干细胞培养技术精选(九篇)

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第1篇：干细胞培养技术范文

【摘要】

目的 建立Wistar大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）分离、培养的方法，并进行鉴定、标记。方法 采用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠的MSCs。采用相差显微镜观察MSCs的形态学特征；流式细胞仪检测第3代细胞表面标志抗原CD29、CD44、CD34和CD45的表达率；电镜检查第3代MSCs超微结构。DAPI标记MSCs为下一步进行体内细胞移植示踪。结果 原代培养的MSCs于6～8 h后贴壁，6 d左右形成集落，14 d 左右可达到80%～90%融合。第3代细胞表面标记物CD29，CD44，CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %，78.2%，0.0%，0.3%。超微结构清晰，可见细胞器，如线粒体、粗面内质网和高尔基复合体，细胞核呈圆形或不规则，可见较多微绒毛。DAPI可良好标记MSCs细胞核，呈蓝色荧光。结论 采用全骨髓贴壁培养的方法能够成功分离和培养大鼠的MSCs，在第3代可获得高纯度MSCs。DAPI可以作为一种示踪剂标记MSCs。

【关键词】 细胞培养；间充质干细胞；种子细胞；示踪剂

【Abstract】 Objective To establish a method for isolation and culture of bone marrow mesenchymal stem cells(MSCs) from Wistar rats in vitro，and to identify characteristic of the cells and to label them after culture expansion.Methods MSCs were isolated and cultivated from the bone marrow of Wistar rats by adherent method.The morphology of MSCs was observed under phase contrast microscope.The expression of CD29 ， CD44 ， CD34 and CD45 of the third generation cells were analyzed by flow cytometry. Electron microscopic features were also observed and MSCs were labeled by DAPI. Results After 6 to 8 h primary culture ， MSCs adhered to plastic surface of the culture dish. 　About 6 d later ， the cells proliferated in colonies.Primary MSCs reached 80%～90%of confluence in 14 d approximately.The positive rates of CD29 ， CD44 ， CD34 ， and CD45 in MSCs at third generation were 98.6% ，78.2% ，0.0% ， and 0.3% respectively. Under the electron microscope MSCs had plentiful cytoplasm with mitochondria rough endoplasmic reticula and Golgi complexes.Their nuclei were round or irregular and there were plenty of microvilli on the surface. All of the MSCs after labeling by DAPI showed blue fluorescence by fluoroscope.Conclusions Mesenchymal stem cells can be successfully isolated and cultivated by adherent method.And higher purity MSCs can be picked up after culture expansion at P3. DAPI can be an effective tracer agent to label MSCs.

【Key words】 Cell culture;Mesenchymal stem cells;Seed cells; Tracer agent

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类具有自我更新和多向分化潜能的非造血干细胞，可以向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、干细胞、肌细胞、神经细胞以及心肌细胞分化〔1，2〕，具有高度可塑性，易于体外扩增，因其来源充足、取材方便，体外增殖能力相对较强，而且在异体移植中排斥反应小，被认为是组织工程和基因工程的理想种子细胞，为心血管疾病、神经疾病和骨关节疾病的治疗提供了一条全新的治疗方案。本文在总结贴壁分离法培养MSCs的基础上，优化MSCs纯化、鉴定、标记的方法，以获得稳定的培养体系，为应用组织工程技术提供大量的种子细胞。

1 材料与方法

1.1 动物

清洁级雄性Wistar大鼠(3周鼠龄，60～70 g)，吉林大学动物实验中心提供。

1.2 主要试剂和药品

低糖DMEM培养基(Gibco公司)，特级胎牛血清(Gibco公司)，胰酶(Sigma公司)，亚美尼亚仓鼠抗大鼠CD29Alexa Fluor (Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD45过氧化物酶（FITC）(Biolegend公司)，小鼠抗大鼠CD44PE (Santa Cruz 公司)，小鼠抗大鼠CD34FITC(Santa Cruz公司)，46二脒基2苯基吲哚（DAPI）储存液(Sigma 公司)。

1.3 分离和培养

Wistar大鼠麻醉后处死，浸泡酒精15 min，无菌条件下分离股骨、胫骨，无血清DMEM冲洗骨髓腔，取混悬液，1 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀含10%胎牛血清的DMEM混悬，将获得的细胞接种在100 ml培养瓶中，5% CO2，37℃下培养24～48 h，换液，去除未贴壁细胞，2～3 d更换一次培养基，光镜观察细胞融合情况，细胞80%融合后传代，0.25%胰酶消化，用血球计数仪计数细胞、传代，培养3～5代细胞。

1.4 透射电镜样品制备

将培养3代10 cm2培养皿中约2×106个细胞以磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3 次，再以3 %戊二醛4℃固定1 h，送电镜室，脱水包埋并制作超薄切片，行透射电镜观察并拍照。

1.5 MSCs表面标记物检测

0.25%胰酶消化收获第3代细胞，收集1×106个细胞，洗涤1次，0～4℃预冷的70%乙醇1 ml边加入边摇匀，混匀后置于4℃冰箱待进行细胞表面标记物检测。检测时以1 ml PBS洗涤2次，加含10%山羊血清的 PBS常温孵育10 min，1 000 r/min离心5 min去上清，与饱和浓度的CD29Alexa Fluor、CD34FITC、CD44PE、CD45FITC单克隆抗体及其同型对照混匀，室温下闭光反应30 min，PBS 洗涤细胞，置于冰上，行流式细胞仪检测。

1.6 MSCs标记

将无菌的DAPI 储存液加入培养的MSCs爬片上清中，至终浓度为50 mg/L ，37 ℃孵育染色至少30 min。细胞至少用Hanks 平衡盐溶液冲洗6 遍以除去未结合的DAPI。荧光显微镜下观察细胞爬片。

2 结 果

2.1 MSCs相差显微镜观察细胞形态

骨髓细胞接种于培养瓶后，约6～8 h可见MSCs细胞贴壁，呈圆形或多角形，换液后，贴壁细胞清晰可见，2～3 d后可见少量短梭形、星形细胞分散贴壁生长，伸出伪足呈逗点状或短棒状；6 d左右可见放射状排列的细胞集落，伸出长短不一、粗细不均的突起、胞核大、核仁清晰。约14 d细胞融合80%～90%，呈漩涡状。传代细胞比原代细胞贴壁快，24 h内已全部贴壁、伸展，增殖迅速，均匀分布生长，3～4 d可见长梭形细胞80%～90%铺满培养皿形成单层。见图1。

2.3 MSCs的鉴定及标记

第3代细胞表面标记物CD29、CD44、CD34和CD45的阳性率分别为98.6 %、78.2%、0.0%、0.3%。见图3。细胞经DAPI标记后，细胞核呈蓝色。见图4。

3 讨 论

由于骨髓的细胞组成复杂，细胞功能各异，其中MSCs含量很低，约为骨髓低密度组分中有核细胞的0.001%～0.01%〔3〕，故分离高纯度的MSCs是原代培养关键性技术。目前，获得MSCs的方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分选法〔4〕。而骨髓贴壁法操作步骤简单，既降低了离心对细胞的损害，又减少了污染机会，且分离的MSCs贴壁时间短，增殖快，细胞数量多，经传代后能够纯化，提示全骨髓贴壁法是一种更加简单有效的MSCs分离方法。

一般认为，间充质干细胞没有特异性表面抗原，整合素家族成员CD29、黏附分子CD44、CD166、CD105等是MSCs的重要标志物〔5〕，而MSCs不表达造血细胞表面抗原，如造血前体细胞标志抗原CD34、成熟造血细胞标志抗原CD38、白细胞标志抗原CD45、淋巴细胞表面抗原CD11a和单核细胞/巨噬细胞表面抗原CD14。因此，实验选取MSCs表达阳性的指标CD29、CD44，以及表达阴性的指标CD34和CD45作为鉴定参考指标〔2，6〕。本研究选择了CD29、CD34、CD44和CD45进行检测，结果表明培养的细胞CD29和CD44阳性，CD34和CD45阴性，符合MSCs的特点，经过传代，第三代可获得较高纯度的MSCs，可以作为稳定的种子细胞进行体内研究。

DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。DAPI对活细胞无毒性，不改变细胞器的超微结构，荧光保持时间较长。移植细胞的标记是研究其在体内的定位不可缺少的，目前常用的标记法有DAPI标记法、溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）标记法、染色体标记法、基因标记法。BrdU法存在只能标记增殖期细胞，且标记细胞不能直接观察等不足。染色体标记主要将雄性供体动物细胞移植到雌性动物体内，通过Y染色体杂交区别确认移植细胞。其优点在于可以终生标记，但也存在操作繁琐，无法观察活细胞等不足。基因标记法通过基因转染或直接从转基因动物取材，使被标记细胞携带绿色荧光蛋白（GFP）暼报告基因。但目前，实现报告基因在目的细胞中高效稳定表达仍然存在程序繁琐、实验周期长、成功率低等困难，而从转基因动物取材又因为动物来源困难，在国内较少开展〔7〕。本研究表明，DAPI起初标记率很高(接近100%)，1 w内可维持80%～90%标记率。但随着标记时间的延长，其标记效率迅速下降，3 w以后绝大多数细胞失去标记。

本实验完善贴壁法建立Wistar大鼠MSCs培养体系，经鉴定细胞纯度高，可以为体内移植提供大量的种子细胞。采用DAPI 进行细胞标记后，荧光显微镜下见所有MSCs 均已被标记蓝色荧光，提示DAPI 标记法敏感性好，标记效率高，可应用进行体内细胞移植的良好标记。

参考文献

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第2篇：干细胞培养技术范文

【摘要】 目的研究柴胡皂苷-d（SS-d）对乙醇损伤大鼠原代培养肝细胞保护的作用和机制。方法采用胰蛋白酶消化、分离大鼠肝细胞进行原代培养，乙醇体外诱导肝细胞损伤，以不同浓度的SS-d对肝细胞保护，检测培养液中丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性和肝细胞内丙二醛（MDA）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）的活性，MTT法检测肝细胞存活率。结果SS-d（1.0，2.0，3.0mg·L－1）明显改善肝细胞存活率，抑制乙醇引起的ALT活性的升高，对肝细胞中MDA含量升高和GSH-px活性降低均有明显的抑制作用。结论SS-d对乙醇损伤大鼠肝细胞有保护作用，其机制可能与SS-d清除自由基、抑制质脂过氧化作用有关。

【关键词】 乙醇 肝细胞 原代培养 柴胡皂苷-d 保护作用 机制

随着人们生活水平的提高和饮酒量的增加，酒精对肝脏的损害日渐突出。了解酒精对肝损伤的机制，筛选有效预防和治疗酒精性肝损伤的药物应用于临床，是亟待解决的重要课题。目前，中药复方对酒精性肝损伤的实验研究和报道比较多，单味制剂报道较少。柴胡皂苷（saikosaponins SS）是中药柴胡的有效成分，根据其化学结构不同可分为柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c和柴胡皂苷d等，以柴胡皂苷d(SS-d)药理活性作用最强。整体水平研究表明柴胡皂苷对酒精性肝损伤有预防作用［1］。本文建立体外乙醇损伤肝细胞模型，在细胞水平上进一步研究柴胡有效成分SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用机制。

1 器材与方法

1.1 药品与试剂 SS-d（纯度98%），昆明长春花科技有限公司提供，临用前以蒸馏水配制；Hanks液高压灭菌，4℃保存；1.0 g·L－1胰蛋白酶，用Hanks液溶解，过滤除菌，调pH 7.2，分装，-30℃保存；基础培养液，RPMI1640培养基10.0 g，用超净水900 ml溶解，5.6%NaHCO3调pH至7.2，定溶到1 000 ml，过滤除菌，临用前每80 ml，加入新生小牛血清20 ml，青霉素100 U·ml－1，链霉素100 μg·ml－1，胰岛素5 μg·ml－1；MTT：SIGMA公司；ALT，MDA，GSH-px测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 动物 SD大鼠，2～4 d龄乳鼠，雌雄不限，清洁级，承德医学院实验动物管理中心提供。

1.3 仪器 CO2培养箱（Taibai LNA-122D 日本），MD-100半自动生化分析仪（美国Bayer公司），721W微机型分光光度计（上海光学仪器五厂），离心机（TGL.16G 上海）。

1.4 肝细胞分离培养［2］取新生2～4 d大鼠30只，75%乙醇浸洗后断头放血，无菌分离肝脏，去除肝脏外膜及其周围结缔组织，置Hanks液中，灌注冲洗肝脏至灰白色，将肝脏剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的组织块，用Hanks冲洗数次，除去血细胞，加入0.8g·L－1胰蛋白酶10 ml，37℃孵育12 min，加入数滴血清终止消化，用滴管轻吹打成细胞悬液，经200尼龙筛网过滤后用培养液洗2次，1 000 r离心5 min，收集肝细胞，台盼蓝活细胞计数>85%，按1 ×109个·L-1接种于铺有鼠尾胶原的24孔和96孔板中，37℃，5%CO2条件下培养24 h后更换培养液去除血细胞，继续培养72 h后进行分组实验。

1.5 乙醇诱导肝细胞损伤模型的建立将含肝细胞培养液的96孔板，设正常对照组及乙醇25，50，75，100 mmol ·L－14个剂量组，肝细胞悬液与不同浓度乙醇继续培养12 h，取培养液按赖氏法测定ALT活性，MTT法测定肝细胞存活率。

1．6 MTT法选择SS-d的实验浓度 SS-d初浓度为5 mg/L，采用细胞培养液进行稀释，依次为5.0 ，4.0，3.0 ，2.0 ，1.0 ，0.5 mg·L－1。将肝细胞接种于96孔板培养72 h更换培养液，换用SS-d稀释液培养，另设空白对照组，12 h后吸出培养液，各孔加入0.05%MTT200 μL，37℃孵育4 h，去上清液，各孔加入二甲基亚砜200 μl，混匀以溶解被还原的MTT结晶，检测波长为492 nm的光密度值，计算药物不同稀释浓度下细胞的存活率。

1.7 SS-d对乙醇诱导肝细胞损伤的保护作用取培养72 h肝细胞，设乙醇损伤模型组、SS-d(1 .0，2 .0，3.0mg·L－1)3个剂量保护组、正常对照组，每组设8个复孔。模型组和SS-d组加入乙醇100 mmol·L－1，同时SS-d组加入不同浓度的SS-d，正常对照组加不含血清的培养液，继续培养12 h，收集培养上清液检测ALT活性，收集肝细胞检测MDA含量和GSH-px的活性，MTT法测定肝细胞的存活率。

1.8 统计学处理 数据以 表示，用SPSS计算机软件进行统计学分析， 组间比较采用t检验，P

2 结果

2.1 乙醇对原代培养肝细胞的损伤不同浓度的乙醇作用于肝细胞，对细胞有剂量依赖性的损伤作用，25 mmol·L－1作用不明显，光镜下细胞形态基本正常，随着浓度的增大，肝细胞存活率呈进行性降低，反映肝细胞损伤的酶ALT逐渐升高；镜下观察肝细胞损伤明显，细胞结构不清，核融解和核膜破裂，其中100 mmol ·L－1乙醇作用最明显，我们选择乙醇浓度为100 mmol ·L－1制备肝细胞损伤模型。见表1。表1 不同浓度乙醇对肝细胞ALT水平及细胞存活率的影响 与空白对照组比较#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.2 SS-d 实验浓度的选择SS-d不同浓度时细胞存活率见表2，为避免药物浓度过大所致的细胞毒性作用，应选择对细胞生长无明显影响即肝细胞存活率在90%以上的浓度(1.0 ，2.0 ，3.0 mg·L-1)作为实验所用药物浓度。见表2。表2 不同浓度SS-d对肝细胞存活率的影响与空白对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

2.3 SS-d对乙醇损伤肝细胞的保护作用 100 mmol·L－1乙醇作用肝细胞后，肝细胞损伤明显，大量细胞坏死，细胞内ALT释放量明显升高，细胞内MDA含量明显增高，GSH-px活性明显下降；而给予SS-d保护后， 培养液中ALT水平明显降低；肝细胞MDA含量明显降低，GSH-px活性明显升高；并且肝细胞存活率明显升高。具有明显的剂量依赖性(P＜0.05，P＜0.01)。表明：SS-d能够保护肝细胞、稳定肝细胞膜的结构，其保护作用可能与抗脂质过氧化作用有关。见表3。表3 SS-d对乙醇损伤肝细胞ALT，MDA，GSH-px水平与对照组比较，*P＜0.01，与模型组比较#P＜0.05，##P＜0.01；n=6

3 讨论

大量研究表明，乙醇对肝细胞损伤是通过自由基介导脂质过氧化作用进行的［3～5］。乙醇在肝脏代谢时产生大量自由基，自由基除直接损伤肝细胞外，可引起肝细胞膜发生脂质过氧化反应，使细胞膜和细胞器结构破坏，膜流动性失常，大量肝内酶（ALT，AST）释放入血，并可抑制抗氧化剂谷胱甘肽的合成，减弱抗氧化酶（GSH-px）的抗氧化能力，使肝细胞代谢紊乱，肝功能异常，肝细胞广泛脂肪样和空泡样变性，最终导致细胞肿胀死亡［6］。因此，清除自由基抑制脂质过氧化反应，才能保护肝细胞，恢复肝细胞结构和功能的完整性。

SS是柴胡的主要成分，研究表明，SS对实验性肝损伤具有明显的保护作用［7，8］。但对单体SS－d保肝作用研究报道较少。因此，我们利用乙醇制备体外肝细胞损伤模型，在细胞水平上对SS-d保肝作用机制进行探讨。本研究显示，模型组肝细胞培养液中ALT活性明显升高，肝细胞脂质过氧化反应产物MDA含量增加，GSH-px活性降低，细胞存活率明显下降，表明乙醇可引起肝细胞氧化损伤；给予SS－d保护后，和模型组比较，肝细胞培养液中ALT活性明显较低，MDA含量明显降低，GSH-px活性明显升高，肝细胞存活率亦有明显升高。提示，SS-d对乙醇损伤肝细胞有明显保护作用，其机制可能是：①SS-d能增强机体内抗氧化防御能力，抑制自由基的产生；②稳定肝细胞膜系统，提高膜结构的稳定性，促进肝细胞增殖，防止肝细胞损伤和坏死。

【参考文献】

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［3］ Sergent O，Pereira M，Belhomme C，et al.Role for membrane fluidity in ethanol-induced oxidative stress of primary rat hepatocytes［J］. J Pharmacol Exp Ther，2005，1:5.

［4］ Stewart SF，Vidali M，Day CP，et al.Oxidative stress as a trigger for cellular responses in patients with alcoholic liver disease［J］. Hepatology，2004，39:197.

［5］ 邓 源，班春林，武晓琼. 乙醇诱导肝损伤作用机制的研究进展［J］. 华北国际医药，2005，17（4）:242.

［6］ Hock J B，Pastorino J G.Ethanol，oxidative stress，and cytokine-induced liver cell injury［J］.Alcohol，2002，27(1):63.

第3篇：干细胞培养技术范文

近日，英国伦敦帝国学院（Imperial College London）的科学家成功地利用人类胚胎干细胞培养出了软骨细胞，这为在将来某一天进行软骨移植提供了很好的契机。

研究结果发表在《组织工程》杂志中，文章详细阐述了帝国学院研究小组将胚胎干细胞变成软骨细胞的过程。这样，医生将可培养软骨细胞并将其移植到许多受损或患病的组织中，即使因运动产生的损伤也可用新的软骨取而代之，甚至是进行整容手术。

软骨（Cartilage）是骨间非常密集的结缔组织，允许关节之间进行平滑的移动。

文章的第一作者Archana Vats博士说：“利用干细胞培养软骨的技术在临床研究中具有巨大的应用价值。目前英国的老龄化问题越来越严重，长寿不可避免地成为备受关注的话题。在此之前，医生也能进行关节移植，却不能移植软骨。而更换软骨后就可以避免再对关节进行移植。”

研究人员在特定系统实验室的有盖培养皿中培养人类胚胎干细胞，进而促使其变成软骨细胞。与生长中的胚胎干细胞相比，在干细胞与软骨的混合物中存在较高含量的胶原质和软骨蛋白。

科研人员将这些胚胎干细胞移植到老鼠体内的特定生物活性部位，之后进行了35的观察。当干细胞脱离活性部位后，研究人员发现这些细胞形成了新的软骨，研究结果显示这些软骨还可以被成功移植到活体组织中去。

第4篇：干细胞培养技术范文

【关键词】 胶质瘤；细胞培养；应用

据统计大约9%的人类肿瘤是脑肿瘤，而脑肿瘤中90%是胶质瘤［1］。脑胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤。在成人致命原发脑肿瘤中，高级别恶性胶质瘤最常见，确诊后中位生存期为9~12个月［2］，而且这些患者是经过积极治疗的，包括外科切除、放疗、化疗等。这些治疗的失败部分归咎于胶质瘤细胞侵袭性生长以及与周围正常脑组织交错，因而外科手术难以完全切除［3］；同时由于其异常的生物学特性，对放、化疗的抗拒，导致术后放、化疗失败；而且经常以同级别或高级别复发［4］。因此需要开辟新的治疗方法如生物治疗以及开发新的治疗药物，这些新的治疗方法及新药研制都需要以实验为依据。目前关于胶质瘤的常用研究方法有临床实验和基础实验。其中常用的基础实验有细胞实验以及动物实验。细胞学实验是基础，是利用培养的细胞进行实验，从细胞水平、分子水平揭示胶质瘤的细胞特性。它具有许多优点：可以长时间直接观察细胞的形态结构和生命活动［5］；研究的条件可以人为控制；研究的样本比较均一；研究的内容便于观察、检测和记录；可以用于许多领域的研究；相对而言比较经济。

1 胶质瘤细胞培养的历史

1925年，Fish培养人恶性胶质瘤细胞获得成功，开创了体外研究胶质瘤的先河。Manuelidis 于1959年建立的世界上第1个人胶质瘤细胞株TC178，使体外长期连续动态观察胶质瘤细胞成为可能。 20世纪70年代以来，随着基础培养技术的迅猛发展，胶质瘤细胞的体外培养和克隆技术日趋成熟。近年来更是探索出许多新的培养方法，并应用于各项研究。

目前胶质瘤的细胞培养技术比较成熟，已经建立了许多胶质瘤品系，如国内的人脑恶性胶质瘤体外细胞系SHG-44，是1980年取材于额叶星形细胞瘤的组织块经胰酶消化，单层静止培养而成的；细胞形态有星形、梭形；流式细胞光度仪测定，此细胞以四倍体为主，G1期占54.57%、S期占15.17%、G2/M期占30.25%；免疫组化提示本细胞中存在S-100和GFAP；存于苏州大学附属第一医院神经外科细胞实验室。已经明确的胶质瘤细胞系（株）有许多，有人型、鼠型等，如U251、U87、U118、T98、TJ899、TJ905、D54、NT325、CHG5、BT325、9L、C6等，而且今后还会不断建立新的品系。

2 目前常用培养方法及应用

现有的胶质瘤细胞培养形式主要有：单层细胞培养、三维/立体培养及联合培养等。

2.1 单层细胞培养及应用 传统意义上的单层细胞培养可以分为原代培养以及传代培养两类。前者是从供体获得组织后的初次培养，后者一般为利用现有的细胞系（株）。

两种培养方法各有优缺点，而且都已经得到广泛的应用。目前国内研究胶质瘤的实验多采用细胞系，这主要是因为国内已经有许多胶质瘤细胞系，品系明确、易于培养；但连续性细胞系由于连续传代，细胞的形态、结构、功能发生了一定的变化，传代代数越多，发生的变化也越大，因而对实验结果有一定的影响。原代培养细胞技术相对要复杂得多，而且培养成功率较低，费时费力，因此不为许多研究者选用；但原代细胞刚离体，在形状、结构、功能等方面与体内细胞更接近，相对能更好地代表其来源组织的细胞类型及组织特异性，更好地保留胶质瘤的生物学特性，更接近也更能反映体内生长特性，所以原代培养出的细胞更适合做药物敏感实验、放射敏感实验等基础实验研究。

原代单层细胞培养常用的方法有：组织块原代培养以及单细胞悬液法培养。前者是将胶质瘤组织块贴附在培养瓶（板）上，一般1~2天就会有细胞从组织块边缘游出，利用游出的细胞进行培养；后者是将组织块通过机械分离或酶消化法或者二者结合的方法分离成单细胞悬液，再接种于培养瓶（板）进行培养的方法［6，7 ］。

传代单层细胞培养的方法相对简单一些，只需将需要传代的细胞用胰蛋白酶消化吹打后，按需要接种于培养瓶内，补足培养液即可。

以上为传统的细胞培养方法，在此基础上又发展出一些培养方法，如：单细胞分离培养法、加支持物培养法、球体细胞培养法、悬浮培养法等。单细胞分离培养也就是克隆培养，国内孙立军、黄强等［8］已经通过对SHG-44细胞系单克隆化，建立了具有低、中、高3种不同分化程度的人胶质瘤细胞株。加支持物培养法是为了实验研究或便于观察而预先向培养瓶/板内加入支持物；如为了做细胞免疫组化，预先在培养板内放入小玻片，再培养细胞，待细胞长在玻片上，取出固定、染色，也称为爬片。球体细胞培养是将长成片的细胞移入不易贴附的底物上，则细胞片能卷聚生长成球形。悬浮培养法，顾名思义就是让原本贴壁生长的细胞悬浮生长。李茗初等［9］运用无血清培养基悬浮培养C6胶质瘤细胞系，从中分离出该细胞系的干细胞。

单层细胞培养是目前最常用的一种培养方式，已广泛应用于各项基础研究。

2.1.1 在放射治疗研究中的应用 目前胶质瘤细胞系众多，不同细胞系有各自不同的特点，如MO54对辐射敏感，而T98则对辐射抵抗［10］；U373、U251、U118MGT-98G表达突变型p53，而U87、D54、A172、CCF-STTG1细胞表达野生型p53。针对不同细胞系的特点，在实验研究时可以根据需要而加以选择。Ostruszka等［11］在研究细胞周期进程中由2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷(2′， 2′-difluoro-2′-deoxycytidine; dFdCyd)引起的放射敏感性的作用中运用了2种人胶质瘤细胞系U251和D54，并且发现U251对dFdCyd的细胞毒性更敏感，dFdCyd也是U251的放射增敏剂，这种差异在于U251表达突变型p53，而D54细胞表达野生型p53，在D54细胞联合dFdCyd和电离辐射后，突出表现在G1期阻滞。Chen等［12］在研究DB-67作为一种新型DNA拓扑异构酶具有靶向辐射增敏剂的研究中也运用了表达野生型p53和突变型p53的D54-MG和T-98G胶质瘤细胞系。Shono等［13］采用将腺病毒载体-p53(Ad-p53)导入表达突变型p53的胶质瘤细胞系U251、U373和表达野生型p53的U87、D54细胞系，Ad-p53能通过增加表达野生型p53胶质瘤细胞的凋亡趋势来提高它们的放射敏感性，并进一步揭示Ad-p53转染的人胶质瘤细胞所诱导的凋亡和磷酸化区域特异性的位点相关。

2.1.2 在化疗药物研究中的应用 胶质瘤化疗效果差，这主要与缺乏有效的化疗药、全身化疗时化疗药难以通过血脑屏障以及肿瘤耐药有关。因此胶质瘤细胞培养广泛应用于新药开发。

Das等［14］用U87-MG研究地塞米松能够通过维持Bax:Bcl比率来保护人胶质瘤细胞U87-MG免于遭受替莫唑胺诱导的凋亡，提示胶质瘤患者接受替莫唑胺化疗之前如果用地塞米松将会产生非预期效果，为指导临床治疗打下基础。Landen等［15］在研究那可丁通过血脑屏障及抑制胶质瘤生长时利用鼠C6细胞系，证明那可丁可以抑制C6细胞增殖，并测定那可丁通过一层培养的脑微血管内皮细胞比率，并且与已知的渗透剂和非渗透剂相比较，来作为体外测定那可丁通过血脑屏障的方法。

2.1.3 在生物和基因治疗研究中的应用 生物治疗主要是通过调动宿主天然防卫机制或给予机体某些物质来取得抗肿瘤效应。对抗肿瘤防御机制的基础理论的深入了解以及生物反应调节剂（BRMs）的不断发现和应用使得生物治疗前景广阔。BRMs大致有以下几类：天然或基因重组细胞因子、抗肿瘤的各类体细胞和辅的造血干细胞、抗体、基因治疗、肿瘤疫苗、抗血管生成药、细胞分化诱导剂、某些菌类及其有效成分、植物药包括中药的有效成分、有机酸及小分子合成剂、其他类型。

随着生物治疗研究的不断升温，胶质瘤的细胞培养已广泛应用于胶质瘤生物治疗的许多方面，如：Friese等［16］利用人胶质瘤细胞系和鼠胶质瘤细胞系GL261 和SMA-560研究NKG2D，肿瘤细胞表达的配体激活免疫受体NKG2D 刺激由NK、γδT和CD8+T细胞介导的肿瘤免疫。人胶质瘤细胞表达NKG2D的配体MICA、MICB和一些UL16-结合蛋白家族，然而胶质瘤细胞因为高表达Ⅰ型MHC抗原而抵抗NK细胞的细胞毒作用，体外实验中质粒介导或腺病毒介导在胶质瘤细胞过表达的MICA可提高它们对NK和T细胞的应答。

肿瘤疫苗也是当今研究热点之一，制备以及测试抗胶质瘤疫苗都需要胶质瘤细胞培养。如利用胶质瘤细胞致敏树突状细胞（dendritic cells，DCs）制备胶质瘤疫苗。Driessens等［17］发现被γ射线或化疗药（顺铂和丝裂霉素）作用后凋亡的胶质瘤9L细胞联合鼠来源的成熟DCs分泌GM-CSF显示较好的治疗肿瘤潜能。Giezeman-Smits等［18］发现用白介素-4(IL-4)转染胶质瘤9L细胞制备的肿瘤疫苗能够诱导亲代肿瘤发生特异的、有保护性的免疫应答。

针对胶质瘤基因治疗的研究也越来越多，如单纯疱疹病毒胸腺激酶(HSV-TK)基因/丙氧鸟苷(GCV)系统、大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶(Ec-CD)基因/5 氟胞嘧啶(5-FC)系统；早期生长反应基因-1启动子（pEgr-1）；CEA-启动子等［19~ 22］。

2.1.4 在动物模型研究中的应用 培养的胶质瘤细胞还可以用于建立动物模型，为研究胶质瘤发病机理以及治疗提供良好的实验对象。如利用鼠类细胞系立体定向注射于大鼠颅内建立鼠胶质瘤模型等。Prins等［23］通过向C57BL/6 (H-2b)雌鼠的腹侧皮下注射GL26胶质瘤细胞以及将GL26胶质瘤细胞立体定向注射于大鼠颅内建立鼠胶质瘤模型，用于研究黑色素瘤相关抗原（MMAs）的靶向免疫治疗。

2.1.5 在其他方面研究中的应用 胶质瘤细胞培养除用于上述研究外，还广泛应用于其他研究方面，如探讨胶质瘤细胞与正常星型细胞之间的作用机制；胶质瘤细胞凋亡机制以及侵袭转移机制等。Zhang等［6］在研究恶性胶质瘤细胞和星型细胞之间的直接缝隙连接的交流中采用了原代培养的胶质瘤细胞和原代培养的星型细胞。Joy等［3］利用SF767 和T98G胶质瘤细胞系研究发现恶性胶质瘤细胞激活P13-K途径并且表现降低凋亡的敏感性。Yamamoto等［24］利用SNB-19、D-54MGU、87 MG、U-373 MG、U-118 MG和SW1088研究N-glycan在调节胶质瘤迁移和侵袭中的作用。

2.2 三维（立体）培养及应用 单层细胞培养虽然已经得以广泛应用，但也有其不足之处：第一，具有遗传不稳定性；第二，是一个平面结构，而人体是三维立体结构，与人体环境相差很远。针对这些不足，许多科研工作者也尝试用立体培养，因为环境对细胞的生长分化有着至关重要的作用。已有科研证明异位植入的胚胎细胞能转化为恶性细胞，并引发癌症，而相同的细胞在子宫内则可形成正常的胚胎；相反畸胎瘤细胞植入胚胎内可能经历正常的发育过程。

与传统的培养方式相比，三维立体培养的细胞在细胞形状和细胞环境更接近于活体内状态，而形状和环境能决定细胞的基因表达和生物学行为。三维细胞培养优点还在于具有清晰的几何学形状，这使其结构与功能直接相关，从而可以进行理论分析［25］。Joki等［26］在研究环氧化酶-2的实验中运用了三维培养系统，证明环氧化酶-2抑制剂NS-398对胶质瘤细胞生长和迁移有抑制作用。

但是三维立体培养也不能完全模拟体内环境，而且立体培养的模型在目前条件下难以无限生长下去，主要是因为模型长到一定大小时，由于模型中心缺乏营养或缺氧而坏死。因此如何解决这些问题，还需要进一步努力。

2.3 其他培养方法及应用 目前培养和应用胶质瘤细胞除了单独应用上述培养方法以外，还有共培养（coculture）方法，即将2种或2种以上的细胞一起培养的方法，其实质也是单层细胞培养；也有尝试2种或几种方法联合应用，如同时选用单层细胞培养及三维立体培养。

Zhang等［6］将原代培养的人胶质瘤细胞和原代培养的鼠星型细胞共培养，并认为2种细胞之间的缝隙连接的形成不是自然的，因为将胶质瘤细胞注射入活鼠脑内很快就能和宿主细胞功能性耦联在一起，而且和胶质瘤细胞耦联在一起的缝隙连接似乎可以调节星型细胞的表型。和胶质瘤细胞共培养的星型细胞表达Cx43显著降低并可以低水平表达GFAP。

Joki等［26］在研究环氧化酶-2的实验中除了运用三维培养系统外，还运用了单层细胞培养检测NS-398抑制胶质瘤细胞增殖以及运用共培养系统检测肿瘤细胞侵袭入正常鼠脑细胞。

3 展 望

提到胶质瘤细胞培养就不得不关注胶质瘤干细胞的研究。目前除胶质瘤细胞原代培养以及胶质瘤细胞系的培养外，还有人通过原代无血清培养、神经干细胞培养、悬浮培养以及CD133免疫磁珠分离等方法成功地分离、培养出胶质瘤干细胞。胶质瘤干细胞的分离、培养及研究是目前胶质瘤研究的热点，该研究将为胶质瘤的诊断与治疗带来新的突破与希望。

胶质瘤血管发生、形成、血管结构改变以及与周围组织的关系也是当今研究热点，而这方面研究也需要细胞培养技术。通过该研究有利于阐明胶质瘤的浸润、转移与其血管生成、结构之间的相关性，以及化疗药物透过血脑屏障的药代机制等。所以胶质瘤的细胞培养是一项非常重要的基础技术，相信新的培养技术会不断产生，新的应用领域会不断发现。

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第5篇：干细胞培养技术范文

【关键词】 川芎； 胚胎干细胞； 细胞分化； 心肌细胞

【Abstract】 Objective：To explore the features of differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes induced by Chuanxiong containing serum，establish a simple and efficient system of ES cells differentiation cardiomyocyte.Method：The action of ES cell activity under Chuanxiong containing serum were observed，visible spontaneous and rhythmic beating embryoid bodies occurred at 3 d，reached peak at 5 d.Myocardial cell specific genes β-MHC were detected by using RT-PCR method.Result：Compared with the rat serum and fetal bovine serum group，theβ-MHC of the cells cultured by Chuanxiong containing serum expression and differentiation rate increased significantly，the differences were statistically significant（P

【Key words】 Chuanxiong； Embryonic stem cells； Cell differentiation； Cardiomyocyte

First-author’s address：Longgang Central Hospital of Shenzhen City，Shenzhen 518116，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.30.005

心肌细胞移植在临床中已经广泛使用，移植细胞包括多种，其中最适合于移植的细胞为胚胎干细胞，主要是由于其具有较强的分化能力和增殖能力。胚胎干细胞分化为心肌细胞是研究心肌细胞分化机制的良好平台和模型[1-2]。随着现代药学的发展，人们更加重视中药的应用，中药历史悠久，很多中药均具有较好的活性，可用于疾病的治疗，其中保护心肌功能的中药应用也较为广泛，具有保护心肌、改善机体免疫功能、促进蛋白增长及防治细胞凋亡等特点[3-4]。与传统的化学药品相比，中药具有安全有效、价格便宜等特点[5-6]。本实验利用胚胎干细胞实验模型，对川芎含药血清诱导小鼠胚胎干细胞分化为心肌细胞进行实验研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 中药川芎含药血清的制备 选取健康未过的SD雄鼠30只[许可证编号：syxk（粤）2013-0085，广州中医药大学实验动物中心]，个体质量（200±10）g，适应性饲养3 d后进行实验。将其随机分为空白对照组、低剂量组及高剂量组，每组10只。给予大白鼠川芎水煎液灌胃（取一定量川芎饮片置容器中，加水没过药面，浸泡30 min后，煎煮3次，60 min/次，合并水煎液，过滤，浓缩至含生药1 g/mL备用），低剂量组的剂量约为正常用量（0.8 g/kg）的5倍，为4 g/kg，2次/d，连续3 d；而高剂量组则为正常用量的30倍，为24 g/kg，

2 次/d，连续3 d，空白对照组灌生理盐水（4 mL/kg）。人与大鼠动物等效剂量系数由《实验动物学》可知为6.3。每次给药10 min后，对其进行取血，将血液静置2 h后离心（离心条件：3000 r/min，离心10 min），离心后取上清液56 ℃加热30 min，过滤，保存于-20 ℃。体外含药血清按20%计算[7-10]。

1.2 胚胎干细胞培养

1.2.1 来源与试剂 小鼠胚胎干细胞选自中科院生化细胞研究所[11-12]；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、明胶、β-巯基乙醇（β-ME）、丝裂霉素C、非必需氨基酸（NEAA）购自美国GIBCO公司，白血病抑制因子（LIF）购自法国Millipore公司。

1.2.2 胚胎干细胞培养与诱导分化 将冻存在液氮罐中的胚胎干细胞取出，于37 ℃水浴锅中迅速融化，将细胞立即转移至10 mL的ep管中，加入适量的培养基，采用300 rcf，10 min离心，去除上清液，加入1 mL培养基吹打，转移细胞并进行培养，当细胞生长至70%左右时，对细胞进行传代。培养液分四组，即：川芎血清低剂量组、川芎血清高剂量组、大鼠血清组、胎牛血清组，将收集到的川芎含药血清和大鼠血清、胎牛血清，配制成10 mL备用，各组培养液终浓度为20%。（1）悬滴培养：ES细胞中加入20%川芎含药血清（低剂量组和高剂量组）的分化培养液，将细胞密度设置为3.75×104/mL。细胞培养在6 cm培养皿中，取1.6 mL细胞置于10 cm的培养皿内盖上，将内盖翻转使其生长，加入5 mL PBS，孵育1 h。（2）悬浮培养：细胞孵育后对细胞进行观察，控制细胞悬滴液中细胞个数为1，第2天于倒置显微镜下观察，每个悬滴内均含有1个，吸去PBS，加入分化培养基，移至6 cm中培养，孵育2 h。（3）贴壁培养：细胞培养2 d后，观察细胞个数，大约为10个，接种至4孔板，第3天时肉眼观察每个培养皿中均可见数十个EBs。分别接种至事先用明胶包被的24孔板内，每孔中加入2 mL分化培养液。

1.3 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达 实验细胞分四组，即川芎血清低剂量组，川芎血清高剂量组，大鼠血清组和胎牛血清组，每组6孔。提取总RNA并测定浓度，分析其完整性，进而合成cDNA，β-MHC Forward：5’-AGAGCTCATCCTTTCTGGTCAT-3’，Reverse：5’-ACCATCTGACATTCTACAGTCT-3’；GAPDH Forward：5’-ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3’Reverse：5’-ATGCCTGCTTCACCACCTTCT-3’[4-5]。PCR体系为：12.5 μL SYBR Green Realtime PCR MasterMix，2.5 μL样品溶液，1.0 μL引物加水至25 μL。反应条件：95 ℃下加热60 s，进行预变性；95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，如此循环40次。扩增后的产物主要是采用荧光检测，用ABI 7500 Software v2.0软件对其进行分析，绘制曲线表，计算Ct值，对系统数据处理后可以得出不同浓度对于细胞分化的影响。

1.4 统计学处理 使用SPSS 22.0软件对所得数据进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，以P

2 结果

2.1 川芎诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化 细胞培养2 d后呈密集状态，一般为圆形，细胞界限和形态不明显（图1）；体外细胞个头小，但生长速度快（图1～2）。川芎分化液培养3 d的胚胎干细胞会收缩配体，导致培养时间增加，收缩越明显，则时间越长。自发节律性收缩区域较大，且细胞形态较单一（图3～4）。于细胞培养的第3 d可见零星EB球发生自发性节律性跳动，5 d时约有70%的EB球出现节律性跳动，低、高剂量川芎血清组（图3～4）EB球发生自发性节律性跳动的细胞数量明显多于胎牛血清（图1）和大鼠血清组（图2）。

2.2 实时定量PCR检测心肌细胞特异基因β-MHC的表达 川芎低、高剂量含药血清组β-MHC表达量均明显高于胎牛血清组和大鼠血清组，比较差异均有统计学意义（P

3 讨论

随着人们生活水平的进步，大部分人均处于亚健康状态，心血管疾病是临床上常见的疾病。心血管疾病的临床突破主要来自胚胎干细胞的发展，胚胎干细胞会根据诱导自发分化成多种细胞，如心肌细胞和血管内皮细胞等[13-15]。心肌细胞对于恢复正常供血、免疫功能均有重要的意义[16-17]。一般情况下，胚胎干细胞能够自然分化，但分化率低，因此提高分化率显得至关重要。临床上对于胚胎干细胞的研究较为广泛，但是研究方向各不相同，关于中药的研究更是凤毛麟角，因为涉及人体、细胞、动物等各个方面，给研究工作带来了一定的困难，但也有部分学者取得了可喜的成果[18-19]。有研究方向为将细胞采用不同密度制成悬浮液，采用不同的方法和改变环境进行培养，分析其分化成心肌细胞的分化率。最后对具有促进分化功能的中药进行相关的安全性评价，致力应用于临床。川芎是伞形科藁本属植物，经研究表明，其具有多种临床功效，如使血管扩张、增加脑部血流量、改善供血、降低血液黏稠度及改善心肌缺血[20]。本课题组在研究川芎含药血清的胚胎毒性时发现川芎含药血清对胚胎干细胞转化为心肌细胞有促进作用（P

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第6篇：干细胞培养技术范文

[关键词]辛伐他汀；牙髓干细胞；增殖；分化

[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）02-0263-04

辛伐他汀是脂类代谢途径中的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglut aryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）还原酶的抑制剂，临床常用于降低胆固醇、降低血脂，减少心脏病的发生[1]。1999年Mundy在Science发表文章，报道辛伐他汀在骨代谢方面的影响，其实验研究发现，辛伐他汀可显著增加成骨细胞数量，减少破骨细胞数量，促进松质骨骨量增加，证明辛伐他汀具有良好的促进骨修复的性能[2]。此后，国内外学者也通过多项实验证实了辛伐他汀的促成骨分化特性。但以往的研究表明，不同的他汀类药物对不同类型的细胞，其增殖效应是不同的。他汀类药物可能抑制平滑肌细胞和内皮细胞的增殖，但却可以提高成纤维细胞的有丝分裂活性。故本实验采用噻唑蓝法、碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色等多种方法，研究辛伐他汀对人牙髓干细胞增值及分化的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料：胎牛血清（Hyclone，美国）；DMEM F/12（Gibco，美国）培养基；3mg/ml Ⅰ型胶原酶（Gibco，美国）；0.25% 胰酶（碧云天生物技术研究所，上海）；青链霉素（碧云天生物技术研究所，上海）；PBS缓冲溶液；100μmol/L 抗坏血酸（sigma，美国）；10mmol/L β-甘油磷酸钠（sigma，美国）；2mmol/L L-谷氨酰胺（sigma，美国）；茜素红（Sigma，美国）；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京）；噻唑蓝（Amresco，美国）；辛伐他汀（sigma，美国）；二甲基亚砜（sigma，美国）；Triton X-100（碧云天生物技术研究所，上海）。

1.2 人牙髓干细胞分离培养及传代：选择哈尔滨医科大学附属第二临床医院口腔外科门诊采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25岁），所有成年患者及未成年患者家属均知情同意。依据Gronthos DPSCs 原代细胞培养法[3]，劈开实验牙，用镊子取出牙髓，含双抗PBS充分冲洗，置于体积分数为0.3%的Ⅰ型胶原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃横湿振荡器内消化1h，200目尼龙筛过滤悬液至10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加入含20%FBS培养基，吹打混匀，血球计数板计数以1×108个/L细胞接种至50ml培养瓶，37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。每周换液两次，细胞融合达80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2比例传代。

1.3 DPSCs鉴定：克隆团分选技术将DPSCs悬液进行纯化分离，流式细胞技术鉴定DPSCs，倒置显微镜观察细胞形态，细胞常规传代至第3代用于后续实验[4-5]。

1.4 MTT染色实验：将DPSCs以5×103个/孔接种在九十六孔板中，在37℃、体积分数为5%C02饱和湿度条件下，于矿化培养液中（DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、100μmol/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，2mmol/L L-谷氨酰胺[6-7]），分A、B、C、D、E五组，加入不同浓度辛伐他汀，进行细胞培养。各组辛伐他汀浓度为A组：1×10-5mol/L；B组：1×10-6mol/L； C组：1×10-7mol/L； D组：1×10-8mol/L；E组：0 mol/L。于细胞培养第3天加入MTT 20μl，37℃孵育4h，吸去孔内培养基，每孔加入二甲基亚砜150μl，培养板均匀振荡10min，自动酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（A）值，观察各组细胞增值情况。

1.5 ALP活性测定：细胞培养条件同MTT实验，细胞培养分为ABCD四组，各组辛伐他汀浓度为：A组：1×10-6mol/L；B组：1×10-7mol/L； C组：1×10-8mol/L； D组：0 mol/L。培养3天时，去除培养板中培养液，0.01mol/L PBS冲洗细胞3次，加入50μl 0.1% Triton X-100，4℃冰箱过夜，光镜下观察已无明显细胞结构，反复吹打后每个样本加入ALP缓冲液和基质液各50μl，充分混匀，37℃水浴15min，加入显色剂150μl，在酶标仪上选择520nm波长检测各孔A值。观察各组细胞ALP活性，找出辛伐他汀诱导DPSCs成骨分化的最佳浓度。

1.6 茜素红钙结节染色：将DPSCs以1×105个/孔接种于六孔板中，细胞分组及培养条件同ALP检测实验。DPSCs于14天进行茜素红染色，培养皿PBS缓冲液冲洗3遍，95%无水乙醇固定15min，蒸馏水冲洗3次，0.1%茜素红-Tris-HCl（pH=8.3）37℃，30min，蒸馏水轻轻冲洗，干燥。

1.7 统计学分析：使用SPSS 15.0统计学软件，计量资料采用“均值±标准差”形式描述。

对实验组与对照组检测结果进行t检验和方差分析。

2 实验结果

2.1 DPSCs光学显微镜下细胞形态学变化：DPSCs原代培养24h内细胞贴壁缓慢，可见细胞为梭形，形态较小，未完全伸展，且有少量悬浮未贴壁细胞。48h，细胞梭形，贴壁较多，少量细胞呈克隆团状生长，见图1。7天后可见DPSCs大量扩增，呈伸展长梭形，克隆团状聚集生长，细胞融合率可达80%。

2.2 辛伐他汀对DPSCs增殖能力的影响：与对照组E组比较，A、B、C、D四组辛伐他汀对细胞增值均有一定的抑制作用，其中A组、B组、C组与对照组比较，差异有统计学意义（P

2.3 辛伐他汀对DPSCs碱性磷酸酶活性的影响：A、B、C组测得的A值明显高于对照组，差异均有统计学意义（P

2.4 辛伐他汀对DPSCs矿化的影响：DPSCs 14天培养后，可见部分细胞发生成骨细胞样多角形以及锥体形态改变。DPSCs在矿化诱导后逐渐产生白色点状晶体。经茜素红染色后光学显微镜下均可见橘红色矿化结节，呈团状不规则形态。如图3。

3 讨论

实验研究表明，DPSCs可向神经细胞、脂肪细胞、肌细胞、成骨细胞等多种细胞分化[8-13]，拥有多向分化的潜能，它可以作为一种组织工程的种子细胞，用于颌骨缺损的修复治疗。目前，各种药物、细胞因子及可溶性蛋白的添加广泛用于诱导DPSCs的骨向分化，如抗坏血酸、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等[11-13]。辛伐他汀作为一种新发现药物，已被证实具有促进成骨的活性。Wang PS等人的多项统计分析表明，辛伐他汀可以明显提高绝经后妇女和老年人的骨密度， 降低骨折发生的比例[14-16]。Maeda 等研究辛伐他汀对非转化成骨样细胞（MC3T3-E1）和鼠骨髓细胞的影响，发现辛伐他汀能提高成骨细胞ALP活性和促进矿化结节形成[17]。

在骨形成过程中，成骨细胞的演化经历细胞增殖、细胞外基质成熟、矿化和细胞凋亡4个不同阶段，各阶段调控精细，不同标志物特异性表达。ALP的表达是成骨细胞分化的主要特征之一，是基质成熟的早期标志物，其作用是水解有机磷酸释放出无机磷，促使基质矿化[18-19]。ALP是骨形成所必需的酶，它的表达表明细胞分化和骨组织形成的开始，代表着骨形成的状况。矿化能力是干细胞成骨的重要特性之一，组织内的钙质大部分以磷酸钙或碳酸钙的形式存在，茜素红AR-S法通过钙离子与茜素红特异性结合，可使矿化结节呈现鲜红色，因此茜素红染色是鉴定成骨分化的较特异的方法。

本实验采用MTT法、ALP试剂盒、茜素红染色法检测辛伐他汀对人牙髓干细胞的影响。结果显示，辛伐他汀抑制牙髓干细胞的增值，但对牙髓干细胞向成骨细胞分化具有促进作用。预示该药具有骨缺损治疗的临床应用前景，为颌骨骨缺损的组织工程修复提供了理论依据。辛伐他汀对人牙髓干细胞影响的研究还不成熟，本实验只是进行了初步的探讨，具体的药物浓度、作用方式和作用机制还有待进一步研究。

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第7篇：干细胞培养技术范文

[关键词] 神经干细胞；慢病毒载体；转基因；神经营养素-3；脑缺血

应用干细胞移植技术来治疗中风等神经系统疾病的基础研究已取得一定进展。但到目前为止，还没有直接证据表明移植细胞能和宿主的神经网络建立有功能的突触联系[1]。近年来，研究方向已转向促进中枢神经系统（central nervous system， CNS）内源性NSCs的增殖、存活及向神经元方向分化[1]。本研究旨在进一步探讨细胞移植后对大鼠海马区内源性细胞增殖及向神经元方向的分化的影响。

1材料和方法

1.1 实验动物及器械

孕14天Sprague-Dawley大鼠1只及雄性Sprague-Dawley大鼠（体重230g～250g）由汕头大学医院实验动物中心提供。15ml离心管（Corning，Mexico）， 低温离心机（Lock-Song，北京路科顺高新技术有限公司），一次性200目尼龙细胞筛（BD Falcon，美国），24孔培养板（Corning，美国）， 25cm2细胞培养瓶（Corning，美国），CO2恒温培养箱（Thermo forma 3110 series， 美国），倒置荧光显微镜（Leica，德国），手术显微镜（Leica，德国），立体定向仪（江湾II型-C）。

1.2 实验试剂

干细胞培养液：DMEM/F12培养液（Gibco，美国），添加b-FGF（20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美国）、EGF 20ng/ml，Cytolab/Peprotech Asia，美国），1%浓度的N2和2%浓度的B27添加剂（Invitrogen，美国），谷氨酰胺（2mmol/ml，Hyclone， 美国）、青霉素（10u/ml， Gibco ，美国）、链霉素（10mg/ml， Gibco ，美国）。4℃保存。0.25%胰蛋白酶（Gibco ，美国），胎牛血清（Invitrogen，美国）； 10%水合氯醛（Sigma-Aldrich） ； 表达hNT3基因的慢病毒载体（LV/ hNT-3，上海吉凯基因化学技术有限公司构建）。

1.3 神经干细胞分离、培养及hNT-3基因修饰

从孕14天Sprague-Dawley胎鼠海马组织提取NSCs，进行体外无血清培养、扩增和纯化 [2]。经免疫荧光Nestin染色鉴定后，取第五代的神经干细胞球，用0.125%的胰蛋白酶消化和机械吹打的方法，使神经球分散成3～5个细胞一簇；4℃离心1000rpm×5min，吸走上清，再用干细胞培养液洗涤细胞两次；用干细胞培养液重悬细胞，以1×105 cells /500µl/孔接种于24孔板，置37℃，5%CO2培养箱中培养；3～4h后，各孔以最佳感染复数 （multiplicity of infection， MOI）为10的比例加入LV/ hNT-3稀释液100µl， 10h后置换出病毒液，培养条件不变。已转染hNT-3基因的NSCs命名为NSCs-hNT3。

1.4 大鼠缺血再灌注模型（tMCAO）建立及细胞移植

参考Pringle等的方法，建立大鼠tMCAO模型[3]，右侧大脑中动脉阻断时间为2h。tMCAO模型建立后7d，选取神经损害程度评分[4] （Neurological Severity Scores，NSS）为8～9分的大鼠，随机分为NSCs-hNT3治疗组、NSCs治疗组及生理盐水对照组，各组动物数均为6个（最终纳入实验数）。细胞治疗组分别移植NSCs-hNT3或NSCs 2 00，000 cells/10µl，生理盐水对照组注射10µl生理盐水。具体方法参照文献报道[2]。

1.7 BrdU标记及标本取材

三组大鼠，在细胞移植7天后开始腹腔注射BrdU（50 mg/kg， b.i.d，共6天），对内源性新增殖的细胞进行标记。在最后一次注射结束后24h内（细胞移植后第14天），完成NSS评分后，处死动物取材。具体是：以10％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，用冰生理盐水和4%多聚甲醛经心脏灌洗固定后，取出脑标本，4%多聚甲醛4℃下后固定24h，30％蔗糖脱水48h。标本用冰冻切片机行冠状位连续冰冻切片，片厚20 µm。切片取材部位为背侧海马区（冠状缝后3.0 mm-4.5 mm）。切片收集到24孔板内，浸泡在冻存液内-20℃保存备用。每隔5张取1张切片用于免疫荧光组织化学染色，对体内新增殖的细胞及其分化进行检测。

1.8 免疫荧光双标染色

取24孔板，孔内预先加入TBS。将冰冻切片从冻存液内取出放入板孔内，行抗BrdU/DCX双标染色。具体如下：（a） TBS洗3次，每次5min；（b） 50%甲酰胺/2×SSC在65℃条件下作用2h；（c） 吸去液体后用2×SSC洗2次，每次5min；（d） 2N的HCl 37℃处理10 min；（e） 0.1M的硼酸缓冲液室温下10min，TBS洗3次，每次5min；（f） 3%H2O2 37℃处理10 min ，蒸馏水洗3min，TBS洗5min；（g） 用含5%羊血清、0.1%BSA、0.1%TritonX-100的TBS在37°C封闭30min；（h） 吸去封闭液，加入小鼠抗BrdU IgG （1：100）与兔抗DCX IgG （1：100），将脑片漂浮在上述抗体中，4°C孵育过夜；（i） TBS洗3次后， 各孔内加入用封闭液稀释的FITC标记的羊抗鼠和TRITC标记的羊抗兔的二抗混合液（1：100）。室温暗盒中作用40min后，各孔再加入0.1%的DAPI进行细胞核染色，继续作用10min；（j）TBS洗3次后用毛笔把脑片裱贴在载玻片上，并用 50%甘油封片，置荧光显微镜下观察，参考Baldauf [5]方法对海马齿状回SGZ和SCZ区域800µm范围进行细胞计数、照相。用 Image plus 6.0图像处理软件来处理和分析图像。

1.9 统计学处理

实验数据以X±S表示，组间细胞计数先应用Kruskal-Walis法进行差异性检验，再用Mann-Whitney’ U检验进行两两比较。应用统计软件SPSS 17.0进行统计分析。

2结果

2.1 神经干细胞培养及鉴定

原代培养5～7天， 即形成悬浮生长的神经球（图1），免疫荧光Nestin染色阳性，在荧光显微镜下观察呈绿色（图2）。

图1倒置显微镜下观察呈悬浮生长的神经干细胞球

图2荧光显微镜下观察呈绿色的

Nestin 染色阳性的神经干细胞球

2.2 免疫荧光染色

图3免疫荧光染色

各组大鼠缺血侧海马DG区新增殖的BrdU+细胞（红色）、DCX+细胞（绿色）及非特异性细胞核DAPI染色（蓝色）。其中 A-E 为NSCs-hNT3治疗组，A1-E1为 NSCs治疗组；A2-E2为生理盐水对照组。D、D1及D2分别为对应组别的融合图像，BrdU+/DCX+的细胞显示为黄色。E、E1及E2分别为对应组别融合图像的局部放大，箭头所示为BrdU+/DCX+细胞，即海马DG区新增殖并已向神经元方向分化的内源性细胞。Bars=100µm

图4各组缺血侧海马DG区增殖细胞数比较。

*表示组间比较，统计学差异显著（P

虽然海马组织未直接受到缺血性损伤，但是缺血发生后，缺血性损伤同侧海马区也会出现新生细胞增多，表现为BrdU+（红色），主要位于齿状回附近（图3）。细胞移植2周后，Kruskal-Walis检验示3组间BrdU+细胞数有显著性差异 （X2=13.36， P=0.001），NSCs-hNT3治疗组和NSCs治疗组海马齿状回SGZ和SCZ BrdU+细胞数（63.8±8.1 cells/800µm，52.5±6.7 cells/800µm）显著高于生理盐水对照组（13.3±2.5 cells/800µm）（P=0.004， P=0.004 respectively），且NSCs-hNT3治疗组BrdU+性细胞数也显著高于和NSCs治疗组 （P=0.037）。DCX是未成熟神经元的免疫学指标（绿色）。DAPI将细胞核非特异性染成蓝色。用Image plus 6.0图像处理软件将三种不同染色图像进行融合，显示>90%的新增殖细胞为BrdU+/DCX+细胞（黄色）。三组之间BrdU+/DCX+细胞数也存在统计学差异（ X2=13.93， P=0.001），组间两两比较结果与BrdU+细胞数比较结果相一致（图4）。

3讨论

Parkinson，s病、中风及脊髓损伤等神经系统常见疾病是由神经元和神经胶质细胞结构和功能缺失所致，干细胞移植治疗神经系统疾病的研究已取得一定进展。但遗憾的是，由于诸多因素的影响，移植的干细胞及其在宿主CNS内的子代细胞，大多数会在短期内死亡[1，7，8]，而且干细胞在体内自行分化成神经元的比例低，是影响疗效提高的重要因素。且到时目前为止，并没有获得移植细胞与宿主神经网络建立突触联系的确切证据。近来，基于干细胞治疗神经系统疾病的研究热点，已转向促进CNS内源性NSCs增殖并向神经元方向分化，防止其凋亡，并整合到神经网络中，进而促进神经系统功能和神经网络重塑[9]。

利用干细胞携带目的基因到达损伤部位或病灶局部，以达到修复损伤、治疗疾病的目的， 是目前干细胞研究的另一个热点 [10，11，12]。以NSCs作为基因治疗的细胞载体，来治疗中枢神经系统疾病，具有其特别的优点。NSCs不仅具有自我更新和多方向分化潜能，而且具有低免疫原性，以及向病灶和损伤部位敏锐的趋化性，移植基因修饰的NSCs， 一方面不仅可以突破血脑屏障的限制，在病变或损伤部位通过表达目的基因来发挥治疗作用。另一方面有望解决基因治疗的靶向性问题。而且与直接体内法（in vivo）比较，可以降低基因治疗过程中病毒载体产生的免疫毒性反应。其次，NSCs移植到体内后，存活的时间比骨髓间充质干细胞、脐血干细胞等长，满足基因长期表达的需要。此外，与其它载体细胞如成纤维母细胞不同，NSCs移植能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞[13] 。移植基因修饰的NSCs治疗中枢神经系统疾病，有望获得细胞移植和基因治疗的双重疗效。

在海马DG区， 内源性NSCs增殖主要发生在脑缺血后第一周，到第2、3周则已恢复至至正常对照水平。新增殖的细胞存活可达3周 [7，8]。本研究中，我们在大鼠缺血再灌注脑损伤发生1周后，将NSCs-hNT3移植到大鼠纹状体半暗带，对照组移植普通NSCs或生理盐水。我们发现，在细胞移植2周后（脑缺血3周后），生理盐水对照组缺血侧海马区仅少许BrdU+细胞，与相关文献报道一致。而与之比较，NSCs治疗组缺血侧海马SGZ区BrdU+/DCX+细胞显著增加（P=0.004），提示大鼠体CNS内源性NSCs增殖因外源性NSCs移植而增强，这可能是因细胞移植后，分泌了一些可改善缺血局部的微环境的营养因子，对CNS内源性神经干细胞的增殖与存活发挥了促进作用。hNT-3是神经营养因子家族成员之一，具有介导NSCs存活的作用[14]，在中枢神经系统发育和损伤后修复过程中还能诱导干细胞向神经元方向分化[15]。正常生理情况下，hNT-3的表达维持在较低水平。但经基因hNT-3修饰的NSCs移植到大鼠CNS内，能够表达丰富的hNT3因子[2]。这可能是NSCs-hNT3移植后，缺性性脑损伤大鼠海马区内源性细胞增殖进一步显著增强（P=0.037）的原因之一。在海马DG区，免疫荧光染色示>90% 的新增殖细胞为BrdU与DCX染色双阳性（BrdU+/DCX+），提示新生的NSCs主要向神经元方向分化，也许其中部分细胞已经分化成成熟的神经元，不过有待进一步研究。

干细胞移植治疗CNS疾病，其作用机理复杂，一般认为是通过分泌多种细胞因子及免疫调节物质起作用――即所谓的“旁路作用机理（bystander mechanism）”[1]。利用基因技术手段，对干细胞进行基因修饰已是相对成熟的技术。但基因修饰的干细胞在表达生成特殊细胞因子的同时，可能会使其它细胞因子的表达发生意想不到的变化。移植到宿主体内后，各种细胞因子的表达、调控及对CNS的影响更为复杂。对此，我们必须有清醒的认识。

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第8篇：干细胞培养技术范文

【关键词】骨髓间充质干细胞；细胞培养；细胞鉴定

【中图分类号】R392.4【文献标识码】A【文章编号】1044-5511（2011）11-0346-02

骨髓间充质干细胞(bone marrow-drived mes-enchymal stem cells,BMSCs是来源于骨髓的 MSCs，具有采集方便的优点，是理想的组织工程种子细胞［1］具有多向分化和自我复制潜能,易于自体采集、无免疫排斥反应、避免伦理学限制等优点,在细胞治疗方面得到了广泛的应用。但是BMSCs在骨髓微环境中所占比例极少,使用何种简单操作方法快速获取形态均一和纯度较高的BMSCs便成为该研究领域关注的焦点［2］。本实验采用全骨髓贴壁细胞培养法和密度梯度离心法相结合分离、纯化BMSCs，通过体外培养扩增，以及流式细胞术鉴定，建立稳定的BMSCs培养扩增方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物：日本大耳白兔4只，4周龄，雌雄不限，体重250~300g，购于兰州生物制品研究所。

1.2 主要试剂及仪器：二氧化碳培养箱(BB16UV型,德国Heraeus公司)、超净工作台(VS-1300L型,苏净集团苏州安泰空气技术有限责任公司)、倒置相差显微镜、超声波清洗仪、纯净水系统、酸度计、台式高速离心机(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)、低糖培养基(GBICO公司)、胎牛血清（杭州四季青）、谷氨酰胺、青链霉素、胰酶、流式细胞抗体（北京博奥森生物技术有限公司）。

1.3 兔BMSCs的采集： 取4周龄日本大耳白兔一只，雌雄不限，20ml空针空气栓子经耳缘静脉注入，待兔死亡后，将其全部浸泡于75%酒精溶液内8~10分钟，在无菌环境下切开前后肢皮肤，切下兔前后两肢，剃去覆盖于肱骨、胫骨及股骨上的肌肉组织，注意保留骨的完整性，用组织剪分离股骨、胫骨及肱骨，将其置于无菌培养皿中，纵向依次剪开各长骨两端，5ml注射器沿剪开的骨端注入L-DMEM冲洗3次，收集冲洗液约10ml，用筛网过滤冲洗液，加入完全低糖培养基重悬组织冲洗液，吸管反复吹打混匀，1000 r/ min ，4 ℃，离心 5 min ，弃去上清。再次加入适量完全低糖培养基，吹打混匀，分别加入一次性培养皿中，放入37℃，体积分数为5%CO2培养箱中培养（图1）。

1.4 兔 BMSCs 培养：1.4.1 原代 BMSCs 培养 向分离得到的细胞组织悬液加入 10ml 含 20 %胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）的 L-DMEM 培养基重悬细胞，并转移至中号塑料培养皿内。将培养皿置于37 ℃，体积分数为 5 %的 CO2孵箱中培养。培养 72 h后使用含 20 %FBS 的 L-DMEM 完全培养基换液。原代培养 5-7 天后，细胞融合可达 80 %以上。将原代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成和细胞形态（图2）。

1.4.2 传代 BMSCs 培养 待原代细胞铺满培养瓶底后，用EDTA胰蛋白酶消化贴壁细胞，FBS 终止消化后将细胞悬液以 1:3 比例接种于新培养瓶中，加入含 10 %FBS 的 L-DMEM完全培养基 5ml 培养，每隔 2 天换液，约 3-4 天后细胞可铺满瓶底。将传代培养的 BMSCs 在倒置相差显微镜下观察细胞形态。以此方法，向后传至三代（图3、4）。

1.5 兔 BMSCs的鉴定

对干细胞的鉴定主要是建立在对细胞表面标记物的识别基础上，采用流式细胞仪特有的细胞分析技术，可在短时间内精确分析出细胞表型以及其所占有的比例，使用间接标记法标记 CD44、CD34。取第3 代 BMSCs 以 2.0×105/mL 重悬，PBS 洗涤细胞 3次，向细胞悬液中加入鼠抗兔CD44、CD34 （稀释 1:100） 为一抗，4 ℃保存 30 min，加入羊抗鼠含 FITC、PE 的二抗，4 ℃避光保存 30min。PBS 洗涤细胞 3 次后放入流式细胞仪中检测。记录数据（图5、6）。

2 讨论

BMSCs具有贴壁性、具有强大的增殖能力和多向分化潜能、具有免疫调节功能、具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥的特性。

2.1更好地增加BMSCs的贴壁性： 在BMSCs培养中，细胞贴壁培养与传代成功与否是本实验的关键。其中存在很多问题，比如在细胞贴壁方面，用一次性塑料培养皿效果要优于可重复使用的玻璃培养瓶、培养皿。塑料培养皿内壁有一层鼠尾胶原，它可以更好地促使骨髓间充质干细胞贴壁。

2.2 培养基最佳的酸碱度： 培养基中加碳酸氢钠的目的，是为了在二氧化碳培养箱中平衡培养基中的PH值。对于GBICO的DMEM培养基，3.7g是对应二氧化碳培养箱的二氧化碳浓度设定在10%，而5%的则对应的是2g碳酸氢钠。暴露在空气中的培养液，因为大气中二氧化碳的浓度很低，液体中的二氧化碳会气体分压高于大气，因此会逐渐溢出，浓度逐渐降低，液体的PH值也逐渐升高，如果DMEM在空气中存放时间过长，它将有可能变成紫红色。一般新配置的颜色正常，在多次开盖，培养液接触空气的时间较长后，颜色会逐渐变成紫红色，笔者的做法是，配制培养液时加hepes，用小容量的分装瓶分装，及尽量减少培养液与空气的接触时间。配培养基时，将酸碱度调至6.9-7.0，过滤后酸碱度会适当增高。

2.3 传代的注意事项

2.3.1 EDTA-胰酶最佳消化时间：具笔者在试验中的观察，在BMSCs传代过程中，根据培养瓶、培养皿或培养板中贴壁细胞的覆盖率确定，当BMSCs贴壁达到80%-90%就可以传代了，用玻璃尖吸管滴入EDTA-胰酶4-7滴，在倒置相差显微镜下观察，当细胞70%由原来的纺锤状、梭形变化为椭圆形时为最佳时间，一般为1至2分钟。

2.3.2 加入EDTA-胰酶后的吹打时间与次数 ：加入EDTA-胰酶后，静置1分钟，在镜下观察细胞变椭圆或圆形，并有轻度漂浮时，用尖吸管轻轻吹打3-6次即可。

2.3.3 骨髓间充质干细胞特异性标志物： 虽然目前尚未发现骨髓间充质干细胞特异性标志物，Pittenger等认为CD29、CD44、CD105、CD166、SH2、SH3为间充质干细胞的重要标志物［3］。

综上所述，对 BMSCs 的形态学观察和表型分子鉴定实验均证实培养传代的 BMSCs 的生物学特性并未发生明显改变，说明本实验的分离培养扩增方法安全有效。本实验成功的建立了一系列分离、体外培养和扩增兔 BMSCs 的实验方法，为进一步组织工程研究奠定了实验基础。

参考文献

［1］ 兔骨髓间充质干细胞的体外分离培养和生物学特性观察Progress in Modern Biomedicine Vol.10 NO.17 SEP.2010 3239-3243

［2］骨髓间充质干细胞的分离、培养及生物学特性 陈建梅姚荣伟 李勇 张馥敏 江苏医药2010年10月第36卷第19期2306-2308

第9篇：干细胞培养技术范文

【关键词】阿尔茨海默病；四乙胺；β淀粉样多肽；神经干细胞

基金项目：黑龙江省佳木斯大学研究生创新科研项目资金（项目编号：YJSCX2011021JD）；黑龙江省科学技术研究项目（项目编号：2012772）

作者单位：154000佳木斯大学阿尔茨海默病（Alzheimers disease， AD）是与衰老相关， 以严重的高级认知功能障碍为特征的隐袭性、逐渐性进展的退行性脑病[1，2]。AD 发病机制极其复杂， 主要病理学特点是β淀粉样多肽（Aβ）聚集形成的老年斑（SP） 和神经原纤维缠结 （NFT） 的形成， 伴脑皮质层神经元减少[3，4]。在研究中发现，AD患者常伴发大脑海马区的萎缩和神经干细胞的减少。同时也证实Aβ具有神经元毒性作用[5]和诱导神经干细胞的凋亡[6]，Aβ诱导的神经元凋亡的同时均伴随钾通道激活，尤其是延迟整流钾电流增强[7]。TEA是钾通道阻滞剂，研究证实心肌细胞凋亡中钾通道阻滞剂能起到保护和抑制的作用[8]。本研究以钾离子通道阻滞剂TEA作用于Aβl40诱导的神经干细胞，观察神经干细胞存活和Caspase3活性的变化，探讨Aβ致伤的神经干细胞凋亡时钾通道阻滞剂TEA在其中的作用。

1资料与方法

11实验动物、主要试剂及仪器雄性 Wistar 大鼠（

12大鼠海马区神经干细胞的分离与传代培养及鉴定新生的Wistar 大鼠（

13实验分组实验共分四组：Aβ140组：在传三代后的神经干细胞加入Aβ140 5 μM；Aβ140+TEA组：在Aβ140 5 μM孵育前30 min加入TEA 5 mM；空白对照组：加入等量的培养液的神经干细胞培养组；TEA对照组：神经干细胞加入TEA 5 mM。上述各组分别在0 h，12 h，24 h和48 h个时间点行细胞活性及凋亡检测。

14MTT法检测神经干细胞的存活率四组传代后的神经干细胞经不同处理后，停止培养前4 h将每孔加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl使终浓度为 1 mg/ml，放置37℃培养箱继续培养4 h，用翻板法将96孔板内的培养基弃去，在每孔中加入溶解液 DMSO 150 μl，振荡 10 min使其充分溶解结晶产物。在酶标仪上以波长570nm检测每孔的OD值。所检测OD值的大小可反映细胞代谢活性的强弱。每组设3个孔，实验重复3次，细胞存活率的计算：细胞存活率=试验组光吸收值/对照组光吸收值×100%。