黄芪的作用精选(九篇)

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第1篇：黄芪的作用范文

1、补气益血，健脾养胃，增强体质，提高免疫，抗病毒。很适合流感季节饮用。

2、黄芪可补气健脾、益肺止汗，民间常用于治疗产后乳汁缺少，又可补虚固表，治疗产后虚汗症。母鸡性味甘温，能温中健脾、补益气血。

3、此汤适用产后体虚、面色萎黄、乳汁过少、易出虚汗等症。需要注意的是，黄芪炖鸡汤宜在产后5～7天后食用。

（来源：文章屋网 ）

第2篇：黄芪的作用范文

中图分类号：R285

文献标识码：B

文章编号；1007－2349(2007)06－0030－02

黄芪为豆科植物荚膜黄芪和内蒙黄芪的干燥根，具有补气升阳，益气固表，托毒生肌，利水消肿等功效。化学成分包括含黄芪多糖、多种氨基酸、黄芪皂苷、维生素及硒、硅、钴、钼等微量元素。现代医学发现它具有调节免疫、增强细胞代谢、强心、利尿、降压、降血糖等作用。本文就黄芪的免疫调节作用机制及其在呼吸系统疾病中的应用做一概述。

1　黄芪的免疫调节作用

1．1黄芪对巨噬细胞调节作用 黄芪能增强网状内皮系统的吞噬功能，使血白细胞数、巨噬细胞吞噬指数显著升高。

1．2黄芪对T淋巴细胞调节作用黄芪注射液可明显增加肿瘤的T细胞总数(TLC)与辅助细胞数(Th)，同时外周血a－醋酸奈酯酶细胞阳性反应增加。体内注射可促进Con．A诱导的T淋巴细胞增殖与转化。体外实验表明，低浓度黄芪可促进T淋巴细胞转化，而高浓度黄芪反而使之活力受抑制，说明黄芪具有免疫增强和免疫抑制的双向调节作用。黄芪对受胰酶损伤的T细胞E受体有明显修复作用，能使损伤，脱落的E受体重新复原。

1．3黄芪对B淋巴细胞调节作用电镜观察，黄芪皂苷能促进B淋巴细胞增殖与分化。研究还发现，黄芪能减轻钻60照射对小鼠脾脏B淋巴细胞的破坏。

1．4黄芪对IL－2产生有促进作用IL－2主要由辅T细胞产生的非特异性细胞因子，作用已活化的T细胞促进增殖并对B细胞有调节作用。黄芪可明显促进小鼠脾细胞产生IL-2的水平，间接增强体液免疫应答。

1．5黄芪能提高病毒诱生和自生干扰素的能力，促进免疫分子生成黄芪不仅能促进环已亚胺、放射菌素D在人肺二倍体细胞上引起IFN―P超诱导反应，而且可诱导小鼠脾细胞产生IFN－γ。

1．6黄芪能促进抗体和补体生成 黄芪水煎剂中的黄芪多糖能使脾脏的浆细胞增殖，促进抗体合成。电镜观察黄芪皂苷甲能促进B细胞增殖、分化和浆细胞抗体生成，不仅浆细胞数量增多，而且胞质内扩张的粗面内质网中也有大量的抗体成分。黄芪水提液可明显升高肝炎患者的总补体(CHso)和分补体(C3)。

2　黄芪免疫调节作用在呼吸系统疾病中的应用

2．1用于防治感冒 黄芪能提高病毒诱生和自生干扰素的能力，增强对病毒抑制作用，促进抗体生成。易感者在感冒流行季节服用黄芪，不仅可使感冒次数减少，而且使感冒症状较轻，病程较短。

第3篇：黄芪的作用范文

20世纪60年代后,斯坦福大学与美国国立肿瘤研究所从临床病例分析发现放射线确能引起心脏损伤[1]。由此确定了放射诱发心脏病(radiation induced heart disease)这一名词。由于放疗对肿瘤治疗的广泛应用,对人体正常部位的辐射损伤日趋被人们所重视,目前尚无特效防治方法。笔者针对放射损伤机理,采用黄芪治疗取得较好的结果,现结果如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

    选择湘雅医院、湖南中医药大学附属二医院1999年10月－2006年11月期间接受胸部放射治疗的肿瘤患者,在治疗前后进行运动试验的临床资料分析,共65例。其中男35例,女30例；年龄22～72岁,中位年龄61岁；肺癌33例,食道癌27例,胸腺癌1例,纵隔肿瘤2例,乳腺癌2例。观察对象一般情况较好,能耐受运动试验。其中治疗组33例,对照组32例,2组年龄、性别、原发病均无显著差异(p>0.05),具有可比性。

1.2  纳入与排除标准

    符合放射性心肌炎诊断标准,并排除对st段指标的影响因素,合并陈旧性心肌梗死、心瓣膜病变、预激综合征、束支阻滞、心肌病、贫血和电解质紊乱等不列入观察范围。

    放射源及剂量：采用60 coγ射线或直线加速器x射线照射,常规剂量分割,心脏及其相连大血管受照体积50%以上。照射总剂量40～70 gy/4～8周。

1.3  治疗方法

   

对照组采用卧床休息,给予辅酶q10胶囊(上海旭东海普药业有限公司,国药准字19993852,每粒10 mg)20 mg,每日3次；肌苷片(上海天晴制药厂,国药准字h33020003,每片0.2 g)0.4 g,每日3次口服。并给予胰岛素12 u、维生素c注射液5.0 g、10%氯化钾注射液10 ml、加入10%葡萄糖注射液500 ml中静脉滴注,每日1次。心力衰竭、心律失常者给予强心剂和抗心律失常药。重症者加用糖皮质激素。治疗组在上述治疗的基础上加用黄芪120 g,水煎服,每日2次。2组疗程均为4周。

1.4  观察指标

   

治疗前均记录临床症状、体征(心悸、胸闷、心音低、心脏杂音、心动过速、心动过缓)；检查心电图,用活动平板分析仪进行运动试验(采用bruce方案)；心肌酶学用酶法测定,包括丙氨酸转氨酶(alt)、肌酸磷酸激酶(cpk)及乳酸脱氢酶(ldh)；并检测肝功能及尿素氮。疗程结束后复查上述检查。

1.5  疗效标准

    治愈：症状、体征消失,心电图及心肌酶学恢复正常；显效：症状、体征改善,积分值较治疗前减少1/3,心肌酶学有1项以上改善；无效：治疗结束后症状、体征及心肌酶学均无改善或达不到上述标准者。

1.6  统计学方法

   

所测数据应用spss12.0统计软件包进行统计分析。计量资料以x±s表示,计数资料采用t检验。

2  结果

(见表1～表3)表1  2组放射性心肌炎患者临床疗效比较(略)注：2组比较,p<0.01。表2  2组放射性心肌炎患者治疗前后主要症状、体征积分及运动代谢当量、运动时间比较(略)注：与本组治疗前比较,p<0.05,p<0.01；与对照组治疗后比较,p<0.05(下同)。表3  2组放射性心肌炎患者治疗前后心肌酶学变化比较(略)

3  讨论

   

从中医学的观点来看,放射线是一种毒热性杀伤因素。热能化火,火热可以灼伤、消耗人体的而致病。这种热毒之邪来势凶猛、险恶,极易伤阴耗气,致使人体正气不足、抗病能力下降。黄芪具有益气养阴、扶正祛邪、养心通脉之作用。黄芪含有黄芪多糖、葡萄糖醛酸、多种氨基酸、叶酸、黄芪苷等有效成分,具有显著的增强心肌收缩力、改善微循环、扩张血管、增加心肌血流量、降低血压而起到保护心肌和改善心功能的作用；可抑制肿瘤坏死因子表达,抑制心肌细胞凋亡,具有明显纠正心力衰竭作用[2]。其作用机制可能与下列因素有关：①大剂量的黄芪皂苷抑制心肌细胞na＋-k＋-atp酶活性,从而间接抑制na＋-ca2＋交换,使ca2＋浓度增高,或抑制磷酸二酯酶活性,使心肌中环磷酸腺苷(camp)浓度升高,ca2+内流增加,而呈正性肌力作用；②黄芪多糖和黄芪皂苷能够改善心肌代谢,降低细胞耗氧量,维持氧的供求平衡,提高心肌耐缺氧能力,保护心肌细胞超微结构,稳定线粒体功能,改善细胞营养；③直接抑制或清除自由基的产生,保护心肌超氧化物歧化酶等酶的活性,提高心肌抗氧化能力,减轻细胞膜的脂质过氧化状态；④通过抑制磷酸二酯酶的活性,使血小板内camp水解减少,含量升高,从而抑制血栓形成及降低血小板粘附率。

    本观察结果表明,黄芪对放射所致的心脏损伤具有较好的治疗作用,能显著降低alt、ldh,减少放射所致心肌损伤,并且能增加患者的运动耐

量,提高肿瘤患者的生活质量。

【参考文献】

第4篇：黄芪的作用范文

【摘要】

目的：研究黄芪复方对大鼠主动型Heymann肾炎的治疗作用，并探讨其作用机制。方法：大鼠腹腔注射同种肾脏免疫复合物，复制大鼠主动型Heymann肾炎模型，观察灌胃给予黄芪复方三种剂量1.5、0.75、0.375g浸膏/kg（折合生药4、2、1g/kg），治疗大鼠H基残留冻土层eymann肾炎4周，对Heymann肾炎模型的作用。结果：①能明显降低肾炎大鼠尿蛋白，血清肌酐与尿素氮，能升高血清总蛋白与白蛋白水平；②能明显提高血清SOD活性和降低血浆MDA含量；③能使肾炎大鼠降低的胸腺及脾脏指数以及脾淋巴细胞ConA增殖反应恢复，使IL-1水平明显降低。结论：黄芪复方对大鼠Heymann肾小球肾炎有明显的保护作用，该疗效可能与其抗炎、抗氧化和免疫调节等作用有关。

【关键词】 黄芪复方 大鼠 Heymann肾炎

Effects of Huang-Qi-fu-fang on Heymann nephritis in rats

【Abstract】Objective:In order to study the effects of huang-qi-fu-fang on nephritis in rats and the reasonality of the compound and try to find out the mechanisms of Huang-qi-fu-fang.Methods:The rat models of AHN were induced by intra peritoneal administration of kidney homogenate and Freund's adjuvant.We studied the effects of huang-qi-fu-fang which was given orally at the dosages of 4，2，1g/kg crude drug body weight on Heymann nephritis for 4 weeks in rats.Results:①the levels of proteinuria and blood urea nitrogen and creatinine in all treated groups were remarkedly decreased.②The concentrations of serum cholesterol and triglycerides and plasma，MDA were obviously descreased after treatment ，but the levels of serum total protein and albumin and the activity of SOD were mardedly increased. ③this compound could restore the diminshed indexes of thymus and spleen，proliferative response to splenocyte induced by Con A and enhanced IL-1 production by peritoncal macorophages in HG rats.Conclusion:The protective offects of Huang-qi-fu-fang on Heymann nephritis in rats were associated with its anti-inflammatory，anti-oxidative and immunomodulatory activities.

【Key word】Huang-qi-fu-fang rat Heymann nephritis

1 前言

黄芪复方是以黄芪为主药与另二味中药组成的复方，黄芪被历代视为补气要药[1]。本草纲目记载“可治一切气衰血虚诸证”。现代医学研究表明，黄芪具有降压、利尿、强心、抗炎、镇痛及免疫调节等作用。单独或与其他药配伍用于治疗慢性肾炎，在临床上取得了较为满意的效果。目前医学研究认为免疫学机制、肾血凝障碍及氧自由基代谢失衡等在肾炎的发病机理中具有重要作用[2]。本文采用大鼠主动型Heymann肾小球肾炎模型以及多项指标，观察黄芪复方对实验性肾炎的防治作用，为本方的气血双补、活血促消治疗慢性肾炎的论点提供基础。

2 材料与方法

2.1 动物

Wistar大鼠，体重150～200g，雌雄各半，购自安徽省医研所实验动物中心，合格证:皖医实动准字03号；C57BL6小鼠，3月龄，购自安徽医科大学实验动物中心，合格证：皖医实动准字01号。

2.2 药品及试剂

2.2.1 黄芪复方（浸膏）由合肥恒星药物研究所提供，用0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）制成混悬液供灌胃（ig）给药。

2.2.2 地塞米松（DXM），四川巴中制药厂产品，批号990524，使用前用0.5%CMC-Na配成所需浓度。

2.2.3 卡介苗，中国药品生物制品检验所，批号980012，规格60mg/支。

2.2.4 SOD测定试剂盒，北京北方生物技术研究所产品。

2.2.5 ConA，LPS均为Sigma产品。

2.2.6 [3H]TdR，比放射活性为666TBq.mol－1，中国原子能原研究院产品。

2.2.7 RPMI1640培养粉为Gibco公司产品。

2.2.8 小牛血清，安徽医科大学微生物教研室提供。

2.2.9 牛血清白蛋白（BSA），Sigma公司产品。

2.3 仪器和设备

2.3.1 GL20A型全自动高速冷冻离心机，湖南仪器总厂离心机厂生产。

2.3.2 CX-7型全自动血液生化分析仪，美国Backman公司产品。

2.3.3 LBYN-6＋旋转式血液粘度仪，北京普利生集团公司产品。

2.3.4 Napco-6100型CO2培养箱，美国Precision Scientific公司产品。

2.3.5 FJ2107液体闪烁计数仪，西安262厂生产。

2.4 实验方法

Heymann肾炎模型的建立[3]：取大鼠60只，随机分为6组，即正常对照组、模型组；地塞米松（DXM）组；黄芪复方高、中、低剂量组（4、2、1g.生药/kg）。取卡介苗8支，置灭菌玛瑙钵中，加灭菌液体石蜡16ml，充分捻磨使之完全乳化，制成Freund's完全佐剂（浓度30mg.ml－1）备用。取肾皮质5g制成匀浆与弗氏完全佐剂混合成10ml，加生理盐水20ml，除正常对照组外，每鼠腹腔注射2ml，两周一次，自第4周大鼠蛋白尿明显出现起，灌胃给药，每日一次，连续四周。

2.5 观测指标

2.5.1 每日观察动物的一般情况，每周称体重一次，并以此来调整用药量。

2.5.2 尿蛋白的测定：采用磺柳酸比浊法作24小时尿蛋白定量，实验前测一次，实验开始后第1、2、3、4、6、7周各测一次。

2.5.3 血液生化测定：治疗结束后24小时采血测定甘油三酯（TG）、总胆固醇（TCH）、极低密度脂蛋白（VLDL）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）。采用CX-7型全自动血液生化分析仪进行检测。

2.5.4 血浆丙二醛（MDA）含量的测定[4]：治疗停止后24小时采血，取血浆1ml，加入30%TCA1ml，摇匀后静置5min，加入0.67%TBA2ml，煮沸30min，冰水冷却。离心（2000rpm）10min，上清液于535nm处测吸光度值。

2.5.5 血清SOD活性测定：治疗停止后24小时采血，取血清测定SOD活性，采用放射免疫法，严格按试剂盒说明书操作。

2.5.6 脏器系数及病理组织学检查：实验结束时，取每鼠两侧肾脏、胸腺、脾脏称重。分别按g/100g体重计算各脏器系数（%）。取各组肾标本作HE染色，光镜检查。

2.5.7 大鼠脾淋巴细胞增殖反应：无菌取脾脏，常规制备脾细胞悬液（1×107.ml－1细胞）。在96孔培养板上，每孔加入脾细胞悬液100ul（终浓度为5×106ml－1）、ConA50ul（终浓度3ug.ml－1）或LPS50ul（终浓度6ug.ml－1）置37℃、5%CO2培养箱培养48h，终止前6h，每孔加入[3H]TdR1.4×104Bq，培养结束后收集细胞于69型纤维滤纸上，在液闪仪上测cpm值，结果以3个复孔cpm的均值表示。

2.5.8 IL-1的产生与检测

2.5.8.1 IL-1的产生：以RPMI-1640培养液常规制备大鼠腹腔巨噬细胞悬液（2×106.ml－1），在24孔培养板上，加入腹腔巨噬细胞悬液1ml置37℃、5%CO2培养箱培养2h后，吸弃培养液，以温Hank's液（37℃，含5%小牛血清）轻洗三次，除去非粘附细胞，获单层M￠，每孔分别加入内含LPS的RPMI-1640培养液1ml（终浓度6ug.ml－1）。置37℃、5%CO2培养箱培养6h后，去上清，以温Hank's 液轻洗一次，每孔加入RPMI-1640培养液1ml，置37℃，5%CO2培养箱继续培养42h后，4℃离心（2000rpm，10min），收集上清，即为含IL-1活性的上清液，待测。

2.5.8.2 IL-1的检测：用小鼠胸腺细胞增殖法检测IL-1，取正常C57BL6小鼠，无菌取胸腺，以RPMI-1640培养液制成2×107.ml－1细胞悬液，在96孔培养板上，每孔加入稀释30倍的IL-1待测上清100ul，每一样本设3个复孔，分别加入脾细胞悬液50ulCooA50ul（终浓度3ug.ml－1），置37℃、5%CO2培养箱内培养48小时，终止培养前6h，每孔加20ul[3H]TdR。培养结束后，用多头细胞收集器收集细胞于69型纤维滤纸上，在液闪仪上测定放射性，结果以3个复孔cpm的均值表示。

2.6 数据统计学处理：采用SPSS10.0进行统计，所有数据均用x±s表示。

3 实验结果

3.1 对动物一般状况及体重的影响：与正常对照组比较，模型组动物于造模一周左右出现毛发疏松，无光泽，精神萎靡，体重明显下降。黄芪复方三个剂量组的大鼠的体重均有不同程度的恢复，见表1。表1 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠体重的影响（略）注：与正常组比较，P＜0.05 ；与模型组比较，﹡P＜0.05。

3.2 对大鼠24小时尿蛋白的动态变化的影响：各组试验前24小时尿蛋白含量均＜24mg/24h。正常对照组在试验开始后第1、2、3、4、5、6、7wk尿蛋白与试验前均无显著性差异。模型组于开始建模后第一周末尿蛋白开始增加，其后逐周递增，第6周达峰值，DXM及黄芪复方各剂量组均明显降低，黄芪复方高剂量组的降尿蛋白作用尤为突出，见表2。表2 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠24小时尿蛋白动态变化的影响（略）注：与正常组比较，P＜0.01；与模型组比较﹡P＜0.05；﹡﹡P＜0.01。

3.3 对大鼠血清蛋白质、肾功能和血脂的影响：模型组大鼠血清TP和ALB均明显降低，TCH、TG、VLDL、BUN、Cr均明显升高，黄芪复方高、中剂量组能明显升高TP及ALB，明显降低TCH、TG、VLDL以及明显改善肾功能，使BUN、Cr降低，低剂量组可明显升高TP与降低TCH，对上述其他指标亦有一定改善，提示本药可改善Heymann肾炎大鼠的肾功能，并有降低血脂和升高血清蛋白质的作用，见表3。表3 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠血清蛋白质、肾功能和血脂的影响（略D)注：与正常组比较，P＜0.01；与模型组比较﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01。

3.4 对大鼠血浆MDA含量和血清SOD活性的影响：与正常对照组比较，模型组大鼠血浆MDA含量明显升高，SOD活性明显下降，DXM及黄芪复方各剂量均能提高SOD活性和降低MDA含量，提示本药有明显抗氧化作用，见表4。表4 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠血浆MDA含量与血清SOD活性的影响（略）注：与正常组比较，P＜0.01，与模型组比较﹡P＜0.05，﹡﹡P＜0.01。

3.5 对大鼠免疫功能的影响：与正常对照组比较，模型组大鼠的胸腺及脾脏系数明显降低，大鼠脾淋巴细胞的ConA增殖反应明显降低，腹腔巨噬细胞产生IL-1明显增加，黄芪复方高、中剂量组能使降低的胸腺及脾脏系数恢复，黄芪复方高剂量组能使Heymann肾炎大鼠脾脏淋巴细胞ConA增殖反应恢复，使升高的IL-1水平明显降低。提示本方有明显的机能依赖性的免疫调节作用，见表5、表6。表5 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠免疫器官脏器系数的影响(略)注：与正常组比较，P＜0.05，与模型组比较，﹡P＜0.05。表6 黄芪复方对Heymann肾炎大鼠脾脏淋巴细胞ConA增殖反应和IL-1的影响（略） 10.581±2.102﹡

注：与正常组比较，P＜0.01；与模型组比较，﹡P＜0.01。

3.6 对大鼠肾脏系数及其病理组织学改变的影响：模型组大鼠的肾脏系数明显增加，提示病变肾脏肿胀明显，黄芪复方高、中剂量组能明显降低肾脏系数，见表5。

病理组织学检查表明经HE染色，模型组大鼠的肾小球毛细血管壁明显增厚，部分肾小球系膜细胞和基质轻度增生，经PASM/Masson染色，可见肾小球毛细血管基底膜中心重度增生，肾近曲小管上皮细胞内可见多量脂滴，表明建模成功。黄芪复方中、高剂量组的上述病变均有不同程度的减轻，尤其是高剂量组经HE染色可见肾小球毛细血管壁轻度增厚；PASM/Masson染色，可见肾小球基底膜轻度增厚。提示本方对大鼠Heymann肾炎的肾病理组织学变化有明显的改善作用，见图1～8。

4 讨论

目前，我国的肾小球肾炎仍然是影响人们身体健康的重要原因之一，每年因肾小球肾炎而进入终末期肾衰的患者居各病因之首[5]。治疗肾小球肾炎通常使用糖皮质激素、免疫抑制剂、抗凝等药物，但对不同病理类型的肾炎其疗效尚不能令人满意，而且某些药物的不良反应亦难以避免。故开发治疗慢性肾炎的有效药物，将有广阔市场。

Heymann肾炎模型长期以来一直是用于研究人类膜性肾病的一个经典动物模型。因其发病迅速、病变稳定，可用来观察药物的疗效。制备该动物模型有主动型和被动型Heymann肾炎两种，主动型Heymann肾炎动物模型用自体或同种动物肾匀浆加完全弗氏佐剂给大鼠腹腔注射，两周一次，动物出现大量蛋白尿为其特征。

本研究采用了主动型Heymann肾炎，观察造模成功后给予黄芪复方对模型动物的影响。结果表明：①黄芪复方能明显改善Heymann肾炎模型鼠的肾脏病变，降低模型大鼠的肾脏系数，并明显改善其病理组织学变化，明显降低尿蛋白排泄量；②明显升高血清总蛋白、白蛋白水平；③改善肾功能，使升高的血清肌酐与尿素氮明显降低；④使血清SOD活性升高，MDA含量降低；⑤使对Heymann肾炎大鼠降低的胸腺和脾脏系数，以及脾淋巴细胞ConA增殖反应恢复，使腹腔巨噬细胞过高产生IL-1的水平明显降低。提示该方对Heymann肾炎模型有明显的疗效，其作用机制可能与黄芪复方具备抗氧化作用[6]，减轻氧自由基及脂质过氧化物对肾脏的损害，从而降低肾小球滤过膜通透性，从而减少尿蛋白；抗炎与免疫调节作用[7～9]，影响炎症因子的合成、释放，减轻肾脏的炎症反应；改善机体代谢，促进机体的恢复[10、11]等作用有关。

参考文献

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[9] 王 斌．黄芪复方1号对脾气虚小鼠免疫功能的影响[J]．中成药，1998，20（1）：31．

第5篇：黄芪的作用范文

【关键词】 黄芪注射液；，，基因报告系统；，，雌激素受体；，，HeLa细胞；，，配体结合域

摘要：目的构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统，研究黄芪注射液对雌激素受体（ER）活性的影响。方法 PCR扩增雌激素受体配体结合域，将配体结合域克隆到真核表达质粒 pCMV-BD构建细胞杂交基因报告系统，研究黄芪注射液与雌激素受体的关系；MTT法检测黄芪注射液对细胞活力的影响。结果成功构建含有雌激素受体配体结合域的哺乳动物细胞杂交基因报告系统，黄芪注射液不能提高细胞活性，但对雌激素受体具有激活作用。结论黄芪注射液可能通过雌激素受体发挥疗效，细胞杂交基因报告系统是研究中药作用机理的手段之一。

关键词：黄芪注射液； 基因报告系统； 雌激素受体； HeLa细胞； 配体结合域

Activating Effect of Astragalus Injection on Estrogen Receptor

Abstract:ObjectiveTo establish the Gal4DBD-ER or ERLBD report system to study the effect of Astragalus Injection on ERs.MethodsGene report system was generated by amplifying the ligand binding domain(LBD ) with Pfu polymerase and subcloning the product into the eukaryotic expression vector pCMVBD. This system was employed to study the relationship between Astragalus Injection and ERs. Cell activity were detected by MTT.ResultsGene reporter system using ER-LBD is established. Astragalus Injection can not improve cell activity but can activate ERs activation.ConclusionThe mechanisms of Astragalus Injection may be related to its effect of activating ERs. Gene report system can be used to study the mechanisms of Chinese traditional medicine.

Key words:Astragalus Injection； Gene Report system； Estrogen receptor； HeLa cell； Ligand binding domain

雌激素受体（Estrogen receptor， ER）是一个核转录因子， 属甾体激素受体家族成员，调控基因表达。ER在1967 年被首次发现［1］， 20 多年来， 它作为内分泌治疗的预测因子被广泛应用。1996 年 ERα首次从大鼠中克隆［2］，其后人和小鼠也相继发现 ERβ的表达［3，4］。ERα和 ERβ的结构、功能存在差异， 在乳腺癌的发生发展中发挥不同作用［5］ 。因而研究药物对雌激素受体的作用，将有利于我们认识药物的作用机理。黄芪主要有补气的作用，在临床上主要治疗以气虚为主证的疾病，在处方中多以君药出现，具有补中益气、补气升阳、益卫固表的作用。为了进一步探讨其作用机理，本研究采用哺乳动物细胞杂交技术研究黄芪注射液对雌激素受体配体结合域的作用，探讨黄芪对雌激素受体的部分作用。

1 材料与方法

1.1 材料Hela 细胞由中国科学院广州生物医药与健康研究院裴端卿研究员赠送；DMEM无血清、无酚红培养基、胎牛血清、青霉素和链霉素购自 Hyclone公司；Lipofactemine2000购自 Invitrogen公司；SteadyGlo荧光检测试剂盒购自 Promega公司；细胞培养板均购自 Corning Costar公司；MTT购自 Molecular公司； 黄芪注射液(上海禾丰药业)。

1.2 PCR 扩增 hERa-LBDcDNA

根据 gene bank报道的 ERs序列（M12674和NM001437），设计 hERa-LBD和 hERb-LBD cDNA 序列的引物，在5’端引入一个 BamH Ⅰ的酶切位点，在 hERa-LBD的3’端引入一个 Eco R Ⅰ的酶切位点， 在 hERb-LBD的3’端引入一个 Hind Ⅲ的酶切位点，引物序列如下。上游5’GCGGATCCGGAGGGAGAATGTTGAAAC3’下游　5’GCGAATTCTCAGACTGTGGCAGGGAAAC3’；Human ERβLBD引物序列：上游5’GCGGATCCGGCAAGGCCAAGAGAAGTG3’下游5’　GCAAGCTTTCACTGAGACTGTGGGTTC3’。以 cmxp-ERa和 cmxp-ERb 全长 cDNA 质粒为模板进行 PCR 反应。反应程序为：94 ℃，5 min ；94 ℃，1 min ；55 ℃，1 min ；72 ℃，2 min ； 72 ℃，7 min循环20次；PCR 产物进行1 % 琼脂糖凝胶电泳，用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化并回收所需 DNA 片段，纯化的 DNA 溶解在50 μl 的 TE 缓冲液中。

1.3 哺乳动物细胞表达质粒 pCMV-hER LBD的构建

用 BamH Ⅰ和 EcoRI双酶切 PCR 产物，琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收纯化 DNA ，加入经相同双酶切处理、凝胶纯化回收的 pCMV-BD载体，经过连接反应，构建成 pCMV-Gal4 hERaLBD 和 pCMV-Gal4 hERβLBD质粒。反应体系为：pCMV-BD 2μl (50 ng ) ， hERaLBD或 hERβLBD 6 μl (100 ng) ，10 ×连接缓冲液1 μl ，T4 DNA 连接酶1 μl (3 U) ；16℃过夜连接； 将1 μl 连接产物转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞， 卡那霉素抗性筛选阳性克隆。小量提取质粒，双酶切消化，1 % 琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性重组质粒并测定序列。

1.4 细胞培养胎牛血清采用 Charcoal-strip处理，人子宫癌细胞系 Hela培养在含10% Charcoal-Strip胎牛血清及抗生素（青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml）的无酚红 DMEM 培养基中，37℃，5% CO2 的 二氧化碳培养箱湿润培养。

1.5

MTT检测黄芪注射液对 Hela细胞增殖能力的影响细胞以104个/孔接种至96孔板，分成4组，每组12孔，利用含有10%胎牛血清的 DMEM培养液培养24 h之后，向培养液中分别加入不同浓度(0.001%，0.01%，0.1%)的黄芪注射液，继续培养24 h。用噻唑蓝 (MTT)比色法测定细胞的增殖能力。

1.6 瞬时转染将处于对数生长期的细胞以104/孔传代于96孔细胞培养板中，培养过夜，长到80%～90%满时用于转染。用优化培养液MEM稀释 lipoFectamine 2000 试剂（ 0.5 μl/100 μl ）和质粒 DNA。优化培养液稀释后质粒浓度分别为：pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERβLBD，25 ng/孔; pFR-Luci，50 ng/孔; pFRTlaczeo plasmid， 50 ng/孔。lipoFectamine 2000稀释5 min后，将稀释后的脂质体和质粒 DNA 等体积混合，于室温放置20 min。迅速将细胞换液成含有10％Charcoal-Strip胎牛血清的无酚红 DMEM 100 μl。再加入脂质体/ DNA 混合物，将枪头深入液面下，逐滴加入，并轻轻摇晃混匀。

1.7 转染细胞的药物处理及检测将黄芪注射液溶于 DMSO中，在细胞瞬时转染质粒6 h后，分别加入不同浓度的黄芪注射液，并以 DMSO为对照。放于5％CO2培养箱中继续培养24 h，之后根据 Promega公司 Steady-Glo kit说明书测定细胞的荧光值，并以 β-Gal作为内标进行校正，测定 β-Gal活性。

1.8 数据处理 用 SPSS10.0统计软件包中的方差分析进行统计学处理，所有数据均用 ±s表示，所有实验独立重复3次或3次以上。

2 结果

2.1 hERa-LBD和 hERβ-LBD的 PCR扩增和序列测定扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，在1 024 bp和883 bp处有特异性扩增条带，片段大小与预期值相符。结果见图1。序列分析结果显示得到的克隆基因序列与文献报道一致。

M：Marker DL2000 A和B：ERa LBD C和D：ERβ LBD

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果（略）

2.2 pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERβLBD的酶切分析重组质粒 pCMV-Gal4 hERaLBD和 pCMV-Gal4 hERbLBD经限制酶 BamH Ⅰ和Eco RI（Hind III）双酶切后，1.5%琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段与预期值相符。结果见图2。并将质粒送测序公司测序，测序结果分别与报道的 hERaLBD和 hERβLBD序列一致。

M： DL2000 Marker ERa：pCMV-Gal4 hERaLBD酶切结果　ERb：pCMV-Gal4 hERβLBD酶切结果

图2 pCMV-Gal4 hERaLBD和pCMV-Gal4 hERβLBD经双酶切之后琼脂糖电泳图（略）

2.3 黄芪注射液对细胞增殖能力的影响HeLa细胞在高浓度（0.001%~0.1%）黄芪注射液作用24 h后，黄芪注射液不能提高细胞活力，低、高剂量与对照组相比无统计学意义（P＞0.05）的差异。结果见图3。

2.4 黄芪注射液对雌激素受体配体结合域的激活作用 通过 Gal4DBD-ERα和 ERβ LBD 细胞杂交报告系统，本研究发现，黄芪注射液可以在高剂量（0.1%）显著地提高ERα的活性，但是小于0.01%的情况下无激活ERα活性的作用，高、低剂量的黄芪注射液对ERβ均有明显的激活的作用。结果见图 4。

图3 MTT法检测不同剂量黄芪注射液对Hela细胞增殖能力的影响（略）

a不同剂量黄芪注射液对 ERα的激活作用

b不同剂量黄芪注射液对 ERβ的激活作用

图4 黄芪注射液对 ERs活性的影响（略）

3 讨论

我国中药具有数千年的历史，而且安全性高、副作用低，因此具有很好的发展前景，但对中医药有效成分的分析与研究还是处在早期阶段，使得我国中药的发展受到很大的限制，需要建立一个国际认可的、现代化的中药机理研究体系，来进行中药作用机理的研究。核受体家族基础研究的进展促进了新的受体病的发现， 扩大了对激素抵抗机制的认识， 为药物的设计和疾病的治疗提供了新思路［6］。核受体一般有6个功能区，其中与配体发生相互作用的是E/F区，核受体的配体结合域便有此区编码。雌激素受体是核受体中的一种，同样具有核受体的特征，具有与配体结合的配体结合域。因而可以通过细胞杂交基因报告系统，研究中药有效成分与雌激素配体结合域的相互作用，确定中药作为 ERα与 ERβ选择性配体的功能，分析中药作为促效或拮抗药的机理。所以通过克隆雌激素受体配体结合域构建细胞杂交基因报告系统对研究中药与雌激素受体的关系具有重要的作用。黄芪为豆科植物蒙古黄芪的根， 主要化学成分为蕊异黄酮、3-羟基-9， 10-二甲氧基紫檀烷、黄芪皂苷Ⅰ，Ⅴ，Ⅲ 等，部分成分属植物雌激素类。中医认为黄芪注射液是具有益气养元、扶正祛邪、养心通脉、健脾利湿之功， 主要用于治疗心气虚损、血脉痰阻之病毒性心肌炎、心功能不全及脾虚湿困之肝病。近年临床上还拓展应用于肝硬化、脑血管疾病、肾脏疾病，对其抗肿瘤机制也进行了大量研究。已知机理之一是黄芪通过红细胞C3b 受体活性增加， 免疫粘附功能增强， 自然杀伤(NK) 细胞具有广谱抗肿瘤活性，从而刺激体内免疫细胞提高机体抗肿瘤作用［7，8］。在本研究中，实验证明黄芪注射液并不能显著地使 Hela细胞增殖。利用高保真Taq酶克隆到两种雌激素受体亚型的配体结合域，并将其成功克隆到含有 Gal4 DNA 结合域的真核表达质粒中，利用细胞杂交基因报告系统研究了黄芪注射液对雌激素受体的作用。发现黄芪注射液在高、低剂量下均可显著提高雌激素受体ERβ的活性，只有高剂量下才可激活雌激素受体ERα的活性。由此推测，黄芪注射液可能是通过，至少部分通过雌激素受体发挥其促进细胞活力增加，并在治疗各种疾病中发挥疗效。文献报道蕊异黄酮、黄芪皂苷是生物活性较弱的雌激素， 可以与人体ER结合形成ER2复合物， 通过核内转录通路， 即在细胞核内利用DNA反应元件的基因转录， 翻译成效应蛋白， 起到促进细胞增殖的生物学效应， 取代完整的雌激素反应［9］。黄芪因浓度不同分别起雌激素和抗雌激素的双相作用。低浓度(1×10-5～1×10-8)mol/L时表现出雌激素作用， 而高浓度(1×10-4～ 1×10-5) mol/L时则表现出抗雌激素作用。其类似雌激素作用是由ER介导的， 标志是刺激肽合成酶2 (PS2)mRNA 的表达; 而抗雌激素作用并不由 ER介导， 在 ER阴性细胞中仍然表现出抗增生作用［10］。本研究首先成功构建了含有雌激素受体配体结合域的细胞杂交基因报告系统，并成功研究了黄芪注射液与雌激素受体的关系，为将来中药作用机理的研究提供了一个新的思路和技术平台。

参考文献

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第6篇：黄芪的作用范文

摘 要:目的:探讨黄芪甲苷(AS-IV)对高糖诱导的足细胞凋亡的作用及其机制。方法:条件性永生的小鼠足细胞分为正常糖组(NG)、高糖组(HG)、甘露醇高渗对照组(MA)及HG+不同剂量(10、50、100 μg/mL)黄芪甲苷干预组(AS-IV)。流式细胞仪及Hoechst染色检测细胞凋亡;荧光探针CM-H2-DCF-DA标记细胞检测活性氧(ROS)水平;Western印迹检测足细胞p38-MAPK活性。结果:高糖促进足细胞ROS的产生并引起足细胞凋亡,AS-IV明显抑制高糖诱导的ROS的产生及足细胞凋亡,且呈剂量依赖关系。此外,高糖激活p38-MAPK信号通路,AS-IV呈剂量依赖性抑制p38-MAPK活性。结论: AS-IV能减少高糖所致的足细胞凋亡,其机制可能与AS-IV抗氧化及抑制p38-MAPK活化密切相关。

关键词:黄芪甲苷;高糖;足细胞;凋亡;活性氧;p38-MAPK

中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0822-03

Astragaloside IV Inhibited High Glucose-Induced Podocyte Apoptosis and Its Mechanism

GUI Dingkun1,CHEN Jianguo1,CHEN Yifang1,HUANG Jianhua2

(1.Department of Nephrology, Zhejiang Hospital, Hangzhou 310013,Zhejiang,China;

2.Institute of Integrated Chinese and Western Medicine, Huashan Hospital, Fudan University, Shanghai 200040, China)

Abstract:Objective: To study the effects of Astragaloside IV(AS-IV) on glucose-induced apoptosis of podocytes and explore its possible mechanism. Methods: Conditionally immortalized mouse podocytes were divided into nomal glucose group (NG) , high glucose group (HG), mannitol group (MA) and HG with 10, 50 and 100 μg/mL of AS-IV for 24h.Flow cytometry and Hoechst staning were used for the quantification of apoptotic podocytes. Reactive oxygen species (ROS) generation was measured with the fluoroprobe carboxymethyl-H2-dichlorofluorescein diacetate. The activation of p38-MAPK was determined by Western blot. Results: HG induced ROS generation and apoptosis of podocytes. AS-IV inhibited HG-induced ROS generation and apoptosis of podocytes in a dose-dependent manner. Moreover, HG caused p38-MAPK activation in podocytes, while AS-IV dose-dependently inhibited p38-MAPK activation.Conclusion: Astragaloside prevented high glucose-induced podocyte apoptosis and this effect may be involved in inhibition of ROS and p38-MAPK.

Key words:Astragaloside IV; high glucose; podocyte; apoptosis; ROS;p38-MAPK

收稿日期:2009-11-11

基金项目:浙江省老年医学重点学科群计划项目(2008ZJ006)

作者简介:桂定坤(1978-),男,湖北孝感人,主治医师,博士,从事肾脏病基础与临床研究。

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见且最严重的并发症之一,若能早期干预治疗DN,仍有希望阻止或延缓病情进展,然而,迄今尚无满意的防治早期DN的方法。近年来研究证实肾小球足细胞凋亡是早期DN进展的关键[1],因此,抑制足细胞凋亡将为防治早期DN带来新的曙光。DN属祖国医学“消渴”、“水肿”、“虚劳”等证范畴,关键病机为气阴两虚。黄芪益气健脾、利水消肿,是临床治疗DN的常用中药,黄芪甲苷(Astragaloside IV,AS-IV)是黄芪的主要活性成分之一,笔者前期研究发现AS-IV能改善高糖刺激下的足细胞黏附,从而保护足细胞[2],本研究进一步探讨AS-IV对高糖诱导的足细胞凋亡的作用及其机制。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器黄芪甲苷(成都思科华生物技术有限公司),RPMI1640培养液、胎牛血清(美国Gibco公司),Hoechst-33342、小鼠γ-干扰素(美国Sigma), Trizol试剂、荧光探针CM-H2-DCF-DA(美国Invitrogen),p38、磷酸化p38抗体(美国Santa Cruz), ApoAlert Caspase 3荧光检测试剂盒(美国BD Bioscience), AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒 (上海晶美生物技术有限公司),荧光显微镜(日本Olympas),激光共聚焦显微镜、流式细胞仪(美国BIO RAD)。

1.2足细胞培养条件性永生的小鼠足细胞由英国Luigi Gnudi 教授 (King's College London School of Medicine, London, UK) 馈赠,按原始文献方法[3]培养,培养瓶预先经01mg/mL胶原I在37℃处理1h,细胞生长在含10U/mL γ-干扰素,10%胎牛血清,100U/mL青链霉素,100μg/mL链霉素的RPMI1640培养液中,在5%CO2、33℃培养孵箱传代培养。然后转入37℃、5%CO2培养孵箱分化14天后进行实验。

1.3细胞处理及分组生长状态良好的足细胞种植于经胶原I处理的培养板中,当细胞生长至60%～70%时,换1%胎牛血清培养液培养24h同步化, 然后分为:①正常糖对照组(NG):D-葡萄糖5 mmol /L;②高渗对照组(MA):甘露醇25mmol /L+D-葡萄糖5 mmol /L;③高糖刺激组(HG):D-葡萄糖30 mmol /L;④高糖刺激+AS-IV干预组:不同剂量(10、50、100μg/mL)AS-IV干预24h。

1.4细胞凋亡检测 ① 流式细胞仪检测足细胞凋亡率:上述已分化足细胞经同步化处理后,根据不同实验分组处理细胞,然后用预冷磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,细胞刀刮下重悬于1×结合缓冲液中,调整待测细胞浓度为1×106个/mL,取100μL细胞悬液加入反应管中,然后分别加入5μL AnnexinV-FITC和5μL碘化丙啶(PI),轻轻混匀,避光室温反应15min,加入400μL 1×结合缓冲液,筛网过滤后用流式细胞仪检测,计算凋亡率。

② Hoechst-33342染色检足细胞凋亡率:上述不同实验组细胞以甲醇、冰乙酸混合液(体积比为3∶1)固定10min,用PBS冲洗两次,加入终浓度为5μg/mL的Hoechst-33342,避光室温孵育30 min,30%缓冲甘油封片。然后在激光扫描共聚焦显微镜下观察,各组随机选取不重叠10个视野计数细胞总数和凋亡细胞,计数200个细胞,计算凋亡细胞占总细胞数的百分比(凋亡率),重复实验3次。

1.5足细胞ROS检测用ROS特异性荧光探针CM-H2-DCF-DA标记细胞ROS水平, 将上述各实验组细胞放入含10μmol/L CM-H2-DCF-DA的PBS中37℃孵化45 min,然后用PBS冲洗并收集细胞,用激光扫描共聚焦显微镜检测ROS水平。

1.6Western印迹分析足细胞p38-MAPK活性 收集上述各实验组细胞以冷PBS洗涤两次后分别裂解细胞,4℃ 15 000r/min离心10 min后留取裂解液上清,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。以12 %SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离,电泳完毕后将凝胶上的蛋白电转移至硝酸纤维素膜上。室温下以5%脱脂奶粉封闭, 用抗磷酸化p38MAPK抗体4℃孵育过夜, 然后再与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1h, DAB显色。用ECL化学发光剂处理, 胶片曝光, 扫描并定量分析胶片条带的光密度, 重复3次独立实验。

1.7统计学方法计量数据采用±s表示,组间比较采用单因素方差分析,用SPSS 11.0 统计软件分析。P

2结 果

2.1 黄芪甲苷(AS-IV)对高糖诱导的足细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测到高糖(HG)刺激24h后足细胞凋亡显著增加(P

注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组

与NG组相比,*P

图1 流式细胞仪(A)及Hoechst-33342染色(B)检测

不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞凋亡的影响

2.2AS-IV对足细胞ROS水平的影响 与NG组相比,HG组足细胞内ROS水平显著增加(P005), 而AS-IV能呈剂量依赖性减少足细胞ROS水平,在10μg/mL剂量时发挥作用,在100μg/mL剂量时达高峰(P

注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组。

与NG组相比,*P

图2 不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞ROS水平的影响

2.3AS-IV对足细胞p38-MAPK活性的影响 与NG组相比,HG刺激显著激活p38-MAPK信号通路(P0.05)。而AS-IV能显著抑制高糖诱导的足细胞p38-MAPK活化,其作用呈明显剂量依赖关系,在100μg/mL剂量时作用最显著(P

注:NG:正常糖对照组; MA:高渗对照组; HG:高糖刺激组。

图3 不同剂量黄芪甲苷(AS-IV)对足细胞

p38-MAPK活化的影响

3讨论

DN属中医“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“虚劳”等范畴。病位在肝、脾、肾, 基本病机为气阴两虚,并兼夹瘀血、水湿、痰浊等标证。本虚标实、虚实夹杂的病机特点和复杂的病机演化规律决定了DN中医证型的多样化。研究报道[4]认为DN是在“消渴”气阴两虚的基础上发展起来的,气阴虚损、血瘀阻络贯穿本病始终。黄芪有补气升阳,固表止汗,利尿消肿等功效,一直作为治疗DN的常用药物在临床中广泛使用,黄芪甲苷(AS-IV)是黄芪的有效药理成分之一,本研究首次发现AS-IV能明显抑制高糖所致的足细胞凋亡,将为防治早期DN开辟一条新途径。

大量研究表明DN早期就可出现足细胞凋亡,继而加重疾病进展,最近动物实验证实1型及2型DN足细胞凋亡均显著增加[5],且足细胞凋亡比足细胞脱落剥离、微量白蛋白尿及细胞外基质增生发生更早,提示足细胞凋亡是早期DN进展的新机制[1]。笔者采用流式细胞仪及Hoechst染色检测细胞凋亡,均发现黄芪甲苷(AS-IV)能呈剂量依赖性抑制高糖诱导的足细胞凋亡,其中100μg/mL抑制作用最明显,提示AS-IV对高糖诱导的足细胞凋亡具有明确的抑制作用。

氧化应激是引起早期DN进展的重要机制,早期DN产生的氧化应激以形成活性氧(ROS)为特征,现已证实ROS是引起足细胞凋亡的重要因素[1],高糖能直接促进足细胞ROS的产生[6],并通过p38-MAPK信号通路诱导足细胞凋亡[1]。AS-IV具有广泛的药理作用,抗氧化是AS-IV的重要研究领域之一,体内和体外实验均已证实AS-IV有明确抗氧化作用,从而减轻心肌缺血损伤[7]。本研究发现AS-IV呈剂量依赖性抑制高糖诱导的足细胞凋亡及足细胞ROS的产生,提示AS-IV可能通过抗氧化作用抑制足细胞凋亡。

丝裂原激活的蛋白激酶( mitogen active protein kinase, MAPK)信号通路在早期DN足细胞凋亡中的作用越来越受到人们的关注。MAPK是调控细胞生长与凋亡过程的重要信号途径, 包括p38-MAPK、c-Jun-N末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)等主要亚型。细胞外刺激经过激酶级联反应将信号传导至胞核而调控细胞生长和凋亡,在细胞对生长因子和环境应激的反应过程中,MAPK信号通路起关键作用[8],其中p38在细胞凋亡、细胞因子产生、转录调节和细胞骨架重组中起至关重要的作用, p38激活可引起转录、蛋白合成、细胞表面受体表达和细胞骨架结构方面的过度变化,最终导致细胞凋亡[9]。现已证实p38-MAPK信号通路异常激活是导致早期DN足细胞凋亡的关键环节[1]。笔者发现高糖能显著激活p38-MAPK信号通路,而AS-IV能抑制高糖诱导的足细胞p38-MAPK活化,其作用呈明显剂量依赖关系。ROS与MAPK激活之间的关键联系可能与氧化应激通过凋亡信号调节酶-1(apoptosis signalregulatingkinase 1) 激活p38-MAPK有关[10],因此,笔者认为AS-IV缓解高糖诱导的足细胞凋亡的机制与其减少足细胞ROS水平及抑制p38-MAPK的活化密切相关。

综上所述,笔者研究表明中药黄芪的主要药理成分AS-IV能显著缓解高糖所致的足细胞凋亡,其机制可能与AS-IV抗氧化及抑制p38-MAPK活化密切相关,因此,AS-IV可能成为防治早期DN的潜在新型中药单体,值得进一步研究和开发。

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第7篇：黄芪的作用范文

【关键词】 黄芪多糖；胃癌细胞株SGC-7901；MTT

胃癌是消化道常见的肿瘤，是危害人类健康的主要疾病，居癌症死亡原因的前5位。顺铂(cisplatin,CDDP)是临床上治疗肿瘤的基础化疗药物，对肿瘤有较肯定的疗效,但毒副作用较大。黄芪是传统扶正固本的中药，黄芪多糖（astragalus polysaccharides，APS）是从中提取的具有较强的生物活性的大分子化合物,研究显示黄芪多糖具有增强免疫调节和抗肿瘤作用。本实验以人胃癌细胞株SGC-7901为试验对象研究黄芪多糖对肿瘤细胞的增殖的抑制作用,为临床肿瘤中药治疗用药开发和应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 细胞株 人胃癌细胞株SGC-7901 (上海细胞资源中心)，培养于含10%新生胎牛血清、0.1%青霉素、链霉素的RPMI1640完全培养液中,37℃恒温、5%CO2、饱和湿度培养箱孵育，每1～2 d更换1次培养液，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2 主要试剂 RPMI1640培养基( Gibco公司)；新生胎牛血清( Fetal Bovin serum,FBS，兰州民海生物工程有限公司)；顺铂（山东齐鲁制药厂）；胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO) 、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(均为Sigma公司产品)；黄芪多糖(西安鸿生生物技术有限公司产品)。

1.3 试验仪器 超净工作台(上海博迅实业有限公司)；CO2 培养箱(日本三洋工业株式会社)；酶标自动分析仪BIO-RAD550型(美国)；台式离心机(Eppendorf公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组 设空白对照组(不加细胞而只加培养基)、阴性对照组（加二甲基亚砜 2‰DMSO）、顺铂用药组（每孔加顺铂2 μg/mL)、黄芪多糖用药组（每孔加入25 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml的黄芪多糖，用2‰DMSO溶解)。孵育时间为12、24、48 h。

1.4.2 MTT法测细胞增值选择对数生长期胃癌SGC-7901细胞，用含10%新生牛血清的RPMI1640培养液稀释至一定浓度，调整细胞数为5×103 个/mL，接种于96 孔培养板,每孔200 μl,37℃恒温、5%CO2、饱和湿度培养24 h后,分别加入含有不同浓度黄芪多糖及顺铂溶液，每孔加药量为100 μl。培养12、24、48 h 后,每孔加入5 mg/mlMTT20 μl,继续培养4 h后,吸去上清液,加入150 μl的DMSO液,在平板摇床上振荡10 min,用酶标仪在波长490 nm处测每孔吸光度(A),根据A值判定药物对细胞增殖的影响。

1.4.3 统计学方法 数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用SPSS10.0软件做单因素方差分析,（P

2 结果

黄芪多糖对人胃癌SGC-7901细胞增殖的抑制作用（见表1）

黄芪多糖对人胃癌细胞株SGC-7901增殖作用影响（x±s）

实验结果显示,2‰DMSO对胃癌细胞株SGC-7901无细胞毒作用,与空白对照组相比无统计学意义( P>0.05)。黄芪多糖对胃癌SGC-7901细胞株的增殖抑制有量效关系,并呈时间依赖性，与DMSO组相比,不同浓度黄芪多糖作用于胃癌SGC-7901细胞株12 h对细胞株的增殖没有明显的抑制作用；作用24 h对人胃癌SGC-7901细胞的增殖有抑制作用(P

3 讨论

胃癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率在世界范围内呈上升趋势。化疗作为治疗肺癌的手段之一在胃癌的综合治疗中占据着重要的地位。顺铂为胃癌化疗中常用的药物,但其对正常组织的具有毒性作用，在杀伤癌细胞的同时,对某些正常组织也有一定的损害,故寻找高效低毒的肿瘤化疗药物及增敏剂以增强顺铂的化疗效果是医学工作者面临的重要课题。

黄芪多糖是从中药黄芪中提取的有效单体。大量研究显示，黄芪多糖通过调节免疫系统发挥抗肿瘤作用：通过调节细胞免疫功能来增强IL-2/LAK抗肿瘤作用；通过促进抗癌素的分泌、IL-2R受体的表达、LAK前体细胞的增生而达到抗肿瘤作用［1］。周淑英等［2］实验结果表明：黄芪多糖对小鼠移植性肿瘤、肝癌（Heps）均有明显的抑制作用；与IL-2配伍应用可以明显提高LAK细胞对靶细胞细胞的杀伤率，提示黄芪多糖抗肿瘤效应可能主要与黄芪多糖具有增加机体免疫功能的作用有关。但也有实验证明黄芪多糖抗肿瘤作用是通过诱发细胞凋亡实现的［3］。黄芪多糖对肝癌BEL-7404细胞有杀伤作用，与顺铂联合使用具有协同抗肿瘤作用［4］；对大鼠实验性肝癌具有抑制作用［5］。

第8篇：黄芪的作用范文

关键词：神经干细胞；黄芪甲苷；增殖

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.05.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）05-0042-03

学基础[1]。近来，很多研究表明，NSCs和神经前体细胞的替代移植疗法对治疗脑和脊髓损伤、帕金森病及周围神经损伤等神经组织疾病具有强大的应用价值[2-5]。

中医药疗法在神经元保护和修复方面显示了一定作用。现代研究发现，黄芪不同提取物具有抗氧化、抗炎、扩张血管、改善脑血流等作用[6]。黄芪甲苷是从黄芪总苷中分离得到的一类单体化合物，是黄芪的主要活性成分之一。本实验采用黄芪甲苷对大鼠胚胎干细胞增殖作用进行研究，为中枢神经系统疾病和损伤的修复提供实验基础和临床应用依据。

1 实验材料

1.1 培养基、试剂与药物

HBSS液（无钙离子和镁离子，LONZA，USA）；DMEM/F12（1∶1）培养液（Hyclone Laboratories，USA）；B27添加物（GIBCO， USA）；重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，ProSpec-Tany， Isreal）；人表皮生长因子（EGF，Strathmann Biotec， Germany）；青霉素-链霉素溶液（双抗，100×，Sigma）；Nestin小鼠单克隆抗体（Santa Cruz，USA）；BrdU小鼠单克隆抗体（Sigma， Germany）；ABC试剂盒（Vector Laboratories，USA）；DAB试剂盒（Vector Laboratories，USA）；黄芪甲苷、丹酚酸B（天津中一制药）。

1.2 仪器

MCO-5M 型O2/CO2孵箱（Sanyo，Japan）；CK30倒置显微镜、IX70荧光倒置显微镜（Olympus，Japan）。

2 实验方法

2.1 神经干细胞原代培养及传代

孕16 d SD大鼠，脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒，无菌条件下打开腹腔，取出串珠状子宫，浸泡于冷HBSS液中，取出胚胎，置于另一冷HBSS液中，小心剥离外层骨膜，取出大脑皮质并去除软脑膜，冷HBSS液漂洗2次，转移至离心管加入一定量冷HBSS，吹打呈均匀悬浊状，过200目（70 ?m）筛网，1000 r/min离心8 min，弃上清，以全培基（含2%B27，20 ?g/L bFGF，20 ?g/L EGF的DMEM/F12，1%双抗的HBSS液）重悬，约3～4个胎鼠/75 cm2的密度种入培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养。每2～3 d行半量换液1次。约5～9 d传代1次。传代后以1×105个/mL的密度全培基重悬种入培养瓶或培养板。

2.2 神经干细胞亚代克隆Nestin鉴定

将经过多次连续传代所形成的亚代克隆细胞球接种于预先置有50 ?g/mL多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2 h。经4%多聚甲醛固定后，0.3%Triton X-100室温通透，正常血清封闭，滴加Nestin小鼠单克隆抗体，行ABC法免疫组织化学染色。染色后，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。

2.3 神经干细胞BrdU标记及增殖鉴定

将NSCs亚代克隆细胞球制成1×105/mL的细胞悬液，培养3 d后掺入BrdU（10 ?mol/L），24 h后吹散NSCs克隆球，收集细胞接种于预先置有50 ?g/mL-多聚赖氨酸涂层盖玻片的6孔板中，贴壁生长2 h。经4%多聚甲醛固定后，用盐酸变性硼酸中和，然后以正常血清封闭。滴加单克隆Anti-BrdU抗体（1∶800），4 ℃过夜，行ABC法免疫组织化学染色，并以苏木素复染，以50%甘油封片，在普通光学显微镜下观察照相。

2.4 有限稀释法检测黄芪甲苷对神经干细胞的增殖作用

将NSCs克隆球制成1×105个/mL的单细胞悬液，将该细胞悬液稀释240倍，分别加入0.035 ?mol/L丹酚酸B和不同剂量的黄芪甲苷（6、0.6、0.06 ?mol/L），种入24孔板。共设5组（对照组、丹酚酸B组及黄芪甲苷高、中、低剂量组），每组4孔。常规培养4 d后对神经球进行计数（包含细胞≥5）。

3 统计学方法

采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据以―x±s表示，采用方差分析。P

4 结果

4.1 神经干细胞培养及增殖鉴定

对传代NSCs进行Nestin染色，细胞胞浆呈棕黄色，为阳性（细胞阴性对照未黄染），表明本实验所培养细胞为NSCs，见图1。对传代NSCs进行BrdU标记后染色，与BrdU阴性对照比较，NSCs细胞核被黄染，表明经传代后NSCs依然具有体外分裂增殖能力，见图2。

4.2 不同剂量黄芪甲苷对神经干细胞增殖作用的影响

第1次实验结果显示，与对照组比较，黄芪甲苷高、中、低剂量组神经球生成数目均显著增加（P

5 讨论

NSCs源于胚胎干细胞和成年干细胞，具有自我更新、多潜能分化、低免疫原性，以及具有迁移功能等生物学特征。正常情况下NSCs通常处于静息状态，仅表现较低的再生能力，在一定的病理刺激下被激活。在神经退行性病变或中枢神经系统受到损伤的情况下，病变部位潜在的内源性干细胞可被激活，进行增殖、分化并取代死亡的神经元或胶质细胞[7]。利用NSCs治疗神经退行性病变以及修复中枢神经系统损伤存在巨大潜力。目前对NSCs的研究，一是在体外分离培养NSCs，并移植入受损的中枢神经系统内[8]；二是在体内诱导内源性NSCs的增殖和分化而获得自我修复[9-10]。由于具体的移植细胞的数量以及最佳的移植时间窗仍没有统一的标准，同时由于伦理学等因素的影响而使供体来源受限，因此寻找药物，尤其是天然植物药对内源性NSCs的增殖、分化的影响，将有巨大的价值。

Reynolds等[11-12]研究发现，可以通过NSCs形成神经球的能力来反映NSCs的自我更新能力。并且，对于神经球的培养技术已经被广泛应用，成为衡量NSCs自我更新能力的标准方法。本研究以无血清的培养基观察黄芪甲苷对神经球形成的影响。在添加EGF和bFGF的无血清培养基中，分离得到的大鼠胚胎NSCs能够增殖形成神经球。随着培养时间的延长，在含有不同浓度黄芪甲苷的药物培养基中，神经球的增殖水平有所提高。黄芪甲苷在0.06～6 ?mol/L的剂量范围内，培养板中神经球的数目显著增加。说明黄芪甲苷能够显著提高NSCs的增殖活性，并且有望在更低的剂量范围内表现出促进NSCs增殖的作用。

黄芪是常见的补气中药，有效成分主要有皂苷类、黄酮类及多糖等。曲氏等[13]研究发现，黄芪注射液使大鼠组织神经细胞的Bax蛋白表达减少，Bcl-2蛋白表达增强，抑制脑缺血再灌注损伤，发挥脑保护作用。李氏等[14]研究表明，黄芪总苷和黄芪甲苷对氢化可地松诱导老前期大鼠衰老具有延缓作用。本研究结果表明，黄芪甲苷具有明显的促进NSCs增殖作用。今后将继续对黄芪甲苷对大鼠胚胎NSCs增殖作用机制进行深入探讨和研究，为开发具有神经保护作用的药物提供依据。

参考文献：

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[13] 曲友直，赵燕玲，秦怀洲，等.黄芪注射液对脑缺血再灌注后的神经细胞凋亡及相关基因表达的影响[J].神经疾病及精神卫生，2007，7（1）：13-15.

第9篇：黄芪的作用范文

关键词：黄芪总皂苷；三七总皂苷；脑缺血再灌注；脑水肿；SOD活力；CAT活力；MDA

中图分类号：R743；R-33

文献标识码：A文章编号：

1673-7717（2008）11-2486-03

Effect of Astragalus and Pnanx Notoginsong on Cerebral Edema and

Lipid Peroxidation of Cerebral IIschemia Reperfusion of Animols

REN Zhouxin1, LI Li2, LI Jun2, LUO Yongming3（

1.Henan College of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450008，Henan,China;

2. Henan Institute of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou450004，Henan,China;

3. Jiangxi College of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330004，Jiangxi,China

）

Abstract：Objective: To investigate the effect of total saponins of Astragalus(TSA) and total saponins of Pnanx notoginseng(PNS) on cerebral edema and lipid peroxidation in cerebral ischemia reperfusion of animals. Methods:Two common carotid arteries of rats or mice were ligated to make the model of cerebral ischemia reperfusion.Then drugs were given by vein.Many indexes were detected, including of water content of cerebrum, content of EB and MDA, activity of SOD,CAT in cerebral tissue.Results:Compared with vehicle group, CAT and SOD activities were increased significantly and MDA content, water content of cerebrum,content of EB were decreased significantly in TSA and PNS group(P

Key words：Astragalus;Pnanx notoginseng；cerebral ischemia reperfusion；lipid peroxidation；SOD activity；CAT activity；MDA

前期的研究发现：黄芪总皂苷合三七总皂苷配伍对缺血再灌注脑组织损伤具有协同的抑制作用，并找到了优化配伍剂量[1]。本部分实验在多种脑缺血再灌注损伤的动物模型上观察TSA＋PNS对脑组织水肿、脑血管的通透性和脑组织中SOD活力、CAT活力和MDA浓度的影响，首次对TSA＋PNS的药效学进行了初步的研究。

1材料

1.1实验动物

SD大鼠，雄性，清洁级，体重250～300g，昆明小鼠，清洁级，雄性，体重25～30g，华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，许可证号：SCXK（鄂）2004-0007。

1.2药物

黄芪总皂苷，从豆科植物蒙古黄芪Astragalosides membranaceus Burge.的干燥根中提取，为易吸湿的淡黄色粉末；三七总皂苷，从Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen.的干燥根中提取，为淡黄色粉末，江西中医学院药学系提供。经过纯化验证和HPLC图谱分析，三七和黄芪总皂苷的纯度分别达到了87.5%和74.0%。尼立苏注射液（有效成分尼莫地平），山东新华制药股份有限公司产品，批号：0402006。

1.3实验仪器和试剂

723-A型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司产品；电热恒温水浴箱,北京市医疗设备总厂产品；FSH-2可调高速匀浆机，江苏金坛宏华仪器厂产品。SOD、CAT、MDA测试盒均为南京建成生物工程研究所产品。伊文思蓝，Fluka进口分装。

2方法

2.1对脑缺血再灌注模型大鼠脑水肿脑血管通透性的影响

2.1.1分组模型制作和给药共分成6组，假手术组、模型组、尼莫地平1mg/kg组、TSA8mg/kg+PNS20mg/kg组、TSA16mg/kg+PNS40mg/kg组、TSA32mg/kg+PNS80mg/kg组。水合氯醛ip麻醉大鼠，颈正中切口，暴露并分离双侧颈总动脉和迷走神经，用小动脉夹闭双侧颈总动脉和迷走神经，用温生理盐水湿润纱布，轻轻覆盖创口，避免手术窗口干燥。模型组和各给药组在接扎双侧颈总动脉前5min，由股静脉注射伊文思蓝50mg/kg。缺血90min后，舌下静脉注射药物或等容量的生理盐水，打开动脉夹再灌注，直视下证实血流恢复了再通，剔除不能恢复血流的动物。缝合手术创口。假手术组动物不夹闭双侧颈总动脉和迷走神经，其余操作同上。测量脑含水量的动物不注射伊文思蓝，其余操作同上。

2.1.2脑含水量和脑指数测定再灌注1h后，断头，在冰浴上取脑，无菌条件下用4℃生理盐水漂洗，去除血迹，用滤纸吸干表面水分，称重后在106℃烘箱中烘48h至衡重，计算脑含水量：脑含水量＝（脑湿重-脑干重）/脑湿重×100%。

2.1.3脑组织中伊文思蓝含量的测定再灌注1h后，断头，在冰浴上取脑，无菌条件下用4℃生理盐水漂洗，去处血迹，用滤纸吸干表面水分，称重，浸泡于5mL甲酰胺溶液中，在45℃条件下温浴72h，取色素液比色，根据回归方程计算伊文思蓝的含量，以μg/g湿重表示。

2.2对脑缺血再灌注模型小鼠脑组织中脂质过氧化的影响

2.2.1分组模型制作和给药共分成6组，假手术组、模型组、尼莫地平2mg/kg组、TSA16mg/kg+PNS40mg/kg组、TSA32mg/kg+PNS80mg/kg组、TSA64mg/kg+PNS160mg/kg组。水合氯醛ip麻醉小鼠，颈正中切口，暴露并分离双侧颈总动脉和迷走神经，用小动脉夹闭双侧颈总动脉15min，打开动脉夹，再灌注10min，再次关闭15min，同时，股静脉取血0.4mL，立即尾静脉注射药物，再灌注后12、18、24h，迅速断头，在冰浴上取脑，无菌条件下用4℃生理盐水漂洗，去除血迹，然后去处小脑和嗅球，制作组织匀浆。假手术组动物不夹闭双侧颈纵动脉和迷走神经，不取血，其余操作同上。

2.2.2脑组织中SOD CAT MDA检测取不同浓度的组织匀浆，按照试剂盒说明书操作，分别检测SOD活力、CAT活力、MDA含量。

2.3统计学分析

实验数据以±s表示，采用SPSS11.5软件做统计分析，组间差异比较用单因素方差分析Student-Newman-Keleus test统计。

3结果

3.1对脑组织含水量和血脑通透性的影响

结果见表1。和假手术组比较，模型组脑含水量显著增加（P

3.2对脑组织中T-SOD活力 CAT活力和MDA含量的影响

结果见图1～3。和假手术组比较，手术后3个时间点模型组脑组织匀浆中T-SOD活力显著降低（P

4 讨 论

脑水肿的发生和血脑屏障（BBB）的破坏密切相关。正常生理状态下，伊文思蓝（EB）进入血中与血浆蛋白紧密结合，不易透过BBB。BBB损伤后，结合EB的血浆蛋白可外渗入脑组织，使脑组织中的EB含量增加，所以，脑组织中EB的含量能够反映BBB的通透性。BBB是一个复杂的系统，由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞、外膜细胞、血管周围的巨噬细胞和基底膜组成。它能控制血循环中许多物质向中枢神经组织的转运，从而保证中枢神经组织内环境的稳定。脑缺血再灌注后，血管局部内皮细胞和白细胞的黏附、活化，释放出的蛋白水解酶等破坏了BBB，血液中的糖类等多种成分大量进入脑组织，导致脑水肿。本研究结果证实：TSA＋PNS能降低脑缺血再灌注大鼠脑组织中的EB含量，降低脑微血管的通透性；降低脑组织的含水量，抑制脑水肿。

一些实验显示：脑缺血再灌注的水肿和自由基密切相关[2]。双侧颈总动脉接扎再灌注模型是一个比较成熟的模型，能较好地再现自由基的产生，对组织的破坏，以及清除自由基酶活力的变化等病理过程。用体外自旋捕捉和低温ESR法都可以测得该种模型OFR信号显著增强[3]，用高效液相的方法，证实•OH含量显著增高[4]。

在本次实验中，模型组和假手术组比较，T-SOD活力、CAT活力和MDA浓度均呈现显著性差异，从再灌注12～24h时程上看：模型组代表细胞膜受损程度的MDA浓度逐渐降低，提示该段时间自由基的致损作用逐渐减轻，T-SOD活力、CAT活力在18h最低，而在24h又有所回升。这些结果提示：缺血再灌注对脑组织自由基清除系统的影响是多方面的，一方面，大量出现的自由基产生的过量消耗，是自由基清除酶活力降低的主要原因；另一方面，这种消耗可能通过某种机制，激活了机体自由基清除系统的代偿机制，大量表达具有清除自由基的酶蛋白，以补充这种消耗。

文献报道：TSA可以从多种途径对抗自由基，减轻脑损伤。体外用Xan/XO鲁米诺CCl体系中加入TSA，能够抑制O-2和发光剂鲁米诺反应，释放出光子，证实TSA具有清除O-2的作用[5]。组织中SOD是重要的O-2清除剂，先给予黄芪甲苷，能够抑制小鼠局灶性脑缺血组织中SOD活性的降低，提高SOD的催化能力，可能是黄芪皂苷清除O-2的重要机制[6]。另有报道：TSA对•OH也有显著的清除作用[7]。PNS对黄嘌呤氧化酶产生的自由基有清除作用[7]，能通过保护内源性SOD活性和抑制脂质过氧化的抗氧自由基机制，减轻脑缺血再灌注损伤[8]。在本次实验中，TSA＋PNS中、高剂量应用后，可提高T-SOD活力，降低MDA含量，中剂量提高CAT活力，提示TSA＋PNS具有抗氧化损伤的作用，该作用可能和提高病理状态下的SOD、CAT活力有关。

参考文献

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