌具有抑制作用。Wei A等[20]报道广藿香油中的百秋李醇具有显著的抗氧化活性。Yang Y等[21]研究发现广藿香油具有止吐作用。

3.2 藿香油

国内比较少见对藿香油的单独研究。Shin S等[22]对藿香油及其中的主要成分Estragole进行了相关研究，发现藿香油及甲基胡椒酚都对真菌表现出明显的抑制作用；另一项研究则发现，甲基胡椒酚对念珠菌有抑制作用。Friedman M等[23]在一项抗菌物质筛选实验中发现，甲基胡椒酚对空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李司忒(氏)菌和沙门氏菌都表现出明显的抑制作用。

3.3 广藿香油与藿香油抗菌作用比较

杨氏等[24-25]通过研究广藿香油与藿香油对16种皮肤细菌的体外抑制作用发现，藿香油抗菌作用很弱，干燥棒杆菌、固着微球菌和莫拉氏菌3种最敏感的菌种在油浓度高达1500 μL/L时仍表现出与对照组细菌几乎相同的生长速度和菌落特征；而广藿香油在药物培养基小于400 μL/L时仍可完全抑制16种供试菌当中的13种。结果更显示，广藿香挥发油在某种浓度下能抑制异源或负责菌的生长繁殖，而不破坏正常微生物的生态平衡。在另一项研究广藿香油与藿香油对12种皮肤癣菌和条件致病真菌的体外抑制作用中，发现2种油都可以选择性地完全抑制皮肤癣菌的生长繁殖，而对条件致病菌的生长繁殖几乎没有影响，其中广藿香油表现出对皮肤癣菌很好的特异选择性抑制作用(MIC为50～400 μL/L)。而藿香油对皮肤癣菌抑制作用较弱(MIC为700～1000 μL/L)。

4 安全性研究

4.1 广藿香油安全性研究

迄今尚未发现广藿香油或其主要成分广藿香酮及广藿香醇的相关安全性研究报道。2005版《药典》并未明确规定其用量，只是要求按具体处方量添加[7]。在常用的藿香正气制剂中，包括藿香正气口服液、藿香正气水、藿香正气软胶囊，在2005版《药典》中均以广藿香油替代[26]。

4.2 藿香油安全性研究

目前，国内关于藿香油安全性研究的报道多为翻译或参考国外资料。国外报道较多的主要为藿香油中主要成分Estragole的安全性数据。在致癌性研究中显示，长期饲服甲基胡椒酚或皮下注射、腹腔内注射甲基胡椒酚均证实其具有致癌性，且多为肝脏肿瘤；研究还发现，甲基胡椒酚的1-羟基代谢物具有更强的致肝癌性[27-28]。在致突变性研究中显示，Ames试验中对大多数菌株均有致突变性[29-30]。其他研究发现，甲基胡椒酚的代谢产物(1-羟基甲基胡椒酚等)可在体内及体外形成肝脏DNA加合物[31-32]。在药物动力学及药物代谢学研究中则发现，甲基胡椒酚的代谢途径有2种：一种是以CO2为最终代谢产物排泄；另一种是以1-羟基甲基胡椒酚为最终代谢产物排泄[33-34]。两种代谢途径同时存在，并与给药剂量有关。

5 小结

上述研究表明，广藿香油与藿香油来源于同科不同属植物的提取物，化学成分和药理作用明显不一样。广藿香油主要含广藿香醇及广藿香酮(总量占40%以上)，不含甲基胡椒酚，具有抗炎、抗过敏、提高免疫、抗菌、镇痛、抗痉挛、抗氧化、止吐等作用，且无不良反应报道，在中成药中大量应用；藿香油主要含甲基胡椒酚(占80%以上)，不含广藿香醇及广藿香酮，虽有抗菌作用，但逊于广藿香油；具有抗菌、解痉、镇静及升高白细胞的作用，但存在致癌和致突变的安全性问题，目前未见在药品中应用。特别值得关注的是，广藿香和藿香在中药处方中曾有混用的历史，现在仍在混用；而广藿香油及藿香油应用范围涵盖了药品、食品、香料等领域，在使用过程中必须对两者的安全性加以考虑，区分运用。目前，国内常用广藿香油替代广藿香和藿香用于中成药生产，而非用藿香油替代广藿香和藿香，正是基于药效和安全性的考虑。

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