蛋白酶抑制剂精选(九篇)

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第1篇：蛋白酶抑制剂范文

【关键词】 豆豉；，，胰蛋白酶抑制剂；，，分离纯化；，，降糖作用

摘要：目的从豆豉中提取胰蛋白酶抑制剂，并探讨其降血糖活性。方法以永川豆豉为材料，经脱脂，酸性溶液提取，硫酸铵沉淀得到胰蛋白酶抑制剂粗提物，再经Sephadex G-75凝胶层析得到纯化的胰蛋白酶抑制剂，以纯化的胰蛋白酶抑制剂给糖尿病小鼠灌胃并观察其降血糖活性。结果从豆豉里分离出的胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率为30%~40%；用抑制剂提取液给四氧嘧啶糖尿病模型小鼠连续灌胃4 d，发现其血糖值明显低于模型组；观察小鼠的胰组织病理切片，与糖尿病小鼠比较，灌胃后的小鼠胰组织明显得到修复。结论 豆豉提取液有较明显的降糖作用。

关键词：豆豉； 胰蛋白酶抑制剂； 分离纯化； 降糖作用

Purification A Trypsin Inhibitor from Lobster Sauce Produced in Yongchuan and Hypoglycemic Action of Research

Abstract：ObjectiveTo isolate and purify the trypsin inhibitor from Lobster sauce and investigate its hypoglycemic action.MethodsA trypsin inhibitor was purified from the lobster sauce of Yong Chuan by defatting，extraction with axidic buffer，precipitation，chromatography on Sephadex G-75， and its hypoglycemic action in mice was studied.Results A series study on lobster sauce showed that the inhibitor had inhibition activity of thirty~forty percent to trypsin. In mesoxalyl carbamide model，the blood glucose levels were reduced after four days treated with lobster sauce extracts of Yong Chuan， compared with the model group.ConclusionThe trypsin inhibitor has hypoglycemic action.

Key words：Lobster saace； Trypsin inhibitor； Isolation and purification； Hypoglycemic action

蛋白酶抑制剂广泛存在于动植物和微生物中，具有抑制蛋白酶的活性的作用，能与相应的蛋白酶水解，参与体内许多重要生理过程的调节。其中胰蛋白酶抑制剂具有重要的药用价值，对于急性胰腺炎、肺气肿、出血性和败血性休克等疾病有独特的疗效［1］。蛋白酶抑制剂被认为是植物天然的自我防御体系，是植物抗病基因工程的重要目的基因来源［2］。大豆胰蛋白酶抑制剂（STI）与其它临床上广泛应用的胰蛋白酶抑制剂具有相似的性质，但其生理活性研究还没得到足够的重视。和其他胰蛋白酶抑制剂相比，大豆胰蛋白酶抑制剂具有分子量较小、免疫反应较弱、植物来源的抑制剂能避免携带动物病毒、原料来源广、价格低廉等优点，应当得到足够的重视。大豆胰蛋白酶抑制剂的种类有7~10种，目前研究证明主要有两种在动植物体内能抑制胰蛋白酶活力：一种为鲍曼克抑制剂(BBI)，是由71个氨基酸组成的多肽，分子量为7 975，分子内有7个二硫键，另一个为库尼兹抑制剂（KSTI），分子量约2万，分子内有2个二硫键。近年来国外报道发现低浓度的BBI在动物体内对直肠癌、肝癌等多种癌症有抑制作用；另有报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调可能有一定效果［3］，但未见有降血糖作用的详尽报道。因此，对具有强抗癌活性且毒性小的胰蛋白酶抑制剂，从豆豉中分离纯化，使其成为抗癌、治疗糖尿病及其并发症的新药用于临床，有十分积极的意义。

1 仪器与材料

DS1高速组织捣碎机（上海标本模型厂）， KDC1042离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），722分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司），AE240电子天平（METTLER公司）；雄性昆明种小鼠（体重18~22 g），永川豆豉(市售咸豆豉) ，透析袋，牛胰蛋白酶(1∶250) 、BAPNA・HCl(购自上海维思科贸有限公司)， Tris( 成都化学试剂厂生产)，sephadexG75 (上海化学试剂厂生产)，四氧嘧啶(Alloxan，Sigma公司)，葡萄糖试剂盒GLU（氧化酶法，液体，北京北化康泰临床试剂有限公司），肝素钠（天津生物化学制药厂），其它试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 豆豉胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

2.1.1 豆豉胰蛋白酶抑制剂粗提物的制备大豆胰蛋白酶抑制剂的提取方法已由Kakade等人在1974年提出。由于大豆胰蛋白酶抑制剂对热酸环境相对稳定，一般采用水浸酸提、沉淀再经离子交换或凝胶层析纯化制得。取2 kg永川豆豉，于46℃恒温干燥9 h，干燥后置于干净托盘中，把干燥豆豉粉碎、称重，然后加入去离子水2 L，于0℃提取15 h。15 h后于3 000 r/min离心6 min，沉淀弃去， 收集上清液。取上清液，加入正己烷［正己烷∶上清液(1∶2)］，静置30 min，后用1 000 ml的分液漏斗分离上述混合液，回收正己烷，收集棕色豆豉提取液。用稀盐酸20%(v/v)调豆豉提取液的pH约为4，于55℃水浴中保温1 h。称取固体硫酸铵，分次少量加入于水浴的上清液里，使硫酸铵的饱和度为30%，继续于55℃的水浴恒温15 min，离心15 min（3 800 r/min），弃去沉淀，留上清液。在上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵的饱和度为55%，55℃保温10 min，再离心15 min，弃去沉淀，收集上清液。再于上清液里加固体硫酸铵，使硫酸铵溶液的饱和度为70%，55℃恒温10 min，离心30 min（12 000 r/min），弃去上清液，收集沉淀，用20 ml磷酸盐缓冲液（pH 7.8）溶解沉淀，沉淀即为抑制剂粗提物［4］，于4℃保存在冰箱里。

2.1.2 抑制剂粗提物的透析将抑制剂粗提物置于透析袋中蒸馏水充分透析7 d，除去盐分。

2.1.3 凝胶柱的制备及抑制剂粗提物的纯化［5］取层析柱（16 mm×60 cm)洗干净并烘干。称取12.5 g sephadex G75溶解在250 ml 0.05 mol・L-1 pH 7.8的磷酸缓冲液中，充分混匀后，在100℃水浴中蒸煮5 h，赶走气泡，将凝胶连续沿壁缓缓倒入层析柱中，待有2 cm沉淀后，打开柱子下端的出口。稳定以后在凝胶的上缘留2~3 cm缓冲液，并放一个面积相当的滤纸片，吸出存留缓冲液，加入5 ml样品，连上缓冲液，打开出口阀，控制流速在2 ml/h。流出30 ml后，用干净的试管分部收集（2~3 ml），检测每管的抑制剂活性。

2.1.4 BAPNA法测定胰蛋白酶抑制剂活性 参考文献［6］略加改进，取不同胰蛋白酶抑制剂制备物并与0.2 ml胰蛋白酶溶液（0.1mg/ml）混合，于5 ml TrisHCl缓冲液（pH 8.0，0.05 mol・L-1）中37℃保温5 min，加入BAPNA 2.5 ml（5 mmol・L-1），于37℃恒温10 min，立即加入0.5 ml 33%醋酸溶液终止反应，以不加抑制剂的试样做对照，410 nm处测定吸光度值。每降低0.1个A410 nm为一个BCTI抑制活性单位（U）。

图1 豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率（略）

由图1可看到纯化过的豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制作用是较强的，是一种抑制力较强的抑制剂。

2.2 抑制剂提取物对小鼠血糖水平的影响

2.2.1 实验性四氧嘧啶糖尿病动物模型的建立取雄性昆明种小鼠（体重18~22 g），随机分为3组。每组10只，分别为正常对照组、四氧嘧啶高血糖模型组、抑制剂提取物灌胃组。高血糖模型组及高血糖模型灌胃组禁食10 h。按200 ml/kg的用量，腹腔注射四氧嘧啶。72 h后人工断尾取血，选取空腹血糖值大于11.0 mol・L-1的小鼠作为高血糖模型小鼠。

2.2.2 豆豉胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖水平的影响高血糖模型灌胃组按每天0.3 ml/只用量经口服灌胃给药4 d。正常组和高血糖模型组每天注射等剂量的生理盐水。每日观察小鼠皮毛、活动等生长情况。末次给药后，所有动物禁食10 h，按试剂盒方法测定血糖值。

表1 豆豉胰蛋白酶抑制剂对四氧嘧啶高血糖模型小鼠血糖水平的影响（略）

P＜0.001

由表1可见，第1天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型组有所降低，第4天灌胃后的小鼠血糖值比高血糖模型组明显降低，说明豆豉胰蛋白酶抑制剂提取物有较明显的降血糖作用。

2.2.3 豆豉胰蛋白酶抑制剂对胰组织的影响处死小鼠，分别取四氧嘧啶糖尿病模型小鼠灌胃前后的胰腺组织做病理切片（HE染色），显微镜下观察，结果如图2~3。 由图2~3可见，四氧嘧啶高血糖模型小鼠胰组织严重病变，灌胃后小鼠胰组织形态好于四氧嘧啶高血糖模型组织，胰岛结构较清晰，边缘与周围腺胞界限明显。说明豆豉胰蛋白酶抑制剂提取液对胰岛组织有明显的修复作用。

图2 抑制剂灌胃后小鼠胰组织 （略）

图3 四氧嘧啶糖尿病模型小鼠胰组织（略）

3 讨论

据报道大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗，调节胰岛素失调有一定效果。我们在实验中观察到豆豉胰蛋白酶抑制剂提取液有降低四氧嘧啶糖尿病模型小鼠血糖的作用。我们尚在本实验中做了豆豉胰蛋白酶抑制剂对α-葡萄糖苷酶活性抑制实验，结果显示无抑制活性作用。提示其降糖机理可能不是通过影响胰岛素受体后糖代谢的环节，而可能是通过保护或修复胰岛β细胞及胰岛组织促进胰岛素分泌或释放起作用的［7］。可能是豆豉提取液中胰蛋白酶抑制剂对胰腺产生了一定作用，促进胰岛素的释放，从而降低了血液中葡萄糖的浓度，但降糖作用机理尚有待再进一步分析研究。

参考文献

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第2篇：蛋白酶抑制剂范文

【关键词】 鱼腥草 胰蛋白酶抑制剂 正交实验

Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction procedure for trypsin inhibitor from Houttuynia cordata Thunb.．MethodsThe inhibition rate of trypsin activity was used as screening parameter， we employed the orthogonal design method to test the effects of four factors， including temperature of extraction solution (A)， volume of extraction solution (B)， pH value of extraction solution(C) and time of extraction (D)， on the extraction of trypsin inhibitor.ResultsFactor B performed the most significant effect on the extraction， and factors A and C came the next and factor D the last. ConclusionThe optimum extraction technology is A1B2C3D2 when the inhibition ratio of trypsin activity is considered as preferential parameter.

Key words:Houttuynia cordata Thunb.; Trypsin inhibitor; Orthogonal design

蛋白酶抑制剂（proteinase inhibitor， PI）是一类能够抑制蛋白水解酶活性的物质，广泛存在于动植物和微生物中［1］。其中胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor， TI）具有重要的药用价值，对急性胰腺炎、肺气肿、抗休克、防治脑水肿和脑缺血等都有很好的临床治疗效果，还有研究表明对 HIV 和肿瘤的治疗也有重要意义［2］。因此，从传统中药中筛选具有TI活性的材料有很广阔的应用前景和市场价值。

鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的地上部分，具有清热解毒、消痈排脓、利尿通淋之功效，是临床应用极其广泛的中药之一［3］。本实验根据前期筛选的结果，利用鱼腥草为材料对从鱼腥草中提取TI的工艺进行优化，找出最佳的提取条件，为今后的工业化生产TI提供基础性数据。

1 仪器与试剂

1.1 试剂胰蛋白酶( 北京麒麟宏伟公司) 、大豆蛋白酶抑制剂（国药集团化学试剂有限公司）、苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）（上海三杰生物技术有限公司）、三-羟甲基-氨基甲烷、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠等为国产分析纯；鱼腥草。

1.2 仪器可见光分光光度计(7202B) 、离心机（LD-4） 、精密pH 计、水浴锅、精密电子天平（FA2004N）。

2 方法

2.1 鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分提取的正交实验设计根据文献［4～6］及预实验结果，本实验采用双蒸水作为提取TI的溶剂。称取干燥的鱼腥草全草5 g，粉碎，在平行操作条件下，选用L9(34)正交实验表进行提取实验，以胰蛋白酶活性大小为指标，进行9次实验，每次实验重复3次（正交因素水平见表1），然后过滤并收集滤液，减压浓缩到100 ml。 表1 因素水平（略）

2.2 鱼腥草中胰蛋白酶抑制活性成分对胰蛋白酶的抑制率测定方法采用苯甲酰DL-精氨酸对硝基苯胺（BAPNA）法［7］：取胰蛋白酶液1 ml，加药材提取液1 ml在37℃水浴保温5 min，加入BAPNA溶液5 ml，37℃水浴保温10 min后，立即加1 ml三氯乙酸（30%）终止反应，用分光光度法在410 nm条件下测定吸光度。按下列公式计算样品提取液的抑制百分率：i=(Ar-Abr )-(As-Abs)(Ar-Abr)×100%

式中：i —抑制百分率；Ar —标准溶液的吸光度；Abr—含标准溶液的空白对照液的吸光度；As—样品溶液的吸光度；Abs—含样品溶液的空白对照液的吸光度。

3 结果与方差分析

结果见表2，表3。由方差分析可知，各因素对提取效果的影响程度依次为B>A>C>D，其中因素B为高度显著，因素A，C影响显著，因素D没有统计学意义，对试验结果的影响很小。由R值可知， 各因素对试验结果的重要次序为B>C>A>D。考虑到规模化生产中经济、效率等因素，本文优选工艺A1B2C3D2， 即在60℃，用30倍量水， pH值为9，3 h/次为最佳提取工艺。按照此工艺条件进行3次平行实验，测定提取液对胰蛋白酶的抑制率，结果平均抑制率为58.27%，表明本实验确定的工艺路线稳定可靠。表2 L9(34)正交实验结果（略）表3 正交实验的方差分析（略）

4 讨论

因素A对实验结果有显著的影响，60℃时提取活性最高，随着温度的上升抑制率有下降的趋势，说明随着温度的上升对TI有失活的作用。因素B对实验有高度显著的影响，在所有因素中影响最显著，说明随着溶剂量的增加会提高TI的提取效率，但从变化趋势看当30倍量时继续增加溶剂量，TI的提取率增幅不是很明显，因此考虑生产成本和效益用30倍量是最好的。因素C对实验结果也有显著影响，随着pH值的增加，提取活性成分的提取率增加，这说明在碱性条件下提取效率升高。

本实验通过正交实验法对提取工艺条件进行了优化， 并按最佳工艺进行了验证试验， 结果证明用该工艺作为鱼腥草中TI的有效部位的粗提取，具有工艺简单、提取率高、操作控制容易、稳定性好的特点。

【参考文献】

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第3篇：蛋白酶抑制剂范文

【关键词】　基质金属蛋白酶抑制剂-1；　慢性乙型肝炎；　肝纤维化；　诊断；　酶联免疫吸附测定

Clinical Application of Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1 in Assessment of Liver Fibrosis/SHI Yu-ling.// Medical Innovation of China，2012，9(23):087-089

【Abstract】　Objective：To evaluate the clinical value of TIMP-1 for diagnosis liver fibrosis. Method: CHB patients were divided into mild liver fibrosis group (S0-S1) and significant liver fibrosis group (S2-S4)， according to pathological diagnosis. The diagnostic capacity of CTGF was assessed by comparing the area under receiver operating characteristic (AUC) with a panel of fibrosis markers.Result：Serum level of TIMP-1 in control group，S0-S1，S2-S4 was(146.6±29.2)，(161.2±43.2)，(221.6±93.8)μg/L，respectively. The level of TIMP-1 in S2-S4 group was significantly higher than that of S0-S1 group (t=5.32，P

【Key words】　Tissue inhibitor of metalloproteinases-1;　Chronic hepatitis B;　Liver cirrhosis;　Diagnosis;　Enzyme-linked immunosorbent assay

First-author’s address:The First People Hospital of Xiangcheng ， Xiangcheng 466200，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2012.23.056

有研究发现，血清基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases-1，TIMP-1)在肝纤维化发生发展中有重要作用[1]。为了评估血清TIMP-1在肝纤维化中的诊断价值，笔者测定了肝纤维化患者血清中TIMP-1的含量，将肝穿刺病理学检查作为金标准，使用ROC曲线分析TIMP-1诊断明显纤维化的临床价值，并和肝纤维化标记物HA、PCⅢ、CⅣ、LN比较其诊断性能。

第4篇：蛋白酶抑制剂范文

[关键词] 血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C；血清视黄醇结合蛋白；肾损害

[中图分类号] R544.1+4；R587.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）01（b）-049-02

Analysis on early diagnosis of hypertensive and type 2 diabetes nephropathies with cystatin C and retinol binding protein

SHAO Yaoming NI Fangying MA Jian WANG Qiong

Department of Laboratory Medicine, Wuxi People's Hospital Affiliated to Nanjing Medical University, Jiangsu Province, Wuxi 214023, China

[Abstract] Objective To explore the clinical significance of determining cystatin C (Cys C) and retinol binding protein (RBP) in diagnosis of early renal damage in patients with hypertension and type 2 diabetes. Methods Cys C and RBP were detected in 185 hypertension patients and 193 type 2 diabetes patients and 30 controls with auto chemistry analyzer, BUN and SCr were detected at the same time. Results Cys C and RBP in patients with hypertension and type 2 diabetes group were increased significantly compared with those of the control group (P < 0.01); but there was no significant of BUN and SCr among the three groups (P > 0.05). Conclusion Cys C and RBP are good diagnostic markers of early renal damage in patients with hypertension and type 2 diabetes. The combined examination of Cys C and RBP can be more helpful for the diagnosis of early renal damage.

[Key words] Cystatin C; Retinol binding protein; Renal damage

肾脏是人体的重要器官，也是原发性高血压及2型糖尿病常会累及的脏器。肾脏病变的早期阶段是一种非常隐匿的病理过程，进展缓慢，又无特异性的临床表现。肾小球滤过率（GFR）是评价肾功能的重要指标，血BUN、SCr是临床常用的滤过功能指标，但BUN、SCr受多种因素影响，并不能敏感和精确地反映GFR，特别是肾功能轻度损伤时，血BUN、SCr的变化并不明显。临床实践证明：只有当50%以上的有效肾单位受到损害时BUN、SCr才高于正常值。有研究结果表明，血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C（Cys C）和血清视黄醇结合蛋白（RBP）反映肾小球滤过率明显优于血BUN、SCr[1]。本资料通过对原发性高血压患者及2型糖尿病患者血清Cys C、RBP的联合检测，与血清BUN、SCr指标比较，探讨血清Cys C、RBP在者肾损害早期诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

高血压组185例患者中，男103例，女82例；年龄30～75岁，平均（48±18）岁；病程5~28年，均为我院心血管内科就诊患者，符合WHO/ISH1999原发性高血压诊断标准。2型糖尿病组193例患者中，男103例，女90例；年龄33～78岁，平均（51±13）岁；病程5~30年，均为我院内分泌科就诊患者，符合美国糖尿病学会（ADA）2002年2型糖尿病诊断标准。对照组30例均为我院体检中心健康体检者，男16例，女14例，年龄25～72岁。均排除继发性高血压、肾疾病、自身免疫病、1型糖尿病及其他心脑血管疾病。三组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

高血压组、2型糖尿病组及对照组患者均空腹14 h，清晨采集静脉血4 mL，离心后取血清，采用Beckman-Coulter全自动生化分析仪检测血清Cys C、RBP、BUN、SCr，试剂、质控品、定标品均为公司原装配套产品；同时取晨尿3 mL采用罗氏公司U411尿液分析仪作尿常规蛋白定性分析，试剂、定标品均为公司原装配套产品。

1.3 统计学方法

采用SPSS 10.0统计软件进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用q检验；计数资料比较采用χ2检验。P ＜ 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清 Cys C、RBP、BUN、SCr检测结果比较

高血压组、2型糖尿病组患者血清BUN、SCr与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）；血清Cys C、RBP与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；高血压组与2型糖尿病组患者血清BUN、SCr、Cys C、RBP比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

表1 三组血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、视黄醇结合蛋白、尿素氮、

肌酐结果比较（x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.01

2.2 患者尿蛋白定性血清Cys C、RBP、BUN、SCr的阳性率比较

原发性高血压、2型糖尿病患者尿常规蛋白定性、血清BUN、SCr的阳性率较低，血清Cys C、RBP阳性率较高，联合检测阳性率更高。见表2。

表2 患者尿蛋白定性血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、视黄醇结合蛋白、尿素氮、肌酐的阳性率比较（%）

注：与尿蛋白定性比较，*P < 0.01；与BUN比较，#P < 0.01；与SCr比较，@P < 0.01；与Cys C+RBP比较，P < 0.01

3 讨论

原发性高血压及2型糖尿病均是严重威胁人类健康的慢性疾病，原发性高血压病理过程主要表现为血管重构和动脉粥样硬化，2型糖尿病主要引起微血管病变，肾脏损伤是两种疾病常见的并发症。临床准确的测定及客观估计肾功能对早期肾损害的诊断有重要价值。近年来研究表明血清Cys C和RBP与肾脏GFR有良好的相关性。

Cys C是近年发现的血浆内源性小分子微量蛋白，由122个氨基酸组成，属碱性非糖基化蛋白质，相对分子质量为133 359，等电点（PI）为9.3，Cys C由人体内有核细胞产生，生产较稳定，不受个体、肌肉量、性别、年龄、肾前因素和慢性炎症的影响。由于其相对分子质量低，能自由滤过肾小球，在近端肾小管上皮细胞被分解代谢，不被肾小管重吸收和分泌，其血液中的浓度主要由GFR决定，是理想反映GFR的内源性标志物。肾脏受损情况下，GFR减低，从而导致血中Cys C水平显著升高[2]。

RBP是肝脏合成的视黄醇（维生素A）转运蛋白，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液[6]。人体内RBP 90% 与视黄醇结合为holo-RBP，未结合的游离RBP相对分子量蛋白较低，可自由通过肾小球滤过膜[3]。85％ holo-RBP与TTR结合，形成大分子物质，不被肾小球滤过，15％部分经肾小球滤过。因此，当肾脏滤过功能受损害时，血中RBP水平会明显增高[4]。

临床较常以尿蛋白定性或血清BUN、SCr的变化来了解肾脏早期损伤情况，由于尿蛋白定性灵敏度较低，尿中检出蛋白时肾脏已有显著受损；血清BUN、SCr个体差异较大，受年龄、性别、饮食等多重因素影响，血清BUN、SCr发生变化常提示肾脏损伤较严重，本研究中BUN、SCr升高的高血压及2型糖尿病患者GFR已明显降低，因此，不能以尿蛋白定性、血清BUN、SCr作为早期肾损伤的诊断指标。本实验表明：高血压及2型糖尿病患者血清BUN、SCr浓度与对照组无显著差异时，血清Cys C和RBP的含量已显著增高，表明BUN和SCr正常的高血压及2型糖尿病患者，其肾小球功能在已开始受损，结果与国外相关研究基本一致[5-6]。从表2可以看出，高血压及2型糖尿病患者尿蛋白定性、BUN和SCr检出率仅为8.20%、7.14%、9.79％；而血清Cys C和RBP的检出率分别为37.83%、33.60%，明显高于前者。血清Cys C和RBP联合应用的测出率高达52.38％。

综上所述，血清Cys C和RBP的联合检测对临床早期诊断、早期治疗原发性高血压肾损伤具有较大的实用价值。

[参考文献]

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第5篇：蛋白酶抑制剂范文

【关键词】骨关节炎；软骨；MMP和TIMP

【中图分类号】R684.3 【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2014）01-0029-02

1 简介

骨关节炎（OA） 是一种慢性退行性疾病，是引起关节疼痛和残疾的主要原因[1]。其特征是关节软骨的破坏导致关节功能障碍。这种破坏主要是由于软骨中降解细胞外基质（ECM）大分子的蛋白水解酶活性的升高。长期以来一直在探讨基质金属蛋白酶（MMPs）与疾病发生和潜在治疗靶点之间的确切相关性，并混淆了它们在许多疾病病理方面的广泛作用。

软骨基质由两个主要的ECM成分组成：II型胶原纤维和软骨可聚蛋白聚糖类（约各占45%），还有一些其他含量较少的大分子物质[2]。在正常软骨中，软骨细胞会把合成的大量II型胶原、蛋白多糖等物质分泌到ECM中，构成细胞外纤维网架，给细胞提供支持与保护。这些物质同时被软骨细胞分泌的MMPs降解，维持软骨细胞内外动态平衡。关节软骨损伤时，软骨细胞分泌大量的MMPs对ECM进行降解，软骨细胞失去胶原网络结构支持而破坏，导致OA的发生。

2 MMPs：破坏的主宰者？

MMPs属于金属蛋白酶含锌超家族成员，来源于关节的固有细胞和浸润细胞，包括胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、膜型MMPs和其他分泌型MMP。MMPs最初是以降解基质的蛋白水解酶为特性的，但最近的研究表明它们作用于ECM还可以释放生长因子或产生新的配体[3]。MMPs也可以从载体蛋白中释放生长因子，激活蛋白酶抑制剂，并激活或灭活炎性细胞因子和炎性趋化因子[3]。因此它们在骨形态发生、骨重塑、伤口愈合和血管生成中有重要作用。大多数情况下，MMPs还有可能参与组织的正常生物过程，如修复和重塑[4]。在OA中，组织试图修复损伤、控制炎症和感染，但过程可能并不完整。这种'落空'的修复伴随基质更新和细胞表面以及胞周分子的调节，可能导致MMPs活性的不平衡，因此造成了组织的破坏。与非关节炎软骨相比，OA关节软骨中的MMP-1、MMP-3、MMP-13，MMP-28均升高。关节软骨的周期性压力负荷可增加MMP-3和MMP-13的表达和活化[5]，甚至单一的压力损伤都可增加MMP-3和TIMP-1mRNAs的表达水平[6]。关节的不稳定、老化、氧化刺激也促进软骨基质的分解。对于造成软骨损伤的MMPs来说，内源性TIMP的水平并不过量。TIMPs是组织中的主要抑制剂。Woessner等[7]在1995年的研究中发现在关节炎中软骨的退变本质上是MMPs和TIMP的不平衡造成的。在各种OA动物模型中应用合成型TIMP预防软骨和骨蛋白水解的实验[8]均支持金属蛋白酶破坏骨关节功能的理论。

3 TIMP的临床试验

一些在动物模型中显示出疗效的TIMP已被用于临床试验，但都未能在OA疾病中显示出明显疗效[8]。在某些病历中，这些抑制剂还出现了不良反应，如肌肉骨骼疼痛和肌腱炎、轻度贫血、肝酶升高等，主要是由于抑制剂缺乏特异性。人类基因组中有50多个与人类金属蛋白酶密切相关的碱性活性中心的类似结构，在一定程度上可以使它们对相同抑制剂敏感。我们对这些酶类的精确功能还了解甚少，但有些动物模型研究正在证明它们在生物学中的重要性，但抑制其活性的结果还不确定。例如，小鼠MMP14基因缺失可引起关节炎样症状。在注射Ⅱ型胶原蛋白和脂质多糖的单克隆抗体后，MMP-2基因敲除小鼠比野生型小鼠的关节炎更严重；在关节失稳的模型中MMP-3基因敲除小鼠比野生型更易发生OA。这些观察结果所强调的概念是，高度特异性抑制剂对避免毒副作用是有必要的。基于这个原因，进一步开发金属蛋白酶抑制剂的另一个先决条件是对靶酶的准确识别。

4 研发选择性TIMP的提议

MMPs的活性受到三个水平的调节，即基因转录水平、无活性酶前体的蛋白水解作用和特异性抑制因子TIMP。抗TNF抗体和IL-1受体拮抗剂可有效地减少MMPs[9]。由于对金属蛋白酶基因表达的复杂调节机制仍然缺乏充分的认识，所以并未建立起MMPs信号肽或转录水平的有效调控。此外，也有人担心，抑制这些水平的同时也可能会影响正常细胞的运行。在OA中，有多种刺激素和细胞信号通路诱导MMPs的表达或激活，软骨细胞是这些破坏性酶的主要细胞来源。在这种情况下，使用合成型TIMP对预防疾病进展可能是有效的。在与S1'底物结合袋牢固结合的高度选择性MMP-13抑制剂方面已得到了最新进展[10]。

开发特异性抑制剂的另一种方法是TIMPs。到目前为止，在人类中发现4种抑制所有MMPs的TIMPs表达，即TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3和TIMP-4，但TIMP-1对某些膜型MMPs的抑制作用较弱。TIMP-MMP复合结晶物为开发更具特异性的TIMPs提供了线索。TIMP分子有一个与MMP相互作用的脊状扩展位点。这个区域位于MMPs的活性位点，也就是N-末端Cys1残基的氨基和羰基基团，与锌酶活性位点螯合。围绕TIMPs反应性脊状区域的突变可改变其特异性，也就是特殊MMPs的选择性。例如，TIMP-3或Thr2Gly的N-末端突变可干扰TIMP-3对MMPs的抑制活性[11]。Chung等[12]报告了胶原酶血红素域裂解三倍螺旋胶原蛋白的一个绝对必要条件，表明辅助域可能是开发变构或外部抑制剂的一个好靶点，可能会比传统活性位点抑制剂表现出更高的特异性。

5 结论

OA中的MMPs升高，毫无疑问会在OA疾病进展中导致软骨和骨破坏。但TIMP并不能有效地治疗OA。其原因还不清楚，但可能是由于抑制金属蛋白酶是正常关节生理活动和动态平衡所必不可少的。OA时出现由MMPs引起的软骨基质渐进性破坏。通过TIMP或使用降低金属蛋白酶合成但又不影响基质合成的制剂来减少基质的降解率，可能是行之有效的。产生金属蛋白酶的天然抑制剂包括雷公藤内酯醇，多酚和三萜类。多西环素是一种基质金属蛋白酶活性的弱抑制，并抑制一些MMP的产生，已用于牙周疾病的治疗。一项最近的试验中表明，使用多西环素治疗单侧膝关节OA患者可延缓关节间隙变窄[13]。但并不清楚多西环素是否可以有效地抑制金属蛋白酶的活性或者还有其他活性。

研制新型TIMP不仅需要其更具特异性，还应具备毒副作用小的条件。外部或变构抑制剂对多种蛋白酶都有活性，但需要进一步研究以了解OA中来自于不同细胞的MMPs的功能。因此，提高TIMP的靶向性是一种行之有效的方法。此外，在临床试验中，还需要能有效监测TIMP临床疗效的方法。我们相信这些困难是可以克服的，因为伴随TIMP早期临床试验的失败，我们对这方面知识的了解在迅速地增加。随着许多有用的研究工具和技术的产生[14]，我们最终会得到一个有价值的治疗实体。

参考文献：

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第6篇：蛋白酶抑制剂范文

【关键词】 ACEI TPK 尿微量白蛋白

为探讨如何能够更有效地延缓及逆转糖尿病肾病(DN)的发展，本研究对60 例早期DN患者临床观察，其中60 例使用依那普利联合胰激肽原酶(怡开)治疗早期DN，观察12周，通过检测尿微量白蛋白(UAER)，效果满意，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采集2005年10月—2006年12月住院患者，按照WHO(1999)糖尿病诊断标准，共纳入60 例超重体型2型糖尿病患者。用随机排列表法等分对照组30 例，联合治疗组30 例，两组患者年龄、性别、体重指数、FBG、HbALc、血压、UAER等基本匹配。主要观察指标为尿微量白蛋白。1周内检测3次以上(酶联免疫法)均在30～300 mg/24 h之间，全部病历均除外急慢性肾炎、泌尿系感染、发热、严重心肝脑疾患等其他引起蛋白尿的因素。一般情况比较见表1。表1 两组患者一般情况比较

1.2 治疗方法

所有被选患者均给予糖尿病常规综合治疗，包括饮食和运动治疗，并根据病情选用口服降糖药物或胰岛素强化治疗，使血糖控制在稳定水平(空腹＜7.0 mmol/L，餐后2 h＜11.1 mmol/L)，伴高血压者根据血压调整依那普利剂量，使血糖控制在＜130/80 mm Hg(1 mm Hg＝0.133 kPa)。对照组使用依那普利(扬子江药业集团有限公司)5～20 mg，每日2次口服，联合治疗组在对照组治疗的基础上加用怡开(常州生化千红制药有限公司)240 U，每日3次口服。疗程12周。

1.3 观察项目

治疗前后分别检测患者24 h尿微量白蛋白。

1.4 统计学方法

用SPSS软件完成计量治疗，以±s表示，组间差异以t检验测定P值，率间比较用χ2检验，P＜0.05为差异显著性。

2 结

果

对照组UAER由治疗前的(255.6±51.72) mg/24 h下降到治疗后的(105.50±36.82) mg/24 h(P＜0.01)，联合治疗组UAER由治疗前的(276.12±59.11) mg/24 h下降到治疗后的(69.10±29.91) mg/24 h(P＜0.01)，分别下降了37.6％0和66.30％，与对照组相比，联合治疗组效果更显著(P＜0.01)。治疗期间，使用依那普利有2 例咳嗽，但可耐受，未退出研究，尚未发现怡开毒副作用。

3 讨

论

糖尿病肾病是糖尿病患者主要的微血管并发症，发病机制包括多元醇通路的激活、蛋白非酶氧化和蛋白激酶的激活，血管活性物质的活性过度、激肽系统活性不足等［1］。其中肾内血流动力学和肾小球微循环与DN有着极为密切的关系，除了高血糖对肾脏的损害，激肽系统与肾素血管紧张素系统不同程度的异常改变［2］，使糖尿病患者体内肾素血管紧张素系统活性增高，其血管加压作用直接参与了肾脏的进行性损害。它通过影响全身及肾脏局部的血液动力学，升高肾小球内压力，使肾小球血浆流量增加，高灌注可导致肾小球入球小动脉扩张，肾小球超滤压增高，从而使蛋白漏出增加，并引起滤过膜增厚，肾小球毛细血管闭塞，肾小球硬化。多数研究证实血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)降低血液中AngⅡ水平，阻断AngⅡ在DN发生发展中的不良作用，特别是ACEI扩张出球小动脉作用明显超过入球小动脉，可降低肾小球内压，进而降低尿白蛋白的排泄，起到肾保护作用，且有不依赖于血压的降尿白蛋白效应［3］，通过抑制肾小球系膜细胞纤维母细胞的过度增生及肥大，减轻肾间质纤维化的过程［4，5］。ACEI同时可抑制激肽酶Ⅱ的活性，降低激肽的分解，增加激肽系统活性，增加肾血流灌注，改善肾脏功能。胰激肽原酶能够改善血管平滑肌使小血管和毛细血管扩展，增加毛细血管血流量，改善微循环，恢复肾毛细血管的正常功能，并且激活金属蛋白酶(原酶)水解肾小球系膜区和基底膜区的细胞外基质在系膜区和基底膜区堆积。水解胶原防止基底膜增厚，延缓糖尿病肾病的形成。本研究中两组治疗前后UAER均明显下降，但ACEI联合TPR疗效更加显著。基于激肽系统与肾上腺血管紧张素系统(RASS)系统的相互协调，共同维持肾脏血流动力学稳定和糖尿病时两系统不同程度的异常改变，故RASS系统的阻断及缓激肽原酶系统(KKS)系统活性的增加，使激肽的产生提高和降解减少，是ACEI和TKP肾保护的共同途径，加之ACEI和TKP各自特有的肾保护作用，得以早期DN有效控制，二者联合应用表现出稳定的协同效应。依那普利在使用中有2 例咳嗽，但可耐受，未退出研究，怡开无明显毒副作用。

参考文献

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第7篇：蛋白酶抑制剂范文

子宫内膜异位症(Endometrosis，EMs)是指子宫内膜组织（腺体和间质）在子宫腔被覆内膜及子宫肌层以外的部位出现、生长、浸润、反复出血，以子宫内膜细胞异位生长为特征。主要影响生育年龄的妇女，是目前常见的妇科疾病之一，近年来发病率明显增高，约占妇女人口的10%～15%，在生育年龄的妇女中发病率高达30%［1］。EMs为良性病变，但其某些生物学行为却类似恶性行为，尤其是具有组织侵袭、远处种植生长的能力。可引起痛经和不孕，严重困扰着广大妇女的身心健康。EMs一直是妇科领域的难治之症，国内外妇产科学者一直在努力探索其发病机制，但至今尚无定论。研究证明，子宫内膜碎片(腺上皮及间质)必须通过粘附、侵袭和血管形成，才可以生存、生长，并引起病变和症状。目前，很多研究也是从粘附，侵袭以及血管形成相关因子着手，试图发现EMs的发病机制。其中主要的相关因子包括整合素家族相关因子、基质金属蛋白酶(metrix metalloproteinase，MMPs)及组织金属蛋白酶抑制剂( tissueinhibitors of metalloproteinase， TIMPs)、血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(KDR)，而这些也是EMs发生机制中的研究热点，本文就MMP及其TIMP在EMs中的研究进展作一综述。

1 MMPs和TIMPs

MMPs是一组调节复杂，钙及锌依赖的中型蛋白酶家族，是细胞外基质降解过程中的重要酶类。MMPs的活性调节在组织重建、炎症及肿瘤生长、侵袭、转移等过程中起重要作用。在正常稳态组织中MMPs表达量极少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激下其表达量上升，从而在许多生理及病理过程中扮演重要角色。根据结构的同源性和底物的特异性MMPs被分为五类（1）胶原酶类：如MMP1。（2）明胶酶：如MMP2和MMP9。（3）基质裂解酶：如MMP3，MMP10，这类酶可以降解基底膜的许多成分和蛋白多糖反应蛋白质核心。（4）模型蛋白酶：如MMP14，MMP15，是一组与膜关联的MMPs。（5）其他：如2000年在子宫内膜癌细胞系中被鉴定的MMP26，它们的底物是不同的或者是未确定的。

TIMPs是MMP体内天然的抑制剂，是一组能抑制MMP活性的多功能因子家族。目前发现有TIMP1、2、3、4四种，TIMP1、2、4为可溶性蛋白，TIMP3是一种结合细胞外基质的不可溶性蛋白。TIMPs主要是从MMP酶原活化阶段、在活化的MMP阶段两个方面抑制MMP的激活。其表达受激素、细胞因子和生长因子多方面的调控。TIMP通过调节MMP的活性调控细胞外基质的更新，细胞外机制合成与降解过程的协调依赖于二者间的平衡。子宫内膜周期性的增生和剥脱生理过程中无疑贯穿着组织的崩解和重建，因此MMPs和TIMPs的协调表达必然在这一过程中起着关键作用。

研究证明组织中MMPs和TIMPs与涉及细胞外基质(ECM)降解和重建的生理和病理过程有关，如子宫内膜的周期性增生和脱落、乳腺组织的发育和萎缩、结缔组织的发育等。近年来在EMs的研究中也比较关注MMPs和TIMPs的表达和变化，许多研究表明，MMPs和TIMPs的表达异常与子宫内异症的发生有一定的关系，而抑制MMPs活性成为子宫内膜异位症治疗的又一新靶点。另外，MMPs近年来的研究还表明MMPs在降解ECM的同时，还具有调节细胞生长、凋亡、分化等更广泛而复杂的生物学作用［2］。另有研究也证明，MMPs和TIMPs在恶性肿瘤细胞的侵润和转移过程中起着决定性的作用。所以，对异位症与侵润转移相关因子的研究可以增进我们对这种疾病病因的分子机制的理解［3］。

2 MMPs及TIMPs与子宫内膜异位症

子宫内膜的月经周期变化过程涉及细胞增殖和凋亡、组织降解和重建等一系列细胞行为，有报道表明，在子宫内膜不同类型的细胞中，多种MMP分子在子宫内膜中的变化与月经周期相关。它们有特异的表达模式，表达水平呈现一定的周期性变化。如Hampton等研究表明，MMP1和MMP3 mRNA的表达严格限制在月经期。另有研究观察到MMP7和MMP11不但在月经期表达，而且在之后的增殖期也持续表达，但水平有所下降［4］。除了MMP7在子宫内膜上皮细胞特异表达外，子宫内膜中的基质细胞表达所有类型的MMPs5］。Mizumoto等［6］采用免疫组化研究内异症患者子宫内膜MMP1、2、3、7、9的表达模式，结果显示月经期MMP1、2和9在基质细胞和上皮细胞，而MMP7仅在上皮细胞都检测到强烈的表达，并由此推测以为内膜对周围基质降解作用是多种MMP共同作用的结果。MMP3主要表达于某些巨噬细胞，但关于其表达模式尚不清楚。子宫内膜异位症对胞外基质的降解可能涉及多种MMPS，这些MMPs主要产生于基质细胞［7］。有研究发现，在经期脱落的内膜中.有包括MMP9及TIMP1在内的多种MMP及TIMP的表达。目前的研究也逐渐显示，在EMs患者的病灶组织中一些MMP呈高表达［8］，如异位内膜比在位内膜产生更多的MMP2，3，9，且MMP3在异位病灶的表达也不具有正常妇女在位内膜表达的那种周期性变化，而是呈持续性高表达［9］。Chung等［10］研究表明与EMs患者在位内膜相比，异位内膜呈现MMP9，MMP2mRNA高表达和TIMP3、TIMP2低表达。Lim等［11］应用免疫组化法对MMP7、9、13在EMs在位和异位内膜中的定性表达研究发现:异位内膜中MMP7，9，13表达强于在位内膜，且在深部内异病变中表达强于浅表内异病变，故认为MMP由于在异位内膜中表达增强使其具有更强的降解细胞外基质的能力。最近研究表明，间质细胞中的MMP2可能在EMs的进展中起重要作用［12］。由此可见，MMPs在以为病灶中的过度表达已被许多研究证实，同时有效的治疗可使其表达水平降低。

此外，研究还发现一种孕激素受体激动剂——TNPR能有效的下调MMP在子宫内膜中的表达，并且在EMs小鼠模型中有效诱导损伤的减少，从反面证明MMP的表达与EMs的关系［13］。然而不论从哪个角度去研究，在EMs的发生过程中MMP的表达均发生变化，因此设想MMP在EMs的病理发生过程中起到一定作用，但具体作用机制尚有待进一步研究。

近年来，随着研究的不断深入，对MMPs结构功能关系的认识有了迅速增长，同时新的MMPs成员被不断的发现。如MMP26 (endometase)是Park等于2000年从子宫内膜癌。DNA文库克隆到的，其分子量仅为28kDa，是目前发现的MMPs成员中分子量最小的一个。并且MMP26具有与其它MMPs不同的结构特点和基因转录调节区，MMP26在被检测的8种人组织中，只表达于子宫，提示它可能具备某些特殊的功能。Isaka K等的研究表明MMP26定位于子宫内膜腺上皮细胞［14］。

TIMPs作为MMPs的组织型抑制剂，可与活性形式的MMPs以1:1的比例形成以非共价键和化学键结合的高亲和力不可逆的复合物来调节MMPs的活性。MMP/TIMP的比例增加与经期逆流于腹腔的内膜侵袭生长于异位部位有明显的相关性。MMP/TTMP失衡导致细胞外基质降解，基底膜消失，促使子宫内膜在异位部位的生长。TIMP1在间质细胞、上皮细胞中表达无明显差异，且表达于各个时期的内膜中。体外动物实验证实TIMP1可有效地减少异位症的侵袭生长。Kim等［15］研究发现TIMP1和TIMP2能抑制血管生成素诱导血管内皮细胞出芽。TIMP1可与活化的MMP1、MMP3、MMP9形成复合体而抑制其活性，TIMP2主要抑制MMP2活性，对MMP家族其他成员也有抑制作用，并能阻碍所有被激活的MMPs的水解酶活性。TIMP1/MMP9复合物还能与MMP3结合形成一个更加稳定的三元复合物，导致对MMP3活性的抑制。TIMP3能抑制MMP1、2、3、7、9和13的活性，还能阻断另外一种金属蛋白酶ADAM10的活性［16］。TIMP4能抑制MMP2和MMP7的活性，对MMP1、3和9也有较弱的抑制作用，然而TIMP4的研究不够透彻。Sharpe等对实验大鼠的研究表明:用GnRHa 治疗患子官内膜异位症的大鼠后MMP的活性降低，而MMP抑制物(TIMPs)的活性增加，同时也证实了EMs患者如腹腔中TIMP1明显下降。且有体外动物实验证明TIMP1可有效减少异位内膜的侵袭生长。

总之，MMPs及TIMPs在子宫内膜异位症的发生发展中具有重要作用，并为EMs的治疗提供了新的靶点。抑制MMPs活性是当前研究的主要方向。在子宫内膜异位症病人中使用简便易行的、标准化的MMPs， TIMPs检测，有助于评估病情及治疗效果，为广大EMs患者排忧解难。

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第8篇：蛋白酶抑制剂范文

【摘要】 目的：探讨基质金属蛋白酶_7(MMP_7及其组织抑制因子_1(TIMP_1在胃癌中的表达与浸润、转移的关系。方法：应用免疫组化检测36例胃癌标本中肿瘤组织及癌旁组织中MMP_7和TIMP_1的表达，并进行回顾性随访。结果：胃癌组织中MMP_7阳性表达率(58.3%明显高于癌旁组织(5.6%，P

【关键词】 胃癌；基质金属蛋白酶_7；基质金属蛋白酶抑制因子_1

［Abstract］Objective：To investigate the expression of matrix metalloproteinase_7(MMP_7and tissue inhibitor of metalloproteinase_1(TIMP_1in gastric carcinoma and their relationship with tumor cell invasion and metastasis. Methods：The immunohistochemistry was used to detect the expression of MMP_7 and TIMP_1 in 36 patients with gastric carcinoma. Results: The positive expression rate of MMP_7(58.3%in gastric carcinoma was higher than that of paracarcinoma mucosa(5.6%(P

［Key Words］gastric carcinoma，matrix metalloproteinase_7，tissue inhibitor of metalloproteinase_1

据统计，约有80%以上的肿瘤病人死于肿瘤的侵袭与转移，其过程虽很复杂，但其基本步骤包括压力作用、癌组织粘附性降低、癌细胞迁移、细胞粘附分子作用和细胞外基质降解。基质金属蛋白酶(MMP能有效降解细胞外基质，在肿瘤生长、转移过程中均起着重要作用。MMP_7是MMP家族中最小的成员，可降解各种细胞外基质成分。为研究胃癌发生浸润、转移的分子机制，本研究应用免疫组化检测胃癌组织中MMP_7和其组织抑制因子_1(TIMP_1的表达，探讨其在胃癌发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2004_01—2006_12汕头大学医学院第一附属医院有完整资料的原发性胃癌手术切除标本的存档蜡块36例(男性32例，女性4例。年龄44～81岁，平均60.2岁。所有患者术前均未接受放、化疗，并进行随访。病理组织分型：标本经病理证实为腺癌，其中低分化腺癌11例，高、中分化腺癌25例。采用国际抗癌联盟1987年公布的胃癌TNM分期：Ⅰ期2例，Ⅱ期8例，Ⅲ期20例，Ⅳ期6例。其中有、无淋巴结转移分别为24和12例。

1.2 检测方法

手术标本常规福尔马林固定，24h内取材，石蜡包埋，连续切片(厚4μm，苏木精_伊红染色。MMP_7和TIMP_1免疫组化染色。本实验采用链霉素_生物素(S_P免疫组化技术，MMP_7和TIMP_1单克隆抗体及免疫组化试剂盒(福州迈新生物技术公司，中国。按说明书操作。用已知的乳腺癌阳性片作阳性对照，同时用PBS替代一抗作阴性对照。根据细胞膜或胞浆的染色程度及染色细胞百分率进行判定：细胞膜或胞浆中有棕黄色颗粒沉着为阳性。基本不着色或着色细胞占计数细胞50%为“+++”。

1.3 统计学处理

各样本计数资料采用SPSS10.0软件包统计处理，组间计数资料差异比较采用χ2检验。

2 结果

MMP_7在胃癌组织中的阳性表达率(58.3%(21/36显著高于癌旁组织(5.6%(2/36(P

3 讨论

我国胃癌的死亡率一直居恶性肿瘤第一位。胃癌的浸润、转移是造成胃癌患者死亡的主要原因。胃癌患者的预后与肿瘤的分化、浸润程度及是否有转移存在着密切相关性，其中浸润和转移是恶性肿瘤重要的生物学特征，也是影响预后的主要因素。基底膜和细胞外基质的降解是恶性肿瘤浸润和转移的首要环节。LIOTTA等［6］提出肿瘤侵袭三步(粘附、降解和运动理论。明确肯定了蛋白水解酶在肿瘤侵袭和转移中发挥重要作用。研究发现，MMPs是降解细胞外基质蛋白的最主要的蛋白水解酶，其活性被体内天然存在的TIMPs所抑制，与肿瘤的浸润与转移密切相关。MMP_7属MMPs家族成员，能降解基底膜和细胞外基质的多种成分，且是降解基底膜的酶中最重要的一种［2］，在肿瘤发展过程中起重要作用。MMP_7可表达于多种组织的病理和生理过程中，但主要表达于某些肿瘤细胞或肿瘤浸润边缘的细胞胞浆中。MMP_7对基底膜和基质的降解作用有两面性：①有助于病理损伤和生理生长过程中组织的修复和塑形；②有助于肿瘤细胞的扩散、转移以及肿瘤的血管生长。MMP_7是通过降解细胞外基质而促进肿瘤转移的［3］。MMP_7还参与恶性肿瘤转移的其它关键环节，如促进肿瘤的血管和淋巴管生成，为肿瘤细胞转移提供门户等［2］。MMP_7随胃癌的进展而表达增高，有淋巴结转移胃癌组中阳性率显著高于无淋巴结转移组，表明MMP_7表达与肿瘤的转移有关，而肿瘤的转移与肿瘤患者的预后密切相关，所以MMP_7的检测有可能成为评价胃癌恶性行为的生物学标记物［4］。彭芳等报道［5］MMP_7的表达水平与浸润程度和淋巴结转移状况和TNM分期密切相关。MMP_7在浅层浸润组和深层组的阳性率分别为20.0%和70.0%(P

TIMPs是MMPs的天然抑制剂，它可与活化状态的MMPs以1∶1分子比例非共价结合，这种结合是不可逆且稳定的，从而使MMPs不能发挥其作用，是MMPs的负调控因子。MMPs与TIMPs之间的平衡关系失调是导致肿瘤转移的一个重要因素，TIMPs通过下调MMPs的降解活性而抑制肿瘤的浸润和转移［6］。在所有的TIMPs中，TIMP_1作用最强，对于所有类型MMPs均有抑制作用［7］。TIMP_1在胃癌中的表达较少报道，李莉等［8］发现，TIMP_1与胃癌浸润、转移和TNM分期呈负相关。TIMP_1可通过其N端功能区的半胱氨酸与活化形式MMP_7的锌离子活性中心结合，其碳端功能区与MMP_7的其他部位结合，以1∶1的比例形成MMP_7－TIMP_1复合体，从而阻断MMP_7与底物结合，使MMP_7失去生物学活性，是一种转录后的调节机制［9］。本研究结果显示胃癌组织中TIMP_1的阳性表达率为44.4%，癌旁组织50.0%，这可能与我们研究的例数偏少有关。但TIMP_1的表达随胃癌TNM分期增加而减少(P

参考文献

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第9篇：蛋白酶抑制剂范文

【摘要】 目的： 探讨强力霉素（doxycycline，Dox）保护胸腺上皮细胞的作用及其机制，为进一步研究Dox的免疫调节作用奠定基础。方法： 利用光学显微镜观察Dox对丝裂霉素(mitomycin， MMC)诱导MTEC1凋亡的影响，同时采用Hochest33342、PI单染、Annexin V和PI双染确认其作用，最后利用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析了SAX2芯片捕获的Dox作用前后的差异蛋白质。结果： 通过形态学观察、Hochest33342、PI单染及Annexin V和PI双染发现Dox确实能保护MTEC1抵抗丝裂霉素诱导的细胞凋亡。随后采用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析SAX2芯片捕获蛋白，发现Dox能调控15种蛋白，其中上调8种，下调7种。结论： Dox具有保护MTEC1，抑制MMC诱导的细胞凋亡作用，并对MTEC1的蛋白表达有调控作用。

【关键词】 强力霉素; 小鼠胸腺髓质上皮细胞系; 细胞凋亡； 蛋白质芯片

［Abstract］ Objective: To expose the molecular mechanism of doxycycline(Dox) that protects the mouse thymic epithelial cell line(MTEC1) free from apoptosis which induced by mitomycin(MMC).Methods： The effect of Dox protects the MTEC1 cells antiapoptosis against the MMC induced was observed under an optical microscope， and confirmed by Hochest33342 stain， PI single stain， Annexin V and PI double stain， and observed by fluorescence microscope or flow cytometer. Furthermore， SELDI Protein Chip was used to analyze the profile proteomics of MTEC1 cell which treated by doxycycline or not. Results： Dox was found to protect the MTEC1 free from cell apoptosis not only morphology observed with optical microscope but also detected by Hochest33342 stain， PI single stain， Annexin V and PI double stain. Proteomics assay by surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry(SELDITOFMS) disclosed that the Dox can upregulate 8 proteins expressions and downregulate 7 protein expressions. Conclusion： Dox protects MTEC1 against the apoptosis induced by mitomycin and regulated the proteins expressions in MTEC1. It will contribute to the further exploration of the mechanisms of Dox on MTEC1.

［Key words］ doxycycline; mouse thymic epithelial cell line; apoptosis； protein chip

强力霉素（doxycycline，Dox）是属于半合成的四环素类抗生素，除具有广谱抗菌作用外，还具有抗原虫、螺旋体、衣原体、支原体和立克次体等作用。近年来的研究表明Dox和其他四环素类抗生素还有其他生物学作用，如①抗肿瘤作用：Dox和四环素化学修饰物（chemically modified tetracyclines，CMTs） 通过上调caspase3途径［1］、Fas/FasL途径［2］及p53依赖途径［3］，抑制VEGF［4］、细胞外基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases2，MMP2），MMP9及VM［5，6］，通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡［1］，从而杀伤多种肿瘤和抑制肿瘤细胞（前列腺癌、血液系统肿瘤、淋巴瘤、乳腺癌及其骨转移瘤和骨肉瘤等）的转移；②抗凋亡作用：Dox和米诺霉素（minocycline，Min）可以通过抑制caspase 3，COX2，p38 MAPK和iNOS的表达，在脑缺血发生时保护脑细胞免于凋亡［7-9］；③抗炎症作用：Dox和CMTs下调单核细胞表面的MHCⅡ抗原表达，抑制软骨细胞、角膜上皮细胞表达炎症介质（IL1，IL6， TNFα和iNOS），抑制IL1转换酶β （IL1 betaconverting enzyme，ICE）的表达；抑制类风湿性关节炎及其软骨和结缔组织的重塑。在血管损伤中能抑制MMP9和VEGF，从而抑制病理性的血管重塑［10］；④促进细胞增殖：Dox可以刺激纤维细胞、正常淋巴细胞增殖，很少引起多发性硬化症患者淋巴细胞增殖和不引起急性播散性脑脊髓炎患者淋巴细胞增殖［11］。⑤免疫调节：Dox下调骨髓来源的树突状细胞（dendritic cells，DCs）其表面标志的共刺激分子CD86，CD80和MHC2Ⅱ；而且在同种异体混合淋巴反应中，Dox抑制DCs刺激同种反应性T细胞增殖能力［12］。我们在使用TetOn表达系统研究胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells， TECs)功能调节过程中，意外发现Dox本身对TECs行为有显著影响，其能通过活化ERK通路，促进小鼠TECs细胞系（MTEC1）增殖［13］，也促进原代小鼠TECs的增殖，这一结果提示，Dox可能通过促进TECs增殖的作用，促进T细胞的重建，因此阐明Dox对TECs的作用机制具有重要的意义。本研究采用蛋白质组学的方法初步研究了Dox对MTEC1影响，以期寻找相应的靶分子，为深入研究Dox的生物学作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞系 小鼠胸腺髓质上皮细胞MTEC1，由北京大学医学部免疫学系T细胞研究室建立。

1.1.2 材料和试剂 FITC标记的Annexin V和PI双染试剂盒：北京宝赛公司产品。Dox，Hochest 33342，PI，已氰，尿素，蛋白酶抑制剂（Leupeptin，Aprotinin和PMSF），Hepes，TriHCl和OGP均购自Sigma公司。注射用丝裂霉素（mitomycin，MMC，日本Kyowa Hakko Kogyo 公司产品）。SAX2蛋白质芯片和阴离子交换柱（Hyper Q DF）购于美国Ciphergen公司。蛋白质芯片阅读机由美国Ciphergen公司生产，PBSIIC型。

1.2 方 法

1.2.1 形态学观察Dox对MMC诱导的MTEC1细胞凋亡的作用 MTEC1细胞（3×105/孔） 接种于6孔板中，加入Dox（10 μg/ml）培养36 h，然后加入MMC（10 μg/ml）诱导细胞凋亡，同时设立MMC对照组，培养结束后于倒置显微镜下观察并照相。

1.2.2 Hochest33342染色检测细胞凋亡 1×105 MTEC1细胞接种于预先放置无菌小盖片的6孔板，加入Dox 10 μg/ml培养24 h，然后加入MMC继续培养8，18，36，48，60 h，同时设立空白，MMC和Dox对照，Hochest33342染色观察。

1.2.3 PI染色 3×105处于对数生长期的MTEC1细胞接种在25 cm2培养瓶中，加入Dox 10 μg/ml培养24 h，然后加入MMC分别继续培养24 h和36 h，同时设立空白，MMC和Dox对照，PI常规染色观察，FACS分析。

1.2.4 Annexin V和PI双染 细胞接种同上，加入Dox 10 μg/ml培养24 h，然后加入MMC继续培养24 h，同时设立空白，MMC和Dox对照，Annexin V和PI双染观察。

1.2.5 细胞总蛋白的提取 MTEC1培养于10%血清的DMEM培养基中。将处于对数生长期的MTEC1消化，计数，以1×105/孔接种于6孔板中，当细胞长至70%汇合度时换液，并加入10 μg/ml Dox；对照组采用相同体积的PBS处理细胞，并继续培养72 h，当细胞长成单层后，用细胞刷刮取细胞，冷PBS洗3次，加入细胞裂解液（8 mol Urea，4% CHAPS，40 mmol pH7.4的TrisHCl，1 μg/ml的蛋白酶抑制剂Leupeptin，Aprotinin和0.1 mmol PMSF），静置30 min，14 000 r/min离心20 min，取上清。用Bandford法测定总蛋白浓度，分装-80℃备用。

1.2.6 水化阴离子交换柱 阴离子交换柱用5倍柱床体积的TrisHCl（50 mol/L，pH9）洗3次，并将上述处理过的柱子储存在0.8 ml 的缓冲液中，4℃过夜，次日使用。

1.2.7 上样和洗脱 用1 mol/L尿素调节细胞的蛋白浓度至2 mg/ml。取200 μl滴加到阴离子交换柱的柱床上面，1 100 g/min振荡20 min。

1.2.8 蛋白芯片样品的制备 阴离子交换柱采用梯度pH洗脱液（pH9，pH7，pH5，pH4）洗脱，以获得不同pH的流出液组分。每个组分将分别采用SAX2芯片检测。

1.2.9 SAX2蛋白芯片检测 将芯片安装于bioprocessor上，芯片AH点加200 μl 结合缓冲液（50 mmol Tris+20 mmol NaCl pH 8.0），振荡室温下孵育5 min，每点分别加25 μl不同组分流出液和75 μl结合缓冲液，振荡孵育60 min，弃掉液体，用200 μl 洗脱缓冲液（50 mmol Tris + 20 mmol NaCl pH 8.0）洗涤芯片2次，每次5 min，加200 μl 1 mmol HEPES（pH7.0）后马上倒去，卸去bioprocessor，取出芯片各点加两次0.5 μl SPA，芯片表面干后，用蛋白质芯片阅读机（PBSIIC型）进行蛋白质谱分析。

1.2.10 数据采集和结果分析 蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSIIC型读取数据。仪器用标准多肽（peptide all in one）和低于200 kDa的蛋白质标准分子（protein all in one） 校正，系统的质量偏差为0.1%。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下：激光强度230、检测敏感度8，优化相对分子质量范围3～50 kDa，最高相对分子质量200 kDa，每个样品收集50个点，采用Ciphergen proteinchip 3.0.2版本的分析软件自动采集数据。两个蛋白质峰比较时，标志蛋白定义为蛋白质峰强度相差1倍以上。

2 结 果

2.1 Dox抑制MMC诱导的MTEC1细胞凋亡的形态学观察

我们在以往的研究中发现Dox能促进MTEC1增殖［13］，而在本次研究中发现Dox不仅能促进MTEC1增殖，而且能保护其抵抗凋亡（图1）。

(a)(b)a：Dox （10 μg/ml）实验组，细胞生长致密，存活良好；b：MMC（10 μg/ml）对照组，细胞大部分死亡，仅有少量存活（100×光镜下观察结果，右上角为200×光镜下观察结果）

2.2 Hochest33342，PI染色和Annexin V＋PI双染确认Dox的抗凋亡作用

Hochest33342染色的形态学观察发现MMC处理MTEC1 36 h能明显诱导细胞凋亡，而Dox也能明显地保护MTEC1细胞免于凋亡，同时发现Dox能明显促进细胞增殖（图2）。PI染色发现在MMC处理36 h后细胞明显凋亡（42.19%），Dox能保护MTEC1抵抗凋亡，使凋亡细胞下降到15.25%（图3）。

a～c为Dox处理24 h后MMC诱导MTEC1细胞凋亡24 h；d～f为Dox处理24 h后MMC诱导MTEC1细胞凋亡36 h； a，d：Dox对照组；b，e：MMC处理组；c，f：Dox＋MMC处理组

图3 经PI染色后流式细胞术分析Dox抑制MTEC1细胞凋亡作用

Fig 3 FCM analyzed the MTEC1 cells that protected by Dox against apoptosis that exposed to MMC with PI staining

Annexin V＋PI双染观察发现MMC诱导24 h后MTEC1早期凋亡细胞占77.74%，而中晚期凋亡细胞占20.12%；加入Dox使MTEC1早期凋亡细胞下降到51.01%，而中晚期凋亡细胞下降到6.30%（图4）。由此可见，Dox能明显保护MTEC1抵抗凋亡。

a：圈门设定；b：正常培养的MTEC1细胞未染色对照；c：正常培养的MTEC1细胞染色对照；d：Dox处理MTEC1细胞24 h；e：MMC诱导MTEC1细胞凋亡24 h；f：Dox处理24 h后MMC诱导MTEC1细胞凋亡24 h

2.3 Dox对MTEC1细胞蛋白表达水平的影响

为了了解Dox促进细胞增殖和保护MTEC1抵抗凋亡的机制，我们采用蛋白芯片技术对Dox处理前后的MTEC1进行了分析，结果发现Dox作用MTEC1细胞后，SAX2芯片捕获的蛋白中有15种蛋白发生表达变化，其中8种蛋白质表达增高，有7种蛋白质表达降低（表1，图5）。

表1 强力霉素处理后MTEC1细胞蛋白表达

横坐标表示相对分子质量，纵坐标表示蛋白质峰的强度。谱图从上至下依次为对照细胞和加药细胞。标记的峰是加药后表达减弱的蛋白，标记蛋白相对分子质量为8 551.2 Da

3 讨 论

强力霉素属于半合成四环素类药物，具有广谱的抗菌、抗原虫的生物学活性。近年来发现，其具有广泛的生物学作用，能诱导肿瘤细胞凋亡、抗炎症作用、免疫调节、促进细胞增殖和保护神经细胞抵抗缺血再灌注损伤［1-13］，但是其分子机制尚未完全明确。本项研究发现经Dox处理的小鼠胸腺上皮细胞具有抵抗MMC诱导的细胞凋亡作用。胸腺上皮细胞在T细胞的发育、分化和成熟中具有重要作用。最近的研究发现在HIV或移植物抗宿主排斥反应中，胸腺上皮细胞经常受到严重损伤，其作用方式主要是诱导细胞凋亡；而在对老年小鼠的研究中也发现，老年鼠的骨髓输出的T细胞前体细胞的能力是正常的，关键是胸腺上皮细胞发生了凋亡，因此保护胸腺细胞的药物及其作用对于胸腺功能的重建具有重要意义。蛋白组学是继基因组学兴起的一门新兴学科，通过任何有意义的因素引起的2个样本之间的差异蛋白质谱，可能揭示出细胞生理和病理状态的进程、对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析。其中表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术（surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry，SELDITOFMS）是蛋白质鉴定的核心技术，具有快速、操作简便、样品用量少和对多样品的平行检测等特点。已被广泛应用于肿瘤、免疫性疾病和其他疾病标志物的筛选［14-17］。我们在本试验中，采用SELDITOFMS分析了由SAX2芯片捕获的经Dox处理的MTEC1和正常培养的MTEC1细胞的蛋白，结果发现，SAX2芯片捕获的蛋白中有15种蛋白发生表达变化，其中8种蛋白质表达增高，7种蛋白质表达降低。这些被诱导差异表达的蛋白，为开展进一步的分子机制研究提供了有价值的线索。目前我们正通过与WCX2相匹配的亲和柱获得其中感兴趣的蛋白，并进行质谱鉴定，从而为阐明丝裂霉素诱导细胞凋亡以及强力霉素抵抗凋亡的作用途径提供实验依据。

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