商业计划书感想精选(九篇)

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第1篇：商业计划书感想范文

关键词:红花注射液;内毒素;急性肝损伤;Bax Bcl-2;Bax/Bcl-2

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)01-0159-04

Effects of Safflower Injectionon on Bax Bcl-2 and Bax/Bcl-2 in Rats with

Acute Hepatic Injury

CHEN Ying1,HUANG Xiaomin2

(1.Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053,Zhejiang,China;

2.Zhejiang Hospital of TCM,Hangzhou 310006,Zhejiang,China)

Abstract:Objective:To observe the protective effects and mechanism of safflower injection (SI) on rats with acute hepatic injury (AHI) induced by endotoxin. Methods:80 male Sprague-Dawley rats were randomly divided into ten groups, three SI treated groups, three reduced glutathione treated groups, three AHI model groups, and one control group. The rats were intraperitoneal-injected with Lipopolysaccharide (LPS) plus D-galactosamine (D-GalN) for modeling. The SI treated groups was injected SI into a tail vein, and the reduced glutathione treated groups was was injected reduced glutathione as the positive control. The blood from the abdominal vein and liver tissue samples were obtained at 6h, 24h and 48h after modles established. The contents of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) were tested, the hepatic pathological changes were observed with hematoxylin-eosin (HE) stain, and the expression of Bax, Bcl-2 were detected by immunohistochemical studies. Results:Compared with the control group, serum levels of ALT and AST in rats of the model groups significantly elevats at 6h, 24h and 48h time points (P

Key words:SafflowerInjection; endotoxin; acute liver injury; Bax;Bcl-2; Bax/Bcl-2

红花又名红蓝花、草红花、刺红花,药用来源于双子叶植物纲菊科一年生草本植物红花CarthamustinctoriusL的筒状花冠,始载于《开宝本草》,性味辛、微苦、温,归心、肝经,具有活血通经、祛瘀止痛的功效。《本草纲目》记载红花能“活血润燥、止痛、散肿、通经”,为内、外、妇、伤各科血瘀证的要药。红花注射液是由中药红花中提取制备的灭菌水溶液,其主要成分是红花黄色素(safflor yellow,SY)。研究证实:活血化瘀注射液可显著提高内毒素血症大鼠生存率, 拮抗炎性细胞因子, 减轻肝细胞损伤, 对内毒素血症大鼠有一定的保护作用[1]。本实验欲通过红花注射液对LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤大鼠模型[2]大鼠的Bax、Bcl-2表达及其比值的影响,并与传统护肝药还原型谷胱甘肽对照,探讨预防性给予红花注射液对内毒素性急性肝损伤的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物来源 分组

清洁级雄性SD大鼠80只,体重(200±10)g(浙江中医药大学实验动物中心提供)随机分为模型组、红花注射液干预组(红花组)、还原型谷胱甘肽干预组(TAD组)及空白对照组。模型组时相点设为6、24、48h,红花注射液干预组、还原型谷胱甘肽干预组(TAD组)时相点同模型组;每时相点10 只动物;空白对照组10只动物。

1.2 实验动物处理

模型组以腹腔注射LPS(Sigma公司)(50μg/kg)+D-GalN(Sigma公司)(300mg/kg)建立大鼠急性肝损伤模型;红花组、TAD组在建模前0.5h分别以红花注射液(生产,批号071101)(2.5mL/kg)、还原型谷胱甘肽(商品名:泰特、TAD,意大利福斯卡玛生化制药公司生产,批号37016/37003)(108mg/kg)尾静脉注射1次。

1.3 标本采集与处理

红花组、TAD组、模型组分别于建模后各时相点及空白对照组在6h时3%戊巴比妥钠(1mL/100g)腹腔注射麻醉,在无菌条件下腹腔静脉取血4mL,离心分离血清,ElectroluxBCD-277双温冰箱-20℃保存备用。取肝左叶组织于10%中性甲醛溶液中固定,固定后的肝组织常规方法石蜡包埋、切片。

1.4 肝损伤指标的测定

1.4.1 血清生化指标测定使用日立7020全自动生化分析仪测定各实验组大鼠ALT、AST水平。

1.4.2 肝组织病理切片 组织切片常规HE染色,光镜下进行组织形态学观察。

1.5 肝组织细胞的Bax Bcl-2表达

参照二步法抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒(上海基因技术有限公司,兔抗鼠bax多克隆抗体、兔抗鼠bcl-2多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司)推荐方法进行。计分标准:每张切片随机选取5个高倍视野(400倍),根据着色程度及着色细胞阳性范围进行计算,着色程度:不着色者为0分,着色淡者为1分,中等着色为2分;着色深者为3分。着色细胞阳性范围;无着色为0分,着色阳性细胞小于1/3为1分,着色阳性细胞1/3～1/2为2分,着色阳性细胞大于1/2为3分;将每张切片着色程度与着色细胞阳性范围得分各自相加为其最后计分。

1.6 数据统计

采用SPSS 13.0软件进行分析,资料以±s表示,计量资料组间差异采用单因素方差分析,计数资料组间差异采用非参数的秩和检验,两两比较采用SNK-q检验。

2 结 果

2.1 光学显微镜下病理检查

空白对照组大鼠肝组织光镜下结构完整、清晰,肝小叶结构正常,无中性粒细胞浸润,无肝组织细胞变性坏死现象;模型组大鼠肝组织6h切片可见炎细胞浸润和点片状坏死,24h切片肝组织结构尚存,可见肝组织细胞肿胀、边界模糊,肝组织细胞有大片状坏死和多量炎细胞浸润;48h切片肝组织小叶结构紊乱,可见肝组织细胞坏死更加明显,弥漫性炎细胞浸润。红花组及TAD组大鼠肝组织细胞坏死和炎细胞浸润减少,肝组织细胞水肿减轻,肝小叶结构接近空白对照组肝组织,其病理改变较模型组同时间点明显减轻。

2.2 血生化检测

模型组血清ALT、AST在6h开始增高,48h血清ALT、AST仍处于较高水平,各时间点测定均显著高于对照组;红花组及TAD组大鼠血清ALT、AST各时间点虽高于对照组,但明显低于模型组,差异有统计学意义(P

2.3 肝组织Bax Bcl-2蛋白表达 Bax Bcl-2阳性细胞表现为细胞浆棕黄色染色。

Bcl-2在大鼠肝组织主要表达在汇管区、肝窦、肝组织细胞的胞浆中;Bax在主要表达在肝组织细胞浆,其次在肝窦和中央静脉有表达,见图1、图2。空白对照组可见少量阳性表达;模型组各时间点Bax、Bcl-2蛋白明显上调,与空白对照组有统计学差异(P

3 讨 论

急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)是指原来不存在肝硬化的病人在一种或多种较强的致病因素作用下,引起的急性、大量肝组织细胞坏死,或肝组织细胞内细胞器严重功能障碍,在疾病发生26周内出现肝功能迅速恶化,并导致精神异常及凝血障碍的一种临床综合征,具有相当高的死亡率。ALF的发生是肝组织细胞的急性大量死亡不能为细胞增生所补偿的结果[3]。研究证实急性肝衰竭患者肝组织细胞的死亡表现为凋亡和坏死, 而且凋亡是其主要的病理改变[4]。人体肝组织学检查和动物实验均证实了凋亡在急性肝损伤、肝衰竭的细胞死亡中起重要作用[5-6]。现在认为,肝组织细胞凋亡是肝衰竭分子机制中最重要的事件[7]。

早在1995年韩德五就提出内毒素血症特别是肠源性内毒素血症是肝功能衰竭发生的物质基础[8]。内毒素引起的脏器功能损伤和多器官功能障碍综合征过程中,肝脏既是清除内毒素的主要器官,同时也是内毒素血症时受损最早、最明显的靶器官之一[9]。本实验研究中,笔者采用LPS/D-GalN急性肝损伤大鼠模型。D-GalN为一种选择性损害肝脏的药物,能消耗肝细胞三磷酸尿酐(UTP),抑制RNA合成;促使肥大细胞脱颗粒释放组胺,造成结肠水肿,使肠源性内毒素吸收增加,增强小鼠对LPS的敏感性(约100 000倍)[10];而LPS与血清中的LPS结合蛋白(LBP)形成复合物, 与细胞膜上的结合受体CD14结合后, 在MD2等蛋白协同作用下, 由信号受体TLR4将信号传导到胞内, 促进炎症介质IL-1、TL-6和TNF-α的释放,导致肝组织细胞凋亡、坏死[11]。

ALT、AST为氨基酸代谢中的重要酶,在于肝组织细胞内ALT主要分布于细胞浆内,AST分布于细胞浆和线粒体中,正常时血清内含量很低,当肝组织细胞受损伤时,细胞膜结构破坏,即可从细胞内逸出而进入血液循环中,此时血清ALT、AST较正常增高,在排除肝外脏器病变的情况下,血清ALT、AST在一定程度上反映了肝组织细胞损害和坏死的程度。本实验中,模型组与空白对照组比较显示:LPS在6h内即造成了D-GalN致敏大鼠血清ALT、AST升高,且肝组织见炎细胞浸润和点片状坏死进行性加重,表明LPS+D-GalN可成功复制急性肝损伤。红花注射液及还原型谷胱甘肽预处理的两组大鼠肝脏的细胞坏死和炎症程度均较模型组明显降低,血ALT、AST均明显下降,表明红花注射液对内毒素性急性肝损伤大鼠具有较好的保护作用,并于24h、48h时作用较明显,且效果与还原型谷胱甘肽相当。哺乳动物细胞凋亡是受Bcl-2蛋白家族、调节蛋白凋亡激酶激活因子1(Apaf-1)、caspase蛋白家族等调控的。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族中两个典型的抑凋亡和促凋亡蛋白,且二者通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡。当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡;Bax与Bc1-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能[12]。Bax与Bcl-2的比值决定同源二聚体(Bax/Bax)与异源二聚体(Bcl-2/Bax)的比值,这对决定细胞是否进入凋亡状态有重要意义。这一家族蛋白在肿瘤中研究最多,证实了在1993年Korsmeyer就提出的假说:在外界因素刺激下细胞的生死最终取决于Bcl-2和Bax两种调控因子的平衡结果[13],但在内毒素性急性肝损伤中研究较少。本实验中,免疫组化法检测肝组织Bax、Bcl-2的表达结果显示:模型组与空白对照组比较:在肝损伤程度加重的情况下Bax、Bcl-2表达均上调与以往研究中bax上调, bcl-2下调[14],或bax上调,bcl-2无显著变化[15]并不完全一致,但是本实验中Bax/Bcl-2上升与以往研究结果一致,由此笔者认为在内毒素性急性肝损伤的发生、发展过程中,Bax/Bcl-2比值可能与肝损伤程度正相关,Bax/Bcl-2可能是肝组织细胞凋亡动态变化的决定性因素之一。红花组及TAD组与模型组比较:大鼠肝组织细胞Bax与Bcl-2表达及Bax/Bcl-2下降,表明红花注射液对急性肝损伤大鼠的保护作用可能是通过下调Bax、Bcl-2蛋白的表达及降低Bax/Bcl-2比值,从而抑制肝组织细胞的过度凋亡来实现的,该途径可能是其抗内毒素性急性肝损伤的主要机制之一。

综上所述,该实验于6h内即成功复制了内毒素性急性肝损伤大鼠模型。红花注射液可明显保护LPS/D-GalN诱导的肝组织细胞损伤,此作用可能与Bax/Bcl-2比值降低,从而抑制肝组织细胞的过度凋亡有关。它为防治所致危重症急性肝衰竭提供了新思路,并为临床应用红花注射液防治急性肝损伤提供了部分理论依据和实验基础。

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