基因治疗的基本策略精选(九篇)

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第1篇：基因治疗的基本策略范文

【关键词】超声微泡；双自杀基因慢病毒载体；基因治疗

【中图分类号】R341 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2012）13-0013-02

目前，基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是一种颇具临床应用潜力的治疗策略， 但是由于治疗的靶向性成为关系到治疗安全性的瓶颈问题。近年来研究表明[1-5]，超声微泡造影剂有望成为一种新型的体内靶向给药的载体系统。本研究旨在构建超声微泡包裹的特异性双自杀基因慢病毒载体，为临床实时可视状态进行超声定位控释和载质粒微泡基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的构建与包装

1.1.1目的基因的扩增与TA克隆

提取正常人外周血gDNA，并通过PCR方法扩增出KDRP、CD、TK基因；回收

PCR产物并分别将其链接到pMD18-T载体上，构成重组T质粒；抽提质粒，并对各重组T质粒的酶切鉴定及测序；

1.1.2 慢病毒载体构建与包装鉴定

将经测序证实的T-KDRP、T-CD、T-TK三种质粒上的KDRP、CD、TK元件通过特定的限制性内切酶酶切后，依次连接到经相应酶酶切的pLenti6-EGFP载体上，经脂质体法转染至293T细胞，24h后通过荧光显微镜即可见GFP荧光表达，72h后收集上清，0.45um滤器过滤，25000rpm离心90min，沉淀溶于Hanks溶液，-80℃贮存备用。将梯度稀释的病毒液，加入293T细胞中，72h后置于荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度计算滴度。按公式计算病毒滴度：

病毒滴度=GFP细胞阳性数×病毒上清稀释倍数/0. 4m1（pfu/ml）。

1.2 载药粒微泡的制备于鉴定

1.2.1载药粒微泡的制备

声诺维sonovue为磷脂包裹的六氟化硫（SF6），按使用说明注入生理盐水5 ml震荡形成微泡混悬液。取50ul微泡悬液于1.5mlEP管内，再滴加入100MOI病毒载量的病毒上清液，轻轻混匀后室温孵育20 min。

1.2.2载药粒微泡的鉴定方法。

采用Malvern激光测量仪检测载药微泡的粒径大小，光学显微镜观察其外观，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量。

（1）粒径大小比较

载质粒微泡为白色混悬液，PBS（Phosphate buffered saline 磷酸盐缓冲生理盐水）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。去除上层及下层液，取中层液，测定其粒径大小，镜下比较观察载药微泡与空白微泡外观。

（2）包封率的测定

将制备好的含有慢病毒载体的微泡溶液中加入5%乙醇1 mL混匀，6℃，16000 rpm高速离心20min，去上层微泡，取下层液体，加5%乙醇0.5 mL稀释冲洗，再加入适量乙醚，漩涡振摇，6000 rpm离心15 min，取乙醚层，50℃水浴挥干后，加0.5 mL甲醇溶解作为样液，进样量10μL。采用RP-HPLC测定双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的包封率，按下式计算包封率：

包封率（%）=[（投入药量―游离药量）/投入药量]×100%

（3）载药量的测定

以下式计算载药量：

载药量%=（Wt～Wi）/Wc×100%

其中Wt为脂质微泡溶液中药物总含量，Wi为游离药物量，Wc为磷脂用量。

（4）稳定性测定

4℃冰箱贮存，对短期内的载药微泡溶液的质量进行监测。

取少量载药微泡混悬液分别于1d、2d、5d、8d、10 d经光学显微镜（×400）进行观察其形态变化。第10 d的取该样品由Malvern粒径测量仪检测粒径。4℃冰箱贮存10 d后，RP-HPLC测定载药微泡溶液的包封率。

2 结果

2.1 病毒滴度检测结果：

经荧光显微镜下观察GFP的表达情况，计数发荧光细胞数目，根据病毒用量和稀释度，获得病毒滴度为（3.5×1012pfu/L）的双自杀基因慢病毒载体pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK。

2.2 载药微泡质量鉴定：

2.2.1包裹有pLenti6-EGFP-KDRP-CD/TK的声诺维微泡与空白声诺维微泡粒径的对比观察：

载质粒微泡呈乳白色混悬液，用磷酸盐缓冲生理盐水（Phosphate buffered saline PBS）冲洗，静置后分三层，上层、中间层为微泡，下层为PBS液。

镜下比较观察载质粒微泡（图A）与空白微泡（图B）的形态，其形态相近，为近似的圆形微泡。其粒径范围92%在2～5μm之间，平均粒径约2.90μm（图A），粒径大小均相似。

2.2.2 包封率和载药量测定结果

采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）测定载药微泡的包封率和载药量，

得到结果：

包封率为90.6±3.1%。载药量为29.2±0.9%。

2.2.3 稳定性测定：

4℃冰箱贮存10 d后，可见仍为乳白色混悬液，光镜下观察，微泡粒径大小未见明显变化，微泡形态好，大小均匀，相互之间无明显聚集现象，分层情况基本同前，样品经光镜下观察及Malvern测量仪检测发现，与制备初始相比，平均粒径大小约3.08μm），未见明显变化；RP-HPLC测得包封率：86.1±2.8%，没有出现明显药物渗漏。

3 讨论

基因治疗已成为一种全新的肿瘤治疗模式，其中自杀基因治疗是近年来新兴的肿瘤基因治疗的研究热点。自杀基因疗法是利用基因工程技术将自杀基因转入肿瘤细胞进行表达，注入体内的无毒或低毒的前药在表达的特异性酶作用下转化成毒性产物，该产物可作为DNA合成的核苷替代物掺入到DNA中，干扰细胞DNA的合成，从而引起肿瘤细胞的死亡[6]。

本研究所采用的克隆方法并不是将PCR产物直接与表达载体相连接，而是先将PCR产物TA克隆，构建成重组T质粒后再将目的基因与表达载体酶切连接，主要是考虑到：PCR产物直接进表达载体成功率不高；而先进T载体，再酶切连接表达载体，可减少碱基错配，提高成功率。目前己发现的自杀基因体系已有十多种，本实验选择胞嚓陡脱氨基酶基因（CD）和单纯疤疹病毒胸普激酶基因 （HsV-TK简称TK）来构建双自杀基因质粒，是因为研究表明[7]，二者作用机制具有很强的互补性，将其连接在一起，构成融合基因，使两个自杀基因体系协同作用，能显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用。同时选用肿瘤特异性启动子KDRP，突破对肿瘤细胞类型的依赖性，扩大肿瘤基因治疗谱。运用增强型GFP绿色荧光蛋白作为报告基因，可直观的检测目的基因的检测和计算病毒滴度。而慢病毒载体最大的特点是可以感染分裂期及非分裂期细胞，容纳外源性目的基因的片段大，可以在体内长期地表达，不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，可在更多范围的宿主细胞内生成高滴度的病毒，己成为当前基因治疗中载体研究的热点。

超声微泡造影剂声诺维可作为一种新型基因载体。在一定剂量超声波的辐照下，利用微泡在超声介导下的空化效应介导目的基因的靶向释放和导入。国内外许多学者通过体内外实验证实空化效应是超声介导基因转染的主要机制，微泡造影剂作为外源性空化核被引入体内后大大增加了单位体积内空化核的数量，降低超声波的空化闭值，增强空化效应，从而提高基因转染效率[3-4]，尤其在抗肿瘤治疗、溶栓治疗等方面具有潜在的重要应用价值。经静脉注入载药微泡后，用超声辐照特定部位，含气体的超声造影剂在超声波作用下会不断地产生非对称性收缩和膨胀，当声能达到一定强度时，微泡破裂药物被释放到超声所辐照的局部组织中。在这一过程中，微泡作为空化核增强空化效应，依靠能量辐射作用，使微泡破坏后释放的药物能够进入血管壁甚至组织间隙，从而发挥定位靶向治疗作用[2]。

而载药微泡的外观、粒径大小、包封率、载药量等是衡量载药脂质微泡质量的最重要指标。我们制作的载双自杀基因慢病毒载体微泡乳化良好，大小均匀，粒径范围92%在2-5μm，与空白微泡相似。微泡内药物的包封率为90.6±3.1%，载药量为29.2±0.9%，均达到较理想的水平。此外稳定性也是衡量载药脂质微泡特性的主要指标之一，它能反映脂质微泡溶液包封率随时间变化的情况。脂质微泡作为药物载体稳定性是指被包裹药物在脂质微泡中的滞留性。经由本实验证实，我们制作的载药微泡同时也具有较高的稳定性。

本研究联合了双自杀基因的杀伤效应、KDR启动子的肿瘤特异性、慢病毒载体的高载性和超声微泡靶向的可控释性等多种技术优点，制备出了较为理想的载有靶向基因药物的微泡，期望为进一步临床实施可视状态下的肿瘤的基因治疗提供一种更加安全、高效的策略。

参考文献

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作者简介：

郝轶，硕士，主治医师，新疆医科大学附属肿瘤医院，830011。

基金项目：

新疆维吾尔自治区自然科学基金（编号：2011211B19）Correspondence to：HAO Yi（郝轶）

第2篇：基因治疗的基本策略范文

钙离子循环在心肌细胞的兴奋收缩耦联中起着至关重要的作用。心肌细胞兴奋去极化激活L-型钙通道，少量Ca2+迅速内流，胞内钙浓度增高，激活肌浆网上钙释放通道(ryanodinereceptor，RyR2)，导致肌浆网内贮存的Ca2+释放入胞浆，此过程即钙触发钙释放(calcium-inducedcalciumre-lease，CICR)。胞浆中游离钙达到10－5mol/L时，肌钙蛋白被激活，肌钙蛋白的构象改变，肌球蛋白和肌动蛋白接触，引起心肌细胞收缩。肌浆网上的钙泵(sarcoplasmicreticulumcalciumadenodinetriphosphatase，SERCA2)将胞浆内游离Ca2+泵回肌浆网贮存，胞浆内游离钙降至10-7mol/L时，肌球蛋白和肌动蛋白分离，心肌舒张。心肌的收缩-舒张过程受到多种因素的调节。受磷蛋白(phospholamban，PLN)是存在于肌浆网纵行小管的膜蛋白，非磷酸化的PLN与SERCA2结合，通过蛋白-蛋白之间的相互作用抑制SERCA2与Ca2+的亲和力，降低SERCA2的活性。环磷酸腺苷(cAMP)依赖性蛋白激酶A(PKA)和Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CaMBKⅡ)则使PLN磷酸化，磷酸化的PLN与SERCA2解离，消除其抑制作用，活化SERCA2。咖啡因、ATP、Na+、K+及磷酸化等都可以刺激RyR2的开放，而H+、钌红和去磷酸化等则可以抑制RyR2的开放。FKBP12.6可以稳定RyR2关闭时的构象状态。S100A1作为一种钙结合蛋白，对Ca2+有很强的结合力，可以调节RyR2和SERCA2的功能以及肌浆网钙含量。β-肾上腺素受体的激活可以增强钙循环，加快心肌收缩和舒张的节律。

2．心力衰竭的基因治疗

心脏收缩-舒张过程中任何一个环节的功能障碍都可能导致心肌的收缩和/或舒张功能降低，从而诱发心力衰竭的产生。心力衰竭的基因治疗靶点即针对此过程中的钙循环相关蛋白和调控因子。基因治疗包括三个基本要素:基因载体、转移方式和靶基因。

(1)基因载体靶基因需要通过特定的载体转移到靶细胞中去，目前常用的基因载体主要分为非病毒载体和病毒载体两大类。非病毒载体可大致分为质粒DNA、脂质体DNA复合物和高分子DNA复合物。寡核苷酸类及其类似物，亦可单独或以复合物的形式作为一种非病毒载体用于基因转移。一种可降解的高分子聚合纳米粒子，具有强大的核酸容量，避免了腺病毒转染有关的安全问题，适合作为基因载体，已得到了美国FDA的批准［3］。病毒载体在临床前研究中应用更为广泛，主要包括腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、反转录病毒和慢病毒载体，病毒载体的应用大大提高了基因转移的效率。重组人类腺病毒载体是转基因治疗模型中最常用的载体，它的优势在于:扩增相对容易，可以达到较高的病毒滴度发挥功能，对靶细胞存在尤其是对心血管系统广泛亲嗜性。无论在体内还是体外环境下，绝大部分心肌细胞都可以被腺病毒有效转染。然而，将腺病毒应用于临床仍面临许多挑战。腺病毒进入机体后，可能会引起强烈的免疫和炎症反应，这将限制其后续的表达。病毒可能感染所有的器官(尤其是肝脏)，不能呈现理想的组织选择性。相对于腺病毒，虽然AAV、反转录病毒和慢病毒载体有着较低的免疫原性，但是AAV难以达到高效价的病毒滴度，对靶基因的装载能力有限以及人体本身存在中和抗体等。反转录病毒载体不能转染类似心肌细胞的不分裂细胞，慢病毒的生物安全性尚待评价。

(2)载体转移途径目的基因转移到靶细胞，除了需要适宜的载体，还要有适合的转移途径。一些可增加血管通透性的化学物质曾被用于促进载体从血管腔转移至心肌，如硝酸甘油、硝普钠、5-羟色胺、缓激肽、组胺及血管内皮生长因子等，但是对于临床心力衰竭患者，考虑到以上物质有降低血压的作用，需谨慎应用。常用的转移途径包括:①顺向注射法:一种为阻塞冠状动脉的顺向注射法，即用球囊阻塞冠状动脉近端，使病毒载体不会逆流或被稀释，但此法存在安全隐患，因为即使短时间的冠状动脉阻塞也可能不能耐受;另一种为非阻塞冠状动脉的延长顺向注射法，此法用于AAV的转移最为有效，而且可作为心力衰竭患者不能耐受冠状动脉阻塞法的最佳选择。尽管这种方法并不能感染所有心肌(约60%)，但它更符合冠状动脉的正常生理血流特点。重度心力衰竭患者接受携带SERCA2a的AAV1转染的临床研究，即采用了延长顺向注射法。另一种为循环灌注技术，通过经皮的最小微创手术建立心肌的独立灌注区域，使冠状动脉和冠状窦之间形成一个闭合回路，此法在携带SERCA2a的腺病毒载体和AAV转染绵羊心力衰竭模型中应用，证实可显著改善心肌收缩力［4］。②逆向注射法:经冠状静脉逆向注射对于有冠状动脉疾病的患者来说是一个非常好的选择。然而，逆向注射法对不能耐受冠状动脉阻塞的患者也存在操作困难。③直接注射法:经过外科手术或经皮介入将载体直接注入到心肌组织，此法可避免许多血管内途径带来的潜在弊端:肝脏和脾脏的首过消除作用、中和抗体的效应、T细胞应答以及血管内皮屏障的不渗透性。直接注射法仅将病毒载体转移至注射部位心肌。④心包腔途径:经由心包将载体转移，载体会优先在心包邻近的心肌细胞中表达。如何最优化心包转移法的治疗效应主要取决于多少比例的靶组织需要被纠正。局灶性的基因转移适于局部缺血的心肌组织，弥散性的基因转移更适于纠正整体的心功能不全。⑤手术转移:通常需对实验动物进行开胸手术，继而采用直接、顺向或逆向注射。然而，临床心力衰竭患者能否耐受此法尚待进一步研究证实。

(3)靶基因理想的靶基因应具备以下特性:在心力衰竭动物模型证实能改善心功能，无致心律失常性，量效关系明确，即靶基因表达越多，心脏功能的改善越明显［5］。如表1所示，迄今用于心力衰竭转基因治疗的靶基因包括［6-18］:钙循环相关蛋白:①过表达SERCA2a:早在20余年前，Gwathmey等即发现，无论心力衰竭病因如何均存在明显的钙循环异常，且部分归因于SERCA2a的活性下降。大量的心力衰竭动物模型结果显示，过表达SERCA2a基因可显著增加心肌收缩功能，在容量负荷过重所致的心力衰竭猪模型，甚至可改善心室重构［6-7］。另外，过表达SERCA2a可修复心肌能量供应和利用的失衡，降低室性心律失常发生，增加冠状动脉血流［8，19］。②抑制PLN:抑制PLN的表达，可起到与过表达SERCA2a相似的效应，进一步改善心肌的收缩和舒张功能。在起搏诱导的羊心力衰竭模型，通过基因沉默抑制PLN的表达，2周后，即显示PLN抑制组左心室舒张末径显著减小，射血分数显著增加［9］。利用RNA干扰技术，将携带抑制PLN表达的基因序列的AAV9，通过静脉注射转染心脏结果显示:PLN蛋白表达下降了75%，SERCA2a的活性部分恢复，心力衰竭大鼠的血流动力学特性显著改善，收缩功能、舒张功能各项指标均恢复正常，心室肥厚、心肌纤维化程度均明显下降［10］。③S100A1:S100是一类钙结合蛋白，其中S100A1主要在心脏表达。S100A1参与了对细胞内外Ca2+调控的多个环节，可增加肌浆网SERCA2a和RyR2的活性促进心肌的收缩和舒张，调节细胞膜的顺应性和对Ca2+的反应性，调控Ca2+介导的线粒体的能量代谢［20-21］。在心肌梗死后心力衰竭猪模型，通过冠状静脉逆向转移法，将AAV-S100A1注射至左心室非梗死区结果显示:注射14周后，S100A1治疗组修复了肌浆网的钙循环障碍，抑制了进行性的心功能下降，逆转了左心室重构，且不增加室性心律失常的诱发率，证实了S100A1转基因治疗的长期有效性和安全性［11-12］。β肾上腺素受体(β-AR)系统:心力衰竭患者的β-AR往往呈现为表达下调。将携带β2-AR的腺病毒经冠状动脉转染兔心肌细胞，发现在转染后第1周、3周时，反映心肌收缩力的指标dP/dtmax明显增加，且心肌细胞对β-AR激动剂异丙肾上腺素的反应性显著增强［22］。过表达β2-AR的小鼠亦显示心脏功能得到明显改善。G蛋白偶联受体激酶(GRK):β-ARs与G蛋白之间的相互作用是通过激酶对偶联受体的磷酸化调节作用来实现的。GRK2是心脏中表达最多的GRK，它在心力衰竭时表达增加，导致β-AR信号通路敏感性下降，功能障碍。在心肌梗死后心力衰竭小鼠模型，选择性的抑制GRK2表达，结果发现10天后，GRK2抑制组小鼠生存率增高，心室重构延缓，心肌的收缩力增强［23］。β-ARKct多肽是GRK2介导的β-AR失敏的抑制剂。将携带β-ARKct的腺病毒感染心梗后心力衰竭兔，发现转染后3周，心室功能明显改善［16］。β-ARKct过表达的阳性结果在猪的心力衰竭模型上亦得到验证［17］。腺苷酸环化酶(AC):心肌细胞接受儿茶酚胺刺激，经由β-AR使细胞内AC激活，生成cAMP，这是正常的生理反应。分离过表达VI型AC的转基因小鼠心肌细胞，发现cAMP表达增高，心功能增强［24］。在起搏诱导的心力衰竭猪模型，转染携带Ⅵ型AC基因的腺病毒，结果显示可显著改善心脏功能和逆转心室重构，且这种效应与cAMP的生成增多具有明显相关性［18］。

3．心力衰竭基因治疗的临床试验

靶基因在细胞模型、啮齿类动物模型和大动物模型上均得到验证，合适的载体和适宜的转移途径，这些是开展临床试验的前提。诚然临床试验开始前还需要充分评价机体对病毒载体的免疫反应、明确心功能指标的评价标准以及评价罹患心律失常的风险［25］。既往因病毒载体所导致的严重不良事件，如注射重组腺病毒后诱发的多器官衰竭、注射反转录病毒后出现的T细胞淋巴瘤等，限制了基因治疗的发展。随后新的研究进展和新的病毒载体的迅速出现，突破了以上技术瓶颈，为转基因治疗领域带来了新的曙光［26］。心力衰竭转基因治疗第一项临床试验始于2007年，是在美国发起的多中心CUPID(calciumup-regulationbypercu-taneousadministrationofgenetherapyincardiacdisease)研究，旨在评价AAV1-SERCA2a基因治疗对晚期心力衰竭患者的安全性及生物学疗效。第一期试验共纳入12例患者，通过冠状动脉内注射给药，四组内的每3例患者均依次增加给药剂量。随访至第12个月时，试验结果显示安全性尚可，41.7%的患者显示症状改善，33.3%显示功能改善，16.7%显示生物标志物改善，50%有左心室功能和重构改善［27］。在二期试验中，共39例晚期心力衰竭患者随机接受AAV1-SERCA2a治疗，分为低剂量组、中等剂量组、高剂量组和安慰剂组。在第6个月时，评价患者的症状(NYHA分级、明尼苏达心力衰竭问卷)、功能状态(6分钟步行实验、最大氧耗量)、NT-BNP水平、心脏超声各项指标等。组间和组内患者比较，以上临床指标具有一致性的改善才被认为是试验成功。高剂量AAV1-SERCA2a治疗组达到了预设定的成功标准。与安慰剂相比，AAV1-SERCA2a治疗的患者显示NYHA分级、明尼苏达心力衰竭评分、6分钟步行实验、最大氧耗量、NT-BNP水平和左心室收缩末期容积得到改善或稳定。所有接受AAV1-SERCA2a治疗的患者心血管事件发生率均降低，不良反应、疾病相关事件及心律失常均未见增加［28］。随访至3年，SERCA2a基因仍在表达，治疗的临床效果仍然存在［29］。入选250例，以SERCA2a为靶基因的CUPID2b期试验(NCT01643330)即将完成［30］。另两项以SERCA2a为靶基因的试验也正在进行当中。第一项试验在英国实施，纳入的是在AAV6-SERCA2a治疗前接受左心室辅助装置治疗至少1个月的晚期心力衰竭患者。另一项二期临床试验AGENT-HF(AAV6-CMV-Serca2aGENetherapytrialinheartfailure)在法国实施，是一项单中心、双盲、随机、安慰剂对照的平行研究，主要探讨AAV6-CMV-SERCA2a治疗对严重心力衰竭患者心脏重构的影响。此外，尚有以AC6、SDF-1为靶基因的临床试验正在进行中。

第3篇：基因治疗的基本策略范文

[关键词]基因编辑技术； CRISPR/CAS9； ZFNs； TALENs

基因编辑技术是一项对基因组进行精确定点修饰的技术，可对特定DN段进行敲除、加入和替换等，从而在基因组水平上进行精确的基因编辑。此过程模拟了基因的自然突变，修改并编辑了生物的基因组，使研究人员可以在极短时间内模拟自然界漫长时间的基因演变，甚至能够完成自然进化中无法完成的基因组改变。在科研领域，该技术可以快速构建模式动物，节约大量科研时间和经费；在农业领域，该技术可以人为改造基因序列，使之符合人们的要求，研制如改良水稻等粮食作物；在医疗领域，该技术可以更加准确、深入地了解疾病发病机制和探究基因功能，以及改造人的基因，达到基因治疗的目的等。因此，基因编辑技术具有极其广泛的发展前景和应用价值。

锌指核酸酶（zincfinger nucleases，ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶 （transcription activatorlike effector nucleases，TALENs）和成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是三大基因编辑技术。这3种技术皆是通过在特定的靶向序列处引入双链断裂缺口（doublestrand break，DSB），继而通过NHEJ途径（nonhomologous end joining，NHEJ）和HR（homologous recombination，HR）途径这2种细胞内DNA修复机制完成修复。NHEJ途径（nonhomologous endjoining，NHEJ）使基因MDNA缺口处有碱基的插入或者缺失，造成移码突变，导致基因的敲除；HR（homologous recombination，HR）途径在提供外源DNA模板的条件下使基因组DNA得到精确的基因修复或靶向基因的添加[1]。由此可见，这3种基因编辑技术本质上均是利用非同源末端链接途径修复和同源重组修复，联合特异性DNA靶向识别及核酸内切酶完成的DNA序列改变。

11ZFNs每个锌指核酸酶单体都是由锌指蛋白（zinc finger protein，ZFP）与非特异核酸酶结合的人工合成酶。此酶的N端部分是能识别含有特定DNA序列的锌指蛋白，C端部分则由非特异性切割结构域Fok I以及连接DNA结合结构域和内切酶的肽段组成[23]。ZFN的特异性取决于ZFP，因此筛选高质量的ZFP是获得高效、特异性的ZFN的前提[47]。ZFP通常由3～6个锌指组成，每个锌指识别基因组中连续的3个碱基。ZFP一旦与基因组中的特定序列结合，Fok I核酸内切酶便会形成二聚体发挥内切酶活性，产生DNA双链断裂的缺口，继而通过细胞内修复机制对断裂部位的基因进行修饰[811]（图1）。ZFN的基因打靶效率一般能够达到30%，可以做到针对特定序列设计ZFN来实现对靶基因的修饰。然而ZFN识别结构域存在的上下文依赖效应大大降低了ZFN设计和筛选效率。目前尚不能针对任意一段序列均可设计出满足要求的ZFN，也不能在每一个功能性染色体区段都能够顺利找到适合的ZFN作用位点。在ZFN的筛选和设计方面存在较大的技术困难之外，其制备价格也比较昂贵。此外，ZFN的脱靶切割也往往会导致细胞毒性。综上这些因素使得ZFN在基因治疗领域的应用有一定的局限性。

12TALENsTALEN是植物病原菌黄单胞杆菌Xanthomonas sp.产生的TALE蛋白的中央区域结构域与FokⅠ核酸内切酶结构域组合而成的一类重组核酸酶。TALE蛋白的中央区域结构域是该蛋白识别特异DNA序列的结构域。它包含了155～195个蛋白单元模块，每个模块单元有34个氨基酸残基，其中除第12和13位氨基酸可变外，其他氨基酸都是保守的。因此，这第12和13位氨基酸被称作重复可变的双氨基酸残基（repeat variable diresidues，RVDs） 位点[12]，是靶向识别的关键。由于TALE存在多种变体，所以可以构建出靶向基因组中预设DNA靶位点的多种TALEN。相比ZFN技术，TALEN使用了TALE蛋白的中央区域结构域代替ZFP作为人工核酸酶的识别结构域，更好地解决了DNA序列识别特异性低的问题。TALE蛋白中央区域结构域对碱基的识别只由2个氨基酸残基决定：组氨酸天冬氨酸特异识别碱基C，即HD（His Asp）C；天冬酰胺异亮氨酸识别碱基A，即NI（Asn Ile）A；天冬酰胺甘氨酸识别碱基T，即NG （AsnGly）T；天冬酰胺天冬酰胺识别碱基G或A，即NN（AsnAsn）G或A；天冬酰胺赖氨酸识别碱基G，即NK（Asn Lys）G；天冬酰胺丝氨酸可以识别A，T，G，C 中的任一种NS （AsnSer）A，T，C，G [1314]（图2）。这种与DNA碱基一一对应的方式在设计上相对于ZFN要简单得多。然而，在实际构建过程中，TALE分子的模块组装和筛选过程也比较繁杂，通常需要大量的测序工作。这使得该技术的使用成本较高，对于普通实验室的可操作性较低。此外，TALEN分子比ZFN大得多，因而在不能高效导入细胞方面也限制了它的应用。

13CRISPR/Cas9CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPRassociated protein）系统是在细菌和古细菌中发现的一种获得性免疫系统[15]，由成簇的、规律间隔的短回文重复序列CRISPR与Cas蛋白组成，能特异性识别外源病毒或质粒的核酸物质，并对其进行剪切，起到防疫外源核酸入侵的作用[16]。其中CRISPR簇通过转录生成一段非码RNA，即CRISPR前体

的靶标可设计为针对一个基因，也为针对多个基因，都能达到有效的特异性位点编辑的效果。CRISPR/Cas9系统已被公认为是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第3代“基因组定点编辑技术”。ZNFs和TALENs作用时均是采用蛋白质对DNA序列的识别，而CRISPR/Cas9对靶序列的识别是RNA与DNA的碱基配对过程。该识别方式使得CRISPR/Cas9与前二者相比更为精准，降低了脱靶切割的几率，减低了细胞毒性。CRISPR/Cas9所有成分都可以通过导入质粒进行表达，因此也省去了耗时耗力的蛋白质工程过程。同时，研究人员可以通过生物信息学分析，设计出针对绝大多数基因的特异性靶标识别crRNA。因此，与前2代技术相比，CRISPR/Cas9成本低、制作简便、快捷高效、脱靶率低的优点使其迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具，逐渐成为当今分子生物学领域最炙手可热的技术之一。然而CRISPR/Cas9 系统也存在着一些不完美之处：Cas9 蛋白对于目标序列的识别除了依靠crRNA序列的匹配之外，目标序列附近必须存在一些小的前间区序列邻近基序（PAM），因此Cas9 蛋白对于设定序列的切割仍有局限性；另外和ZFNs及TALENs技术一样，CRISPR/Cas9也面临着如何控制双链断裂之后的非同源末端连接修复可能会随机产生细胞毒性的问题。

14 NgAgoCRISPR是以RNA为向导寻找靶向序列，而NgAgo则是以DNA来担任向导。韩春雨等的工作显示，NgAgo可结合24个碱基的gDNA，比CRISPR结合19个碱基的gRNA要长5个碱基，因此理论上精确性要高1 024倍，脱靶率也较低。然而，不同于CRISPR/Cas9技术大量运用已获得了实践验证，NgAgo的作用效果还有待于今后工作的检验。

2基因编码技术的应用

21在基因治疗中的应用随着DNA双螺旋结构的发现和以DNA重组技术为代表的现代分子生物学技术的发展，以及人类对疾病认识的不断深入，越来越多的证据表明，许多疾病都与基因突变、缺失或表达异常有关，由此基因治疗技术顺势而生。基因治疗是指应用基因工程技术将正常基因或有治疗作用的基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治疾病。其最核心的策略是通过细胞内基因修饰来治疗疾病。近两三年来，基因编码技术作为该策略的新生力量开始活跃在基因治疗的舞台上，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面取得许多堪称跨时代的佳绩。

癌症治疗方面：2015年11月英国伦敦大奥蒙德街医院（Great Ormond Street Hospital）的医生第一次依靠使用“分子剪刀”修改基因的疗法，成功地治愈了一名患有“无法治愈的”白血病的1岁女孩“莱拉”（Layla）。其治疗方案是利用TALEN蛋白对异体T细胞进行基因编辑，去除内源性TCR（提高肿瘤杀伤特异性）及CD52（避免药物alemtuzumab的干扰），并命名为antiCD19 CART细胞，再将这些经过设计的“人工培育的免疫细胞”输入患者体内去捕捉和杀伤肿瘤细胞。经过1个月的治疗，这名女孩目前摆脱了癌症，身体状况很不错，成为世界上首次用基因编辑治愈的白血病女孩[18]。此外，科学家们在过去的几十年中已经确定了许多肿瘤治疗中相关的基因，包括原癌基因、抑癌基因、基因组修饰类、基因抗药性基因。近2年，研究者们已经开始利用基因编码技术对上述基因开展了大规模的基因编辑修饰研究，预计今后几年内会出现多项癌症治疗方面的重大突破。

遗传性疾病治疗方面：2015年底《Nature》杂志发表的对2016年热点研究领域的展望（The science to look out for in 2016）中提到美国加利福尼亚州里士满Sangamo生物科学公司将计划开展利用ZFN纠正导致血友病基因缺陷的人体试验，并对其研究成果表示非常期待。另外该公司还与马萨诸塞州剑桥市的Biogen公司合作开始了另一项试验，尝试通过该技术提高β地中海贫血患者体内一种血液球蛋白的功能[19]。已有研究证实人β珠蛋白（HBB）基因的突变可能导致地中海贫血症。我国中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，修改了人类胚胎HBB基因的DNA，为治疗地中海贫血症提供了可能。该研究中一共使用了86个胚胎，48 h后有71个胚胎存活，其中在54个接受了基因测试的胚胎中仅有28个胚胎的基因被成功修改，但其中只有一小部分包含替代的遗传物质。该研究是史上第一例利用基因编辑技术改造人类胚胎细胞的案例。尽管该研究使用的胚胎均为无法发育成婴儿、不能正常出生的胚胎，该成果的伦理问题在西方仍引发巨大争议，由此《Nature》的记者和编辑们最终将黄军就选入了年度十大人物之列[20]。多种肌肉营养障碍症（duchenne muscular dystrophy，DMD）是表达dystrophin蛋白的基因发生移码突变，导致不能形成有功能的抗肌萎缩蛋白dystrophin所引发的一种遗传性疾病。2014年研究者已利用CRISPR技术成功修复了小鼠胚胎中的dystrophin基因缺陷。今年，西南医学中心的Chengzu Long，杜克大学的Charles Gersbach，哈佛大学Amy Wagers 与MIT张锋合作研究组这3个独立的研究组又分别完成了小鼠成年体的基因修复。其中Chengzu Long研究组的研究方案为利用腺病毒将gRNA以及CRISPR/Cas9导入肌肉细胞，利用CRISPR/Cas9切除有缺陷的DN段，使小鼠能够产生较短版本的有功能的dystrophin蛋白[21]。

逆转录病毒相关传染病的治疗方面：HIV病毒的基因会整合到病人的基因组上。利用抗逆转录病毒药物治疗仅能抑制HIV病毒的复制但对整合在细胞中的病毒DNA不起作用，一旦停止服用药物这些病毒余孽就会起死回生，开始产生艾滋病原体。因此只有清除整合在宿主靶细胞上的HIV病毒基因才能实现根治艾滋病的梦想。2013 年，朱焕章等设计并获得了一对能特异靶向多数HIV亚型基因保守区LTR （long terminal repeat） 的ZFN，并证实该ZFN能特异性靶向HIV感染及潜伏细胞系上的HIV1前病毒LTR，且介导了HIV1整合基因的高效切除，亩获得了显著抗HIV感染的效果[22]。今年，Rafal等[23]利用CRISPR/Cas9技术使带有HIV病毒的T细胞失去活性，同时病毒复制在受感染细胞中降低了90%。这一治疗方案预计在两三年后开展临床试验。

22在新方法学及动物模型制备上的应用当前，各类基因敲除（knockout）和基因嵌入/置换（knockin）基因工程动物及细胞系已经成为现代医学认识疾病发生发展规律、研究疾病预防和治疗的重要实验工具和手段。传统的基因工程动物制备工艺――基因打靶技术是基于胚胎干细胞的一种同源重组技术。利用该技术制备基因修饰动物周期较长且存在生殖系统传递失败的风险。新型的基因编码技术系统可在小鼠受精卵中直接进行基因组编辑，因而快速、高效、低成本、无物种限制地一步生成基因工程动物。复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室的研究人员通过CRISPR/Cas9技术进行凝血因子Ⅸ（Factor Ⅸ，FⅨ）基因敲除，快速、高效地构建血友病乙模型小鼠，以期为血友病乙的研究提供更加便捷的途径[24]。Park 等[25]使用TALEN 技术将诱导的多能干细胞中含有F8 基因的140 kb染色体片段倒置，建立了小鼠血友病A模型，并且再次通过TALEN基因编辑工具将其之前倒置的染色体片段再重新恢复到正常。实验结果表明TALEN基因编辑工具既可以建立疾病模型，又可以介导疾病的再次纠正。军事医学科学院的研究人员利用CRISPR/Cas9介导的同源重组，将有丝分裂降解结构域MD（Mitosisspecial degradation domain，MD）插入到进基因组表达框上游，以期周期性持续降解细胞内CTCF（CCCTC binding factor，CTCF）蛋白，从而获得CTCF蛋白特异性降解细胞系，为后续研究CTCF功能奠定基础[26]。

此外，随着现代生物技术的不断发展和完善，基因编辑技术已经变为科研人员的新宠，越来越多的科学家运用其与其他技术相结合进行各种学术研究。第三军医大学西南医院和重庆大学的研究人员通过CRISPR/Cas9介导的同源重组修复方法，用GFP标记HCC细胞中的内源多功能性因子Nanog，证明雄激素/雄激素受体轴可以通过直接结合其启动子，增加Nanog的表达，并促进HCC细胞的干性和肿瘤发生[27]，从而初步阐明了肝癌发生的性别差异的机制。CRISPR/Cas9技术的成熟使得利用多重sgRNA载体高效、高通量编辑细胞内基因成为可能，为新型功能遗传筛选创造了条件。IAA2（indole acetic acid 2）是拟南芥Aux/IAA生长素响应基因大家族中的一员。由于没有该基因的失去功能型突变体，其功能和作用机制的研究受到了阻碍。研究人员在GoldenGate克隆技术的基础上，将每3个sgRNA串联到同一个入门载体中，再将入门载体与含Cas9表达框的目标载体LR反应，获得最终的表达载体。结果表明，设计的6个sgRNA有4个发挥了作用，产生了碱基插入突变和大片段缺失突变等多种可遗传的突变，所得到的突变体为后续的IAA2功能研究提供了良好的材料[28]。

23其他应用前景目前，世界各地的实验室已将基因编辑技术应用于生物学研究的各个领域。

预防疟疾：利用CRISPR/Cas9对蚊子的基因进行改造，使其携带一种抗疟疾的基因，从而对疟原虫产生抑制，进而遏制疟疾的传播[29]。另一种改造为导入不孕基因，使疟蚊灭绝[30]。

器官移植：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，对猪胰岛素基因进行了无痕定点修饰，使猪胰岛素基因编码生产人胰岛素，成功建立了完全分泌人胰岛素的基因编辑猪。这为糖尿病人提供更为理想的临床异种胰岛移植供体。另外，有研究改造了猪肺基因以利于用于人体肺移植，以及去除了猪器官上的内源性逆转录病毒（PERV）以防止移植器官带来的病毒感染[31]。

生物制药：北京蛋白质组研究中心张普民教授及其研究团队利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行了基因编辑，在猪白蛋白的基因区域插入了人白蛋白的编码DNA，使猪只产生人白蛋白而不产生猪白蛋白[32]。

农业育种改良：利用CRISPR/Cas9技术几年内可实现至少50～100年才能完成的育种改良工作。圣保罗Recombinetics公司利用该技术培育出不会长角的牛，从而使牛无须经历被切去牛角的痛苦过程。目前该公司正致力于培育永远不需要被的猪。

灭绝物种复活：加州大学圣克鲁斯分校Ben Novak将灭绝的候鸽的博物馆标本DNA与现存鸽子进行序列比对，并尝试对现存鸽子进行基因改造，使这些鸽子变得更接近灭绝的候鸽。

3基因编码技术的争议与思考

基因编辑技术可谓当今生命科学界炙手可热的前沿科技。顾名思义，该技术能够对最基本的遗传单位――基因直接进行设计和修改，其意义和价值可想而知。这使得各大公司迅速加入到基因编辑的产业之中。2015年8月，比尔及梅林达・盖茨基金会和谷歌风投基金投资Editas医药公司1.2亿美元；2015年10月杜邦与Caribou生物科学公司达成了合作协议，使用CrisprCas9技术来改进农作物（http：//wwwnaturecom/news/genomeediting7factsaboutarevolutionarytechnology118869）。中国基因编辑技术产业已走在世界的前列：在CRISPR技术数上中国仅次于美国，位居世界第2；目前50多家中国研究机构已提交了基因编辑专利；劲嘉股份与黄军就团队合作开展CRISPR技术治疗地中海贫血在临床应用方面的研究。中泰证券的分析师认为未来5年仅地中海贫血基因治疗的国内潜在市场空间超过500亿元。与此同时，随着基因编码技术的不断发展，CRISPR/Cas9系统相对前两代技术效率提升了10倍以上，操作容易程度提升了100～1 000倍，构建周期缩短至原来的1/12，成本由5 000美元降低至30美元，脱靶率依据最新技术已降低至目前检测技术检测不到的水平。脱靶率、效率、便携性及成本的极大改善，使得该技术更平民化，技术门槛越来越低。它已成为许多车库生物学家/草根生物学家以及生物黑客的新宠。都柏林生物黑客和企业家Andreas Stürmer说，CRISPR是有史以来最了不起的工具，可以在自己的家里玩（http：//wwwnaturecom/news/biohackersgearupforgenomeediting118236）。

但任何事物都有其双面性，基因编辑技术产业虽然能够造福于人类，然而上面所述的巨大的经济利益驱动以及越来越低的技术门槛，再加上人类对自身健康改良的迫切心态极可能导致对该技术的滥用，进而对人类和地球环境形成威胁，甚至造成意想不到的生态灾难。在美国国家情报总监詹姆斯・克拉珀的威胁评估报告中，“基因编辑”已经被列入“大规模毁灭性武器和武器的扩散”威胁名单，与核武器并列（https：//wwwtechnologyreviewcom/s/600774/topusintelligenceofficialcallsgeneeditingawmdthreat/）。因此，关于该技术运用的争议从其诞生之日就已出现，并呈愈演愈烈之势。现有争议最集中之处为关于人类胚胎改造的伦理学争议。史上第一、二例基因编辑技术改造人类胚胎细胞的研究皆出现在中国。2015年4月，中山大学黄军就和他的团队利用CRISPRCas9基因编辑技术，为治疗地中海贫血症修改了人类胚胎基因组[33]。2016年4月29日广州医科大学范勇团队，宣布他们用基因编辑技术制造出一个能对艾滋病毒免疫的人类胚胎[34]。尽管这2例基因编辑研究都使用的是人类三核受精卵（不能正常发育的受精卵），但在国际上仍引起了广泛的关注和全球科学家激烈的讨论。讨论的焦点不在于文章的学术价值，而在于改造人类胚胎细胞的伦理问题。由于基因编译技术引发的伦理问题迫在眉睫，2015年12月1日，由美国国家科学院、美国国家医学院、中国科W院和英国皇家学会联合组织召集的人类基因组编辑国际峰会在华盛顿召开。会议重点了解各方对基因编辑技术的伦理问题的态度和想法。美国再生医学联盟主席兰菲尔（Edward Lanphier）等在《Nature》杂志上发表评论文章称，希望研究人员暂时不要对人类生殖细胞进行基因编辑，否则可能对后代产生无法预测的后果[35]。然而，人类胚胎改造的研究终究为大势所趋。2016年2月1日，英国政府批准了伦敦弗朗西斯・克里克研究所 Kathy Niakan研究员对人类胚胎进行编辑的请求。这项研究成为世界首例获国家监管机构批准的人类胚胎编辑研究。

综上所述，日渐成熟的基因编辑技术已经成为了强力的生物、医学工具，在癌症、遗传性疾病和逆转录病毒相关的传染病等疾病的治疗方面带了巨大的突破，可以快速构建实验新方法和动物模型，推动科研的发展，并在器官移植、生物制药、农业育种改良、灭绝物种复活和中药现代化等方面具有广阔的应用前景。其价值甚至引起了普通民众的广泛关注。人类畅想将来它不仅可去除遗传缺陷、治疗疾病，还可导入长寿、健康、强力的基因，甚至制造完美人类。当然，任何事物都是一把双刃剑，在乐观畅想基因编辑技术可使人类变得更加完美的同时，也不要忘记滥用技术可能带来的潜在风险和生态灾难。建立针对基因编辑技术安全有效的检测手段，制定合理健全的法律道德制度，才能使这项技术更好地应用和造福人类。

4基因编辑在中药发展中的潜在前景

如何让传统中药跟上生命科学现代化的步伐，使传统中医药走出国门，让世界接受中草药，是当今中医药工作者面临的难题。长期以来，由于中医药与现代医学、生命科学之间缺乏有效沟通的桥梁，有逐渐被边缘化的趋势。中药基因组计划将现代生命科学的最新技术和研究成果应用于中药研究，有望彻底改变中药研究手段和方法的落后局面，架起传统中医药学与现代生命科学之间沟通的桥梁。中国中医科学院中药研究所陈士林团队在著名植物学杂志《Molecular Plant》发表丹参全基因组[36]，标志着作为常用中药丹参的遗传密码被破译，为揭示丹参主要药理活性成分丹参酮和丹参酚酸生物合成及其调控的分子机制，促进丹参优良品种选育提供了重要的遗传背景基础。该工作构建了世界上首个药用植物基因组框架图，标志着我国中药研究进入了基因组学时代。目前已有多个中草药如印度大麻、赤灵芝、牛耳草、铁皮石斛等完成了基因组测序。中草药基因组研究的飞速发展为基因编辑技术在中草药研究中的应用带来了极佳的时机和广阔的前景。今后研究者们可以以丹参研究为模板，借鉴国外的植物基因组研究计划的经验，对中草药在结构基因组学、功能基因组学和生物信息学等方向展开研究。在此基础上，利用基因编辑技术开展中药药效成分、药材的生长及抗性相关基因的研究和改造工作，结合先进的育种方法，筛选出既保持“道地血统”，又优质、高产、抗病的中药材优良品种。该工作既有利于实现中药标准化生产，使中药质量可控，又有利于解决当前中药材资源面临的“断粮”困境。

中药药材是现代药物研发最大的遗传信息资源之一。我国在该方面具有得天独厚的优势。《本草纲目》中记载了1 892种药用植物，1995年出版的《中华本草》收集了8 000多种药用植物，而且其中不乏很多名贵，稀缺的药材如人参，虫草等。另有统计表明，我国中草药已有12 000多种。基因编辑技术的成熟也为开发这个药物基因资源带来了良机。基因编辑技术在中药资源的引入和应用，将会为解决这一问题带来新的前景。通过基因编辑技术可以快速获得药材靶基因的突变或是导入异源基因，从而快速鉴定出该基因产物与药理活性成分的相关性和重要性，发掘出新的或更高效的药物相关基因，并可更清晰地阐明药理活性成分生物合成及其调控的分子机制。

尽管将基因编码技术引入中药研究能为传统中草药带来新发展和突破，但与当今各个领域广泛应用基因编码技术相比，其在中药研究中的应用还处于起步阶段，还有许多基础工作有待完善。比如这一技术的应用必须以完善的中药基因资源为基础，如果没有对中药特别是具有丰富药理药效学和临床应用价值的名贵中药的基因资源的研究与开发，基因技术体系的应用必然大打折扣。此外，也不能盲目的为了中药的基因而基因，浪费大量的人力物力资源，应有的放矢的将目标集中在既具有重要临床应用价值的名贵或濒临灭绝的中药基因资源的研究与应用上，为中药现代化搭建良好的基础技术平台，让现代基因技术更好的为传统中药的发展服务。

[致x]李连达院士对本文的选题、框架设计等给予了诸多宝贵意见。

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[34]Kang X，He W， Huang Y，et al.Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Casmediated genome editing[J]J Assist Reprod Genet， 2016， 33（5）：581.

第4篇：基因治疗的基本策略范文

生物化学是基础医学课程中重要的基础课,但由于其知识的抽象性、宽泛性,一度成为让学生头疼的科目之一,“生化、生化,生而难化”也成为了大家对生物化学的印象。然而,随着生物化学在现代医学中越来越普遍的应用,其重要性也受到愈来愈多的关注。因此,必须要对传统的生物化学授课方法进行全面改革,达到全面培养学生创新能力和综合素质的目标。

1 生物化学与临床学科之间的联系

生物化学式研究生物体内化学分子与化学反应的科学,它联系着生物科学的许多分支,尤其是分子生物学、遗传学、细胞生物学等,一度被公认为生命科学的基础和前沿学科。生物化学作为一门重要的基础课程,与临床有着紧密的联系。无论是从分子水平探讨疾病的病因、阐明疾病发生发展的机制,还是对疾病做出诊断、寻求防治等,都能运用到生物化学的理论与技术。

2 目前专科生物化学教学中存在的问题

2.1 生物化学教学不受重视。

以山东滕州枣庄科技职业学院为例,笔者发现,生物化学被定义为考察课,课时相对较少。就开课时间来看,在三年制的教学计划中,生物化学于第一年下学期开课,与生理学、病理学、病理学、病原生物与免疫学、局部解剖等学科基础课以及计算机、英语等公共基础课同期开设。加之计算机与英语统考,生物化学的课时被很无奈的削减(约54-60学时,其中还包括实验课10-16学时)。由于课程的减少,教程的内容难以完成,其效果可想而知,更不用谈如何与临床相联系了。

2.2 教材更新速度较慢。

就目前山东滕州枣庄科技职业学院所采用的生物化学教材来看,其版本远远落后于本科教材,书中缺少很多相关内容,如基因育基因组、朊病毒、癌基因与抑癌基因、肿瘤标志物、基因诊断与基因治疗等等。教材的落后,导致学生所接触的知识远远更不上实际,直接影响其与临床学科的结合,影响其在临床学科上的应用。

2.3 师资队伍存在缺陷。

就山东滕州枣庄科技职业学院教授生物化学的教师队伍来看,部分教师第一学历并非出自医学院校,而是来自综合、师范等大学。这导致了教师队伍中临床医学知识的缺乏,直接影响教师对教程中与临床学科相关知识的讲授,致使课程讲授的不够深入与透彻,更别谈引入更多临床应用的实例。因此,将生物化学的教学与临床学科结合显得步履维艰。

2.4 教学方法滞后。

由于生物化学理论比较抽象,代谢反应错综复杂且相互联系,大多数同学在学习该课程的过程中采取死记硬背的方式来应付期末考试,并不能理解生物化学的意义。而在后面几个学期学习诊断学、内科学等学科时也没有结合生物化学的理论知识来理解各种疾病与其症状及各项诊断指标的联系,进入临床实习后对生物化学的记忆更加所剩无几,以至于只知道机械的看化验单而不明白各检验指标的真正涵义。

3 改革策略

3.1 适当调整课程设置

学院应当重视起生物化学的教学地位,建立统一的大纲来对教学过程进行参照与约束,适当增大生物化学课程时间,调整其授课比例,对于学好、用好教材、完成生物化学教学目标起到保证性的作用。

3.2 快速更新教材

专科生物化学教材版本少,更新慢。由于培养方向的不同,在章节方面,专科教材应与本科有所区别,在保留传统章节的基础上,创立新的章节、补充新内容。在教学内容方面就是要增加新的知识点,如基因、基因组和人类基因组计划,癌基因与抑癌基因、肿瘤标志物、基因诊断与基因治疗等,以加强与临床学科应用的联系。

3.3 探索新的教学方法

在教学中将生物化学理论知识与临床疾病相关知识相结合,达到融会贯通的效果。在讲授生物化学知识时应密切联系临床,如在讲解正常的糖代谢的同时要引导学生分析可能会出现的疾病状态下的血糖变化,并针对各种不同病因提出可应用的生化指标及检测的意义。通过这种与临床病例相结合的教学方式,使学生牢牢掌握生物化学的核心内容,并是枯燥的理论趣味化、实际化,使生物化学的基础教学与临床应用达到完美统一。

3.4 增强师资队伍建设

生物化学教师平时备课时要注重病例的收集和疾病相关生化知识的积累,多与临床医师进行交流,不断完善和更新自身知识结构,实现生化基础与临床知识的统一。另外,要充分利用来自医学院校生物化学教师临床知识丰富的特点,采取集体备课、研讨教材、互通有无等方式达到优势互补。

4 小结

第5篇：基因治疗的基本策略范文

【关键词】医学分子生物学;教;课程设置

【中图分类号】G424 【文献标识码】B 【文章编号】1006-1959(2009)10-0245-02

分子生物学是研究生物大分子的结构、功能及基因结构、表达与调控的科学,从分子水平探讨生命现象的本质。医学分子生物学是研究人体在正常和疾病状态下生命活动及其规律,从分子水平开展人类疾病的预防、诊断和治疗研究的一门科学。分子生物学已成为生命科学领域的重要基础学科和前沿学科,广泛渗透到医学各学科领域,推动了医学各学科的发展,使医学科学从宏观到微观,从整体、细胞水平逐步进入了分子水平。医学各专业的学生,有必要很好地学习有关分子生物学基础理论,掌握必要的分子生物学实验技术,了解当今分子生物学的研究进展。加强医学分子生物学的教学,对培养具有广博知识的复合型医学高级人才具有及其重要的意义。近几年来,我们对医学分子生物学的教学进行了一些探索,取得较好的效果,积累了一些经验,特总结如下。

1 优化课程设置

医学教育的特点决定了医学分子生物学不同于综合性大学、农林、师范院校的课程,医学分子生物学偏重于与临床的结合,但又不能忽略基础知识的强化。正确处理分子生物学基础和临床应用的教学是解决医学分子生物学教学的关键[1]。为了和生物化学教学内容衔接,本课程不再讲授基因信息传递,仅讲授基因组的结构与功能,补充介绍网络生物信息资源。着重介绍分子生物学的基本技术和新技术,如PCR和各种衍生的PCR技术、DNA序列测定、分子杂交、基因工程、基因芯片等,并兼顾介绍一些新的技术如RNAi等。联系临床介绍癌基因与抑癌基因、基因诊断与基因治疗等。教师结合自身的科研经历展开授课,使课堂教学生动,给学生留下的印象深刻,让学生学有所获、学有所乐。

分子生物学是一门技术性很强的学科,如果只学习理论知识而不做实验,往往如空中楼阁,不知所云[2]?在坚持医学分子生物学理论教学的同时,通过开设相关实验将理论教学与实践操作有机结合,有助于加深对医学分子生物学理论的理解,增强学生的动手能力,使学生在教学过程中体会到所学知识的应用价值,提高学生的学习兴趣。我们在保证总课时36学时不变的情况下,调整了教学时数的分配,压缩理论课时,增加实验课时。将理论课由28学时减少到18学时,实验课由8h增加到18学时。将教师的科研成果应用于实践教学中,利用获得的重组DNA克隆作为实验材料,连续开设了质粒DNA的提取、感受态细胞的制备、质粒DNA的转化和筛选、核酸的体外扩增、DNA的琼脂糖凝胶电泳共六个实验。在实验中着重介绍每个技术的原理和应用,利用实验步骤中间隔的等待时间讲解一些背景知识和需要补充的理论知识,使实验课内容充实而饱满。实验完成后进行总结,分析成功的经验和存在的问题,找到实验失败的可能原因,有利于学生学习知识和积累经验,为今后的临床及科研工作奠定基础。

2 开展双语教学

双语教学是我国高等教育与国际接轨,迎接新世纪挑战和教育改革发展的必然趋势,也是当前教学改革的重点和热点[3]。分子生物学进展极为迅速,其中大多数信息储存在英文资料和文献中,如果采用英文资料和课件进行讲授,学生可更准确的把握其含义,并且可及时获得分子生物学的最新进展,有助于高素质复合型高素质人才的培养。我们在参考相关专业教材的基础上,选定了DNA序列测定、核酸分子杂交、PCR三章内容进行了双语教学,制作了中文和英文两个课件,教师采用英文课件授课,学生利用中英文两个课件进行复习,使学生既掌握了基本技术,又强化了自身的英文水平,教师的整体教学水平也得到了提高。

3 完善考核体系

考试是督促学生学习的一个重要手段,考试目的是检测教育教学的效果。医学分子生物学是一门专业限选课,由于课时少,内容多,进展快,学生学习存在一定困难,有些学生并未引起足够的重视。如果只注重闭卷考试,会导致学生死记教材,不注重查阅文献和了解新进展,达不到创新性教育的目的。如果完全放弃闭卷考试,有些学生会放松对基本理论的学习,也达不到掌握基本知识和基本技能的效果[4]。为此,我们结合课程的教学特点,制订了闭卷考试、实践考核与撰写综述相结合的医学分子生物学考核方案,规定闭卷考试成绩总成绩的70% ,文献综述占10% ,实验成绩占15%,平时成绩占5%,将培养学生动手能力和思维能力全面地体现在考核成绩中。并且在第一次开课就提出课程的考核方式和考核要求,让学生在学习上引起足够的重视。为防止学生直接下载或复印别人的同类文章,教师限定写作内容,稿件一律用手写,并附5篇以上文献(含英文文献2篇以上),抄袭稿件计零分。这种综合考核方式使学生既能掌握医学分子生物学的知识体系,又能准确把握医学分子生物学的脉络和发展动态,熟悉互联网资源的查询和利用,提高了学生的文献查阅能力和英语水平,从而改变学生“读死书、死读书”的现状。

经过几年的教学探索,我们积累了一些教学经验,初步建立了一套适于医学生的医学分子生物学教学体系,收到了较好的教学效果。当然,现有的教学中仍存在一些不足,需要进一步开展教学改革。我们将充分利用多媒体教学资源,扩大双语教学内容,不断丰富和更新教学体系,创新教学手段,增加分子生物学软件使用的培训,适当介绍国内外最新理论和技术,紧跟分子生物学不断发展的步伐,以提高学生综合素质为目的,逐步提高教学质量。

参考文献

[1] 万天云,王俐,昝玉玺,等.医学本科分子生物学教学改革探索[M].山西医科大学学报(基础医学教育版),2007,9(5):501-502

[2] 刘静,胡维新,罗志勇.开设硕士研究生分子生物学实验技术课程的几点体会[M].山西医科大学学报(基础医学教育版),2006,8(4):419-420

[3] 许晓源.医学院校英汉双语教学的探讨[M].辽宁行政学院学报,2009,11(1): 80-81

第6篇：基因治疗的基本策略范文

1各种干细胞移植在心血管领域的研究

1.1胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells，ESCs)1994年Soonpaa等[1]首次将小鼠的胚胎干细胞移植给成熟的心脏，发现移植的细胞不但能增生和存活，还与宿主之间形成了超微结构连接。但人胚胎细胞移植却面临着诸如胚胎细胞来源、道德伦理等问题。另外，胚胎干细胞的转化条件尚不明了，在体外进行定向诱导还具有相当的随意性。

1.2自体干细胞因无免疫排斥及伦理道德等优点，而具有更为广阔的应用前景。

1.2.1自体骨骼肌卫星细胞骨骼肌卫星细胞是成体骨骼肌中未分化的成肌细胞，参与骨骼肌损伤后形态和功能的恢复。Jain[2]研究证实移植组的心室重建得到缓解，心功能明显改善。该细胞的优点是形成的骨骼肌纤维在损伤区存活时间长，存活能力强。但这种细胞数量极少，不易获得。另外，移植区与宿主心肌间的收缩常不一致，易引起心律失常。

1.2.2自体心脏干细胞近来有观点认为在心脏中存在具有组织特异性的干细胞，称为心脏干细胞。Sakai等[3]在动物实验中证实自体心房肌细胞移植能改善受损心脏的功能。理论上说，该细胞的移植要优于其他干细胞。但对于扩张型心肌病这种全心病变来说，只能考虑其他细胞的移植。

1.3成体干细胞(Adult stem cells，ASCs)上世纪90年代末以来，在Nature、Science、Cell均有报道ASC可分化为其他系列的细胞，即ASC具有“可塑性”或“横向分化”潜能。2002年，Nature刊发了Verfaillie[4]教授小组的研究证实在成体的许多组织中余存着一种稀有数量的胚胎原始干细胞，其表达ESC的遗传。所谓的ASC "可塑性"很可能是这些细胞所为，这提示ASC与ESC可能存在相似性和同源性。

1.3.1成人干细胞主要分为造血干细胞(Hematopoietic Stem Cells，HSCs)和间充质干细胞(Mesenchyrnal Stem Cells，MSCs)。此外，内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells， EPCs)等也属于成体干细胞。

1.3.2造血干细胞2001年Orlic[5]等人在Nature上著文，称造血干细胞直接注射心梗区可转化为心肌细胞[5]，结果引起了广泛关注和研究。然而，2004年4月第428期Nature上同时发表了两篇没有重复出Orlic等人研究结果的论文报道。

1.3.3骨髓间充质干细胞Wakitani等[6]首先证实MSCs可分化为骨骼肌细胞。继而人们想到将骨骼肌细胞分化为心肌细胞。1999年，Makino等人[7]首次报道在体外利用5-氮杂胞苷(5-aza)诱导MSCs分化为心肌细胞。Wang等[8]用同基因成年大鼠作为供体及受体模拟自体移植，并用DAPI染色标记。结果发现，移植后各时相点均可见到DAPI阳性的存活细胞。然而，由于移植细胞在宿主身上的生存力差，长期效果不理想，也限制了其应用。鉴于此，Mangi等人[9]将小鼠MSCs进行基因改造，以病毒为载体，在该细胞中加入1个单肽Aktl，后者能阻断细胞凋亡信号。将这些改造的干细胞注射到小鼠心脏的梗死部位后，Aktl被激活，并使干细胞长期存活。该研究还发现，移植的效果呈剂量依赖性。

1.3.4血管内皮祖细胞1997年Takayuki等[10]在Science上报道EPCs分离成功，并可用于体内血管新生(Angiogenesis)。当时提出的EPCs被认为是假定的。近来随着干细胞研究的深入，EPCs的存在已基本确认。Maeda等[11]将EPCs接种于移植的血管，结果发现这些细胞主要集中在血管外膜与内膜表面，内膜表面的移植祖细胞能很好地附着，在血管腔面发育形成内皮细胞。该研究证实，EPCs具有促进血管新生的作用。

2临床研究

干细胞移植为心血管疾病的治疗开辟了一条新的途径，已由动物实验逐步应用于小样本临床治疗。2001年9月Strauer[12]等在世界上进行了首例自体骨髓干细胞移植治疗急性心梗的实验，他们将该干细胞在PTCA中经导管植入到梗死相关动脉，10周后，通过SPECT、超声心动图和核素心室造影显示心肌梗死范围减少，EF升高，舒张末压降低。2003年，Perin等[13]报道借助NOGA系统经心内膜对14例因严重心肌缺血致心衰患者进行自体骨髓干细胞移植，术后2个月，核素显像显示移植组患者的左室功能有明显改善；术后4个月，EF从20%上升到了29%，心脏收缩末期容积亦有显著下降。

3展望

目前，细胞移植的研究仅限于单种细胞的移植，将2种或2种以上细胞联合移植，以及和基因工程结合的研究还比较少。在心脏缺血时，不但有血供障碍，还有心肌损伤。我们在MSCs的基础上联合EPCs移植，一方面，植入的MSCs替代坏死心肌，改善心功能；另一方面，EPCs通过再血管化改善心肌血供。另外，还可以对干细胞进行基因修饰，然后再进行细胞移植。将基因治疗和干细胞治疗结合起来能够大大提高控制细胞行为的能力。值得注意的是干细胞动员疗法与干细胞移植相比具有无创伤、方法简便、易开展的特点，临床应用更具优势，近来研究发现粒细胞集落刺激因子具有心脏保护作用，能动员自体骨髓源干细胞迁移到心肌梗死部位，修复受损心脏。因此,利用细胞因子动员干细胞修复受损的心肌也有可能是干细胞治疗的新策略。

参考文献

1Soonpaa MH, Koh GY, Klug MG. Formation of nascent intercalated isks between grafted fetal cardiomyocytes and host myocardium. Science, 1994, 264(5155): 98-101.

2Jain M, Dersimonian H, Brenner DA. Cell therapy attenuates deleterious ventricular remodeling and improves cardiac performance after myocardial infarction. Circulation, 2001, 103(14): 1920-1927.

3Sakai T, Li RK, Weisel RD. Autologous heart cell transplantation cardiac function after myocardial injury. Ann Thorac Surg, 1999, 68: 2047-2081.

4Jiang YH, Jahagirdar BN, Reinhardt RL. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived frommarrow. Nature, 2002, 418: 41-49.

5Orlic D, Kajstura J, Chimenti S. Bone marrow cells regenerate infracted myocardium. Nature, 2001,410: 701-705.

6Wakitani S, Saito T, Caplan AI. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve, 1995, 18(12): 1417-1426.

7Makino S, Fukuda K, Miyoshi S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cells in vivo. J Clin Invest, 1999, 103(5): 697-705.

8Wang JS, Shum-Tim D, Galipeau J. Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty.feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg, 2000, 120(5): 999-1005.

9Mangi AA, Noiseux N, Kong D. Mesenchymal stem cells modified with Akt prevent remodeling and restore performance of infarcted hearts. Nat Med,2003 ,9(9): 1195-2001.

10Asahara T, Murohara T, Sullivan A. Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis .Science, 1997, 275(5320): 964-967.

11Maeda M, Fukui A, Nakamura T. Progenitor endothelial cells on vascular grafts.An ultrastructural study. J Biomed Mater Res, 2000, 51(1): 55-60.

第7篇：基因治疗的基本策略范文

1作用温和缓慢

中药作用强度总体上是温和缓慢的，中药多矢量作用合力的微量累计是中药治病的优势，也是其副作用较轻较少的原因。由于一首复方中各有效物质的浓度相对于单一的化学药物来说较低，进入人体后就更低了。而中药这种多种微量单体对众多环节的微调，使机体归复于平衡是中药治病的重要基础。但新药药效标准评价对此是否定的，至少是不完整的。由于中药的这些特点，我们唯一可做的就是尽可能采用现代科学技术，得出令人信服的科研结果，进而有权重新制定或完善新药评价体系。

2现代生物技术与中药作用机制的发现

随着生命科学的发展，尤其是分子生物学在各学科的渗入，中医药实验研究深入到了分子、基因、蛋白质组水平。现代药理研究表明，中药作用原理与其生物活性成分调控基因表达有关[5]。研究发现：对即刻早期基因（IEGs）的表达产物是细胞核内的第三信使，在细胞间信号传导过程中发挥重要的生理作用，共有c-fos、c-jun、c-myc、c-egr4个家族。c-jun基因表达基因转录生成mRNA，核糖体以mRNA为模板翻译成c-jun蛋白，c-jun蛋白与同时表达的c-fos蛋白通过亮氨酸拉链区结合构成异构二聚体AP-1。AP-1通过与靶基因promoter区TGAC/GTCA序列结合，刺激靶基因表达[6]。任永欣等在国内首次复制了硝酸甘油型试验性偏头痛动物模型，并用免疫组化方法观察IEGs，c-fos，c-jun的表达，结果显示：硝酸甘油型试验性偏头痛大鼠脑干、下丘脑c-fos、c-jun基因表达明显增强，复方中药头风饮能显著抑制偏头痛大鼠脑干、下丘脑c-fos、c-jun基因的增强表达，与对照组比较差异有显著性[7]。还有对神经肽相关基因表达的影响，对凋亡相关基因的影响等等。人类基因组计划（HGP）为某一疾病多基因表达调控的研究带来了机会，通过HGP筛选和分离出每种疾病相关的致病基因，再以其作为药物作用靶标研究中药作用的分子机制，这可能是未来中药药理研究发展的趋势之一。另外，基因芯片技术以其检测迅速、分辨率高、检出基因多而成为研究的先进方法之一。生物芯片主要包括基因芯片和多肽芯片。生物芯片技术是指将大量（每平方厘米点阵密度高于400）探针分子（DNA、RNA、多肽等）固定于支持物（膜、玻片、硅片等）上后与标记的样品分子杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度，对样品分子进行定性、定量和结构分析，其原理是利用生物大分子具有特异性互相识别能力，具快速、准确、自动化的优点。利用基因芯片及mRNA差异显示技术从分子水平探讨中药对疾病多基因治疗作用机理，应成为今后研究的主要方向之一。

3蛋白质组学技术在新医学研究中的应用

所谓蛋白质组是指一个细胞或一个组织基因组作表达的全部蛋白质，它具有整体性、动态性、系统性的特点。一方面，强调蛋白质组是对应于一个基因组的全部蛋白质所构成的整体；另一方面，明确提出蛋白质组还是一个在时间和空间上都动态变化的整体。蛋白质组的研究流程大体上分为分离、鉴定、分析3个步骤[8]。即先从组织或细胞中提取蛋白质，进行双向电泳实现蛋白质的分离，含多种蛋白质的样品展开成为有近千个蛋白质点的繁星图；然后进行蛋白质样品的显色，对不同疾病、不同证候的蛋白质与对照样品进行比较，寻找具有统计学意义和丰度差异的蛋白点；切下待分析的蛋白点，使用胰蛋白酶消化；接着对消化后得到的多肽片断进行生物质谱分析测定，得到肽指纹图谱；最后，通过在数据库中检索对蛋白质进行鉴定及功能分析，利用生物信息学的方法进行比较研究。蛋白质组学是从整体的角度，分析细胞内动态变化着的蛋白质组成成分、表达水平和修饰状态，了解蛋白质之间相互作用和联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的科学。其不仅研究蛋白质的构象，更重要的是进一步阐明不同蛋白质、不同构象功能的表现。它不是单纯对蛋白质的个体进行研究，而是对人体的整个蛋白质，即在蛋白质组的基础上进行研究。蛋白质是机体生物功能最终的执行分子，单个蛋白质的研究方式亦无法满足后基因时代的要求。这是因为：生命现象的发生往往是多因素的，必然涉及多个蛋白质；多个蛋白质的参与是交织成网络或平行发生，或呈级联因果；执行生理功能时的蛋白质表现是多样的、动态的。因此要对生命的复杂活动有全面和深入的认识，必然要在整体、动态、网络的水平上对蛋白质进行研究。

4蛋白质组学技术与中医药发展

中医药研究一直在谋求现代化发展，谋求为现代医学有所阐释而走向世界。但在此之前对单个分子的研究，很难反映中医学的“整体观念”和中药作用“整体调节”的最基本特征。蛋白质组学研究时代的到来，为中医药现代化发展带来了新的契机。蛋白质组学的“整体、动态、网络”的特点，与中医理论“整体观念”、“辨证施治”和中药作用“整体调节”，“多层次、多靶点”调节等思想不谋而合。利用功能蛋白质组学技术和策略，分析中医证候及经中药处理过的组织、细胞或体液表达的蛋白质组，并比较处理前后蛋白质表达差异、蛋白质功能结构及相互作用的变化，系统地对证候本质及中药的多环节、多靶点调整作用机理进行研究，最终揭示证候的物质基础及中药作用和配伍规律。目前中医药蛋白质组学研究主要集中在中药药理研究，单味中药或复方的药效和药理研究是中药作用研究的核心。利用蛋白质组学技术研究治疗前后的蛋白质谱变化，在整体水平上评价中药药效，揭示中药作用的靶点、作用环节和作用过程，力求阐明中药多靶点、多层次作用的分子机理。文献检索结果显示，目前蛋白质组学研究主要涉及少量中药复方和少量中药单体的研究。如苗兰等研究血府逐瘀汤对气滞血瘀证模型大鼠血清蛋白质组表达的影响，经双向电泳分离血清总蛋白，并行图像分析比较，发现血府逐瘀汤可影响7个蛋白点差异表达，分析可能与其作用机理相关[9]。申定珠等采用双向凝胶电泳分离健胃愈疡颗粒处理组和未处理组大鼠胃组织的总蛋白，结合图像分析、质谱鉴定和数据库搜查，发现处理组有12个蛋白质表达变化，且大多数蛋白质与溃疡复发的形成、生长、凋亡及免疫相关[10]。运用蛋白质组学的思路和方法研究中医药理论，虽然已取得了一定的进展，但就实验研究方面来看，依然存在明显的不足。具体表现在：（1）相当部分研究仅停留在蛋白质成分分离和差异蛋白点显示，未进一步采用质谱等鉴定分析，未对差异靶点之间进行生物学分析，或未对差异靶点的确切意义进行研究，使实验结果的应用价值受到影响。（2）研究结果大多为平行发生或晚期事件，几乎所有试验报道均未证实蛋白质差异表达是必要的早期事件。（3）大多数研究缺乏必要的对照组。（4）对表达丰度较低的重要蛋白质组的研究不足，对亚细胞蛋白质组的研究未见报道。针对上述问题，我国药学工作者应关注生物医学研究进展，了解更多的生物技术；利用各种生物学数据库，对差异蛋白质进行信息学分析，初步预测差异蛋白质之间的相互联系及可能参与的信号通路网络；在研究中加设对照组，尽可能排除药物或方法造成的干扰；对重要的差异蛋白质作进一步深入的研究，适时引入基因过表达或RNA干扰，或反义核酸技术，以明确差异蛋白质在中药调节中的必要作用；以蛋白质组学筛选研究为基础，利用系统生物学的思路和技术，对具有确切作用的重要靶蛋白进行更深入的中药相关研究；对于蛋白质检测，可根据需要灵活采用不同分辨率的染色技术；由于中药作用多靶点、多层次的特点，在中医药蛋白质组学研究中，极可能筛选出某些未能确知生物学功能的差异蛋白质，再根据研究结果提示，进行生物学作用鉴定，有可能成为中医药学对生命科学研究的重要贡献。所以中医药蛋白质组学研究不仅在于发现种种现象，更应努力揭示现象的本质，重视持续的深入研究，由点到面，由面及点，交叉整合蛋白质组学、分子生物学和生物信息学技术，推动中医药研究的现代化。

5结论与展望

第8篇：基因治疗的基本策略范文

关键词 干细胞治疗 安全性 有效性 合法

干细胞是一类具有不同分化潜能，并在非分化状态下自我更新的细胞。用于治疗的干细胞主要包括成体干细胞、胚胎干细胞以及诱导的多能性干细胞。技术人员可以应用人自体或异体来源的干细胞经体外分离、纯化、培养、扩增、修饰、诱导分化、冻存及冻存后的复苏等过程后回输（或植入）人体，用于疾病预防和治疗。干细胞预防和治疗疾病的预期有望优于现有的手段，尤其对于尚无有效干预措施的疾病，以及威胁生命和严重影响生存质量的重大疾病。正是由于这个重大发现，在全世界掀起了一股干细胞研究热潮，并迅速同时形成了新兴的干细胞产业经济。但是有一些干细胞企业为追求暴利而漠视科学发展的客观规律以及社会伦理与法律问题。干细胞这项新技术是一柄双刃剑，需要法律对其进行规制，才能切实保护患者的合法权益，真正造福人类。

1干细胞治疗进展

干细胞能够分化为不同类型的细胞，成为了人类的一种“修复元件”。可以通过注射干细胞制剂治疗疾病，比方说修复受损的神经系统，恢复神经系统的功能，治愈因神经细胞受损导致的瘫痪。干细胞也可分化成新的胰腺细胞分泌胰岛素治疗糖尿病。从理论上讲，干细胞有望治愈用传统方法无法治愈的疾病，如糖尿病、老年痴呆症、心脏衰竭、红斑狼疮、黄斑变性、类风湿、恶性肿瘤等疾病。因此干细胞似乎成了万能细胞，受到医疗界高度重视。2009年1月23日，美国Geron公司胚胎干细胞用于脊髓损伤被FDA批准用于临床试验。（这是美国首次对胚胎干细胞临床研究发放通行证）。2010年3月，美国Advanced Cell Technology公司宣布用于治疗少年型黄斑变性的胚胎干细胞疗法“MA09-hRPE”被FDA批准临床试验，获得了FDA授予孤儿药地位（FDA批准的第二项干细胞疗法）。2011年1月3日，美国Advanced Cell Technology公司宣布用于治疗老年黄斑变性的胚胎干细胞疗法被FDA批准临床试验。2010年6月，Osiris Therapeutics公司的Prochymal 在三种疾病（克罗恩病、预防骨关节炎、心肌损伤）治疗中完成三期临床试验。2010年11月，美国国立卫生院批复有11种干细胞进入FDA审批程序，并称近期还有30种干细胞陆续进入FDA审批。中国在这方面比较落后，目前还从没有批准过胚胎干细胞制剂治疗技术的临床试验。

干细胞治疗技术的美好愿景刺激了干细胞产业的发展。我国虽然尚未批准胚胎干细胞技术的临床试验，但是从事干细胞技术研究开发的科研机构或者企业也为数不少，遍布全国各地。有北京经开区的汉氏联合干细胞研究院、上海浦东新区的上海科医联创生物科技有限公司、上海市长宁区的臻景医疗公司、广州市生物岛的军事医学科学院华南干细胞与再生医学研究中心、深圳市高新科技产业园的深圳市北科生物科技有限公司、中国滨海新区华夏干细胞联盟、滨海新区科技园的昂赛细胞基因工程公司、无锡的奥斯达干细胞有限公司、湖南长沙市麓谷高新区人类干细胞国家工程研究中心等。并且也有上市公司，如沪深两市中唯一家以干细胞产业为主营业务的上市公司中源协和干细胞生物工程股份公司（股票代码：600645）等。这些企业形成了一个新兴的干细胞行业。

2干细胞治疗的安全性、有效性

干细胞制剂无论是作为药品还是医疗技术在应用于人体临床治疗之前，都必须证明它的安全性、有效性。而这个验证过程漫长而复杂，首先是动物实验、其次是第三方检测、然后再是临床试验。只有证明安全性与有效性后才能应用于临床治疗。

英国《每日邮报》报道了一个典型案例，前奥运选手马克斯・特鲁克斯患帕金森症而接受了干细胞疗法。医生从胎儿那里提取干细胞，通过体外培养，扩增、纯化等技术制成干细胞制剂注入患者大脑中。但是当这名病人去世后，病理学家们发现，这名病人的软骨、皮肤和骨头都堆积在大脑内。也就是说注入的干细胞并没有按照医生的意图分化成神经细胞，而是分化成了软骨、骨头与皮肤。当然，随着技术的发展，像上述案例中干细胞不定向分化的情况已经非常少了。但是很多学者还是总结出干细胞治疗的隐患或者存疑的地方。

2.1免疫排异反应

我们身体的免疫系统天天在击退微生物、病毒、有毒物质的入侵。我们的免疫系统发现这些异物（包括移植手术），便会发动一系列有害的攻击行为。这就是我们常说的免疫排斥反应。如果干细胞来自于异体，那就有可能引起免疫排斥反应。当然科学家可以通过对干细胞加工的方法，使它能够应对免疫系统，但这需要临床验证。

2.2非定向分化

上述英国《每日邮报》报道的前奥运选手马克斯・特鲁克斯案例，就是一个干细胞非定向分化的案例。当医生期望注入的干细胞能够分化成为健康的神经细胞，修复神经系统，但是它却分化成了骨头与皮肤。如何准确地诱导干细胞分化成为制定的细胞，这还需要进一步研究。

2.3细胞生长失控与致瘤性

正常的细胞生长是受控的，能够精确自我复制、恰当时候停止再生、专门分工、各司其职、受损自我凋亡。但是异体注入的干细胞制剂却不一定遵循这套严格的程序，不一定定向分化、不一定停止再生。当注入的细胞生长失控，就有可能生成肿瘤，比如iPS细胞致瘤性高达20%。

2.4作用机理不太清楚

注入的干细胞制剂如何分化、如何分工、如何修复系统功能，以及异体干细胞存活多久，如何在体内发挥作用。对于这些问题还不是完全清楚。

从这些问题可以看出，干细胞治疗目前存在安全性问题。

另外在治疗肿瘤方面，根据国内所报道的案例，疗效不明显。2014年3月15日与3月16日在中央电视台“焦点访谈” 连续两天报道浙江无锡“非法干细胞治疗事件”：

2011年，58岁的昆明市民张某被查出身患结肠癌晚期，一个偶然的机会，他们听说，无锡某干细胞公司拥有一种非常有效的治疗方法，说人体干细胞很有用，能治好。并且其董事长跟他们说：“一般的癌症根本没有问题。你这个病很有希望的，如果不来我们这里的就没救了。”一个剂量12万元，一个疗程36万元。张某的女儿凑足了36万元，汇到该公司的账户上。第二天该公司把张某夫妇带到了无锡市滨湖区的一家社区医院为张某进行胚胎干细胞治疗。2012年3月30日，公司人员告诉他们，治疗结束，效果很好，可以回家休养。而当一家人回到昆明，张某的病情远没有像该公司所承诺的那样，向好的方向发展，能再活十年，而是急转直下，短短三个月便不幸去世。

干细胞治疗技术还处于初级阶段，还有许多难题有待克服。国家应该大力支持干细胞研究，以尽快解决技术难题，攻克科技难关。但是当技术还不成熟，在安全性、有效性没有确证的时候，为了赢利而匆促应用于临床，这就严重侵犯了患者的利益。

3干细胞治疗的管理

2010年10月7日Nature杂志发文“Stem-cell laws in China fall short”，从立法层面指出中国规制干细胞技术的相关法律欠缺，现有法律缺乏可操作性。认为准确清晰、详细的配套规则是必须的。

2012年4月11日Nature杂志继续发文“China’s stem-cell rules go unheeded”从执法层面指出中国干细胞规制收效甚微。未按要求申报批准、未经临床试验验证的干细胞治疗方法广泛应用于临床治疗，并且禁而不止。

目前中国干细胞市场被公认存在以下弊病：

3.1未经临床试验验证、未按要求申报批准而擅自应用于临床

2009年3月2日卫生部组织制定了《医疗技术临床应用管理办法》，并于5月1日施行。干细胞治疗技术被列入第3类医疗技术，由卫生部负责技术审定和临床应用管理。2013年，我国出台了《干细胞临床试验研究管理办法（试行）》，第四条规定：“干细胞临床试验研究必须在干细胞临床研究基地进行，干细胞临床试验研究基地由卫生部与国家药品食品监督管理局组织进行遴选和确定。”也就是说所有干细胞制剂只要应用于临床治疗，就必须经过临床试验验证。可事实上中国许多医院都在开展干细胞治疗技术，却未经临床试验。

3.2虚假宣传扩大疗效

如同2014年3月15日报道的无锡某干细胞公司声称她们的技术治疗一般的恶性肿瘤根本没有问题，最坏也能带着癌症生存10年。干细胞技术治疗恶性肿瘤，如果未经临床试验验证，意味着其安全性、有效性尚未确定。很多企业不顾这些基本事实，为追求高额利润，任意扩大其疗效以吸引患者。

3.3无收费依据与收费标准擅收高价

干细胞临床试验研究管理办法（试行）第七条规定：开展干细胞临床试验研究，不得向受试者收取费用，不得市场化运作，不得干细胞治疗广告。这说明干细胞技术的临床试验不能收取费用。另外中国还没有批准干细胞的临床试验，所以未经临床试验的干细胞技术没有资格应用于临床治疗，更谈不上收取费用了。即使干细胞治疗技术获得了临床批文，准许应用于临床，也不能擅自收取高价，而是必须作为三类医疗技术通过另外的程序申请物价批文。

3.4干细胞供体未经检测

我国《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》强调无论细胞来源如何，都必须提供细胞的组织来源及细胞类别的确证资料，其中包括形态生化或表面标志等。

若体细胞来源于同种异体，需说明供体的年龄、性别，供体必须符合国家对献血员的要求，并提供测试的方法及符合条件的依据。供体必须经过检验证明HBV抗原、抗HCV、抗HIV-1/2、梅毒抗体、细菌、霉菌均为阴性，必要时需说明供体的既往病史、家族史等临床资料。对于那些需通过激活体内免疫功能发挥作用或需体细胞在体内长期存活的体细胞治疗项目，除ABO血型外，还必须对供体做HLA-I类和II类分型检查，并证明与受体（病人）相匹配，同时提供检测方法和依据。若体细胞来源于动物，必须提供动物的来源，遗传背景，健康证明（如重要病原体，包括人畜共患疾病的病原体），饲养条件，应用此类体细胞的必要性和安全性。

可是许多开展干细胞治疗的医院与企业为节约成本，利益最大化，忽略或简化了对细胞与供体的检测。

3.5干细胞来源的伦理问题

事实上目前许多医院或者企业的干细胞来源是流产的婴儿或者剩余胚胎。通过私下与妇产科达成某项协议而获得胚胎干细胞。这种获得方式即使作为科研也必须通过伦理审查。如果流产胎儿是成为企业营利的“原材料”，几乎不可能会通过伦理审查。

第9篇：基因治疗的基本策略范文

【关键词】 急性梗死

关键词: 心肌/细胞学;急性梗死;新生血管化，病理性;移植

摘 要:目的 观察移植的胚胎心肌细胞在成年兔急性梗死心肌组织内的生长发育过程和其与宿主心肌组织的相互作用，以及对周围心肌血运的影响. 方法 将培养的兔胚胎心肌细胞，经DAPI标记后，直接注入成年兔的急性梗死心肌组织内（通过结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型），同时设立对照组.4wk后处死动物，进行组织学和电镜观察. 结果 4wk后的心肌组织切片中，移植心肌细胞与宿主心肌细胞之间形成闰盘，其排列方向与宿主心肌肌纤维方向平行，同时，与对照组相比，心肌梗死区面积减少及移植区血管密度增高（P

Keywords:myocardium/cytology;myocardial infarction;neovascularization，pathologic;transplantation

Abstract:AIM To investigate the interaction between im-planted fetal cardiomyocytes and host cardiomyocytes and the angiogenesis effects of implanted fetal cardiomyocytes on the host cardiomyocytes and the development of fetal cardiomy-ocytes implanted into adult acute infarction myocardium.METHODS After labelled with DAPI，cultured rabbit fetal cardiomyocytes were implanted into the actue myocardial in-farction site of adult rabbits via direct injection.The myocar-dial infarction model was established by ligating the left ante-rior decending artery.Specimens were harvested4weeks af-ter the cell implantation.The results were observed by histo-logic methods and electronic microscopy examination.RESULTS Intercalated disks were observed between the graft-ed and the host cardiomyocytes，with the implanted car-diomyocytes parallel to the host myocardium in an aligning di-rection.The area of myocardial infaction decreased and the vascular density of implantationsites increased compared with those of the control groups（P

0 引言

将体外培养的兔胚胎心肌细胞直接移植到成年兔急性梗死区的心肌内，分别观察研究其在受体心肌组织内的生长发育和与宿主心肌细胞的相互作用情况，以及对周围心肌血运的影响，验证细胞移植治疗缺血性心脏病的作用，为临床上应用细胞移植治疗缺血性心脏病提供实验基础.

1 材料和方法

1.1 材料 成年健康兔18只，雌雄不限，体质量2.0～2.5kg，购自第四军医大学实验动物中心.小牛血清（Hyclone），DMEM高糖培养基（Hyclone），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡盐液（Gibco），4’，6-二脒基-2-苯茚二酮（Sigma），第Ⅷ因子抗体（Sigma）.

1.2 方法

1.2.1 胚胎心肌细胞的分离和培养［1-3］ 取胚胎兔浸入950mL L-1 乙醇30s，取出心脏，分离心室，用培养液洗涤2次，将心室肌肉剪碎，加入0.25g L-1 胰蛋白酶消化30min，反复吹打，室温下540g离心5min，收集消化的细胞，用含100mL L-1 小牛血清的DMEM培养液，置37℃含50mL L-1 CO2 孵箱中培养2h，然后将培养瓶翻置，将未贴壁的心肌细胞继续培养，2d换液1次.

1.2.2 胚胎心肌细胞标记 心肌细胞培养第4日，用0.2g L-1 4’，6-二脒基-2-苯茚二酮（DAPI）荧光标记细胞4h以上，用Hanks平衡盐液漂洗6次以去除未结合的DAPI.0.25g L-1 胰蛋白酶消化后，离心收集细胞，加入DMEM培养液制成细胞悬液（细胞密度为104 μL-1 ），以备用于细胞移植.

1.2.3 兔急性心肌梗死模型的建立及细胞移植 将健康兔随机分成胚胎心肌细胞移植治疗组及对照组.用戊巴比妥钠30mg kg-1 iv，氯胺酮10mg kg-1 im麻醉.左前外侧切口，切断第3，4肋骨进胸，显露左冠状动脉前降支，距离其根部大约1.0～1.5cm，用4-0普理林线直接缝扎，见其远端供血区心肌组织颜色发暗，急性心肌梗死模型即告成立.1h后，用微量注射器向梗死区心肌组织内注射移植用心肌细胞悬液，3点注射，每处50μL，对照组以相同量的DMEM细胞培养液注射.常规关胸，抗感染治疗，每日给予环孢素A10mg kg-1 饲养.手术中未发生气胸及恶性心律失常.

1.2.4 结果观察 心肌细胞移植术前，动态观察培养的心肌细胞，荧光显微镜观察用DAPI标记好的心肌细胞.心肌细胞移植术后4wk，用过量麻醉剂处死动物，取移植区及周围心肌组织，统计梗死区面积，制作标本，进行透射电镜及冰冻切片荧光显微镜观察.同时，对梗死区石蜡切片（治疗组及对照组动物取样2个/只，共取样本36个），用第Ⅷ因子免疫组织化学染色梗死区血管，光学显微镜200倍视野下血管计数，统计移植区血管密度.

统计学处理:数据采用SPLM软件包，运行单因素分析，结果以x ±s表示.

2 结果

2.1 胚胎心肌细胞的特性 对用酶消化法获得的胚胎心肌细胞进行培养，4h后细胞贴壁，24h后可见细胞搏动.培养的心肌细胞成梭形或纺棰形，细胞核大，胞质丰富（Fig1）.

2.2 胚胎心肌细胞移植后心肌再生 治疗组心肌梗死区面积（0.49±0.13）cm2 明显少于对照组（0.96±0.18）cm2 （P

2.3 血管再生 对缺血区石蜡切片用第Ⅷ因子行免疫组织化学染色，显微镜200倍视野下血管计数，移植区血管密度（8.0±2.6），高于对照组（1.6±1.4），（P

图1 －图4 略

3 讨论

正在探索的细胞移植术，为病损性心脏的细胞重构及衰竭心脏的功能恢复，提供了一种全新的治疗策略，为缺血性心脏病的治疗带来了光明的前景.心肌细胞移植可以发挥三大功能:稳定病损性心脏结构，防止组织重构;改善局部或整体心脏的收缩功能;可以充当分子载体，进行基因治疗［4］ .

本实验中，将分离培养的兔胚胎心肌细胞移植到成年兔梗死心肌区域后，心肌梗死区面积明显减少，冰冻切片荧光检测显示，心肌标本中有带荧光的细胞核和肌纤维，说明移植的心肌细胞存活.同时，它们排列方向基本一致，显微光镜下与宿主心肌细胞肌纤维方向平行，这可能与心肌内微环境及宿主心肌细胞收缩时对其产生的机械张力有关［5］ .细胞间形成闰盘是移植的胚胎心肌细胞的结构基础，表明胚胎心肌细胞移植后与宿主心肌细胞融合修复心肌损伤，直接参与了心肌收缩活动.在修复损伤的同时，胚胎心肌细胞还可促进周围血管再生，这可能是由于胚胎心肌细胞在生长发育过程中分泌一些血管生成因子、细胞生长因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子（IGF）、碱性纤微母细胞生长因子（bFGF）等［6，7］ .实验中我们采用了一种新的细胞标记方法，即利用DAPI标记的方法［8］ ，相对于以前用H3标记、酶标记的方法，其具有以下特点:①DAPI对DNA有高 度亲和力，是标记细胞核的荧光染色，具备标记高效性（100%）.②细胞标记的表达不会因细胞分化状况改变.③一旦被标记后，只由被标记的细胞保存，不会有传递.④对活细胞没有毒性，不会改变细胞活性及细胞器的超微结构.

胚胎心肌细胞移植到成年兔梗死心肌区域后，其细胞膜上离子通道的变化，整块心肌的反应性及全心功能的改善尚待进一步研究.另外，胚胎心肌细胞的异体移植，随着时间的延长，受体内终将发生难以避免的排异反应，进一步寻找自身来源的细胞（如骨髓基质细胞）进行细胞移植的研究正在实验中.

参考文献:

［1］Yu SQ，Reng YS，Wang G，Liu WY，Tang CW.Effects of cap-topril on enzymatology of cultured anoxic-reperfused ventricular myocardial cells ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（5）:627-629.

［2］Song ZG，Liu WY.Establishment of culturing adult cardiomy-ocytes model with rheumatic heart disease and study on its colla-gen synthesis ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2000;21（5）:543-546.

［3］Shang LJ，Zang YM.Cardiotoxicity of CGRP in cultured my-ocardial cells of neonatal rats ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（3）:234-236.

［4］Li RK，Mickle DAG，Weisel RD，Mohabeer MK，Zhang J，Rao V，Li GM，Merante F，Jia ZQ.The natural history of fetal rat cardiomyocytes transplanted into adult rat myocardial scar tissue ［J］.Circulation，1997;96:Ⅱ179～187.

［5］Schwars ER，Patterson M，Kloner RA.Cardiomyocyte trans-plantation-a cell replacement for repair of myocardial infarction ［J］.Z Kardiol，1998;87:1-7.

［6］Li RK，Jia ZQ，Weisel RD，Mickle DAG，Ji Z，Mohabeer MK，Rao V，Ivanov J.Cardiomyocyte transplantation improves heart function ［J］.Ann Thorac Surg，1996;62:654-661.