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从普通留学生到国际医药学界的领军人物
许瑞安教授是福建晋江人,其故乡既是一个环山面海的渔、农、侨村,山川揽胜,日月钟华;又是一个文化底蕴十分厚重的中国历史文化名村一晋江福全。史载唐宋开科取士以来,全村进士,举人共20多人,出将入相,该村乃是我国最著名的抗倭历史名城,明代曾在没有官军奥援下,孤城三次打败入侵倭寇;许教授自幼沐浴于海洋文化和中原文化的交汇,其童年就在惊涛拍浪的变质岩礁上外婆家的住屋度过,大自然春风造化孕育着他对万物之灵有着不尽迷思与眷恋;失学,饱受天风海涛的锤炼,不仅为日后的工作打下了坚实的基础,而且从科学态度、科学素养到人生目的都得到了良好的洗礼与升华,立志一生从事科研。
1983年许瑞安教授考上国家教育部公派出国留学。到了国外之后,他不仅迅速克服了独自在异国他乡求学所必然面临的种种不适和不便,而且抓紧一切机会刻苦学习,将绝大部分时间都泡在图书馆和实验室里。正是源于这种严谨认真的治学精神和态度,1989年,他顺利获得了Otago大学的博士学位,之后又前往加拿大攻读博士后。
完成学业后的许瑞安曾在国外多家著名的国际大学、科研机构从事科研教学工作,先后出任过大学载体研究中心、神经载体研究室主任的职务。从那时候起直到2005年年底归国,他主要从事的工作范畴包括病毒载体、分子医学、分子药物学的项目科研和教学,还曾担任过奥克兰大学载体研究中心的主任和美国托马斯・杰弗逊大学的神经载体研究室主任。
在国外期间,许瑞安从1983年起开始陆续发表专业学术论文,迄今为止已经有超过百篇的重要学术文章发表,其中SCl论文就占到了七成以上,SCl影响影子总分超过400分。他在基因治疗研究方面的部分工作发表于NatureMedicine【1998年第5期封面】、Science、PNAS等国际一流学术刊物,2005年发表在美国医学科学检测杂志上的“Stabilityof lnfectiOUS rAAV vector stock”一文更是被世界卫生组织选定为分子疗法临床应用的主要参考文献之一。2006年他在Histopathology杂志发表结肠癌治疗一文,2011年入选结肠癌治疗领域5年来TOP 10论文,且位居榜首。
许瑞安在学术上获得的成果不仅在理论研究方面,更包括了技术实践应用领域。由他创新发明的专利成果达16项,他是国际口服基因疗法的主要奠基人和发明人之一,在分子药物学、癌细胞与基因疗法领域取得一系列的科研成果。
凭借着严谨的科学态度和坚韧不拔的精神毅力,许瑞安从一名普通的留学生成长为一位国际医药学界知名的科学家。
肩负重任,归国奉献
2005年,许瑞安回到家乡,为祖国的药物研究事业贡献才华和智慧。同年,他受聘于华侨大学,并出任所长、主任。由于许教授在分子医学与基因治疗研究领域内的突出贡献和成就,奠定了他在国内外相关领域的学术地位,2007年受命,开始负责组建分子药物教育部工程研究中心的工作。他在任职国家教育部分子药物工程研究中心主任、华侨大学分子药物所所长之外,还兼任了国际癌细胞与基因疗法学会常务理事、国家科技部科技发展战略专家/国际科技合作管理专家、国家教育部学位中心评审专家、福建省生物医药工程研究生培养基地负责人、厦门海洋与基因工程重点实验室主任、厦门市国际科技合作生物医药基地负责人、教授、博士生导师、北京协和医学院荣誉教授、《中国临床药理学和治疗学》编委、顾问,《中国海洋资源》特邀编委、中国海洋大学海洋药物客座教授,山东大学兼职教授等职务。在国际上,许教授同时还是瑞典卡罗琳医学院国际学术刊物lslet编委,美国International Panel of MedicalScience Monitor,我国World JournalOf Gastroenterology PharmacologyandTreatment编委、美、英、德、日、瑞典等国际18家Hepatology,Gene The rapy等SCI学术刊物审稿人、“行政院”台北荣民总院荣誉教授、爱尔兰国家自然基金评审专家、新西兰食品科学技术研究院专业委员。
回到祖国之后,许瑞安教授将全部智慧和毕生对科学事业追求的所有热忱投入到了我国的分子药物与基础医学研究事业当中。他负责组建了华侨大学分子药物学研究所,带领研究所的同仁以新药研发为主旨,积极开展了一系列工作,也由此揭开了华侨大学药学学科和生物医学工程建设的序幕。
自2007年10月分子药物教育部工程研究中心获得教育部批准立项、开始建设以来,在许瑞安教授的带领下,该研究中心依托于华侨大学,得到了迅速地成长。经过了三年的建设时期,到2010年时研究中心已经完善建立起了分子药物、中药复方、厦门市海洋与基因工程药物重点实验室三大药物研究与开发平台。
早在1998年,许瑞安和During就曾经首开人类口服基因疗法的先河,在分子药物领域做出了开拓式的大胆创新并获得了首创的成果。回国后许教授继续发扬在这一领域内的优势,致力于口服基因药物的研发工作,他负责研究的“rAAV基因药物的口服吸收机制”获得了2009年度国家自然科学基金资助。而由许瑞安和肖卫东领军的团队,已经建立起成熟的rAAV载体的产业化技术。
时至今日,在许瑞安教授的不懈努力和推动下,占地500平方米的AAV载体中试生产车间已经建成,可为国内外各家生物医药研发单位提供各种类型中试级别的AAV病毒载体。
推动创新成果研究,建设人才培养体系
许瑞安教授是我国“863”“十五”肺癌基因疗法课题组组长、首席科学家,肝癌基因疗法课题组副组长、国家“863”“十一五”肺癌基因疗法课题组首席科学家,在我国的癌症与基因疗法研究领域力尽所能。与此同时,许瑞安并未满足和止步于个人的研究成果创新,他在积极推动产品开发和研究成果转化、发展学科建设和人才培养等方面依旧付出了极大的心血和努力。由许教授带领的分子药物教育部工程研究中心
重视蛋白药物的临床应用,迄今已建立多种小量蛋白的真核/原核表达系统,并已有三个蛋白产品(Kallistatin,Cygb,Vasostatin)完成动物实验并达到中试规模制备并纯化成功,保证了较大量蛋白纯品可用于药物学、药理学的探索,同时亦能满足基因工程蛋白药物开发的临床研究需要;其团队研发的基因重组FSH,还对妇女不孕具有确切临床价值。目前已提交得到验证的抗病毒和抗感染药物的专利申请,中试、临床试验和报批国家新药的工作正在筹备中,并有望按照欧美标准在国外注册和销售。
与此同时,基因药物平台申请的“肝纤维逆转药物”,利用具有特异的细胞靶向性的基因运载系统携带具有抗氧化和抗炎症双重功能基因抑制星状细胞激活达到防止肝硬化目的,颠覆了目前纤维化治疗的传统思路,具有巨大的市场开发潜力。在中药研发的制备领域,工程中心目前也已经拥有授权或已申请的中药相关专利项目超过10项;在合成药物方面,中心开发出了有效的抗癌药物肉桂酸乙酯衍生物的绿色合成工艺,以成本低、绿色化、操作简单等特色为市场所看好;在海洋药物领域,中心以东南沿海、台湾海峡、东南亚海域有特殊功效的海洋分子药物为研究对象,建设的海洋药物研发平台现如今已发展成为与厦门市政府共建的高校海洋药物重点实验室。
学科建设是重中之重,根深才能树大,许教授牢牢把握学科建设方向。在他的努力下,分子药物工程研究中心2007年正式开始建设,2008年就开始独立招收医学生物工程、分子药物学、微生物生药学和药学方向硕士研究生,2009年福建省唯一的“福建省生物医药工程研究生创新培养基地”落户分子药物学研究所。如今他们已经拥有了一个二级博士点,3个硕士点1个专业硕士点以及完备的科研、教学团队还从美国宾州大学、英国牛津大学、香港大学的教授以及曾在辉瑞、默克等国际知名制药公司承担开发工作的高级工程师中聘请了多位兼职教授或名誉教授。
作为中心领军人物的许教授不仅是科技部科技发展战略专家,还是国际知名的分子药物学家,在他的主持或策划下,工程研究中心仅立项建设期间就申请获得各类国家、省部级、市级课题22项,而且大力加强国际间科技合作与学术交流;与新西兰皇家科学院合作的“核糖开关及其在基因治疗的应用”已获得新西兰政府和国家科技部的资助;2011年与美国伊利诺伊大学芝加哥分校药学院联合建立培养一本一硕一博体系。从今年起开始招收本科生。全体师生们众志成城,同心同德,努力把教育部分子药物工程中心建成了一个分子医药基础研究、产品开发和成果转化一条龙的基地,涉及分子医学,分子药物,医用口服病毒纳米颗粒,药物合成,转化医学,海洋基因药物,天然药物等多门学科,同时为国内培养和凝聚了分子药物领域里的大批技术创新型人才。
与此同时,许教授极力推崇产学研相结合,先后与中侨药业、福建太平洋药业,沈阳天一药业等签订项目合作、转化及技术培训协议;该团队2009年研发的硫酸沙丁胺醇口腔崩解片、药物中间体等项目的研发和成果转化投放市场,每年产值均超2,000万。
如今的分子药物教育部工程研究中心已形成一支囊括多学科、从基础研究至产业化的完整的产学研研发链条。许瑞安教授介绍说:“在这个链条上,我们可以独立设计基因药物载体、蛋白药物和靶向基因药物,可以对病毒载体和基因工程蛋白进行中试规模生产,还可以承担或独立进行新产品的开发与市场化,满足临床药物研发和接受企业委托项目的需要。”
以什么理念和方法面对癌症,一直是大家关心和困扰的问题。医家一直追求癌症的早诊断、早治疗。患者又多持“除恶务尽”的心态,恨不得癌肿一日离己而去。这就铸成人们认识治疗癌症的误区,使医患两家易把“斩草除根”视作最佳方法。而且按现有伦理和道德观念,患者家人一般处在焦躁氛围中,也不情愿地选择“拼一下”,接下来便接受了手术、放化疗等治疗。
事实是一味追求手术切除和攻毒抗癌的结果并不乐观。有人在“中国肿瘤战略防治研讨会”上指出,“总体生存期尚处于低水平状态……”对患者来说,磨难和痛苦接踵而至,可以想象患者痛苦的内心世界,人财两空者又何其多也!
当看到本来自觉身体健壮,正常工作,仅因例行体检而知患上癌症,接着数月便死去,死的那么容易让你无法理解。对此,许多医生的心情也只有无奈:难道这是我们想要的临床结果?扪心自问,病人假若不去体检,情况如何……医生的责任是解除患者疾苦,如果做不到这一点,功过将何以评说,能用科研来搪塞和自我安慰吗!面对现状,不少专家感慨,医疗的目的是让患者好好活着。可见深入探索新的肿瘤防治理论和防治理念是何等重要。
经过长期医学实践、结合中医理论,我形象地将主要采取手术、放化疗、攻毒等法,旨在一味追求攻杀肿瘤的方法,称之为“霸道治癌”。与之区别,本着前贤“仁心仁术”、“无为而治”、“不治而治”、“不药而愈”的传统思想,循安抚鼓励,“顺其自然”,不刻意剿杀……结合西医对症与支持疗法,我引导肿瘤患者“以静应动”,树立与肿瘤长期“和平共处”带病延年理念。这种综合的心理、药物、康复等治疗理念和实践方法,我称之为“王道治癌”。经过多年临床取得令人满意的效果。
我还客观地指出“霸道”治癌的现状和弊端。进而结合中国国情,对国内外专家推重的机体重要抗癌机制——原发癌转移到机体其他部位时要经历数月至数年的“休眠期”说,进行了创新性论述,提出了较“休眠期”说更具积极科学的肿瘤防治“相持期”说,并通过对“相持期”的论述,阐述了“王道治癌”的具体方法。在“相持期”,力求让癌症患者与癌瘤长期和平共处、带病延年。
古往今来,人们及医学界对疾病(尤其是重危疾病)均视为十恶不赦的“祸害”,有病就要求医吃药,医生则以治病用药自居,均信奉一个“治”字。故而,人们常将自己与疾病的关系比之如“农夫和蛇” “东郭先生和狼”不可怜悯,务必除恶务尽,于是,善良的“东郭先生”才总是被世人“责备”。
即便医学著述提及“带瘤生存”,也都是作为说明疗效观察的时间概念进行表述的。如提到“疗效观察”, 说“带瘤生存半年”,也只是在褒扬治疗手段的成果。
本人在临床中体会到“与癌和平共处,带瘤延年”应是人类应该接受的自然现象,而不必刻意将“瘤”置于死地而后快。“农妇和蛇”未必要你死我活,要改变思维,要倡导人与癌瘤“和平共处”。一般听来,这似乎是说“农妇和蛇要和平共处……”是的,16年前在国内最早发表“王道治癌”说,简直是天方夜谭,不可思议。直至2011年4月国内学术界在南京召开首届关于“王道思想”服务于现代社会的全国性研讨会,才予理解。“王道治癌,与癌和平共处”说与学界实现资源共享已历时15年之多,相信在肿瘤防治及提升患者生存信心、意志和生活质量等方面,或应产生了一定的影响。
时至今日,现代医学也开始对肿瘤重新认识,美国医学家威尔什告诫:“对无害的肿瘤进行手术和化疗,不仅无益,反而有害,甚至带来严重后遗症,即使对有害肿瘤过早诊治也非全部有益。”全美抗癌协会已指导意见,建议60岁以上人群应慎用手术和放化疗治疗。
至于“手术并发症”这一“老生常谈”问题,近期更引人注目,黄志强院士指出:“如肝门胆管癌手术现在越做越多,切除率达70%,死亡率很高,病人生存率并未延长。”肿瘤专家汤剑猷最近亦呼吁重视癌症的“过度治疗”问题。
本人在1996年论文指出:实际上生命又是极坚强的,像苏武、白毛女……精神紧张是致病情加重的重要原因已为医界共识,可霸道治疗给癌症患者造成的深刻影响却常被漠视。诚然矢志斗癌无可非议,但作为个体则应十分谨慎。其中两败俱伤者太多了,人们除置身斗争之中难道别无他途吗?君不见与恶人为邻与毒蛇为伴相安无事者亦不乏其人。在一定时间与癌相持和平共处并力争延续这一时间的可能性难道不存在吗?患者能用平常心将癌症以一些普通疾病视之,在本应属自己的时间里获人生之乐,难道不比让患者在霸道治疗下受尽煎熬更有意义吗?唯应强调的是:医者仁术,一切以病人为本,以关爱理解为前提。正如哲人图姆斯所言:“那种不理解病患痛苦的性质的医学治疗,不仅无法减轻病人的痛苦,而且其本身也常成为患者痛苦的根源。”
现代医学亦不清楚“休眠期”之具体时间。而且几乎所有对此研究的学者都认为:处于休眠期的癌细胞是不发生裂变和增殖的,许多患者正是在此阶段接受了手术等治疗。显然丢掉休眠期概念宣称某方法可延长患者生存期是失实的……哈佛大学霍夫曼根教授指出:“当切除处于休眠期的癌时,患者机体的抗癌成分也丧失殆尽,平衡即被打破,发生癌转移也难以避免了”。有学者告诫:“若再一味追求对癌的切除率,至少对某些患者说要付出沉重的代价。”
“休眠期”称“相持期”更为确切,因为科学家至今不知从癌形成之始至威胁个体生命时之时间是多少,却已有发现癌而自然缓解现象之报道。应赋予“相持期”更深刻含义,相持期对患者来说不仅是走向死亡,更是走向胜利的关键时期……在“相持期”只讲“斗杀”,无论对西医抑或中医说均是不可取的。
我常对病家说,肿瘤自身与机体保护机制的关系就像是橘肉与橘皮的关系,人类自我免疫能力是伟大的,起码在癌形成之始,自身保护能力已开始对其监控了,尽管此时自己察觉不到,最新设备也检查不到。至今医学也无能力在隔着或不损伤橘子皮情况下去挖掉全部橘肉,更不必说已发生转移的情况了。
为鼓励患者带癌生存信心,我还讲了一个自己常思考的现象:自然界中小树苗是极少长疙瘩(肿瘤)的,可老树没有几棵不长的,尤其是千年老树,疙瘩摞疙瘩,有的树心都空了,可它仍顽强活着,叶绿枝茂。人类何尝不是如此坚强。我们为什么不可以反过来想,肿瘤也可能是生命物体在其生命过程中的必然现象,或云是其可以长寿的标志呢?
青少年德育工作提供新的契机。在生物知识的教学和技能的训练中要渗透德育教育。教师要在教学中实现科学性和思想性的统一,在潜
移默化中对学生进行政治导向、情感陶冶、意志培养、道德规范。中学生物学科担负着促进学生全面发展、培养社会主义建设合格人才
的任务。生物教师既要教书,又要育人。
关键词:生物教学;德育教育;渗透;
重视生物课的德育功能,掌握生物学科思想教育的特点和方法,才能增强思想教育的效果。
一、把“三热爱”教育贯穿于教学全过程
对学生的思想教育,应始终坚持把爱党、爱国、爱社会主义的教育放在首位,贯穿于教学的全过程。教育内容不仅包括讴歌党的丰功伟绩,赞颂社会主义祖国的繁荣昌盛及社会主义制度的优越,还应包括国情教育和党的基本路线、方针和政策的教育。生物学科在这方面有着自己的优势。
例如,植物学、动物学和自然资源、生态环境保护教育,生理卫生中的计划生育教育,以及绪论课等,就含有许多“三热爱”教育的内容,应进一步充实并写成相对稳定的德育教材,重点讲授。如在开始学习生物课时,介绍我国明朝李时珍编著的《本草纲目》,它不仅是药物学专著,也是植物学、动物学、矿物学专著。李时珍对植物的分类方法比西方植物分类创始人林耐提出的方法要早一个世纪。《本草纲目》这部巨著被称为“东方药学巨典”,译成了十几种文字。这些材料能让学生了解我国古代生物学研究的成就和对世界的巨大贡献,激起强烈的爱国主义热情。
在学科教学中渗透思想教育在时间上要把握适度,一般不宜太长。实践证明,只要所选的内容贴切,结合得好,即使三言两语,也能取得较好的效果。
二、联系思想实际进行有针对性的思想教育
要使德育工作真正取得成效,必须熟悉和了解学生,知道他们的乐趣和苦恼,摸清他们思想上存在的问题,才能对症下药。
学习目的不明确,缺乏远大理想,是当前学生中普遍存在的问题。由此表现出两种倾向:成绩差的同学,认为升学无望,不如早打工早挣钱,因而厌学情绪严重;成绩好的同学,目标只瞄准中考,只知埋头苦读,社会上的事情很少关心。这两种倾向导致学生对生物科表现出不同程度的不重视,前者认为打工经商用不着学生物,后者则认为生物科中考成绩满分只有30分,花过多的时间去学习不合算。
在生物教学中解决学生的思想问题,一要使学生明确生物学科与社会主义经济发展的关系,了解诸如环境、粮食、人口、能源等重大问题都与生物学密切相关。现代生物无论从广度还是从深度上,都与其他学科有着交错渗透的关系。在教学的不同阶段,要结合教材内容,具体地阐述这种关系。例如,结合植物部分的教学,介绍植物在环境保护中的作用,教育学生要绿化环境,自觉爱护一草一木;结合动物学部分的教学,介绍青蛙、鸟类的益处,提倡爱护动物,不要乱捕滥杀;结合人体部分的教学,介绍环境污染对人体健康造成的危害,使学生认识到保护环境就是保护每一个人自身的健康。二要充分介绍我国在生物科学研究上的新成就,培养学生的民族自豪感,使学生从小树立赶超世界先进水平的雄心壮志。同时,针对在部分同学中存在的过分向往西方国家生活方式的倾向,配合理想教育,在教学中要有意识地培养学生树立掌握科学知识报效祖国的思想。可结合教材讲述一些生物学家的爱国事迹,使学生认识到理想和追求是事业成功最根本、最持久的动力,只有明确了为谁而学、为什么而学,才会始终保持奋发向上的激情。
三、以科学家的优秀品质激励学生努力进取
科学家是科学成果的创造者,是科学史的谱写者。让学生了解科学家和科学史,是生动而富有成效的德育手段。我们不可能要求每个学生都去当科学家,但科学家的理想、情操、胆识、毅力、勤奋和创造力等方面的优秀品质,是值得每一个人学习和效仿的。
介绍科学家和科学史,一定要有目的性和针对性。能否做到这一点,关键仍然在于教师对学生的思想动态是否心中有数。例如,教师在和学生接触中,发现有不少学生为成绩上不去而苦恼,并由此产生自卑情绪。为了激励学生勇于进取,教师在教学中介绍达尔文、童第周时,要特别突出强调他们在学生时代都不是令人羡慕的优等生,但他们都以持久的爱好、刻苦的精神和坚忍不拔的毅力获得了成功。针对部分同学生物科成绩不错,但对数理化学习有畏难情绪,甚至有放弃不学的情况,在介绍分子遗传学的发展史时,讲述分子遗传学的奠基人孟德尔正是因为具有坚实的数学基础,才使他能对豌豆的性状遗传进行了有效的统计和分析,从而发现了基因的分离和自由组合规律。针对部分同学重理论轻实践、在实验中不注重观察的现象,可反复强调生物学的研究成果,几乎全部都是通过详细观察和科学分析取得的。
【摘要】 目的从生物利用性角度评价含朱砂中成药中汞的潜在健康风险。方法火焰原子吸收法(FAAS)测定含朱砂中成药总汞含量,体外消化透析法模拟人体胃肠消化,氢化物发生—原子荧光光谱法(HG-AFS)检测得到含朱砂中成药中汞生物利用性相关数据。结果6种常用含朱砂中成药在人工胃液中汞溶出率在0.14%~1.96%范围内,小肠阶段汞可接受率为0.003 8%~0.011 7%。基于汞在人体的半衰期和蓄积中毒量,反推导出含朱砂中成药中汞元素的安全阈值为每人每天0.099 mg。结论综合考虑6种常用含朱砂中成药的汞含量水平、服用剂量、服用频次等,说明口服含朱砂中成药引起汞暴露的安全风险性较低。
【关键词】 生物利用性; 体外消化透析法; 含朱砂中成药; 安全阈值; 汞
Abstract:ObjectiveTo introduce mercury bioaccessibility for risk assessment of Chinese patent medicines containing cinnabar. MethodsTotal mercury from Chinese patent medicines containing cinnabar was determined by FAAS. In vitro digestion and dialysis method was adopted to simulate the conditions of gastric compartment and intestinal compartment and dialysate fractions were collected and quantified by the means of HG-AFS. ResultsIn the gastric compartment, the solubility of mercury from six common Chinese patent medicines containing cinnabar ranged from 0.14%~1.96%; in the intestinal compartment, mercury bioaccessibility (0.003 8%~0.011 7%) was found for all the samples. The toxic threshold level of mercury was 0.099 mg/(person·day) for the case of Chinese patent medicines containing cinnabar on the basis of available data on mercury (cumulative toxic dose and half-life) in the body. ConclusionTaking into consideration on mercury level and intake of Chinese patent medicines containing cinnabar, the potential health risk seems to be low.
Key words:Bioavailability; In vitro digestion and dialysis method; Chinese patent medicines containing cinnabar; Toxic threshold; Mercury
朱砂又名丹砂、辰砂,是一味传统中药,主治安神定惊、明目解毒,其主要成分为硫化汞。在中成药中,含有朱砂的品种占10%;在儿科中成药中,含朱砂的品种占到了20.32%。《中国药典》(2005年版Ⅰ部)正文中收载含朱砂的内服成方制剂44种。《中国药典》对万氏牛黄清心丸、保赤散等7种含朱砂中成药附有朱砂含量测定一项(硫氰酸盐容量分析法),并且对硫化汞的含量指标做了具体规定[1]。但是,含朱砂中成药中重金属汞含量偏高,引起了人们对此类中成药服用安全性的担忧[2~4]。矿物类中药至今没有相应的安全质量标准[5],许多国家对中药都采用食品重金属限量标准来衡量其服用安全性。随着中药国际化进程日益加快和人们健康意识的迅速提高,如何合理科学地对传统矿物药的服用安全性进行评价已经成为当前亟待解决的问题。
众所周知,含朱砂中成药中汞元素主要以硫化汞形态存在,硫化汞是强化学惰性的,其溶解性很差[6]。从生物利用性(bioavailability)角度看,汞的全量并不能反映出人体吸收代谢汞的水平,只有一部分的汞能经过消化吸收后进入体内。因此,评价中成药中汞的安全性非常有必要进行生物利用性方面研究。生物利用性是食品营养和环境化学领域中的概念,被定义为存在于一定基体中的目标物经口腔摄取后能够到达体循环的部分,可分为以下3个过程:①经口服摄入后,从基体释放到人体胃肠消化道的部分,即文献中常常出现的生物可接受性(bioaccessibility);②生物可接受部分穿过肠上皮细胞后被人体吸收的部分;③人体吸收部分经过肝脏代谢后最终进入体循环和机体组织的部分。因此,广义的生物利用性等于以上3个过程生物可利用率的总乘积。在消费品安全性评价方面,一般把生物可接受部分看作口服生物利用性的指标,因为它反映出了现实的最坏风险性[7]。
在参考体外消化法在食品[8~11]、环境土壤[12,13]、玩具[14]、含矿物类中成药[15~17]等方面研究成果的基础上,本文采用体外消化透析法对几种常用含朱砂中成药中汞的生物利用性进行了研究,建立了人体内汞中毒剂量反推模型,对6种含朱砂中成药中汞的健康风险进行了评价。
1 材料与仪器
1.1 仪器TAS-990火焰原子吸收分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),AFS-820双道原子荧光光度计(北京吉大小天鹅仪器有限公司);GWA-UN Pure Water System(北京普析通用仪器有限责任公司)。
1.2 试剂与药品 Hg标准贮备液:(国家钢铁材料测试中心钢铁研究总院);K2Cr2O7,KBH4,NaHCO3,NaOH,HgCl为AR级试剂,HClO4、H2SO4、HNO3、H2O2、HCl为GR级试剂,实验用水为GWA-UN Pure Water System制备的电阻率为18.2 MΩ超纯水。胃蛋白酶(上海国药集团化学试剂有限公司,BR);胰蛋白酶(上海楷洋生物技术有限公司,BR);猪胆盐(上海国药集团化学试剂有限公司,BR);D22mm透析袋(Beijing siyu biotechnology Co., Ltd),截留分子量(Molecular Weight Cut-off, MWCO)8 000~14 000。含朱砂中成药购自海口市药品超市,其中包括大蜜丸1种(同仁安神丸),水蜜丸1种(天王补心丸),胶囊剂1种(复方芦荟胶囊),水丸剂1种(仁丹),散剂2种(儿科七里散,紫雪)。
1.3 样品制备对大蜜丸、水蜜丸、水丸,取20粒,剪碎或研碎成小块混匀;对胶囊剂、散剂,取不少于20粒,倒出粉末状内容物混匀;最后,将以上样品置于密封袋中,保存于干燥器中备用。
2 方法
2.1 体外消化透析法参照Miller[8]、Cámara[9]及庞京团[15]等所述体外消化透析实验体系各项参数,并进行了适当地改动,实验步骤如下:将0.25 g样品和25 ml pH=1.5的盐酸溶液,加入到50 ml离心管中,用1 mol/L盐酸溶液调节pH为1.5,再加入0.16 g/ml的胃蛋白酶液0.5 ml,旋紧盖子,整个实验体系在密闭环境下振荡100 min[(37±1)℃,80 r/min,下同]。将装有5.1 ml 0.2 mol/L NaHCO3溶液的透析袋(长10 cm,直径22 mm)放入胃模拟消化物(pepsin digest)中,连续振荡约45 min后,模拟环境pH为5.0。最后,在小肠模拟环境中加入胰液—胆盐混合物2.5 ml,持续振荡100 min。振荡结束后,将透析袋从离心管中取出,收集透析液于PTFE内杯中,消解后待测,同样方法作氯化汞和空白全过程对照,所得样品均采用原子荧光光谱法测定。
2.2 中成药汞含量的测定 火焰原子吸收光谱法(FAAS)测汞已有不少文献报道,比如FAAS对汞精矿电氧化浸出液[18]、工业硫酸[19]、抗缺氧藏药[20]、报春花及冬葵[21]中汞含量的测定。本实验参考王志华等[22]的方法采用HNO3-H2SO4-HClO4(4∶1∶1)体系高压密封消解中成药,优化仪器工作条件后(见表1),FAAS法测定复方芦荟胶囊中的汞含量为(11.62±0.3)%(n=3,P=0.95),与庞京团等[23]汞量法测定结果(11.70±0.4)%基本一致,表明本方法在准确度、精密度上均满足测试要求,可用于含朱砂口服中成药中汞含量的测定。
2.3 数据处理 中成药中汞的胃肠阶段溶出率、生物可接受率的计算参考文献[15,23]。
3 结果与讨论
3.1 中成药中汞的生物利用性含朱砂中成药中汞的生物利用性结果见表2。在人工胃液中除天王补心丸、复方芦荟胶囊的汞溶出率较高外,其它中成药的溶出率在0.14%~0.67%;在小肠阶段,汞的透析率以同仁安神丸最高(0.011 7%),其次为仁丹(0.009 0%)、天王补心丸(0.007 7%)、儿科七厘散(0.006 7%)、紫雪(0.004 0%)和复方芦荟胶囊(0.003 8%)。含朱砂中成药中溶出汞远低于汞总量,这说明大部分汞都是以难溶形式存在;经过小肠模拟消化后的可透析汞量更低,除同仁安神丸外,生物可接受率都小于0.01%,大大低于胃阶段溶出率,这可能是由于透析过程只允许分子量小于透析膜MW的物质通过,模拟消化过程中汞与蛋白酶或者胰液-胆盐结合形成复合物后就很难通过透析膜。
目前文献报道的体外消化法的各实验参数还未统一,所采用的实验系统各有特点,涉及到人工胃肠消化液组成和pH值、液固比、经口腔摄入物质在胃肠道驻留时间、目标元素测定前所采用的分离方法等[25]。以目标元素在测定前所采用分离方法为例,文献报道有离心、0.45 μm膜过滤、透析等,比如Camara等[9]分别采用透析法和离心法对学生常用膳食搭配中的Ca、Fe、Zn、Cu生物利用性的研究,Iris Koch等[17]离心法对牛黄解毒片中的砷生物利用性的研究,褚卓栋等[24]膜过滤法得到了六神丸、医痫丸等7种添加朱砂中成药中汞的生物可接受性数据,庞京团等[15]确定了透析法测定朱砂中汞的生物利用性的实验条件,并将该方法推广到了含朱砂中成药汞生物利用性的研究[11]。透析不仅可以起到分离目标物的作用还能模拟食物从胃到小肠生理pH值逐渐变化的过程,即将装有5.1 ml 0.2 mol/L NaHCO3(经酸度滴定实验计算得到)放入胃模拟消化物中,因此,本文采用了透析法[8,9,15]。表1 火焰原子吸收分光光度计工作参数表2 六种含朱砂口服中成药中汞的生物利用性
3.2 对含朱砂口服中成药的安全性评价根据日本熊本和新泻水俣病患者所摄入有毒鱼贝的汞浓度和估计摄入量而推算出体内100 mg的蓄积量为中毒剂量[26]。此外,边振考等[27]也曾报道人体汞蓄积中毒量为100 mg。甲基汞安全阈值研究[28]已有文献报道,汞在人体内半衰期为65~70 d[29],本文以汞的中毒剂量和半衰期来反推出日摄入汞的安全阈值。为计算简单此处以70 d计,设日摄入含朱砂中成药中生物可接受汞量为m(单位mg),服用f天后,人体内蓄积汞量N可表示为:
N=m[(12)f-070+(12)f-170+……+(12)170+(12)070] ①人体表现汞中毒时,人体内蓄积汞含量N=100 mg,则有m[(12)f-070+(12)f-170+……+(12)170+(12)070]=100 mg对上式进行求和化简可得下式:100m-100m×2170+2170=2-f70 ②要使人体汞中毒,则该方程必须有解m。因为2-f70>0,则100m-100m×2170+2170>0 ③2170≈1.01由③求得m>0.99 mg,故当f趋向于无穷大时,最小汞中毒量为0.99 mg,考虑到人体摄入汞的其它来源,取其10倍的安全系数,则为0.099 mg ,即摄入含朱砂中成药过程中,汞生物可接受量超过0.099 mg将对人体存在较大中毒风险。
据2003年粮食及农业组织/世界卫生组织联合食物添加剂专家委员会(JECFA)的建议,汞的每周可容忍摄入量(provisional tolerable weekly intakes, PTWIs)为5 g/kg(BW)[30],其含义为按每公斤体重计算,每周可容忍摄入汞量为5 g。若以人体平均体重70kg计算得到每日可容忍摄入汞量(tolerable daily intake, TDI )为0.050 mgHg。由人体内汞中毒剂量反推导出的理论安全阈值与JECFA 建议TDI值处在同一数量级水平,可见其作为汞暴露安全风险评价指标具备合理性。实验所用的6种含朱砂口服中成药每日最大生物可接受汞量见表3,其中,同仁安神丸的日最大摄入汞量已非常接近安全剂量,其他5种中成药则要低1~2个数量级。因此,若严格依照说明书标明剂量(注意:儿童需减量服用)短期服用情况下,由口服含朱砂中成药引起汞暴露的安全风险性比较低。表3 6种含朱砂口服中成药相关信息
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关键词 电喷雾 质谱 定性分析 药物代谢 蛋白质研究
近年来,随着医药的不断发展,天然药物化学中天然产物的提取产物,药物分析中生物体内的代谢研究,还有生物化学中具有生理活性的多肽和蛋白质,逐渐成为当前研究热点[1];后基因组学的蛋白组学,在目前也显得相当活跃,而其中很多高极性、难挥发、热不稳定的大分子有机化合物出现,对其检测有难度。质谱作为一种分析检测手段已经出现几十年,电喷雾质谱(ESI-MS)也已发展十几年,成为一种通用质谱技术,它所涵盖的分析应用领域极其广泛,电喷雾质谱的出现解决不挥发和热不稳定等化合物的分析,应用于中、高极性的化合物,可以检测的分子质量范围从300~2000u的小分子化合物到分子质量超过15000u的生物大分子[2],对于蛋白质、核酸等生物大分子在电喷雾质谱中容易形成多电荷峰,分子量测定准确度高,现今电喷雾质谱成为药学和生物医学研究领域重要的标志性工具,在定性肿瘤差异蛋白方面更是重要的工具,拥有良好的前景。
1 电喷雾质谱特点
1.1 电喷雾质谱的发展
电喷雾和质谱成功地结合,是由Dole及其合作者在1968年中首次阐述;1984年Yamashita和Fenn发表的论文更清晰地阐述电喷雾电离机理,并认为可以用作液质联用(LC/MS)的接口;20世纪90年代,仪器制造和实际应用都表现出高速增长和全面发展的态势。1989年,报告ESI离子源与傅里叶变换离子回旋共振质谱联用成功范例;1991年,Sin,Boyle和Whitehouse报道电喷雾/飞行时间质谱,实现更高的准确度,更高的分辨率;随后离子阱电喷雾质谱、电喷雾-四级杆-飞行时间串联质谱仪(ESI-Q-TOF-MS)为代表的仪器在各行业应用开来。
1.2 电喷雾过程
将溶于极性、挥发性溶剂(如甲醇,乙腈,丙酮等)的样品溶液通过电喷针传输,在电场作用下形成泰勒锥,在电喷针尖部形成雾状正或负离子富集,液滴通过溶剂的挥发逐渐缩小,其表面上的电荷密度不断增大;当电荷之间的排斥力克服表面张力时,液滴分裂,产生单个多电荷离子;生出的样品气相离子经质量分析器分析,从而测出它们的质荷比[3~6] 。
1.3 电喷雾电离的优势
电喷雾电离为一种软电离方式,即给样品较小的电离能量,可以得到不稳定化合物的分子离子峰,且谱图简单,主要用于定性分析。Loo等 [7]归纳出电喷雾质谱的4“S”特点:即灵敏( Sensitivity)、快(Speed) 、专一(Specificity),并能直接给出化学计量比(stoichiomotry)。电喷雾质谱的成功在于2个重要的部分,电喷雾提供相对简单的方法使非挥发性的溶剂形成气态,与此同时质谱提供更直接、灵敏度好的检测[8]。电喷雾质谱可以检测阿摩尔级别浓度的样品[2],并且ESI可在一级质谱(MS)条件下获得很强的待测物准分子离子峰,并且可借助MSn(n=2~10)对准分子离子进行多级裂解,进而获得更为丰富的结果信息[9]。ESI已成为一种成熟、高灵敏、快速的质谱技术。比较质谱的离子源(见表1),可以看出ESI的优势所在。
2 近期电喷雾质谱进展
近年来,电喷雾质谱已经不限于小分子的检测,伴随着蛋白组学、基因组学的发展,带动生物大分子分析的发展。蛋白等大分子化合物样品量少,不适合过于复杂的预处理过程,很多专家致力于提高该技术的离子化效率及减少样品预处理过程,能对复杂基体中的分析物进行简单、快速、实时分析。新发展出极低流速下的电喷雾质谱,被称为纳升电喷雾质谱(nanoESI/MS),电喷雾流速采用纳升级流速,流速低,产生的液滴体积小,稳定液流的流量越低,则电离效率几乎随之成比例地提高,对于蛋白样品量小的物质可以减少样品消耗量,又不会减弱信号强度,导致去溶剂化效率、离子化效率及离子转移至分析器的效率都比常规ESI源高,而且喷雾稳定性好[10]。对于电喷雾电离方式也发展出电喷雾解吸电离DESI、电喷雾萃取电离EESI 等,表2中按先后顺序总结电喷雾电离方式的发展。这些电离方式大多不经过样品预处理,可以进行实时、快速的质谱分析。
电喷雾的首要问题是样品的高纯度,因为一些不纯的物质易导致毛细管喷雾堵塞。近些年来,为避免ESI 堵塞,出现一些非毛细管喷射技术,这些技术利用不同的材料尖端形成电喷雾,如铜线及不锈钢针,用放电针为材料,直接离子化,避免毛细管堵塞现象,样品损失也减少,更适合微量样品的检测。最近,纸、牙签等尖端喷雾技术都成功地用于复杂混合样品的分析,使纸兼有导电和分离的作用,这项技术可以检测很多组织,对于医药中穿刺活检都可以进行检测,使得检测更方便、快捷[11]。
电喷雾质谱一般与液相质谱联用较多,进行分离鉴定,而一些新的液相色谱( LC) 分离技术,例如超高效液相色谱( UPLC) 和快速高分离液相色谱( RRLC),研究新液相色谱和电喷雾质谱的连接,更好、更快地完成医药测定鉴定过程。郭小芳等[12]采用RRLC-ESI-MS方式在20min测定生物碱类成分,马长振等[13]用UPLC-ESI-MS测定白茅根的分析,仅在35min内完成鉴定工作。这些新出现的电喷雾质谱都为更好、更快、更高效地进行分离鉴定做出积极贡献。
3 电喷雾质谱在医药中的应用
3.1 定性分析药物及天然产物
电喷雾质谱可以进行多级质谱,电喷雾软电离方式,导致一级全扫描质谱中主要得到的是分子离子峰,这种分子离子峰能反映被测物组成的分子量信息;二级串联质谱(MS2)可直接对粗分离物中的已知成分进行快速鉴定,还可以对样品中具有相同生药来源的未知化合物进行结构预测。这为天然产物的物质组成分析提供一种简单、快速、灵敏的方法,简化繁琐的分离、纯化过程[14]。
天然产物是新药开发的重要部分,目前使用的很多药物都直接或间接来自天然产物。许国旺等[15]人采用傅里叶变换电喷雾质谱用于鉴定丙二酰基人参皂苷,加入甲酸铵流动相进行优化,选定浓度为15mM,谱图效果最好,电喷雾为负离子模式,丙二酰基人参皂苷的多级质谱具有特征的中性丢失信息,中性丢失44,根据此特点,可用于该类化合物的定性分析,而最终测定结果均通过准确质量验证,实验测定值与理论值偏差小于2ppm,提供准确、灵敏的方法。张道来等[16]人采用正离子模式,在60min内鉴定罗氏车盘车样品的13种化合物,还对刺身皂苷进行分析,实验证明高效液相色谱-电喷雾质谱法能克服皂苷类物质分子内由于寡糖链存在导致难鉴别的困难,对于皂苷类化合物的鉴别及结构分析中显示越来越重要的作用。李娟等[17]等对青蒿素类药物的质谱裂解特征进行分析,采用注射泵直接进样,正离子分析模式,对准离子峰进行碰撞诱导解离(CID) 研究,更好、更快地研究青蒿素的代谢以及结构分析。大黄类化合物也是天然产物,马小红等[18]采用正负离子全扫描,同样进行CID二级扫描,负离子扫描得到谱图更清晰,更好地做好特征分析。胡杨等[19]等发现采用负离子模式,川穹质谱响应度高,进而对川穹进行化学成分分析。吴茱萸也是传统中药,高鹏等[20]采用正负离子模式分别研究裂解方式,并发现负离子的响应更高、定量更好,对今后半萜吲哚类生物碱的鉴定检测提供一定实验基础。李丽等[21]利用电喷雾质谱分析鉴定防风中的未知成分,采用正离子模式。
而对于抗生素,廖琼峰等[22]人研究庆大霉素采用电喷雾正离子模式,对其碎片峰进行分析,二级离子打碎,打碎脱去C环(氨基葡萄糖)碎片,说明C环与脱氧链霉胺之间的碳-氧键容易断裂,可更好地用于今后庆大霉素定性和定量分析。抗生素在食品中的应用近年来也大受关注,采用UPLC/MS/MS,乙腈、七氟丁酸水溶液作为流动相,采用正离子电喷雾模式,多反应离子监测(MRM),仅需时3min,精确度、准确度良好。方东升[23]利用电喷雾质谱为软电离方式,在全扫描一级质谱图上主要得到的是分子离子峰,通过分析直接得到化合物的分子量,从而推测出金霉素样品中的杂质成分,快速地对金霉素进行监控。朱侃等[24]采用质谱等一系列方式测定头孢克洛的结构,采用正离子模式得到头孢克洛的特征峰和纯度。霍佳丽等[25]采用ESI-Q-TOF-MS青霉素类抗生素、头孢菌素类抗生素及喹诺酮类药物进行稳定性研究。显示出快速稳定、所需样品少等优点,为今后电喷雾质谱在抗生素方面的应用做一定基础研究。
电喷雾质谱在中药配伍方面也有很重要的影响,越皓等[26]人研究附子不同配伍药对生物碱的影响和附子中双酯型生物碱毒性,研究配伍减毒使其更好地发挥药效作用,通过分析生附子水煎液的电喷雾质谱图,可以看出生附子中主要的3类生物碱(双酯型、单酯型和脂类生物碱),以及其他小分子的化合物,然后分别和各种药材配伍测定验证,乌头碱类生物碱在电喷雾条件下形成的离子峰相对强度与其物质的量成正比例关系,电喷雾质谱图中各离子的相对丰度可以说明对应离子的相对含量变化,来看清双酯型是否减少,是否有配伍无毒性。甘遂甘草配伍[27]研究水煎液中巨大戟二萜醇型化合物在质谱中离子强度的变化,对萜醇类能更好地检测。中药黄芪与当归配伍采用正离子模式一级扫描,得到特征峰后进行二级串联质谱分析,碰撞能量20%~40%,查看异丙酮类的成分变化,质谱谱图清晰、准确、灵敏度高[28]。闫静等[29]根据生物碱类化合物具有较强质子亲和势的特点,利用电喷雾质谱在电喷雾电离条件下极易形成质子化分子,进行马钱子与甘草的配伍测定,测定出有毒的成分降低。综上,利用电喷雾质谱技术可以很好地说明中药的配伍原则。
3.2 现代药物代谢和药物动力学
ESI电离特别温和,成为分析不稳定共轭代谢物的适合方法,确定药物在体内的代谢,以评估药物的安全性、有效性。ESI电离技术效率高,可以获得更低的检测下限,可以用于范围更大的结构类型。Karthick Vishwanathan
等[30]人运用电喷雾质谱测定人血浆中的莫西沙星,运用洛美沙星做内标,定量限为1ng/mL,能更好地检测出代谢产物,定量采用正离子模式,因为存在氨基和酮基,很容易质子化,而且检测时间短,仅用4min,时间短,灵敏度高。李秋莎等[31]应用LC-MS/MS法研究茶多酚在大鼠体内的多组分药动学,运用负离子模式,特异性很高,分析样品仅需4min,大大缩短分析时间,LLOQ能达到5ng/mL,检测灵敏度得以提高。
万益群等[32]对人体尿液中黄蝶呤与异黄蝶呤进行测定,蝶呤类化合物采用电喷雾质谱起到双重定性的作用,通过选择离子来进行定量,能提高灵敏度,2种蝶呤正离子信号较负离子信号相对强的多,经实验证明,黄蝶呤与异黄蝶呤在ESI+模式中全扫描质谱以离子峰[M+H]+稳定存在,采用健康人和癌症的尿液,分别进行定量分析,方法快捷、准确。
ESI离子源能电离80%~90% 的化合物,属于通用型离子源,适用于多组分筛选[33]。沈保华等[34]用电喷雾质谱对血液及尿液中及其代谢物的筛选及确证,采用正离子电喷雾,测定56种化合物绝大部分最低检测限小于0.1ng/mL,建立包含及其代谢物共61种化合物的精确相对分子质量数据库分析方法,Jun Qian等测定紫杉醇在人血浆中的药代动力学,0.3mL血浆,定量下限为1ng/mL。
马海英等[35]检测粪中黄山药总皂苷及其代谢产物。整体给予大鼠灌服黄山药总皂苷于给药后不同时间,采集尿及血清样品,用ESI- MS检测吸收入血成分,测定时选择负离子方式检测,先用全扫描一级质谱方式获得待测物的准分子离子峰[M- H]–,离子源温度为120℃,然后用ESI- MSn离子阱技术对准分子离子峰及其碎片离子峰进行多级质谱分析,获得相应的子离子质谱图。
高博彦等[36]测定复方酸枣仁汤的血浆代谢情况,在负离子模式下,仅进样10μL,在60min内,梯度洗脱,5%~90%乙腈溶液,检测到各色谱峰在负离子模式下的分子离子峰[M-H]–、[M+Cl]–,由分子峰测定可能的分子量,推断一定的结果,对比原有成分和人血吸收成分,有些许不同,含皂苷类的物质如酸枣仁,一般以原型或者苷元形式存在,一些含挥发油的物质入血较少。
周丽君等[37]测定注射用艾普拉唑钠用丁螺环酮作为内标,用比格犬做实验,最低浓度可以达到5μg/L,且在5min内出峰,采用电喷雾质谱简单快捷,特异性好,进行血药浓度的测定,与剂量呈线性。
陈永婧等[38]利用高分辨电喷雾四级杆飞行时间质谱,正离子扫描模式对膀胱癌血清和尿液代谢组学进行研究,对潜在的标志物进行筛选、鉴定,对代谢产物进行分析,对于电喷雾质谱而言非常快捷、方便。杨杰等[39]研究小柴胡汤对抑郁的影响,收集尿液,收集血液,正负离子同时扫描,看是否能应用于现在流行的抑郁疾病。
3.3 蛋白质方法
电喷雾特点在于可产生大分子化合物(肽,蛋白质)的多电荷离子,根据不同电荷数离子的质荷比可准确计算大分子化合物的分子质量和分析复杂生物介质中的样品,跟传统的质谱相比,扩大检测的Mr 范围,提高灵敏度,根据马安德等研究多肽的相对分子量问题,用电喷雾质谱测定蛋白质和多肤的相对分子质量,精确度可达到0.10%~0.01%。远比精度只有大约5%的聚丙烯酞膝凝胶电泳、凝胶过滤、蔗糖密度离心法等经典的蛋白质相对分子质量测定技术更快捷、更精确[40]。它还可与高效液相色谱(HPLC) 和高效毛细管电泳(CE) 等高效的分离方法相连接,结合2种系统分离和高灵敏、高准确度的优点,扩大质谱在生物领域的应用[7]。
电喷雾质谱对于鉴定凝胶电泳所分离的蛋白质提供有力的分析手段,通常途径是采用双向电泳的方式,分离出的斑点用胰蛋白酶酶解、提取,再用ESI-MS进行测定。孙明忠等[41]采用双向胶内差异凝胶电泳检测2,4-二硝基苯磺酸刺激人角质形成细胞HaCaT反应情况,选取的胶条做质谱分析,胶条的等电点、分子量和质谱分析的等电点、分子量基本吻合,进而继续对肽段进行研究。曾嵘等[42]结合双向电泳,测定胶内人肝癌细胞的蛋白组学,覆盖率达到72.5%,通过正常的肝细胞和肝癌细胞进行比对。牟芝蓉等检测维甲酸诱导肿瘤细胞分化有关蛋白质,用毛细管液相色谱和纳升电喷雾源串联的质谱。所有测定均在正离子方式下进行,经检测质量准确度小于0.1。何晓光[43]采用电喷雾质谱,正离子喷雾模式,筛选鉴定卵巢癌细胞乳源调节肽,为肿瘤等一系列因素提供治疗手段和依据。郭晔等[44]也用凝胶电泳和电喷雾质谱的方法对儿童急性淋巴细胞白血病的差异细胞蛋白进行分析测定。而对于N端封闭,测序仪不能很好地测序蛋白,电喷雾质谱可以结合软件更好地完成测序工作。现在更多采用免疫共沉淀方法(CO-IP)结合ESI-MS查看蛋白质之间的相互作用。电喷雾质谱允许在混合蛋白中蛋白质和蛋白质之间的反应,如乳清蛋白[45],用电喷雾质谱结合有关生化技术可以进行氨基酸序列分析、蛋白质翻译后修饰的结构推断等。孙伟等[46]对牛血清蛋白和马细胞色素C进行优化实验,采用5%~30%的乙腈洗脱梯度,使得胰酶酶切多肽更好地鉴定出来;进行重复性实验时,主要洗脱峰的保留时间差别不超过1min,表明重复性良好;并研究丰度抑制与高丰度蛋白分子量之间的关系,验证高丰度蛋白导致丰度抑制多,结合质谱数据依赖的鉴定技术,导致高丰度的蛋白重复,低丰度可能检测不到,检测结果冗余蛋白较多。
在应用质谱做蛋白组学实验、鉴定肽实验的时候,离子带电荷数受实验条件影响,比如说,仪器所使用的电压,还有溶液的浓度和流速等等。明显的是,ESI过程中肽的性质会很大程度地影响电荷数,比如说氨基酸数目和种类还有肽的形成等,ESI中肽电荷数量可以扩大质谱仪的检测极限[47]。
4 展望
医药生物领域迅速发展,电喷雾质谱的应用会更加发挥它相应作用。如何保证样品损失量少和分析速度快、分析量多是发展方向。为推断化学合成药物杂质结构提供有效依据;为现有药物含量测定提供标准;对药物代谢研究痕量成分提供准确定量要求;对于更复杂成分的中药提供检测手段,解决一定的分析难点;对基因重组蛋白及蛋白组的研究等,在这些方面,电喷雾质谱有重要理论和实际应用意义[48]。
目前电喷雾质谱的应用还存在一些问题,譬如对于大分子样品消耗较大,分析时间长,蛋白重复性不好,小分子低丰度蛋白经常漏检等。如何更快、更好地[49]建立高通量的药物筛选方法、寻找以致病蛋白为靶点的药物前体分子提供新的手段[50]、建立药物毒性安全方案等等,以便更好地服务医药行业是今后需要提升的方面。
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[关键词]民族生态学;人类学;美国
[作者]付广华,中央民族大学民族学专业博士生、广西民族问题研究中心助理研究员。北京,100081
[中图分类号]C95.05 [文献标识码]A [文章编号]1004-454X(2011)01-0069-007
美国式民族生态学指的是诞生于美国生态人类学中的一种独特方法,它试图从认知的视角探讨不同的民族与其自然环境之间的相互关系。自从20世纪五六十年代以来,该学科在欧美国家得到了较快发展,甚至在20世纪六七十年代成为生态人类学中主要的学术思潮之一。至20世纪80年代初期,苏联学术界也以民族(ethos)为研究中心发展起另一种民族生态学研究的理论框架,我们称之为“苏/俄式民族生态学”。由于中国当时恢复了与苏联的密切关系,因此中国民族生态学的发展初期深受苏联学术框架的影响。与此同时,美国式民族生态学研究也开始影响到中国的植物学界和民族学界,从而开启了最早的中国民族生态学研究。然而,由于同时受到美、苏两种学术传统的影响,中国民族生态学界对两者之间的区别与联系一直未能澄清,这给学科的发展带来了一定的隐忧。有鉴于此,我们希望此文能够增加国内学者对美国式民族生态学的认识,亦为促进民族生态学在中国的发展略尽绵薄之力。
一、概念界定
作为一个新的学科领域,民族生态学的概念仍在不断的修正中,这也正表明其研究魅力所在。术语“民族生态学”于1954年为康克林(Harold Conklin)首创。康克林在菲律宾的哈努诺人(Hanunoo)中进行的植物命名方法的语义学研究证实了民族植物分类的等级本质,真正洞察了人类对自然资源的认知。不过,康克林与其追随者一样,只是花费很大力气去记述植物和动物名称的清单以及它们的文化使用口],未能延伸到更深层次的研究。20世纪60年代以后,人类学家日益对理解人群自己的感受及他们对世界的解释感兴趣,因此他们对人类活动的动因和后果感兴趣的程度远远大于人类活动对环境影响的兴趣。于是以人们自己的世界概念模型为重点,产生了被称为“认知人类学”的领域。鉴于其在方法论上的贡献,人类学家们有时也称之为“新民族志”(New Ethnography)或“民族科学”(Ethnoscience)。刚刚诞生的民族生态学与这一领域不谋而合,在借鉴其方法的过程中,逐渐成为这一领域的一个组成部分。
在简单了解民族生态学的发展脉络之后,我们接着来探讨民族生态学的概念界定。虽然康克林没有就“民族生态学”一词给出明确的概念界定,但后来的生态人类学者多次试图去框定“民族生态学”。下面我们就较有代表性的四种界定予以分析,然后结合来自其他学科学者的意见,力争对民族生态学的概念界定有比较清晰的认识。
美国人类学家福勒(Catherine Fowler)是较早地试图从理论上总结民族生态学发展历程的学者。早在1977年,她在为《生态人类学》写作的“民族生态学”专章中叙述了民族生态学的历史、概念、方法论、招致的批评以及其他方面的民族生态学研究。正是在这一专章中,福勒把民族生态学描述为:一种关注本土人环境概念的独特的人类生态学进路,它主要采纳民族科学的方法,尝试证实对应环境的本土术语系统与那些概念化之间的条理关系。从福勒的上述界定可以看出,民族生态学在当时仅仅是人类学的人类生态学的一个分支。对福勒来说,其关键在于要从被研究群体的自观点(own point of view)去看问题,这样民族生态学就变成了一个群体从其自观出发的生物相互联系的观念。福勒还指出,虽然民族生态学因缺乏关注其方法的行为含义而招致了许多批评,但它却始终坚持自身能够更完全和完整地描述土著人与其环境之间的相互关系。
在福勒之后,布罗修斯(J.Peter Brosius)等人对民族生态学有一个更为清晰的界定。他们认为民族生态学(ethnoeeology)是民族科学的一个亚学科,它研究的是传统群体如何组织和分类他们的环境知识和环境过程(pp.187-188)。布罗修斯等人在文章中认为,民族生态学的一个重要方面就是描述和呈现文化内观的知识,而不能止步不前。就像弗雷克(Charles O.Frake)所言,“民族志学者不能仅仅满足于西方科学式的文化生态系统元素的分类。他必须像他们自己所理解的那样按照被研究者民族科学的种类去描述其环境”。由于该文着眼于如何运用民族生态学去探讨传统农业知识,而不是重在民族生态学理论上的探讨,因此这篇文章的最大贡献也许在于指出了本土知识系统中分享的民间智慧和个体经验组合的动态性和复杂性本质。当然,布罗修斯等人在文章中亦指出,在以后的民族生态学研究中,要把研究的注意点从名词转向动词。因为动词本身暗示着过程和其语言认知,它对人类适应的概念化也十分重要。
当代英国生态人类学家米尔顿(Kay Miltort)认为,“ethnoecology”一词中“ethno”这个前缀的意思同“folk”差不多,指的是从被研究者的角度(主位的)界定的而不是从分析者的角度(客位的)界定的知识领域。这样,关于某一社会的被研究者对植物界的民族分类,便成为“民族植物学”,进而类推出“民族动物学”、“民族医学”以及“民族生物学”等。从这个意义上讲,“民族生态学”区别于所谓科学“生态学”,它研究的是特定文化传统的环境知识,而这些知识只在那个特定的文化语境中才是有效的。因此民族生态学有助于理解传统群体与其所处环境的互动过程,从而地方生态治理提供本土经验和智慧。
不难看出,上述概念界定基本上都限制在“民族科学”的语境内,因此我们今天看来可能会觉得上述界定似乎跟人类学界最新的理论发展没有什么联系。其实,面对人类学的后现代时代,民族生态学家们多多少少总会有所触动的。如美国民族生态学家纳扎雷(Virginia D.Nazarea)在1999年出版的《民族生态学》一书中就指出:民族生态学是一种看待人类与自然世界关系的方式,只不过强调认知在框定行为中所起的作用罢了。她认为,作为对自然环境的解释、认知和使用的系统的考察,民族生态学不再忽视文化的代表的与直接的方面的历史与政治基础,也不再把塑造知识系统和最终实践的分布、获取和权力问题拒之门外。民族生态学应该最大化利用其比较优势,结合事无巨细的田野工作,充分意识到历史、权力和风险在塑造环境解释、管理和妥协的重要性。这样一来,民族生态学就会在跨学科研究中做出重大贡献,甚至成为保护、可持续性和平等研究领域的倡行者。从纳扎雷的上述论述中,我们亦可约略看出,民族生态学也在与时俱进中,它不仅坚持其原有的方法论利器,而且还勇于吸收布迪厄等人的知识、权力、风险的新思想,从而为民
族生态学的进一步发展指明了前进的方向。
与上述人类学家不同,植物学、生物学、生态学等其他学科学者的界定却有着一定的差别。民族植物学家马丁(Martin)认为,民族生态学包括所有的描述地方性群体与其自然环境相互关系的研究,因此它包含了民族生物学、民族植物学、民族医药学以及民族动物学等诸多亚学科。无独有偶,墨西哥生态学家托莱多(Victor M.Toledo)也倾向于扩大民族生态学的研究范畴,他认为民族生态学可以被界定为一种跨学科的研究进路,它旨在探索人类群体如何通过信仰和知识的屏幕来看待自然,以及人类自身形象上如何使用或管理自然资源。无论怎么表述,人类学以外的学者也都想把“民族生态学”这一理论工具延为己用,希望通过这种跨学科的探讨来充实自己的专题研究。
我们认为,民族生态学是民族科学的一个亚领域,它研究的是特定文化传统的人们所拥有的生态知识。这种研究最初仅仅在生态人类学界流行,更像是一种观察人与环境关系的视野或方法。只有在发展到一定阶段以后,特别是民族植物学、民族动物学、民族医药学等亚学科促生后,民族生态学才向一门总括式学科的方向发展。值得注意的是,与上述“美国式民族生态学”截然不同的是。“苏/俄式民族生态学”则大致在研究范畴上等同于生态人类学,“学科的主要任务是研究族群或族共同体在所居住地区的自然条件和社会文化条件下谋取生存的传统方式和特点,当地生态系统对人体产生的影响,族群或族共同体同大自然作斗争的特点及对自然界的影响,它们合理利用自然资源的传统,民族生态系统形成和发挥职能作用的规律等等。”由于中国民族学界也曾深受苏联的影响,因此中国的民族生态学一开始就是民族问题研究的一个重要组成部分,指的是以民族为中心的生态学方面的研究。它与生态民族学(人类学)研究对象大致相同,并且其理论方法有进一步融合的趋势。在当代中国的学科分类范畴中,“民族生态学”成为民族学下面自主设置的二级学科,其培养模式与各分支民族学人类学学科相似。据我们所知,目前国内名为“民族生态学”的博士点有两处:一是托庇于云南大学民族学研究院,走的是民族学人类学的培养路线,大致等同于生态人类学或生态民族学;另一个诞生于中央民族大学生命科学学院,走的是生态学的培养路线,实质上是“民族地区的生态学研究”。
二、理论预设
凡是熟悉民族生态学发展历程的人们都知道,民族生态学与认知人类学有着密切的关系,甚至可以说是其一分支学科。按照丹德拉德(Roy D'Andrade)的界定,认知人类学是关于人类社会与人类思想关系的研究。认知人类学家研究的是人们在社群中如何构想和思考那些组成他们的世界的物和事(p.1)。由于认知人类学非常关注分类、认知以及文化的内涵,这使民族生态学也深受其影响,从而使得学科发展中始终存在着两个基本的理论预设:
1、人类与环境的互动很大程度上要受到其认知状况(思想、知识和语言)的影响;
长期以来,由于受到萨丕尔一沃尔夫假说的影响,不少人类学家认为语言是一个用来组织经验的概念体系,它不仅迫使人们接受一定的世界观,而且决定了人们的思维模式,从而决定了人们的行为准则。因此,使用不同语言的人具有不同的概念体系,因此也就具有不同的世界观、思维模式、行为规范和文化。到20世纪50年代后期,人类学家借鉴了语言学家派克的观点,提出要以文化持有者的内部眼光去了解和记录文化,要把文化主位(emie,即文化负荷者的观点)和文化客位(erie,即文化研究者的看法)区分开来。上述两种语言学思想是影响认知人类学发展历程的重要思潮之一。
作为认知人类学的分支领域,民族生态学显然也深受萨丕尔一沃尔夫假说和派克语言学观点的影响,甚至在学科内部形成了对应的理论预设。民族生态学家们认为,人类是一个特殊的物种,他不像其他物种那样,他具有思维、知识和语言,因此这些文化元素必然会对其与自然环境互动的行为施加影响。人们不会直接地对环境起反应,而只能对那些他们意识到的且语言中已标示的动植物做出反应。在面对环境刺激时,人们会在已有世界观的图式下调动其已有的知识体系,从而做出适应性的行为。对此,瓦伊达(Andrew P.Vayda)和拉帕波特(Roy A.Rappaport)曾经在“操作的”环境和“认知的”环境之间做出了著名的区分。所谓“操作的”环境,即所有环境因素的综合,不管这些因素是否得到理解;而“认知的”环境则指的是一个特殊群体的人们所意识到和理解的环境。在某种意义上讲,“操作的环境”和“认知的环境”之间的区分更像是对来自派克的主位和客位方法的一种模仿。
为了洞察土著人的思想、知识和语言对外部环境世界的影响,民族生态学家经常从语义和分类的角度考察土著人的生物分类体系。他们不厌其烦地收集植物、动物、昆虫、土壤、疾病等方面的土著术语资料,然后按照生物分类学的发展或按照一般化水平对术语进行等级上的安排。通过揭示土著生物分类背后的组织原则,民族生态学家们声称克服外来者强加于土著人既有结构的倾向是可能的。但是,大部分的研究仅仅停留在“成分分析”上,很少能够进一步去思考。事实上,结构化了的动植物分类不仅反映了其环境世界观,而且这种世界观影响到分类结构本身乃至人类行为。这也招致了许多批评,因此不少研究成果被批评者们称为“民族语义学”或者“民族分类学”,而不能够升华到“民族生态学”的范畴中去。
2、由于社会的、历史的、文化的和环境的因素差异,不同群体的人们对其所处的外部世界的解释会有所不同。
当今世界生活着各式各样不同的群体。他们采取狩猎一采集、园圃农业、畜牧业、精耕农业以及工业化农业等不同的生计方式。由于生计方式的差别,他们形成了与之相适应的环境观。不同民族的环境观会因为社会、历史、文化的原因而有所差异,同时自然环境因素也在一定程度上影响不同民族对他们所处的外部环境的认知。当然,这也并不是说,每个文化或社会看待外部的环境会一定有着完全截然不同的看法。人类学的田野研究一再表明,不同群体的人们在相似的自然地理条件下,可能会发展出相似的文化特质,从而在文化面貌上具备一定的相似性。
米尔顿的地球变暖案例很好地说明了这一问题:来自西方世界的科学家们说世界正在逐渐变暖,人类的活动,特别是那些向大气释放某些气体的活动是造成地球变暖的原因。虽然大家同处于一个地球,但是,来自其他文化的人们可能否认地球变暖在发生。或者,如果他们承认有变暖现象,他们可能归因于神灵的行动或神圣造物主。或者承认人类要负一部分责任,他们认为地球变暖是某个更高主宰施加的惩罚,因为他们的社会未能尊奉古老的传统。之所以对地球变暖这一外部事件的解释会有如此不同,不仅因为他们朝夕生活的自然生态环境有着较大的区别,而且因为他们与自然相处的不同方式的差异直接影响到他们所处的社会文化。虽然我们并不能否认其中存在的文化建构的因素存在,但是这些差异巨大的解释肯定是跟其社会文化和自然生态差异有着千丝万缕的联系的。
这一理论预设与民族生态学的发展息息相关。由于不同群体的人们对其外部世界的解释(认知)会有所不同,当然所有的解释可能都不乏合理的元素,但只有本土人才会对毕生相处的环境做出最为合理的判断,才会有最为准确的解释。这样的理论预设促进了民族生态学的传统生态知识研究的拓展。著名民族生态学家波西(Darrell A.Posey)等人更是认为本土生态知识(indigenous ecological knowledge)的研究亦即民族生态学。因此在某种程度上,我们可以说,传统生态知识研究是民族生态学区别于生态学、环境科学及其他研究人与环境关系的学科的最重要的特征之一。
如果把两个理论预设结合起来来看,我们会发现它们实际上讲的都是人类行为和认知之间的关系。第―个预设说的是人类在自然环境中的行为会受到其认知状况的影响:如果某个群体的人们对某一类型的自然环境认知水平较高,那么他们就会在这种环境中运用自如,如鱼得水;反之亦然。第二个预设则讲的是人类所处的自然环境和他们延续下来的社会文化传统会影响到其对外部世界的解释(认知)。如长期生活在中国华北平原的人们,来到青藏高原以后,基本上都会不适应,因为他们原来生活于海拔较低的地方,对应的社会文化传统难以应付这样的情形,因此会对这种类型的自然环境持否定态度;而原来居住在高山地区的人们则不同,他们拥有相应的文化适应策略,长期以来也形成了应对的身体素质,因此对青藏高原的抵触性情绪就不会那么强,其解释也就自然有所差异。
三、学科特征
作为生态人类学发展中的独特成果之一,民族生态学在欧美学术界理所当然地被视为人类学的。由于民族生态学十分关注“他者”,尤其那些仍实践着传统资源利用和管理方式的土著群体,因此它具备一些不同于所谓的科学“生态学”的学科特征。具体来说,我们认为美国式民族生态学具有以下学科特征:
1、本土人立场
本土人立场,亦被称为“主位”立场,是从被研究者本身出发看问题的一种方法。它的出现与文化相对论关系密切。在民族学人类学研究中,文化相对论是必须秉持的观念之一。在这一理念的指导下,人类学者常常把自己置于被研究者的立场,从被研究者的时空场景中考虑自己研究的课题,然后再跳出来,结合客位的立场,对文化现象做出正确的解释。作为生态人类学中的一种独特方法,民族生态学必然也要坚持文化相对论,坚持本土人的立场。从学科名称来看,民族生态学(ethnoecology)是一个复合词,它由ethno加ecology构成,这本身就说明了它的属性,即ethno的生态学。ethno在英语中是“民族的”意思。如前所述,它与“folk!”的意思差不多。以此而言,民族生态学就是从本土人立场出发的生态学,其中的“本土人立场”是民族生态学区别于生态学的根本标志。如果在研究中未能采纳本土人立场,而仅仅对土著人的植物、动物、医药进行研究,充其量只是“土著人的生态学研究”,而不能称之为“民族生态学”。当然,如果从“苏/俄式民族生态学”的眼光来看,仍然可以称之为“民族生态学”的。
2、民族志方法
在长期的学科发展历程中,人类学中的观察、参与观察、结构性访谈、半结构访谈、无结构访谈、谱系法等等都民族志方法都得到了极大发展。民族生态学作为一种生态人类学方法,因此不可避免地受到人类学的影响,吸收了民族志方法作为学科的方法论支柱。从20世纪50年代学科诞生之初,到如今蓬勃发展,民族生态学始终坚持民族志方法。事实上,迄今为止,最为杰出的民族生态学研究都是由人类学家来完成的。民族生态学的创始人康克林对菲律宾哈努努人颜色分类和刀耕火种的研究至今仍然是人类学中的经典。为了进行博士论文的研究,康克林从1952年至1954年初一直在菲律宾的哈努努人中进行田野工作。后来,他的研究兴趣转移到菲律宾吕宋岛北部的伊富高人身上去,并为此6次到田野点进行了长达数年的实地调查。正如民族生态学家诺兰(Justin M.Nolan)所言,民族志方法是民族生态学的附赠方法,民族生态学家通过使用参与观察和其他的定性资料收集技术,可以观察到相关生态可能性背景下的不同决策促生的行为模式。这一方法对决定和估测人类行为的影响是不可限量的。民族志方法是民族生态学区别于所谓的科学“生态学”的重要方法论,因此,民族生态学一定要坚持田野调查、坚持参与观察,否则就难以实现其研究目标。
3、认知的视角
作为认知人类学的一个分析领域,民族生态学始终坚持认知的视角,而且长于从认知的角度来分析一个族群与其周围自然生态环境的复杂互动关系。随着认知人类学的发展,对人群概念世界描述本身成了目的,这样正规的采集资料技术就推广到民族生态学中。比如,一位对收集人们怎样对他们的自然环境分类感兴趣的生态人类学者,他会设计出几个层次的问题,从包含事物较广泛的范畴到较小的范畴。刚开始时,他可以问世界上存在着什么事物,然后再依次问有什么植物,有什么树木,有什么药用树,如此逐步缩小范围之最低层次为止。分析者通过向许多提供情况的人按照同样的顺序提出同样的问题,就能得到当地居民对他们自己所处环境的共同认识的总图。这种方法虽然有效,但人类学者逐渐认识到使用这种方法存在很大问题。因为可能在当地人的文化语境中并不存在这样的分类,或者根本没有分类,被调查者就会强行按照自己的逻辑设计出一种分类方法来。这样一来,民族生态学家不得不恢复使用传统的参与观察法。由此可知,民族生态学始终坚持认知的视角,力争从“他者”自身的文化传统去分析其对外部环境的认知,从而为民族生态学的存续提供跨学科的动力。因此,不少认知语言学家、植物学家参与到民族生态学研究中来,运用其语言分析工具和植物学知识,从而更为准确地揭示出“他者”的民族生态学特征。
4、关注传统生态知识
民族生态学自诞生之初,就把传统生态知识(traditional ecological knowledge)作为重要的研究对象。除“传统生态知识”外,生态人类学界内部还有本土生态知识、农村人的知识、本土技术知识、传统环境知识、地方性生态知识以及本土农业知识等类似的术语。这方面的代表作有英格利斯(J.T.Inglis)编辑的《传统生态知识:概念与案例》、贝尔克斯(Fikret Berkes)的《神圣的生态学:传统生态知识与资源管理》等。当然,也有一些学者称之为“本土环境知识”,如埃伦(Roy Ellen)等3位学者编撰的《本土环境知识及其转型》一书就是如此。通过对传统生态知识的挖掘和深描,民族生态学家可以得知当地人怎样理解他们的环境和人与环境相互作用的认识,能够纠正和补充某些肤浅的人类生态学的研究。事实上,传统生态知识研究已经发现,一些个人在各样植物、动物以及其他自然资源上要比其他人知道得多,而这是文化内部因素(如年龄、性别、地位、兴趣、教育以及经验)导致的结果。例如,在女性操控耕作和谷物食品管理的社会,女性很可能要拥有耕作方面的更精细的知识。相反,在男性参与的地方生计的狩猎者中,男性通常
操控和交流着野生动物方面的信息。民族生态学家已经从这些发现中获益,可以从中确认哪些个体在具体资源上是最具备与地方生境的物种差异。这对解决环境问题和促进生物多样性保护都具有相当大的理论指导意义。
5、跨学科色彩浓厚
如马丁和托莱多所述,民族生态学如今已经成为一个庞大的跨学科领域,它包含着民族植物学、民族动物学、民族生物学、民族医药学等多个亚领域。为了学科的发展,民族生态学持续地从生态学、人类学、生物学、语言学、经济学以及其他学科吸取营养。事实上,前辈民族生态学家已经在跨学科上给我们做出了示范:美国学者伯林(Brent Berlin)早就认识到自己学科专业的局限性,因此他长期与两位生物学家合作组成了跨学科团队,最终在民族生态学研究上取得了学术界公认的成就。民族植物学家马丁也提倡这种跨学科团队的合作,生物学家收集和辨认植物物种,语言学家研究地方命名,人类学家记录生态知识,医药学家分析植物的医药价值,动物学家观测动物种群,资源经济学家证实森林产品的价值。不过,他认为,民族生态学家为了获得对传统生态知识的全面认识,一定会经常孤独地工作,因此必然要时常跨越众多学科的边界。可以预见的是。在不久的将来,由不同学科的学者组成的民族生态学研究团队将会越来越多。
结语
在前文中,我们讨论了美国式民族生态学的概念界定、理论预设和学科特征。从中我们可以发现,美国式民族生态学更像是一种观察视角或一种研究策略。在民族生态学内部分化出民族植物学、民族动物学、民族医药学等更为专门化的领域后,民族生态学一跃成为一门统领性的学科,与所谓的西方科学的“生态学”遥相呼应。