基因工程载体的种类精选(九篇)

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第1篇：基因工程载体的种类范文

基因工程在医学上已得到广泛应用，并且应用领域不断被拓宽，取得了令人惊喜的成就。

1 基因工程制药

基因工程制药开创了制药工业的新纪元，解决了过去不能生产或者不能经济生产的药物问题。现在，人类已经可以按照需要，通过基因工程生产出大量廉价优质的新药物和诊断试剂，诸如人生长激素、人的胰岛素、尿激酶、红细胞生成素、白细胞介素、干扰素、细胞集落刺激因子、表皮生长因子等。令人振奋的是，具有高度特异性和针对性的基因工程蛋白质多肽药物的问世，不仅改变了制药工业的产品结构，而且为治疗各种疾病如糖尿病、肾衰竭、肿瘤、侏儒症等提供了有效的药物。众所周知，医治侏儒症的良药是人生长激素，倘若从人的尸体中获取，治疗一个病人就需要600具尸体的脑下垂体才能获得足够的量；倘若运用基因工程生产，就可从每升基因工程菌液中得到2．4g。人们为此而石破天惊的兴奋!成本如此之低，又如此之高产，其巨大的经济效益和社会效益，由此可见。

2 基因工程抗病毒疫苗

为人类抵御病毒侵袭提供了用武之地。基因工程乙型肝炎疫苗、狂犬病疫苗、流行性出血热病毒疫苗、轮状病毒疫苗等应用于临床，提高了人类对各种病毒病的抵御能力。比如，乙型肝炎病毒疫苗的问世，使我国新生儿不再遭遇乙型肝炎病毒的侵袭，也降低了人群肝癌的发病率。又如，为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”，就是按照人类的设计，把“生物导弹”发射出去，精确地命中癌细胞，并炸死癌细胞而不伤害健康的细胞。就单克隆细胞而言，单克隆细胞在肿癌的诊断检测、显示定位、监测病变、监测疗效等方面也有重要价值。人类还通过基因工程生产抵御各种病菌、血吸虫、虐原虫等疫苗，提高人体对各种传染病的免疫力。脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世，变革了机体的免疫方式。如今，人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒(人类免疫缺陷病毒)疫苗的早日问世。基因工程抗体技术的发展，为克服单克隆抗体生产细胞株在生产过程中的不稳定性，为生产大量高效抗病毒疫苗提供了先进的生产工艺。

3 基因工程治疗疾病

临床实践已经表明，基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如，不治之症——白痴病，用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因，就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传疾病约有4000种，包括单基因缺陷和多基因综合征。运用基因工程技术或者基因打靶的手段，将病毒的基因杀灭，插入校正基因，得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。人类精心设计的基因工程操作，克服了不同个体甚至物种之间由于器官移植所产生的免疫排斥作用，实现人体之间的移植已获成功，成功的实体器官移植有肾、心、肝、胰、肺、肠，也有双器官和多器官的联合移植。而人体与动物之间的器官移植成为现实，临床应用已是指日可待的事了。脱氧核糖核酸化学合成的完善和自动化，脱氧核糖核酸扩增技术的优化，为合成基因“探针”，提高临床诊断的质量，是人类所殷切企盼的。基因治疗有两种途径，一是体细胞的基因治疗，二是生殖细胞的基因治疗。体细胞的基因治疗是将正常的遗传基因导入受精的卵细胞内，让这种遗传物质进入受精卵的基因组内，并随着受精卵分裂，分配到每一个子细胞中去，最终纠正未来个体的遗传缺陷。而生殖细胞的基因治疗是将人类设计的“目的基因”导入患有遗传病病人的生殖细胞内，此法操作技术异常复杂，又涉及伦理，缓行之理充足，故尚无人涉足。

4 基因工程诊病

第2篇：基因工程载体的种类范文

关键词：基因工程;实验室建设;管理

中图分类号：G647 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）41-0270-02

实验室是高校开展大学生和研究生实验教学的主要场所，也是高校教师开展科学研究的重要平台，是一所大学教学、学科建设和管理水平的重要体现（袁继红等，2011）。通过实验室开展的实践教学是培养学生动手能力、创新能力以及理论联系实际的基本途径。基因工程是现代生命科学研究领域中一门极其重要的学科，我校生命科学学院开展的基因工程教学主要依托农业生物工程研究院的科研平台进行，对基因工程教学实验室进行建设和管理，期望达到教学、科研资源共享的目的。为此，以科研平台建设的是教学实验室有其不同于常规单一教学实验室的管理模式，能使大学生有更多的机会了解学科前沿和实际研究状况，在验证性实验的基础上融进创新性实验内容。经过几年的实践探索，在提高参与实验学生动手能力及培养创新思维发挥了重要作用，尤其是对进一步攻读相关专业硕士学位或博士学位的学生更具有意义。

一、基因工程实验室的实验内容与教学目标

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术、遗传工程或DNA重组技术等，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有遗传特性，获得新品种，生产新产品的现代生物学技术。以基因工程操作步骤为主线，含有目的基因分离、克隆，载体构建、转化、筛选鉴定等实验内容，设置和选择实验内容时既要注重专业性和可操作性，又要突出先进性和系统性。在通过课堂学习理论以后，需要通过实验对基因工程理论有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握DNA重组的原理和实际操作方法，并在实践中提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为学习相关专业课程以及从事生物技术相关领域的科学研究奠定基础。

我们所建设的基因工程教学实验室进行教学的目标是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。在教学中，我们以问题导向，充分调动教、学双方的主观能动性，积极组织学生参与实验的准备工作;在实验中，安排学生与教师共同讨论实验涉及的理论问题和实验内容可能应用的问题，指导学生分析总结实验结果和存在的问题。以培养学生兴趣为主，发展一批从事基因工程研究的后备力量，据不完全统计，继续深造读研的学生占总人数的30%以上。

二、构建实验体系，全面提高学生实验技能

基因工程实验内容主要包括基因获得、载体构建、基因导入、基因表达4个方面，但在进行实验教学时，往往不是完全直接以此4个方面开展实验。通过几年的本科基因工程实验教学经验，逐渐形成了以基因工程经典性、基础性实验为主，强调实验的连续性，并结合植物基因工程实验室研究设计实验。我们的做法是：

1.基因的获得，主要采用从克隆载体上酶切获得目标基因、通过PCR扩增目的基因、人工合成DNA序列。在基因分离、克隆这部分知识的实验室验证教学中，往往是安排“基因组DNA分离提取技术”、“RNA分离提取技术及cDNA反转录技术”、“基因酶切与DNA的琼脂糖电泳技术”、“PCR技术”、“电泳胶回收DNA技术”。

2.载体构建。这部分实验内容和基因获得部分是难以分开的，常常是将酶切后电泳回收的目标基因、RNA反转录的cDNA、人工化学合成的基因序列、PCR扩增的DNA序列构建在亚克隆载体上、或构建目标基因在表达载体上。这部分实验室教学内容主要有“载体构建技术”、“基因连接技术”等。

3.目的基因导入。根据受体细胞不同导入方法也不同，包括感受态细胞的制备、农杆菌介导转化法，基因枪法（或微弹轰击法），花粉管通道法以及显微注射技术等，结合本实验室研究内容，以植物细胞为主，利用农杆菌介导转化法，以模式植物烟草为受体材料，通过组织培养再生实验获得转目的基因烟草植株。

4.目的基因在宿主基因组上的整合、表达、检测及转基因生物的筛选，实验内容包括报告基因的组织化学染色、PCR扩增目的基因、southern blot、Northern blot、Western Blot等实验内容涵盖了基因工程的主要操作过程和内容，可使学术全面掌握基因工程技术。

结合本实验室特点，设置4个实验内容，包括DN段得连接、转化及酶切鉴定，农杆菌介导的植物遗传转化，转化植物的表型分析及鉴定，转基因植物的性状分析及基因表达产物提取和检测。从2006年开始，已经培养生物技术及生物科学专业的本科生600余人。

三、加强“物、教师、学生”管理，全面提高实验教学效率

仪器设备是基因工程实验得以开设的基础，本实验室仪器设备总值达到2394余万元，完全具备开展基因工程实验所需硬件条件。在实验过程中需要使用大量仪器，包括PCR仪、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、恒温水浴锅等，种类繁多，价格昂贵，学生很容易因为不当操作导致仪器损坏，导致维修经费开支巨大，因此“物”的管理显得尤为重要，必须严格建立实验仪器台账，利用仪器管理软件对仪器出入库、维修及报废等做好记录，便于对每台仪器随时跟踪管理。严格按照“账、物、卡”管理，每台仪器责任到人，做好使用登记，定期组织老师对仪器进行排查和维护，保证学生实验的顺利开展。

教师和实验技术人员是实验教学的实施者，在注重培养学生独立开展实验的能力的同时，教学中要引导学生注意理论知识与实验内容的结合，要讲解清楚实验内容的基本原理、操作的关键步骤，甚至要指出可能的误操作引起的问题。因此教师和实验技术人员业务水平非常重要，目前本实验室已有从事基因工程教学工作教师10人，均获得博士学位，专职实验技术人员9人（含博士1人，在读博士3人）。

学生作为实验教学的主体，在实验设置时应充分考虑学生的水平和接受程度，要鼓励学生按照操作步骤进行实验操作，也要要求学生清楚每一步操作步骤的理论原理以及所使用仪器的基本性能和操作标准规程，才能完成好实验内容的学习，对于出现的问题能够有自己的见解。只有做到“物、教师、学生”三者的有机结合，才能提高基因工程实验教学质量。

四、展望

基因工程是一门新兴的学科，由于基因概念较为抽象，单凭课堂讲解很难完全掌握该门课程的理论基础和操作技术，需要开展相应实验教学，印证课堂教学内容，通过课堂教学-实验教学-知识回顾，才能真正理解基因工程技术的精要内容。

参考文献：

[1]袁继红，李香花，朱意，付家忠.高校生化与分子生物学实验室建设与管理的实践[J].中国现代教育装备，2011，（11）.

[2]赵宏霞，王金平.关于强化实验室建设与工作管理的思考[J].农业基础科学，2009，（15）.

[3]王文娟，朱俊华，尹芳，张雪丹.“分子生物学实验”课程教学改革的实践与探索[J].北京城市学院学报，2010，（3）.

[4]崔芳，孟丽，支涛.电子显微学实验室建设及发展的思考[J].中国校外教育，2010，8.

[5]李开智，肖胜军，郭芳.病理学创新性实验教学初探[J].山西医科大学学报（基础医学教育版），2007，9（4）.

[6]刘幸福，吴元喜.在实验教学中试行“以学生为主体”的教学模式探讨[J].实验技术管理，2002（3）.

[7]谢青，杨广笑.分子生物学创新性实验教学的实践与探索[J].实验室科学，2008，（5）.

[8]李敏，李坚斌，梁兴泉.浅谈大学生创新实验[J].广西大学学报（哲学社会科学版），2009，31（增刊）.

[9]张文利，徐跃飞，董旭.医学本科留学生的生物化学实验教学[J].教育论坛，2008，13（5）.

[10]曹朝晖，龙石银，胡小波.把握专业特色提高生物化学实验教学质量[J].医学教育探索，2008，7（4）.

Discussion for the Construction and Administration of Genetic Engineering Laboratory in University

ZHAO Dan1，ZHAO De-gang1

（“The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region（Ministry of Education），Institute of Agro-Bioengineering and College of Life Sciences，Guizhou University， Guiyang， Guizhou Province 550025”）

第3篇：基因工程载体的种类范文

关键词：木糖筛选系统；木糖异构酶；蔬菜；遗传转化

转化效率低和转基因食品安全性问题一直是制约蔬菜基因工程育种的2个主要因素。在植物的遗传转化中，人们将植物细胞对不同糖类分解代谢能力的差异，作为筛选剂的正向选择系统得以发展，并在安全标记基因方面显示出巨大的应用潜力。

1?蔬菜遗传转化的研究现状及存在问题

随着植物基因工程技术的不断发展和完善，人们对蔬菜基因工程育种的研究日益增多，在蔬菜抗病、抗虫、改善品质及提高产量等方面取得了阶段性进展。

在目前的转基因技术中，对转化植株进行筛选往往采用抗性选择标记，如抗生素类或除草剂类抗性基因等。转基因植株一旦再生成功，这些抗性标记基因常与目的基因共转化并整合到植物基因组中，由此引发环境和食品安全性问题[1-2]；且在抗性选择剂的作用下，转化细胞成活下来，非转化细胞被杀死，因其在逐渐凋亡过程中能够分泌毒素或生长抑制剂，进而造成转基因体系的转化效率低[1]。鉴于这些情况，培育出转化效率高的生物安全标记基因的转基因植物，已成为目前基因工程的重要目标。

2?基于糖代谢相关基因的正向选择系统

2.1?糖代谢相关基因种类及选择优势

安全标记基因是对生态环境和人类健康相对安全的标记基因。研究较多的生物安全标记基因主要是与糖类代谢相关的基因，如磷酸甘露糖异构酶基因（pmi）、木糖异构酶基因（xylA）和核糖醇操纵子（rtl）等[3]。与糖代谢相关基因的转化系统不是将非转化细胞杀死，而是导入特定的基因使转化细胞具备特定的代谢优势或利用特定的物质，使之生长旺盛，从而达到筛选效果[4]。与常规标记基因不同，糖代谢相关基因具有以下优点：这些标记不具有抗性，基因本身及表达产物无毒副作用，因此不必担心环境安全和人类健康等问题；转化体系有利于植株再生，转化率高[5]。目前应用较多的是磷酸甘露糖异构酶基因，已广泛用于水稻、玉米、小麦、甜菜、棉花和番茄等植物转化系统[1]。近年来，木糖异构酶基因也得到初步应用。

2.2?木糖选择系统的筛选机理及应用

木糖异构酶基因（xylose isomerase gene，xylA），来源于红色链霉菌、高温厌氧芽孢杆菌，编码木糖异构酶基因，能催化D-木糖与D-木酮糖的互变异构（图1）[6]。

许多植物细胞可利用木酮糖作为主要碳源，但不能利用木糖。在含木糖的筛选培养基上，整合有外源xylA基因的细胞产生木糖异构酶能催化木糖异构为D-木酮糖，经磷酸戊糖途径分解代谢，为转化细胞生长所利用，而非转化细胞则因碳饥饿而不能正常生长[7]。用食品工业中常用的木糖作为植物转化细胞的筛选标记是安全的。

Haldrup等[8]首先应用D-木糖作为选择剂在烟草遗传转化上获得成功。韦正乙应用来源于大肠杆菌的木糖异构酶基因作为选择标记基因，建立了农杆菌介导的基于木糖选择系统的百脉根转化体系。实验对比了木糖筛选系统和除草剂筛选系统，在时间方面，木糖选择系统获得转基因再生苗要比除草剂筛选系统缩短10 d以上[9]。

3?木糖筛选系统在蔬菜遗传转化上的应用

以木糖作为筛选剂的无抗性选择标记技术是目前转基因研究的前沿。自1995年Vieille等[10]成功克隆并表达了木糖异构酶基因后，以木糖作为筛选剂的遗传转化已在多种粮食作物上得到深入研究，但在蔬菜上的应用却十分有限。

Haldrup等[8]将木糖异构酶基因通过农杆菌介导，成功地转化到马铃薯、番茄的愈伤组织中，然后将愈伤组织置于含有木糖的培养基中进行筛选，得到了能在该培养基中正常生长的转基因植株。应用木糖作为筛选剂的转化效率大致为18%～32%，明显高于应用卡那霉素筛选的转化率（4%～6%）。Haldrup等[11]最终确定以木糖作为筛选剂在番茄上进行遗传转化的碳源最佳配方为不含蔗糖，且D-木糖浓度为15 g/L，应用此配比的转化率可达9%，而用抗性标记选择的转化率仅为7%；马铃薯最适筛选配比为蔗糖7.5 g/L、木糖3.75 g/L，应用此配比的转化效率比用卡那霉素作为选择标记时高9倍，转基因植株中木糖异构酶活性为非转基因植株的5 ～25倍[12]。在不同作物中，木糖的筛选浓度有所差别，且转化率也有不同。

崔丽巍[13]以大肠杆菌xylA作为选择标记基因，利用木糖作为选择剂获得能够表达带有GUS报告基因的转基因黄瓜，同时还构建了pX390-scFv载体，初步建立了农杆菌介导的基于木糖选择系统的黄瓜转化体系。最终确定选择在培养基中加入 15 g/L 的木糖和 15 g/L的蔗糖，能获得较高的转化效率。

4?小结与展望

近年来，以糖代谢相关基因作为选择标记的正向选择系统得以迅速发展，目前应用较多的是磷酸甘露糖异构酶基因，而木糖异构酶标记基因应用相对较少，但已证明在植物遗传转化上是安全、有效的。

目前，笔者已经成功构建基于木糖异构酶标记基因的植物表达载体，并在马铃薯上应用D-木糖成功进行了遗传转化，建立了一套安全且转化率高的马铃薯转基因体系。在此工作基础上，将着力建立辣椒、黄瓜等受基因型限制、转化效率低的蔬菜作物遗传转化体系，提高蔬菜作物遗传转化效率，缓解因转基因食品安全性问题带来的困境，促进蔬菜基因工程育种工作健康发展。

参考文献

[1] 王彩芬.植物遗传转化中选择标记基因的研究进展[J].现代农业技术，2009（2）：6-10.

[2] 孙艳，戴绍军， 魏建华，等.转基因植物标记基因安全性研究进展[J].现代农业技术，2012（3）：17-20.

[3] 郭新梅，张晓东， 梁荣奇，等.以木糖异构酶基因为筛选标记的玉米遗传转化[J].植物生理与分子生物学学报，2007，33（6）：547-552.

[4] 毛萍，蒋彬， 马欣荣，等.木糖对多年生黑麦草愈伤组织生长的影响[J].草业科学，2011，28（5）：758-762.

[5] 孙磊，张国军， 闫爱玲，等.木糖异构酶基因xylA的克隆及其表达载体的构建[J].生物技术通报，2011（7）：167-170.

[6] 王烨，顾兴芳.无抗性选择标记转基因技术在蔬菜作物上的应用[J].中国蔬菜，2011（12）：1-9.

[7] 阎淑滑，周波， 赵霞，等.以木糖异构酶基因xylA为选择标记的Gateway系统植物表达载体的构建[J].生物技术通讯，2010，21（1）：35-38.

[8] Haldrup A，Petersen S G， Okkels F T. The xylose isomerase gene from themoanaerobac- terium themosulfurogenes allows effective selection of transgenic plant cells using D-xylose as the selection agent[J].Plant Mol Biol，1998， 37：287-296.

[9] 韦正乙.利用木糖选择系统获得HAL1转基因百脉根植株及耐盐性鉴定[D].长春：东北师范大学，2007.

[10] Vieille C，Hess J M， Kelly R M，et al.xylA coling and sequeneing and biochemical characterization of xylose isomerase from thermotoga neapolitana [J].Appl Environ Microbiol，1995，61（5）：1867-1875.

[11] Haldrup A，Petersen S G， Okkels F T.Positive selection： a plant selection principle based on xylose isomerase，an enzyme used in the food industry[J]. Plant Cell Reports，1998，18：76-81.

第4篇：基因工程载体的种类范文

关键词：生物技术；林木遗传育种；基因工程

中图分类号： S961.6 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20151132024

树木育种是林业发展中一个重要的组成部分，其可以为林业种植提供一大批新型的高质量品种，但是由于受到树木本身遗传特性的影响，部分遗传特性无法通过传统的手段来进行更改。而生物技术在其中的运用则可以彻底打破传统研究手段的弊端，从基因学等遗传角度来对林木育种进行分析和探究，以确遗传育种的质量，同时其也可以为林木遗传改良的发展奠定坚实的基础，所以对于生物技术在遗传育种中的应用进行研究具有重要的意义。

1 材料与方法

林木遗传育种实际上就是通过改良和探索林木遗传的规律和特性来提升林木种子的整体生长质量。本次研究主要借鉴国内外有关林木遗传育种方面取得的成就来进行分析和研究，以更好的指导我国林木遗传育种的发展。目前，我国林木种群面临这严峻的种植危机，所以林木遗传育种的重要性日益提升，其已经逐步成为林学学科中研究的龙头学科，但是林木遗传育种必须要切实结合常规育种和现代生物技术，以不断加快育种的进程，缩短育种周期，以创设出一大批新的品种。另外，本次研究主要采用文献参考法来借鉴林木遗传育种所涉及到的各个生物领域，具体主要包括林木基因组、林木遗传转化和林木基因工程等3个方面，同时就这些方面的研究内容进行了详细地分析和阐述。

2 结果

2.1 林木基因组方面

通常而言，生物学中的遗传标记主要包括分子标记、形态标记、同功酶标记和细胞学标记等几种标记类型，而分子标记则实际上是以DNA分子本身所具有的多态性为基础的一种遗传性标记形式，其可以充分反映生物个体以及群体间所具有的特定DN段。在当前的林木业中所用的分子标记方式主要由SSR（简单重复序列）、RFLP（限制性片段多态性）和AFLP（扩增片段多态性）等形式，并且已经广泛应用于基因定位、亲缘关系鉴定、克隆以及遗传育种等领域中，并且已经在基因控制方面取得了优异的成绩。

2.2 林木遗传转化方面

近些年来，我国在遗传转化效率提高方面进行了深入的研究，并且产生出一些新技术，比如超声波辅助农杆菌介导法（SAAT）、农杆菌介导结合法、低能离子束、负压与农杆菌介导结合法以及基因枪与农杆菌介导结合法等，这些均有助于提高相应的基因转化效率，增强农杆菌浸染质量。比如，在2003年时期，Zaragoza等将抗除草剂中的bar基因片段借助SAAT导入到刺槐中，并成功获得了的转基因植株。

2.3 林木基因工程方面

针对林木基因工程方面的研究，现在主要包括抗病基因工程、抗虫基因工程、抗逆基因工程以及木质素改良基因工程等几个方面。在抗病基因工程方面，我国在抗病毒基因研究方面的起步比较晚，借助的抗病毒基因只有黄瓜花叶、杨树花叶和洋李痘等病毒外壳蛋白基因。林木抗真菌基因主要包括角质酶基因和几丁质酶基因等类型，具体基因研究内容主要包括过氧化物酶、黄酮合成酶、抗菌肽以及溶菌酶等基因，并且以抗菌肽基因为主。比如，Scorza R.等将杏（Prunus）导入到洋李痘病毒（PPV）的外壳蛋白中，达到了提高该病毒植株抗性的目的。另外，实验人员借助农杆菌介导法将毛白杨导入到兔子体内克隆的防御基因中，并达到了抑制多种微生物生长的作用，比如立枯病、农杆菌和枯草杆菌等等微生物。

在抗虫基因方面。调查研究表明，当前全球范围中已经有超过60种转Bt杀虫基因植物。比如，张冰玉等借助根癌农杆菌介导法在银线杨基因组中导入抗鞘翅目害虫基因（Cry3A）而获取了新型的再生植株；而Southern及PCR点杂交的实验结果表明，外源基因已经可以被整合到杨树基因组中，并且经过生物学的研究，转基因株系BGA-5已经具有毒杀光肩星天牛以及抑制植物生长的效果，并且杀虫率高达30%，而抑制幼虫的生长率也达到80%左右。

在抗逆基因工程方面。植物本身的抗寒性主要是由多种基因所共同控制的，单靠几个基因是无法确保其抗寒特性的。比如，杨川平等以无菌叶片作为转化受体的主要材料，借助根癌农杆菌介导法来将Bet2A这一外源基因导入到小黑杨的无菌苗叶片中的特定基因中，同时对于已经获得转化的11株转化苗进行了斑点杂交和PCR扩增检测，并得知外援基因Bet2A已经顺利整合入小黑杨基因组中。又如，Wei Tang等在火炬松中借助根癌农杆菌介导法导入葡萄糖醇6-磷酸脱氢酶基因和甘露醇1-磷酸脱氢酶基因这两种类型的基因，并成功获得了具有高耐盐性的转基因植物品种。

3 讨论

在林木基因组方面。虽然传统的分子标记具有一定的优势，但是依旧存在着一些不足和缺陷，比如分子标记在各个遗传背景中的表现稳定性不足等。特别是随着杨属植物基因组计划的实施，该全基因组信息可以为其他类型林木基因组的研究与发展提供重要的参考，同时也可以帮助学生可以从特定的基因组中找寻其对应的功能，从而进一步加快分子育种技术的快速发展。

在林木遗传方面。林木基因工程开展的重要前提是要先建立一个科学、完善的遗传转化体系。但是遗传转化工作本身是一项综合性很强的工作类型，其主要包括：携带外源基因载体系统的构建、组培再生系统的建立以及基因转化系统的构建等。通常而言，林木的遗传转化实际上主要包括两个受体系统，即体胚发生与器官发生。胚状体再生系统本身具有很强的外援DNA接受能力，并且可以嵌合的转基因植株体比较少，加之其本身的繁殖率比较高，适合大规模生产，所以其是当前最为理想的基因转化受体系统。农杆菌是当前林木遗传转化的介导，而随身深入了解Vir基因在实际转化中的应用，大大提高了农杆菌介导转化的频率，同时也有利于提高Vir基因的实际转化效率。

在林木基因工程方面。林木病害是致使生产力出现降低的一个主要原因，所以在林木中导入抗病基因具有广泛的应用前景。虫害是影响林木生长的重要因素，甚至会毁灭一大片的森林。林木抗虫分子育种研究的基因类型主要包括蛋白酶抑制剂基因（PI）和苏云金杆菌毒蛋白基因等两种类型。目前，在病虫防治方面，我国对于苏云金芽孢杆菌制剂的应用已经具有数十年的发展和研究史，其所产生的Bt毒蛋白（昆虫毒素）已经被广泛应用于抗虫植物基因的研究中来。通过修饰、改造和表达Bt杀虫基因蛋白中的基因，可以更好地培育有关的抗虫转基因植物；而在当前的林木抗逆基因中，主要包括耐盐、抗旱和抗冻层基因类型，其中的耐盐和抗旱基因主要是与肌醇、甘露醇和脯氨酸等渗透压调节分子所合成的一种基因类型，比如乙醇脱氢酶基因和脯氨酸合成酶基因等；在抗寒、抗冻方面，已经在鱼类抗冻基因途径、糖类基因和超氧物歧化酶等的研究方面取得了很大成果。

随着生物技术的发展，基因工程等先进的遗传学知识为林木遗传育种的发展开辟了一条崭新的发展途径。其不仅可以突破传统育种手段的束缚，从DNA基因角度来对育种遗传进行研究，也可以大大节省人力、物力、和空间，提高林木遗传育种的研究质量，并在抗病基因工程、耐盐碱基因工程和提高光合效率等领域内均取得了突破性进展。相信在不久的过来，生物技术必将会为林木育种发展创造更大的经济和社会效益。

参考文献

[1] 沈熙环.林木常规育种与生物技术的应用[J].林业科技开发，2014，20（1）：1-4.

第5篇：基因工程载体的种类范文

关键词：芳香烃类化合物　微生物降解　生物强化　基因工程菌

一、芳香烃类化合物的来源与危害

目前，全球每年大约有百万吨芳香族化合物被制造出来，这些化合物除广泛用于生产塑料聚合物、农药、染料、医药和其它日用品当中外，还广泛应用于冶金、炸药和化工产品的制造中[1]。这些物质在制造与利用的过程中，其中的有害物质不可避免的泄漏到环境中，导致土壤和水体环境质量下降，危害生态系统安全，从而造成严重的环境污染。

众所周知，芳香烃类化合物是可致癌或有潜在致癌性的物质，由于它毒性强且结构较稳定，所以很难通过降解除去。传统的处理方法包括物理法和化学法，如活性炭吸附、溶剂萃取、焚烧、深埋等[2]，这些方法不但效率低、成本高而且容易造成二次污染[3],目前为降低环境中芳香烃的含量，世界上采用的最安全有效的方法即微生物技术。

二、常见的降解菌株及其降解机理

芳香烃类化合物主要包括：苯、硝基苯、烷基苯、卤代苯、苯胺等[4]。主要降解微生物有假单胞菌属、反硝化菌属、产甲烷菌属、节细菌属、芽孢杆菌属、无色杆菌属、棒状杆菌属、黄杆菌属、土壤杆菌属、黄单胞杆菌属、微球菌属、气杆菌属、埃希氏杆菌属等，以及一部分放线菌、真菌、藻类[5]。它们的代谢途径分为好氧代谢和厌氧代谢。

1.芳香烃的好氧降解

芳香烃的好氧降解较厌氧降解更容易实现，所以目前发现和研究的大部分微生物都是好氧微生物。正常条件下培养的好氧微生物可以产出混合功能的双氧化酶或氧化酶，这些酶在分子氧的参与下．使苯环羟基化。从而引发芳环的裂解，所以能有效地降解芳香烃化合物[6]。

Claude-henri等在对微生物降解土壤中石油烃的实验中发现，大部分的芳烃组分发生了降解。微生物降解芳香烃的最初途径是多种多样的，但这些反应均具有一致的中间产物。邻苯二羟基类化合物原儿茶酚和儿茶酚就是大多数微生物代谢芳香化合物的过程中产生的中间产物[7]，同时也是环裂开前共同的先导性中间产物。

2.芳香烃的厌氧降解

厌氧降解是指在缺乏氧气的外界条件下，一些厌氧微生物、兼性厌氧微生物将有机物作为电子供体，将除氧以外的其他物质作为电子受体，微生物在降解有机物的同时获取化学能量。厌氧条件一般可分为4种：严格的产甲烷环境或发酵，以硫酸盐为最终电子受体，以硝酸盐为最终电子受体以及以Fe(Ⅲ)为最终电子受体。

2.1严格的产甲烷条件或发酵

“产甲烷条件”是指适合甲烷产生的环境或发酵条件。在产甲烷条件下，最终电子受体——二氧化碳被还原成甲烷，在外界存在电子受体或发酵的条件下，厌氧微生物可以将醇、酸、醛、酚等含氧芳香烃厌氧降解。简单含氧芳香烃的降解是以还原反应为基础的，还原反应可将芳香环转化为带有含氧取代基的脂环，大部分此类脂环均可以发生水解反应并破裂。

2.2以硝酸盐作为最终电子受体

硝酸盐呼吸菌一般是兼性厌氧菌，在氧气消耗完全时呼吸菌即可利用硝酸盐。不同的微生物种群对于硝酸盐的还原作用不同，可将其还原为氨或分子氨。在脱氨实验过程中，陈余道等发现在3个月的驯化期后，原环境中 14c甲苯的含量为0.25 mg，其中有75％在8天内被全部菌群转化，生成14C二氧化碳；经过7个月的稳定期后，在相同环境下，8天内间一二甲苯中的80％被菌群转化，生成 14C二氧化碳，同时硝酸盐被还原为氨气[8]。

2.3以硫酸盐作为最终电子受体

硫酸盐可以作为硫酸盐还原菌厌氧代谢过程中的的外来电子受体。这种代谢通常是在硝酸盐耗尽时发生，硫酸盐在代谢过程中被还原为硫化氢。以硫酸盐作为最终电子受体的厌氧降解在很多环境中可被发现，硫酸盐还原菌能够降解苯甲酸、羟基苯甲酸和苯己酸等很多芳香烃化和物[8]。

2.4铁(Ⅲ)作为电子受体

此外，铁(Ⅲ)也可作为厌氧微生物降解芳香烃过程中，微生物生存需要的电子受体[9]。经研究，若含水层中含有丰富的铁(Ⅲ)，其中的微生物对于芳香烃类化合物的转化则较易进行。证明了铁(Ⅲ)还原与烃降解之间的相关关系。

三、生物强化技术

虽然目前通过实验研究已发现了很多种可以降解不同种类芳香烃化合物的微生物菌株。但一方面由于外界环境不适合某些菌株的生存，降低了它们的繁殖速度，使有机物难以按预期目标快速降解；另一方面，多数菌株具有较强的专一性，而污染环境中常存在多种芳香烃化合物，单一菌种不能独立清洁含多种有机混合物的废水,因此需要通过生物强化技术来解决这一问题。

1.生物强化技术

生物强化技术(Bioaugmentation)是指通过向传统的生物处理系统中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的浓度，增强对难降解有机物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物处理体系对难降解有机物的去除效能。

以姚秀清等运用生物强化技术对炼油废水中含量较高的几种芳香烃及其衍生物(甲苯、对二甲苯、乙苯、邻苯二甲酸二丁酯和苯并噻唑)进行降解的研究为例[10]。他们分别选育出了可专一高效降解上述5种难降解有机物的菌种，并按一定比例制备成复合菌剂，运用生物强化技术将复合菌投入模拟废水反应池中，观测其在反应池中的降解效率，研究生物强化技术的处理效果。

2.复合菌剂的作用

在模拟废水处理反应池中复合菌剂有较明显的生物强化作用。复合茵剂的投加可以增加COD的去除效率，减短反应达到平衡状态的时间，及增强抵抗负荷的程度。此外，不同的菌剂投加量，对系统反应速度加快及应对能力增强的效用也不同，生物强化作用在投加lO％高效菌的时候需要最短的启动时间。

复合菌剂的应用使系统内优势菌群的种类发生了变化，进而提高了系统污水处理的效率。但是对于提高系统中高效菌对环境的适应能力、降解活性、及增强菌群竞争能力等问题，仍然有待进一步研究。

四、降解性质粒的研究及基因工程菌的构建

由于系统中高效菌的生存能力低、降解效率差，且存在菌群竞争。因此，可以通过将降解性基因转入适应性较好、繁殖力强的菌株内，或将可降解不同有机物的多种基因克隆到同一受体菌株内，构建出高效“基因工程菌”[4]，达到彻底降解芳香烃类化合物的目的。

1.降解性质粒的研究

在研究苯及其衍生物的降解性质粒的过程中，人们发现在不同种类的微生物中，存在着一些极为类似的基因，它们控制了降解的关键途径。如在降解苯乙烯的过程中，产生的TOL质粒pWWO与PST质粒是十分相似的。可分解代谢甲苯的好氧质粒TOL质粒在假恶臭单胞菌MT一2菌株中发现[4]。目前，对于TOL质粒的形状、基因结构及调控机理等已研究透彻，成为了发现其他降解性质粒的良好开端。

近年来，我国在研究降解质粒方面取得了一定的成果，主要包括对降解性质粒的观察、检测、质粒提取、及确定酶所在位点等[11]，但关于目的基因调控、基因的定位等方面还有待于进一步研究。另外，很少有报道提到了降解性质粒对于蒽醌类化合物的降解研究。

2.基因工程菌的构建

基因工程菌的基本构建过程为：从染色体或降解性质粒中选取起关键作用的基因片段，将其接种在适当的载体上，一同移入受体菌中，此时受体菌便有了新的降解功能。将所选取的基因片段转入受体菌的主要方法有：接合型质粒转移、整合型质粒转移和重组质粒转化。

2.1接合型质粒转移(injugetive plasmid transfer)

接合型质粒转移指通过供体细胞与受体细胞的紧密接触，使质粒转入受体细胞当中，使基因通过细菌间的有效接触而发生的横向转移的过程[12]。Chatteriee DK 等将恶臭假单胞菌的TOL质粒pWWO接合到某一细菌的驯化菌株中，该细菌能将TNT苯环上的3个硝基氧化脱除，并利用其作为氮源来满足生存需要，获得的菌株既可以氧化消除硝基又可以降解甲苯，将TNT作为生存所需的碳、氮源，从而使其矿化。

2.2整合型质粒转移(integrative plasmid transfer)

将降解目的所需的基因连接到可整合基因的质粒(含F因子)上，之后一同移入受体菌中，使该基因片段永久性留存于受体菌的染色体上，使基因所表现的降解性能可以稳定遗传。

在用于耕作土壤中，Ka等研究发现了新的2,4-D-降解菌株，并从中分离出了可自我遗传的降解性质粒-，4-D。其中质粒pKA2在菌株2811P上。分离出最初驯化的2811C菌株，观测到所有pKA2质粒均已整合到受体菌染色体上，没有破坏2,4-D的性状。

2.3重组质粒的转化(recombinant plasmid transfer)

重组质粒是指向一个质粒中同时转入多个有不同降解能力的基因片段，使受体菌可同时降解多种芳香烃，扩大了菌种的可降解范围、增强了菌种的降解能力。

五、存在的问题及展望

综上所述，在实验研究中，复合菌剂的使用，以及基因工程菌的构建，均可大大提高芳香烃类化合物的降解效率。但是当将复合菌剂应用于现实环境中芳香烃类化合物的降解时，就会出现降解系统中高效菌的降解活性下降、存活能力差及菌群间出现竞争等问题。此外，关于基因工程菌方面，国内单纯研究了各种降解性质粒，国外已构建出一些基因工程菌，但由于其安全性问题，目前尚未投入工业化生产。

因此，如何解决以上问题，使复合菌剂以及基因工程菌能真正用于解决环境问题，快速、彻底的降解对环境造成危害的芳香烃类化合物，仍有待进一步的研究。

参考文献

[1]张晶.任庆.朱焕山.芳香族化合物生物降解研究现状与展望[J]辽宁城乡环境科技.2004,24(1).

[2]陈余道.朱义年.蒋亚萍.汽油污染含水层中芳香烃的自然去除与生物降解特征[J]地球化学.2004,33（5）.

[3]邓琦.常萍.周围.程国军.芳香烃化合物降解菌CP5的降解特性及降解基因[J].华中农业大学学报.2010,29(2):185-188.

[4]杜翠红.周集体.王竞.严滨.宋智勇.朴香花.难降解芳香烃生物降解及基因工程菌研究进展[J].环境科学与技术.2005,28（1）.

[5] 杨永华．华晓梅.陈素玲．等．芳香族化合物生物降解代谢及其分子遗传研究[J]．环境科学进展.1995，3(6)：3l-43.

[6] 金若菲．王竞，张劲松．等．蒽醌染料中间体的降解脱色研究[J]．环境科学研究，1999，12(6)：32-35．

[7]盘志剐．张彤等．污染物生物降解[M]上海：华东理工大学出版社，1997．

[8]陈余道,朱义年，蒋亚萍，朱银红，程亚平,黄宗万.汽油污染含水层中芳香烃的自然去除与生物降解特征[J].地球化学.2004,33（5）.

[9]牟伯中.苏荣国.王修林.倪方天.周嘉玺.微生物对芳香烃的降解作用[J].2000,15(4).

[10]姚秀清.徐军祥.张全.复合菌剂生物强化SBR降解芳香烃及其衍生物的研究[J].化学与生物工程.2007,24(8).

第6篇：基因工程载体的种类范文

【关 键 词】 重庆；高考；试题；复习；教学

高考试题体现了知识为载体，以能力立意为指导思想，充分考查学生的理解能力、实验与探究能力、获取信息能力、综合运用能力，对高三教学具有导向性和指导性。因此，研究高考试题，能使我们明确高考的方向和重点，是搞好高三复习教学的重要环节。

一、必修和选修所考主要内容

分析2006—2011年高考理科综合（重庆卷）生物试题中必修所考的章节及分值，可看出前5年（2006—2010年）每年都考的必修本内容主要是新陈代谢、遗传、生命活动调节、生态、细胞。总的来看，新陈代谢、遗传、生命活动调节是每年必考的内容，可占约10—20分；生态的内容2006—2010年都有考到，06—09年都出的是选择题，2010年出了一个大题占12分。细胞的内容2009—2011年都考了，一般出的是选择题。生命的物质基础2006—2009年也都考了，一般也是出的选择题。

分析2006—2011年高考理科综合（重庆卷）生物试题中选修所考的章节及分值，可看出选修本主要考查的内容是一、三、五章的调节和免疫、基因工程、微生物与发酵工程，分值约占15—18分。因此，选修本复习的重点应放在一、三、五章。

二、选择题和非选择题所考内容

从2006－2011年（重庆卷）高考生物试题来看，5道选择题考点相对稳定，一般是出在生态、代谢、生命活动调节（或细胞的结构功能）、免疫调节、微生物等知识；非选择题（二道大题）考主干知识，一般是出在代谢、生命活动调节、遗传、基因工程及细胞工程等知识，其中有一小题必然是考查实验内容的，非选择题考多个知识点，综合性较强。

三、重点知识考查内容

新陈代谢部分考查的重点是光合作用（过程、场所、光能在叶绿体中的转换、影响光合作用因素）、酶（概念、特性、性质、温度对酶活性的影响）、三大营养物质代谢（糖、蛋白质、脂类）、细胞呼吸、植物细胞的吸水和失水、根对矿质元素的吸收、教材中的还原糖鉴定和蛋白质鉴定的实验、叶绿体中色素提取实验。

生命活动调节部分考查的重点是植物激素调节（生长素、秋水仙素）、反射弧（脊蛙反射实验）、反射弧的结构及其功能、动物激素调节和神经调节、甲状腺激素分泌的调节及生理功能。

遗传部分考查的重点是自由组合定律、分离定律、推断写出基因型与表现型及比例、概率计算、染色体变异、多倍体育种、性别决定、伴性遗传、基因突变、基因重组、细胞质遗传。

基因工程及细胞工程部分的考点是基因的结构、基因工程操作步骤、运载体具备的条件、植物细胞的全能性、愈伤组织特点、动物克隆技术（核移植）等，这部分内容多与遗传知识结合起来出题。

微生物部分考查的重点是微生物的培养、微生物的类群、微生物的营养、微生物的生长、微生物代谢与繁殖、微生物灭菌方法、菌落的定义、培养基的类型等。

生态部分考查的重点是生态系统的物质循环和能量流动、生态系统的功能、生态系统营养结构、种群、群落、食物链食物网、种群密度与数量、种群的出生率与死亡率、群落的结构、种间关系等。

免疫调节重点考查的是特异性免疫、细胞免疫、体液免疫、抗原和抗体、血糖平衡调节等。

四、高三复习教学建议

（一）扎实抓好基础，突出主干知识

能力是以知识为载体的，要使学生提高学科内的综合能力，就必须夯实基础知识。因此在教学中，教师要进一步帮助学生查漏补缺，指导学生将基本知识进行整合，构建完整的学科知识网络；要以专题复习为主，引导学生理解每个知识点的内涵、各个知识点的内在联系、每章节知识的联系，从而夯实基础。

高考生物试题中，教材重点章节内容占的分值总是较大，尤其是新陈代谢、遗传、调节、生态等内容，一直是理科综合测试的重点。所以，在抓好基础知识教学的同时，一定要突出主干知识的教学，它是复习教学的重中之重。

（二）加强实验教学，培养实验能力

生物实验是每年高考必考的内容，出在非选择题的一个小题，它利于考查学生的创新能力和实践能力。因此在复习中，应围绕明确实验目的、理解实验原理、设计实验步骤、分析实验数据、得出实验结论、分析解释实验现象和结果、实验材料的选用、实验试剂的使用及颜色变化、实验结果的鉴定等内容进行复习，让学生掌握一些科学实验的基本方法；学会如何做对照实验，让学生学会用简短的文字准确地表达实验过程和实验结论；指导学生学会解各种类型实验题的思路和方法。还要重视对教材实验的复习和课本中经典实验的复习，以及注意与教材中的实验或内容相关的“拓展实验”的复习。

（三）加强综合训练，学会解题方法

在基础复习和专题复习的基础上，后阶段的综合复习要注意加大学科内综合训练的力度。教师应广泛收集、阅读一些资料，精心筛选学科内的综合试题和典型例题，给学生在课堂上练习，并及时反馈学生做题的情况，然后，教师针对学生的知识漏洞及时进行评讲和补救，让学生知道解题思路，学会解题方法、正确审题和规范答题。在进行综合训练的同时，还要注意培养学生用生物学术语来准确、规范地进行表达叙述的能力。

（四）注重选修知识，有机联系必修

高考选修本的内容约占15分。在选修本的复习教学中，要特别注意与必修教材有关联的内容，这些内容往往是学科内知识综合的切入点。如基因工程与遗传，细胞工程与遗传，水和无机盐、血糖、体温调节与新陈代谢，微生物培养与生物代谢类型，光合作用过程中的电子传递和光合作用过程的联系。

高三生物复习教学是一个细致复杂的工作，需要教师的智慧和勤奋，需要教师充分备课，为学生准备复习的“材料”，课堂上要充分发挥教师的主导作用和学生的主体作用，才能取得较好的复习效果。

【参考文献】

第7篇：基因工程载体的种类范文

关键词：小鼠；MCK基因；启动子；序列分析

中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0005-06

在转基因动物研究中，外源基因都需要在某种组织异性表达，因此，组织特异性启动子对于外源基因组织特异性表达具有重要作用。另外，组织特异性启动子是研究细胞分化、基因工程以及再生医学应用中的重要工具。据报道，由肌肉特异性调控元件构成的启动子能够指导载体进行肌肉特异性表达，在非肌肉细胞中表达很低[1]，这些调控元件包括肌酸激酶（Creatine Kinase， CK）调控元件[2]、骨骼肌肌动蛋白调控元件[3]、肌球蛋白重链调控元件[4]和其他肌肉基因的调控元件。高等脊椎动物肌酸激酶存在胞质型和线粒体型两大类，其中胞质型包括肌肉型肌酸激酶（Muscle Creatine Kinase， MCK）和脑型肌酸激酶（Brain Creatine Kinase， BCK）两种形式，而在线粒体中存在CKmt1和CKmt2两种类型的肌酸激酶[5]。肌肉肌酸激酶基因主要存在于各种肌肉细胞中，骨骼肌和心肌中都含有肌酸激酶，尤其骨骼肌含量最为丰富，占全身总量的96%，在收缩肌肉中被转录激活，在成年心肌和骨骼肌中高度表达[6]。

第8篇：基因工程载体的种类范文

80年代后期,人们通过感染植物的方式将发根农杆质粒上的一段转移去氧核糖核酸转移到高等植物细胞的基因组中,诱导出毛状根,建立起毛状根培养系统[6]。黄遵锡等[7]建立了红豆杉毛状根培养体系，发现在红豆杉的毛状根中紫杉醇的含量是其愈伤组织中的近8倍。常振战等[8]报道，对无刺曼陀罗毛状根继代培养5年以上仍保持合成托品烷生物碱的稳定性。冠瘿组织来源于冠瘿瘤，冠瘿瘤的产生与根癌农杆菌有关。它和发根农杆菌是同属的另一种土壤杆菌，也是植物的一种病原菌；根癌农杆菌含有Ti-质粒，转化后的表现性是冠瘿瘤。用冠瘿瘤组织作为培养系统也具有生长素自养，增殖速度快等特点，也可以做细胞悬浮培养。毛状根和冠瘤组织培养技术为生产药用活性成分提供了一条有效途径。传统药材1/3是植物的根部，因此该项技术对其生产尤为重要。目前已在长春花、烟草、紫草、人参、曼陀罗、颠茄、丹参、黄芪、甘草和青蒿等40多种植物中建立了毛状根培养系统。经根癌农杆菌感染形成畸形芽，也已在薄荷、颠茄等植物上取得成功。传统中草药的脱毒研究由于病毒可以传到植物的子代，药用植物的种子带病毒是传统栽培技术难以解决的问题。如果采用细胞工程技术，在无菌条件下对植物的分生组织进行离体培养可以解决这一问题。这里利用的是植物内病毒分布不均匀的原理，在植物病毒含量最少的生长锥中取样，再培育出小苗，以此改善由于病毒而引起的中药品质退化的问题。已有研究表明,太子参采用茎尖脱毒后的种苗产量为1498.4千克/公顷，比种根苗的产量736.1千克/公顷提高103.6%，具有非常明显的增产优势[9]。瞿宏杰等研究了麦冬脱毒前后的产量变化：脱毒苗分蘖快，分蘖数明显增多，所以块根数目增加，盆栽结果发现，单株产量脱毒苗与未脱毒苗分别为4.87g、3.36g，产量增加44.9%[10]。目前，我国科学家已经在怀地黄、甘薯、丹参、柑橘、枸杞、姜、蒜等多种药用植物的脱毒中获得成功。

发酵工程在中草药中的应用

发酵工程又称微生物工程，是利用现代工程技术手段，利用微生物的特殊功能产生有用的物质，或直接将微生物应用于工业生产的技术。中草药生物技术中的发酵工程，主要是针对药用菌类植物的发酵法生产有效成分而言，或者利用微生物培养的原理和技术大规模培养药用植物细胞，从而获得其中的药用成分等。利用发酵技术生产药用活性成分，还可以使药品生产规范化，药源质量稳定，有利于这些药物的产品进入国际市场。传统的灵芝栽培方法周期长，从中提取灵芝多糖远不能满足市场需求，且每批产品的多糖组分和含量相差较大，而通过液体深层发酵技术生产灵芝多糖具有生产周期短、多糖组分和含量相对稳定、主要组分和野生灵芝基本一致等特点，成为获取灵芝多糖的最有效方法[11]。目前，我国冬虫夏草、灵芝、云芝、猴头等药用真菌的发酵产品已投入市场。

酶工程在中草药中的应用

酶工程是利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是将生物体内具有特定催化作用的酶类或细胞、细胞器分离出来，在体外借助工业手段和生物反应器进行催化反应来生产某种产品的工程技术。它既包括利用人工酶催化方法，对药用植物中的药效成分进行修饰，以提高药物品质；也包括利用人工酶催化方法改进中草药制剂过程，如降解淀粉、蛋白、果胶等杂质，分解植物组织，提高药液制剂的澄清度，降低提取难度等。如金东史等人利用酶转化方法将人参中的主要皂苷成分转化成含量只有十万分之几的人参皂苷Rh2，并达到了月产30kg的生产规模[12~13]。利用自制复合酶对、三七总皂苷、三七茎叶总皂苷等系列中药有效部位进行了酶法转化研究[14]，通过HPLC和LC-MS分析发现可以明显改变一些皂苷成分的结构,并降低相应化合物的极性,增加了有效部位中脂溶性成分含量；同时，利用这些复合酶直接酶法转化处理人参、三七、三七茎叶等药材,结果表明复合物酶亦能高效地转化药材中部分皂苷成分为低极性皂苷。

基因工程在中草药中的应用

基因工程是首先克隆或合成目的基因，再按照预先的设计，将目的基因和载体重组在一起，以一定的方式导入生物体内，让受体生物的遗传性状发生预期的改变，或者让受体生物产生目的基因编码的蛋白质等。有关代谢途径的基因工程研究植物次生代谢产物有重要的经济价值，就药物而言，有很多临床应用的药物都是植物的次生代谢产物。然而植物次生代谢产物种类繁多，生物合成途径也千差万别，只有在了解目标植物特定次生代谢产物的基础上，才能有选择的进行有效的基因操作。为此，次生代谢产物以及次生代谢产物途径的研究，一直是科研工作者感兴趣的课题之一，尤其是对次生代谢物的调节与调控。近年研究主要集中于了解与次生代谢相关的酶类及有关基因。中国科学院植物研究所叶和春研究员课题组已克隆出青蒿素生物合成途径中4个关键酶基因，构建了不同启动子下的Cad和FPP基因已整合到青蒿发状根和愈伤组织的基因组中，并在转录水平上已有表达，转基因材料青蒿素的含量有显著提高，使青蒿素的生物合成达到了分子调控的水平[15]。又如名贵中药石斛药源紧张的解决，就是利用毒性基因的诱导表达[16]。此外，利用基因工程技术人工定向改变药用植物的遗传性状，可培养出一些抗病毒、抗虫害、抗除草剂的新型中药，能减少农药的使用，杜绝农药和重金属的污染，从而保证中药的安全化，促进中药的出口。中国中医科学院和佳木斯大学对丹参金属硫蛋白基因进行了较为详细的研究,成功克隆了丹参金属硫蛋白MT22基因,并且研究了铜离子和锌离子诱导丹参毛状根中MT基因表达的情况,证实了MT基因在丹参对酮、锌元素的吸收富集方面发挥着重要的作用。有关转基因植物反应器的研究利用转基因植物作为生物反应器表达重组蛋白等生产外源基因编码的产物是一个很有吸引力的廉价生产系统，它有可能代替成本较高的传统发酵生产系统。在对丹参的转基因研究中,陈海敏等[19]将来自葡萄的白藜芦醇(resveratrol,Res)合酶基因(RS)导入到丹参中,经PCR和PCR2Southern杂交检测,确定RS基因已整合到部分转基因丹参基因组中。近年来，作为生物反应器的转基因植物逐渐增多，研究较为成功的植物主要有烟草、马铃薯、番茄、玉米、油菜、大豆、番木瓜、豇豆、菠菜等。药用植物抗性基因的研究利用分子生物学研究方法和手段，可以定向改变药用植物的遗传性状，培育出具有抗虫、抗病、抗逆、抗除草剂等药用植物新品种。

第9篇：基因工程载体的种类范文

关键词：产气荚膜梭菌；β1毒素；克隆表达

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2016）09-0007-02

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）在自然界中广泛分布，是人和动物肠道内的一种正常菌，能产生a、β、ε、ι四种主要毒素，根据产生这四种毒素种类的不同，可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E五种类型[1]。该菌在家禽中主要是能引起坏死性肠炎，鸡源产气荚膜梭菌主要是A型，但也有C型，C型产气荚膜梭菌主要产生a和β两种毒素。其中β毒素具有细胞毒性和致死性的特点，是重要的致病因子[2]。课题组在前期进行了鸡源产气荚膜梭菌a毒素的克隆表达及免疫原性研究[3]，本研究旨在进一步对β毒素进行克隆表达，为其诊断试剂和亚单位疫苗的研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体 C型产气荚膜梭菌、受体菌大肠杆菌DH5a和BL21（DE3）和pGEX-KG载体由湖北省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶BamH I和Xho I、PCR试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；RNaseA、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程（大连）有限公司；细菌DNA提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 参照NCBI中产气荚膜梭菌β1毒素全基因组序列，设计1对β1毒素基因引物，上游引物CPb01： 5′-ACGGGATCCTTAGTTATAGTTAGTTCACTTT-3′，下游引物CPb02：5′-ACGCTCGAGCTAAATAGCTGTTACTTTATG-3′，目的片段大小为1 008 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物和下游引物分别含有BamH I和Xho I酶切位点。

1.2.2 全基因组的提取 将产气荚膜梭菌在厌气肉肝汤中于37 ℃厌氧培养过夜离心后，将沉淀菌细胞重悬于含2 mg/mL溶菌酶的TE溶液中，混匀后30 ℃水浴10 min。按照OMEGE bacterial DNA Kit说明书进行全基因组的提取。

1.2.3 PCR扩增 50 μL PCR反应体系为：10×Buffer缓冲液5.0 μL，MgCL2（25 mmol/L）4.0 μL，dNTPs（10 mmol/L）1.0 μL，模板5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2 μL和Taq DNA聚合酶（25 U）1.0 μL，加灭菌双蒸水补足至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。取5.0 μL PCR产物于1.0%琼脂糖凝胶电泳，观察结果。

1.2.4 PCR产物的回收、连接转化及鉴定 PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳回收后，以DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，按说明书操作。将回收纯化的目的产物与pGEX-KG载体双酶切后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，以含有氨苄西林（Amp）抗性平板进行筛选培养，挑取白色菌落于含Ampr的LB液体培养基上培养过夜，以SDS碱裂解法提取重组质粒，经PCR鉴定及BamH I和Xho I双酶切分析筛选阳性克隆。

1.2.5 阳性质粒的诱导表达及表达产物的SDS-PAGE分析 将构建的阳性质粒转入受体菌BL21（DE3）经37 ℃加IPTG诱导后，按文献[4]报道的方法收集菌体变性处理后，进行SDS-PAGE电泳分析。

2 结果与分析

2.1 PCR鉴定结果

采用设计的特异性引物进行β1毒素基因的PCR扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳，结果表明，以产气荚膜梭菌为模板扩增出约1 000 bp的特异性条带，与预期大小相符（图1）。

2.2 重组质粒的双酶切鉴定

将质粒经PCR鉴定后用限制性内切酶BamH I和Xho I进行酶切鉴定，结果见图2。由图2可见，经双酶切后可获得大小约为5 000和1 000 bp的2条DNA条带，即pGEX-KG载体和目的基因条带，初步表明成功构建产气荚膜梭菌β1毒素克隆表达质粒。

2.3 β1毒素基因表达产物SDS-PAGE分析

将BL21（DE3）菌株作为表达的宿主菌，经转化挑取单个菌落培养诱导后，菌体经超声波处理，提取包涵体，上清经80%饱和硫酸铵沉淀后得到浓缩，沉淀经透析后，用SDS-PAGE分析（图3），在相对分子质量约为56 ku处出现特异性蛋白条带，结果表明β1毒素可在宿主菌种得以表达，并且β1毒素蛋白多以包涵体的形式存在表达。

3 讨论

产气荚膜梭菌能产生多种具有致病性的外毒素，其中β毒素不仅能引起家禽坏死性肠炎及仔猪肠毒血症，也能引起婴幼儿的坏死性肠炎[5]，危害极其严重。本研究利用PCR技术，设计特异性引物成功地从C型产气荚膜梭菌中扩增出目的片段β1，并构建了成功表达β1毒素的重组菌株，表达的蛋白以包涵体形式存在，纯度高。β1毒素的表达为产气荚膜梭菌的临床诊断和基因工程疫苗提供了前提。

参考文献：

[1] SPARK S G， CARMAN R J， SARKER M R，et al. Genotyping of enterotoxigenic Clostridium perfringens fecal isolates associated with antibiotic-associated diarrhea and food poisoning in North America[J]. J Clin Microbiol， 2001， 39（3）：883-888；

[2] TIMBERMONT L， LANEKRIET A， PASMANS F，et.al. Intra-species growth- inhibition by Clostridium perfringens is a possible virulence trait in necrotic enteritis in broilers[J]. Veterinary Microbiology， 2009（12）：l-4.

[3] 张蓉蓉，艾地云，张腾飞，等. 鸡源产气荚膜梭菌a毒素基因克隆表达及免疫原性的初步研究[J].湖北农业科学，2015，54（20）：5152-5154.