细胞核的功能精选(九篇)

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第1篇：细胞核的功能范文

[关键词] 组蛋白去乙酰化酶;吸烟;慢性阻塞性肺病

[中图分类号] R563[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(c)-016-04

Relationship between HDAC activity and lung function as well as smoking in peripheral blood mononuclear cells of COPD patients

CHEN Yanwei1, YANG Jiong2

(1.Department of Pulmonary Medicine, Shenzhen Nanshan Hospital of Guangdong Medical College, Shenzhen518052, China; 2.Department of Pulmonary Medicine, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)

[Abstract] Objective: To investigate the histone deacetylase (HDAC) activity in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of COPD patients, and determine the relationship between HDAC activity in PBMC and lung function as well assmoking quantity in COPD patients. Methods: COPD patients, healthy smokers and healthy nonsmokers were selected in our study. The peripheral blood of all subjects were obtained, and PBMC was separated via density gradient centrifugation. Histone was extracted and HDAC activity was detected. The lung function, smoking information of all subjects were recorded. Results: HDAC activity in PBMC from COPD patients was decreased by 40% compared with normal nonsmokers [(12.86±6.14) μmol/(L・μg) and (21.39±4.92) μmol/(L・μg), P=0.000)], this decrease showed statistical significance in stage 1, 2 and 3. HDAC activity in PBMC from healthy smoker was 40% lower than healthy nonsmokers [(12.50±4.27) μmol/(L・μg) and (21.39±4.92) μmol/(L・μg), P=0.000]. HDAC activity in PBMC from COPD was negatively correlated with smoking quantity (r=-0.867, P=0.000 for COPD patients; r=-0.607, P=0.000 for all subjects). In COPD patients who smoked more than 35 pack years and smoked less than 35 pack years, the HDAC activity in PBMC of the former decreased more than a half than that of the later. Conclusion: Smoking is one of the important reasons causing the decrease of HDAC activity in PBMC of COPD patients. HDAC activity in PBMC of COPD patients shows zero correlation with lung function (FEV1, FEV1%, FVC, FVC% and FEV1/FVC), suggesting smoking may have different mechanisms on the local and whole damage of lung.

[Key words] Histone deacetylase; Smoking; Chronic obstructive pulmonary disease

肺部炎症是引起慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)气流受限(肺功能)的主要原因。有研究表明,肺部炎症的标志物(IL-8、IL-6、CRP等)与气流受限(肺功能)程度呈正相关。COPD患者肺组织和肺泡巨噬细胞中的HDAC活性与气流受限呈正相关,HDAC活性越低,气道炎症越重,FEV1%越低[1]。HDAC活性降低源于吸烟引起的氧化应激的损伤。吸烟可引起直接肺氧化应激损伤,也可引起间接的系统性氧化应激。

肺泡巨噬细胞由外周血单核细胞迁移至肺分化而来。因此,本研究假设外周血单核细胞中HDAC活性低于健康对照,并观察外周血单核细胞中HDAC活性与COPD患者气流受限(肺功能)的关系,同时观察吸烟量与HDAC活性的关系,以观察HDAC活性是否受吸烟量的影响。

1 对象与方法

1.1 受试者基本情况

收集在武汉大学人民医院体检及就诊的稳定期COPD患者。正常对照为健康志愿者。经患者知情同意,抽取外周静脉血20 ml,加少量肝素抗凝,在4 h内进行外周血细胞分离。

1.2 稳定期COPD诊断及分级标准

参照GOLD(2006修订版)和中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制订的慢性阻塞性肺病诊治指南(2002)。所有患者均除外心、脑血管、肝、肾疾病、糖尿病、肿瘤、风湿、结缔组织疾病,以及肺结核、支气管扩张、支气管哮喘及肺纤维化患者。

1.3 肺功能测定

所有受试者均行肺功能测定,采用Vmax6200(American Sensormedics, Vmax 229 series,Yorba Linda,California)肺功能系统检测FVC、FVC%、FEV1、FEV1%、FEV1/FVC,由同一熟练技师操作,以保证测试的一致性。每位被测试者肺功能测定前3 d内未使用支气管扩张剂,2周内未使用茶碱和激素。

测试方法:吸入200 μg葛兰素后10 min,平静正常呼吸,遂后充分吸气至肺总量位,迅速用最大力呼气,呼气时间≥6 s,或时间-容量曲线显示呼气相平台出现且超过2 s后,用最快速度用力吸气至肺总量位。每个被测试者分别至少测定3次(一般最多不超过8次),每个被测试者最佳值与次佳值2次差异小于5% FVC或0.5 L)。

1.4 人外周血单核细胞分离

人外周血单核细胞分离用密度梯度离心法[2]。将静脉血与Hank's buffered salt solution (HBSS)1×缓冲液1∶1混合后共40 ml,装于50 ml试管中。将混合血与人淋巴细胞分离液(Lymphoprep,Norway,1.077 g/ml)以2∶1体积混合。配平后用TDL-40L高速水平离心机离心,2 000 r/min(1 100 g/min),30 min。吸取中间白色薄雾层于新管。加HBSS于每管,将吸取液与HBSS混匀,HBSS体积大于1倍吸取液体积。配平后1 100 r/min,离心8 min。弃上清,加入HBSS吹打,移入一新试管中离心1 000 r/min,8 min,弃上清。将剩余液体混匀,吸取少量于细胞计数板计数,并用台盼蓝染色鉴定细胞活性。如果细胞总数大于1×107个/ml,活性大于95%,视为合格标本;用1 ml枪头吸取剩余液体于标记Ep管中,-70℃冻存。 1.5 直接组蛋白提取

组蛋白提取用HCl和H2SO4 4℃过夜法[3]。裂解液[10 mmol/L Tris-HCl,pH 6.5,50 mmol/L亚硫酸氢钠,1% Triton X-100, 10 mmol/L MgCl2,8.6%蔗糖,完全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏分子生化公司),20 min,4℃];核冲洗缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,13 mmol/L EDTA,pH 7.4)。

将细胞微离心5 min;用冰冻裂解缓冲液反复冲洗片状沉淀物,直至浮于表面的物质清除(每次离心7 500 g/min,5 min)。用核冲洗缓冲液冲洗核片状沉淀物,并且用50 μl 0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L H2SO4在蒸馏水中悬浮。4℃过夜提取细胞核,微离心剩余物质10 min,用1 ml冰冻丙酮混合上清液,-20℃过夜。微离心样本10 min,用丙酮冲洗,干燥,并用蒸馏水稀释。含有组蛋白的上清液样品用Bradford protein kit(Bio-Rad)定量。Bradford法(考马斯亮蓝)测组蛋白浓度。

1.6 HDAC活性检测

细胞核提取物HDAC活性检测使用HDAC活性荧光分析试剂盒(Cayman,USA),严格按照试剂盒说明操作。

1.7 统计学处理

结果用SPSS 11.0统计学软件进行分析。数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析;相关性采用Spearman相关性分析;P

2 结果

2.1 一般资料

COPD患者26例,均为吸烟者,其中,1期7例,2期8例,3期8例,4期3例;健康吸烟者10例;健康非吸烟者13例,所有受试者均为男性,其身高、体重等无显著性差异(P>0.05)。COPD组与健康吸烟组吸烟量无显著性差异(P>0.05)。COPD组平均年龄高于健康吸烟组和健康非吸烟组(P0.05)。

2.2 COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性

COPD患者外周血单核细胞总HDAC活性较健康非吸烟者低40%左右[(12.86±6.14) μmol/(L・μg)和(21.39±4.92) μmol/(L・μg),P=0.000];在1、2、3期达到显著性差异(图1);其活性与健康吸烟者比较,无显著性差异[(12.86±6.14) μmol/(L・μg)和(12.50±4.27) μmol/(L・μg),P=0.864]。健康吸烟者外周血单核细胞中的HDAC活性较健康非吸烟者低40%,与COPD患者比较,无显著性差异(P>0.05)。

图1外周血单核细胞中的HDAC活性比较

Fig. 1Comparison of HDAC activity of PBMC among subgroups

2.3 COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性与肺通气功能的关系

COPD患者外周血单核细胞中HDAC活性与肺通气功能均无统计学相关(表1)。

表1 外周血单核细胞中HDAC活性与FVC、FEV1、FEV1/FVC的关系

Tab.1 Relationship between FVC, FEV1, FEV1/FVC

and HDAC activity of PBMC

2.4 吸烟受试者外周血单核细胞中HDAC活性与吸烟量的关系

外周血单核细胞中的HDAC活性与吸烟量(包年)呈负相关(在COPD患者中,r=-0.867,P=0.000;在所有吸烟者中,r=-0.607,P=0.000)(图2)。

图2外周血单核细胞中HDAC活性与吸烟的关系

(A:COPD患者;B:所有吸烟者)

Fig. 2Relationship between HDAC activity in PBMC and

smoking quantity

(A: COPD patients; B: all subjects enrolled)

吸烟量超过35包年的COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性平均值明显低于吸烟量低于35包年者(图3)。

图3吸烟量对COPD患者外周血单核细胞

中HDAC活性平均值的影响

Fig. 3Effect of smoking quantity on mean HDAC

activity of PBMC in COPD

3 讨论

研究结果显示,COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性低于健康非吸烟者,与健康吸烟者比较,无显著性差异;COPD患者外周血单核细胞中HDAC活性的降低与COPD气流受限(肺功能)无明显相关,与患者吸烟量呈负相关,提示外周血单核细胞中的HDAC活性降低可能是吸烟的直接作用。

稳定期COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性降低与相同吸烟量的非COPD吸烟者的下降相同,而且两组研究对象随吸烟量增加,HDAC的下降更为明显,提示人外周血单核细胞中HDAC下降与吸烟密切相关。

吸烟也可以引起染色体重构[4],影响NF-κB的表达,促使炎症基因表达[5]。吸烟时每喷烟雾中至少含有10种氧化分子[6],这些氧化分子可以产生氧化应激(oxidative stress)。吸烟引起的氧化应激使细胞核HDAC活性降低,同时可以明显降低上皮细胞的HDAC2表达[7-8],使炎症因子表达增加;这种氧激发可以被抗氧化物N-乙酰半胱氨酸所阻断[9]。健康吸烟者肺泡巨噬细胞HDAC活性低于健康不吸烟者[10]。氧化应激可以通过影响细胞核HDAC活性而影响炎症基因的表达。体外研究显示,氧化应激可以明显降低HDAC活性和上皮细胞HDAC2的表达[7]。

本研究通过提纯单核细胞核HDAC并测定其活性,提示外周血单核细胞中的HDAC活性与吸烟量呈负相关。因此,COPD患者外周血单核细胞HDAC活性降低可能系吸烟所致。

本研究显示,COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性降低与COPD气流受限(肺功能)零相关。

肺功能是目前COPD分级的主要依据,主要反映气道的阻塞程度,并不能反映COPD的炎症程度。Ito等[1]发现HDAC活性在COPD患者的支气管组织和肺泡巨噬细胞中降低,这种降低与COPD气流受限(FEV1、FEV1/FVC)呈正相关。而本研究并未发现外周血单核细胞中的HDAC活性降低与COPD气流受限(肺功能)相关,其原因可能与吸烟对肺部和全身的损害不同有关。

吸烟的烟雾中含有众多物质,可以引起直接和间接肺损害。有害成分可以直接影响HDAC的活性或破坏肺组织,引起肺组织的急性损害。只有部分物质可以进入血液(如氧自由基等)并长期在血液中停留。这些物质可以作用于单核细胞,通过抑制HDAC活性来促进炎症介质的产生。即使停止吸烟,炎症基因的表达维持了这种慢性炎症。炎症基因的表达受促炎症转录因子的调节,这些转录因子主导、放大并且维持了COPD的慢性炎症反应。肺部的局部急性炎症与肺功能(气流受限)呈正相关。而本研究显示,在稳定期COPD患者的外周血单核细胞中,HDAC活性与COPD肺功能(气流受限)无关,提示吸烟对肺部的直接损害与全身的间接损害可能源于不同的机制。

[参考文献]

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[2]Cosio BG, Mann B, Ito K, et al. Histone acetylase and deacetylase activity in alveolar macrophages and blood mononocytes in asthma[J]. Am J Respir Crit Care Med,2004,170(2):141-147.

[3]Ito K, Lim S, Caramori G, et al. A molecular mechanism of action of theophylline: induction of histone deacetylase activity to decrease inflammatory gene expression[J]. Proc Natl Acad Sci,2002,99(13):8921-8926.

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[5]Nishikawa M, Kakemizu N, Ito T, et al. Superoxide mediates cigarette smoke-induced infiltration of neutrophils into the airways through nuclear factor-kappa B activation and IL-8 mRNA expression in guinea pigs in vivo [J]. Am J Respir Cell Mol Biol,1999,20(2):189-198.

[6]Yanbaeva DG, Dentener MA, Creutzberg EC, et al. Systemic effects of smoking [J]. Chest,2007,131(5):1557-1566.

[7]Ito K, Hanazawa T, Tomita K, et al. Oxidative stress reduces histone deacetylase 2 activity and enhances IL-8 gene expression: role of tyrosine nitration [J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,315(1):240-245.

[8]Tomita K, Barnes PJ, Adcock IM. The effect of oxidative stress on histone acetylation and IL-8 release [J]. Biochem Biophys Res Commun,2003,301(2):572-577.

[9]Cosio BG, Jazrawi E, Ito K, et al. Cigarette smoke decreases steroid responsiveness in monocytes: the role of histone deacetylase [J]. Am J Respir Crit Care Med,2003,167:A804.

第2篇：细胞核的功能范文

【关键词】 结核分枝杆菌; 抗原提呈; T细胞亚群; 流式细胞术; 激光共聚焦显微镜

［Abstract］ AIM: To explore whether the human peripheral γδ T cells stimulated by polypeptide heat resistant antigen from Mycobacterium tuberculosis (MtbHAg) express phenotype and have the fuction of antigen presentation. METHODS: The monocytes isolated by adhesion method from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured with GMCSF， IL4 and induced into the mature dendritic cells by adding LPS. PBMCs were stimulated with MtbHAg and IL2 to expand predominantally γδ T cells that were further purified by flow sorting. The pure T cells were isolated from PBMCs using adhesion revomal and nylon column method， labeled with CFSE， and cultured in alone with Mtb secretory antigen (MtbSAg)， in monocytes with MtbSAg， or with MtbSAg prepulsed dendritic cells or MtbHAg activated γδ T cells for 11 days. The proliferation of the CD4+T cells were measured by flowcytometry. The MtbHAg activated γδ T cells were incubated with FITC labelled MtbSAg for different time， and the ingestion of MtbSAg by γδ T cells was measured by flowcytometry and observed with laser confocal microscopye. RESULTS: The expressions of MHCII and costimulatory molecules CD80 and CD86 on γδ T cells that activated by MtbHAg marketly incrased in comparison with that on the resting γδ T cells. The expanded cell counts and proliferation index of the pure nave T cells that induced by MtbSAg pretreated activated γδ T cells were similar to that induced by mature DC. By using flowcytometer and laser confocal microscope， FITC labellaed MtbSAg was ingested by the activated γδ T cells. CONCLUSION: γδ T cells stimulated by polypeptide MtbHAg express the phenotype of professional antigenpresenting cells and they are able to present MtbSAg to nave T cells to induce the proliferation of CD4+T cells.

［Keywords］Mycobacterium tuberculosis; antigen presentation; T lymphocyte subpopulation; flow cytometry; laser confocal microscope

以往的研究表明机体在抗结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染免疫中， 主要有αβ T细胞（CD4＋和CD8＋T细胞）和巨噬细胞发挥重要作用， 而近年的许多研究证明， γδ T细胞在抗Mtb感染中也起到重要的防御作用， 并可能通过与其他免疫细胞之间相互作用， 影响机体在抗Mtb感染中的免疫应答过程。在健康人外周血中， γδ T细胞仅占T细胞库的2%～10%， 根据其TCRδ链V区片段不同又可以分为Vδ1+和Vδ2+二种亚型， Vδ1+T细胞主要分布在黏膜上皮和皮肤组织， 而Vδ2+T细胞则主要分布在外周血中。已有研究发现Vδ2+T细胞能识别小分子的非肽类抗原， 并在此类抗原的刺激下产生显著的扩增［1， 2］。有研究发现， 从扁桃体分离的未活化的γδ T细胞用异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate， IPP) 和来自大肠埃希菌的非肽类抗原4羟基3甲基2烯基焦磷酸［(E)4hydroxy3methylbut2enyl pyrophosphate， HMBPP］刺激后， 表达协同刺激分子和MHCⅡ类分子的能力与单核细胞来源的， 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激诱导成熟的树突状细胞（dendritic cell， DC）相似［3］。但以往的研究， 以及我们以前的实验发现来自结核杆菌的多肽类耐热抗原也可优势扩增人Vδ2+T细胞［4， 5］。本实验中， 我们用多肽类Mtb耐热抗原(Heat resistant antigen， MtbHAg)优势扩增人外周血中的γδ T（Vδ2+）细胞， 观察活化后的γδ T细胞是否能表现出抗原提呈细胞的表型以及是否具有抗原提呈的功能， 探讨γδ T细胞在抗Mtb感染的天然免疫和获得性免疫中的桥联作用。

1 材料和方法

1.1 材料 Mtb耐热抗原(MtbHAg)和Mtb分泌性抗原(MtbSAg)由本实验室从培养的MtbH37Ra株制备获得， 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFSE) 购自Molecular Probes公司; RPMI1640培养液(GIBCO公司) 补充L谷氨酰胺2 mmol/L、 二巯基乙醇(2ME)50 μmol/L、 丙酮酸钠1 mmol/L、 庆大霉素50 mg/L和新生小牛血清(NBS， 杭州四季青公司) 100 mL/L后为完全RPMI1640培养液; 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC) 和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide， DMSO) 购自Merk 公司; 荧光抗体小鼠抗人CD4PE、 小鼠抗人TCRγδPE、 小鼠抗人CD14FITC、 小鼠抗人HLADRPecy 5.5和小鼠抗人CD83FITC等购自Caltag公司; 小鼠抗人CD80FITC和CD86FITC购自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 γδ T细胞的活化和分选纯化 抽取健康志愿者外周血5～10 mL， 肝素抗凝， 用淋巴细胞分离液和梯度离心法常规分离获取外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cells， PBMC）， 将PBMC用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为1×109/L， 加入24孔板， 再加入Mtb耐热抗原(MtbHAg) 2.5 mg/L， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培养5 d后分孔培养， 每隔3 d加入rhIL2 5×104 U/L， 约9 d即可得到富含γδ T细胞的活化T细胞， 经抗TCRPE染色后， 用PBS制备分选用细胞悬液(1×1010/L)， 在流式细胞仪FACSCalibur上进行分选获取纯化的γδ T细胞。

1.2.2 DC的体外培养及检测 常规方法分离获取PBMC， 加入24孔板中， 细胞密度为每孔5×109/L， 37℃、 50 mL/L

CO2培养2 h后吸去悬浮细胞， 并用预热的RPMI1640轻洗培养孔， 以去除残留悬浮细胞， 即获得贴壁细胞。补充培养液后加入rhGMCSF 100 μg/L， IL4 100 μg/L， 第3天时半量换液， 并再次添加GMCSF和IL4， 第6 天半量换液的同时再加入LPS 1 mg/L， 第8天收获悬浮细胞， 分别用小鼠抗人CD83FITC， CD14FITC和HLADRPeCy5.5标记后在流式细胞仪检测外周血单核细胞来源DC的成熟程度。

1.2.3 尼龙毛柱法分离纯化T淋巴细胞 常规方法分离获取PBMC， 调整细胞密度为1×109/L， 加入6孔板中， 2 mL/孔， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培养2 h后， 吸出悬浮细胞， 调整细胞密度为1×1010/L， 注入已制备好的尼龙毛柱内， 另加入5 mL的完全RPMI1640液， 密封， 37℃、 50 mL/L CO2中孵育1 h后， 用RPMI1640完全培养液冲洗毛柱， 收集冲洗出来的细胞， 即为纯化T细胞（purified T， pu T)。

1.2.4 CFSE标记pu T 将获得的pu T调整细胞密度为5×109/L， 每毫升细胞悬液加入1 μL CFSE， 使其终浓度为2 μmol/L， 37℃染色10 min后取出用含100 mL/L NBS的完全RPMI1640培养液洗2次后将染色后pu T制成细胞悬液(1×109/L)。此即为CFSE标记的pu T (pu TCFSE)。

1.2.5 FITC标记MtbSAg 将MtbSAg(1 g/L) 1 mL加入已处理过的透析袋中， 扎紧袋口放入pH9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后取出， 加DMSO配制FITC溶液（1 g FITC/L）混合， 使FITC/MtbSAg的比例为50 μg∶1 mg。室温避光在水平振荡器上慢速振摇2 h后转入透析袋中， 对200 mL PBS透析8 h后换液， 共3次。4℃避光保存。

1.2.6 四种不同的培养方法刺激αβ T细胞扩增 CFSE标记的pu T， 调整细胞密度为1×109/L， 加入24孔板培养， 每孔1 mL， 并按以下四种不同方法加入MtbSAg或抗原提呈细胞。a: CFSE标记的pu T单独培养， 同时加入MtbSAg 25 mg/L。b: CFSE标记的pu T中加入单核细胞 (单核细胞: pu TCFSE为1∶100)， 加MtbSAg 25 mg/L。c: 体外培养的单核细胞来源的成熟DC(MDC)与终浓度25 mg/L 的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗涤3次， 加入pu TCFSE (DC∶Pu TCFSE为1∶100) 中培养。d: 流式分选纯化的MtbHAg活化γδT细胞与终浓度为25 mg/L的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗涤3次， 加入到pu TCFSE(活化的γδT细胞: pu TCFSE为1∶100)中培养。上述4种细胞培养在第4天时加IL2 (5万U/L)扩增细胞， 隔天半量换液并添加同量的IL2以维持细胞生长。

1.2.7 FCM和激光共聚焦检测活化γδ T细胞对FITC标记MtbSAg的摄入 将MtbHAg活化的γδ T细胞的密度调整为1×1010/L， 取100 μL细胞悬液， 加FITC标记的MtbSAg 10 μL， 抗TCRγδPE 3 μL， 避光 37℃， 水浴30 min 至120 min后， PBS洗涤3次， 尽量去除残余液体， 加入10 g/L多聚甲醛200 μL 固定后用流式细胞仪检测FITC阳性细胞数， 表示摄入MtbSAg细胞的比率。同时将水浴90 min的试管轻弹混匀后取出2 μL， 加少量甘油混合后滴在载玻片上， 加上盖玻片后即在激光共聚显微镜（Nikon C1 Si）下观察和拍摄记录， 获取的图象文件用Freeviewer软件分析显示。

1.2.8 统计学分析 实验数据以x±s表示， 数据处理采用SPSS13.0统计软件。样本均数的两两比较， 采用t检验， P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血单核细胞来源DC的表型检测 PBMC来源的单核细胞经GMCSF， IL4培养6 d后加入LPS诱导为成熟的DC后， 用FCM检测其表型， 发现HLADR仍为高表达（81.89%)， 代表DC成熟的CD83与培养前低表达（7.83％）相比非常显著地高表达(85.40%)， 而单核细胞的特征标志CD14从培养前的87.2%降低到5.31%。

2.2 活化的γδT细胞表达协同刺激分子 检测健康人外周血中静止的γδ T细胞表面CD80、 CD86和HLADR的表达水平非常低， 分别为(1.37±2.36)%， (4.13±3.33)%和(8.84±5.44)%; 而经MtbHAg活化后γδ T细胞CD80、 CD86和HLADR的表达分别增加到(62.33±7)%、 (89.12±3.5)%、 (80.56±7.29)% (图1)。

2.3 不同培养方法对纯化初始T细胞增殖总数的影响 在4种不同培养方案中， 加入的纯化T细胞数均为1.0×106， 单独加MtbSAg的a组， 和加单核细胞和MtbSAg的b组， 培养到第11天时， 细胞数分别为1.2×106和5.6×106。而纯化T细胞加入预先与MtbSAg处理的DC（c组）和γδ T细胞（d组）， 培养11 d后的细胞数分别为7.79×106和8×106(图2)。

2.4 FCM分析CD4+T细胞的增殖情况和Modfit软件分析CD4+T细胞的增殖指数 用CFSE标记的纯化T细胞用4种方法培养到第11天时， 标记CD4荧光mAb后用流式细胞仪测定和分析， 结果表明纯化T细胞单独加MtbSAg的a组， 增殖的CD4+T细胞仅占4.5%; 加单核细胞和MtbSAg的b组， 增殖的CD4+T细胞所占比例为35.4%， 而加入MtbSAg预处理的成熟DC和活化γδT细胞的c组和d组， 增殖的CD4+T细胞所占比例分别达到56.4%和57.1%（图3A）。用Modfit软件中的增殖分析模块进行分析， 得到CD4+T细胞各代细胞所占百分率， 增殖指数(Proliferation Index， PI， 即增殖后细胞总数与增殖前细胞总数的比值。在加入MtbSAg预处理的DC（c组）和活化γδT细胞（d组）， 培养第11天时CD4+T细胞的PI分别为58.9和51.9， 且增殖的代数主要集中在第9、 10代， 分别为75.93%和75.71%。加入单核细胞的b组CD4+T细胞的PI为24.39， 第9、 10代所占的比例为57.65%， 而仅有纯化T细胞的a组中， CD4+T细胞的PI和第9、 10代所占的比例仅为4.5%和4.04%（图3B）。

2.5 激光共聚焦显微镜观察活化的γδ T细胞摄入SAg MtbHAg刺激活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg在37℃孵育90 min 时， 同时加入抗TCRγδ PE荧光抗体， 在激光共聚焦显微镜下观察， 发现细胞膜被染成红色的γδ T细胞内分布有大量呈绿色荧光（FITC）细小散点物质(图4)。

2.6 流式细胞术检测活化的γδ T细胞摄入MtbSAg MtbHAg激活的γδ T细胞与FITCMtbSAg在37℃孵育时， 加入抗TCRγδ PE荧光抗体， 用流式检测发现， MtbSAg摄入率即γδ T细胞中FITC+细胞百分数随时间延长不断增加。在孵育30、 60和90 min时， 摄入率分别为(26.68±3.58)%、 (48.09±3.29)%和(53.32±3.29)%; 但是在120 min时降低至(31.28±5.80)% (图5)。

3 讨论

为了探讨多肽类抗原激活的人γδ T细胞是否也具有抗原提呈作用， 首先考虑是否有涉及抗原提呈细胞有关的表型分子的表达。本实验采用多肽类的MtbHAg作为优势激活γδ T细胞的抗原， 其中具有激活γδ T细胞效应的主要组分是Mr在10 000～14 000的非分泌性耐热多肽［4， 5］。用这种多肽抗原激活的γδ T细胞在培养增殖到第11天时， 其表面HLADR和协同刺激分子(CD80和CD86)从培养前的低表达（1％～8％）显著上调为高表达（62％～89％）， 表明这些细胞已具有抗原提呈细胞的表型。

Brandes等［3］发现IPP活化γδ T细胞摄入可溶性抗原后与初始αβ T细胞共同培养促使细胞增殖。本实验中纯化T细胞（几乎均是αβ T细胞）与MtbSAg掺入的DC培养11 d后数量增加7倍， 而与MtbSAg掺入的活化γδ T细胞共同培养后， αβ T细胞的数量增加8倍。我们进一步用CFSE标记初始纯T淋巴细胞后， 再与MtbSAg掺入的DC或γδ T细胞培养， 流式细胞术检测后用Modfit软件进行分析CD4+T细胞各代细胞所占百分率， 发现由活化γδ T细胞和成熟DC作为抗原提呈细胞的二组， 培养到晚期时增殖的细胞绝大多数均是集中在第9、 10代。说明引起CD4+T细胞增殖的能力几乎相同。这些结果表明， 用MtbHAg活化的γδ T细胞和成熟DC一样， 具有提呈可溶性抗原给初始T细胞， 引起CD4+T增殖的能力。这与 Brandes报道的用非肽类抗原刺激的γδ T细胞提呈可溶性抗原的结果相一致。

为了证实MtbHAg活化的γδ T细胞能摄入蛋白抗原， 本实验将活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg在37℃的条件下孵育， 流式细胞术检测显示γδ T细胞摄入SAg的能力随着时间的增加而增加（30 min 至 90 min）。同时， 在激光共聚焦显微镜下也观察到γδ T细胞能将抗原摄入胞内。

综上所述， 经MtbHAg活化γδ T细胞具有抗原提呈作用， 其功能活性似乎与成熟DC没有明显差别， 但γδ T细胞更容易获取和体外操作。因此， 这种活化的γδ T细胞可在制备疫苗和免疫治疗中成为新的目标［6］。

参考文献

［1］ Hayday A， Theodoridis E， Ramsburg E， et al. Intraepithelial lymphocytes: exploring the third way in immunology［J］. Nat Immunol， 2001， 2(11): 997-1003.

［2］ Chen ZW， Letvin NL. Adaptive immune response of Vγ9Vδ2T cells: a new paradigm［J］. Trends Immunol， 2003， 24(4): 213-219.

［3］ Brandes M， Willimann K， Moser B. Professional antigenpresentation function by human γδ T cells［J］. Science， 2005， 309(5732): 264-268.

第3篇：细胞核的功能范文

【摘要】

目的: 本研究旨在探索紫杉醇、 顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡后能否具有较强的免疫原性， 并可以被抗原提呈细胞交叉提呈并促进免疫应答。方法: 用巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和白介素4（IL4）刺激人外周血单核细胞分化诱导为树突状细胞（DC）， 6 d后将DC和经紫杉醇联合顺铂在体外诱导发生凋亡的人卵巢癌细胞株共同培养， 并以冻融细胞共培养DC组和单独DC组作对照， 共培养4 h后， 进行激光扫描共聚焦显微镜观察DC细胞对凋亡细胞的吞噬作用， 同时以流式细胞术(FCM)检测不同培养组DC的分化和成熟程度。结果: 紫杉醇、 顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞可被DC有效吞噬， 与对照组相比， 凋亡组DCs的表达及成熟度均明显增高， 并具有统计学意义（P﹤0.05）。结论: 紫杉醇、 顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞具有较强的免疫原性， 可以促进DC的分化和成熟。

【关键词】 紫杉醇; 顺铂; 树突状细胞; 细胞凋亡; 抗原提呈

［Abstract］ AIM: To explore wheather apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatin could be crosspresented by antigen presenting cells and promote immune responses. METHODS: DCs were generated from peripheral blood monocytes in RPMI1640 supplemented with GMCSF and IL4. After 6 days’ incubation， DCs were further cocultured with either apoptotic HO8910 cell lines induced by paclitaxelcisplatin or control cells for four hours. Maturation of DCs was compared among different groups according to their surface markers through flow cytometry assay and their phagocytosis ability was evaluated by confocal microscopy scanning assay. RESULTS: Apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatincan were phagocytized more efficiently by DCs.Resulting is more cellularity and maturation of DCs in apoptotic cellinduced groups than control group(P

［Keywords］paclitaxel; cisplatin; dendritic cells; apoptotic cells; antigen presentation

化疗药物通过诱导凋亡来杀死肿瘤细胞， 而凋亡的肿瘤细胞是否具有免疫原性一直是倍受争议的话题， 近来研究表明化疗药物诱导的凋亡肿瘤细胞能否有效激发免疫应答， 与肿瘤细胞的性质和化疗药物有关［1］。本研究旨在探索紫杉醇联合顺铂化疗药物诱导卵巢癌细胞凋亡后的免疫原性， 探讨诱导凋亡的肿瘤细胞能否被树突状细胞（dendritic cell， DC）交叉提呈， 从而促进免疫应答， 为临床制定合理的化疗联合免疫疗法治疗肿瘤提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 紫杉醇、 顺铂购自山东齐鲁制药厂; 淋巴细胞分离液购自上海化学试剂厂; 巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor， GMCSF)、 白介素4（interleukin4， IL4）、 肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα， TNFα）均购自R&D公司; CFSE(carboxyfluorescein succinimidylester)活细胞探针购自Invitrogen公司; 小鼠抗人抗体CD14、 CD80、 CD83、 CD86、 CD1a单克隆抗体(mAb)购自ebioscience公司; AnnexionⅤPI核酸染料购自深圳晶美公司; RPMI1640培养液、 2.5 g/L胰酶、 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）购自Gibco公司; 人卵巢癌HO8910细胞株为上海市免疫学研究所馈赠; 人浓缩白细胞由自愿者提供。

1.2 方法

1.2.1 人外周血细胞定向诱导分化和培养DC 取60 mL浓缩WBC， PBS稀释至200 mL， 采用淋巴细胞分离液经密度梯度离心分离获取外周血单个核细胞， PBS洗涤细胞2次， 细胞计数， 在6孔板中以无血清RPMI1640培养液悬浮细胞至密度为5×109/L， 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱2 h后取出， 洗去悬浮细胞（收集备用）， 加入含GMCSF(100 μg/L)、 IL4(50 μg/L)和100 mL/L FBS的RPMI1640培养液诱导培养贴壁细胞， 第3天半量换液， 第6天收集悬浮细胞， 计数。

1.2.2 HO8910凋亡细胞的制备 将HO8910细胞按紫杉醇和顺铂不同的作用剂量和不同时间分组处理， 紫杉醇顺铂浓度分别为2.5～0.3 mg/L、 25～3 mg/L、 125～15 mg/L、 250～30 mg/L， 分别作用12 h、 24 h和36 h后， 用2.5 g/L胰酶消化贴壁细胞， 将细胞用PBS重悬至1×109/L， 取100 μL， 以药物未处理组为空白对照， 参照Annexin VPI试剂盒说明书检测各组细胞的凋亡率。

1.2.3 HO8910冻融抗原制备 收获HO8910细胞， 用PBS重悬至2×1010/L， 置液氮内10 min， 取出后速投入37℃水浴溶解， 反复5次。以3 000 r/min离心10 min， 收集上清， -80℃保存备用。

1.2.4 DC与凋亡细胞激光共聚焦扫描 消化对数增长期HO8910细胞株， 以PBS 重悬细胞至1×109/L， 加入CFSE终浓度为25 μmol/L， 50 mL/L CO2、 37℃培养箱共孵育30 min， RPMI1640培养液洗涤细胞1次后， 用含100 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640液重悬细胞， 并铺板培养。次日加入紫杉醇和顺铂（浓度为250～30 mg/L）， 培养24 h（此条件为1.2.2步骤实验得出诱导细胞凋亡的最佳浓度和时间）后取出， 收集悬浮细胞， 计数。凋亡细胞与培养6 d后的DC以1∶1比例共孵育， 以未处理细胞为对照， 按相同比例和DC共培养， 4 h后取出， 用PBS洗涤细胞， 加入小鼠抗人PECD83抗体， 共孵育30 min后， 用PBS洗涤细胞， 并用40 g/L多聚甲醛固定悬浮细胞， 置于细胞甩片机中1 000 r/min离心3 min， 将细胞固定于载玻片上， 500 mL/L甘油PBS封片， 激光共聚焦显微镜检测。

1.2.5 不同类型肿瘤抗原负载DC表面标志的检测 DC培养至6 d， PBS冲洗收获所有的DC， 分为3组进行实验: 空白组， 单纯DC组; 冻融组: HO8910冻融抗原负载DC组; 凋亡组: 紫杉醇顺铂诱导HO8910凋亡细胞负载DC组。共培养4 h后洗涤细胞， 用100 mL/L FBS1640悬浮细胞， 并加入TNFα至100 μg/L， 培养24 h后流式细胞术(FCM)检测DC细胞表面CD1a、 CD14、 CD80、 CD83、 CD86的表达。

1.2.6 统计学分析 计量资料以x±s表示， 采用SPSS11.5数据包方差分析， P

2 结果

2.1 紫杉醇顺铂诱导人卵巢癌细胞株HO8910凋亡最佳时间与剂量的选择 为确定紫杉醇和顺铂联合诱导人卵巢癌细胞株HO8910的最佳作用剂量和最适作用时间， 我们选取了4个作用浓度和3个作用时间点（见前）处理HO8910细胞， 结果显示紫杉醇顺铂作用浓度为125～15 mg/L， 作用时间12 h后细胞凋亡开始明显增加， 以250～30 mg/L浓度作用24 h细胞基本完全凋亡。显微镜下可见作用24 h后， 细胞呈悬浮状， 部分细胞胞膜不完整。作用36 h后FCM检测结果显示细胞大多呈坏死状态， 显微镜下观察发现细胞呈碎片。上述结果表明， 紫杉醇和顺铂联合诱导HO8910细胞凋亡时， 浓度250～30 mg/L， 作用24 h为凋亡最适剂量、 最佳时间点效应（图1）。

图1 紫杉醇/顺铂作用不同浓度与不同时间细胞的凋亡比例（略）

Fig 1 The percentage of apoptotic cells induced by Paclitaxel/Cisplatin at different concentrations and time points

a: 125 paclitaxel+15 mg/L cisplatin for 12 h; b: 250 paclitaxel+ 30 mg/L cisplatin for 24 h; c: 250 paclitaxel+30 mg/L cisplatin for 36 h.

2.2 外周血单核细胞来源的DC的体外诱导 经常规贴壁法获得外周血单核细胞后， 采用通用的GMCSF和IL4条件培养基体外诱导分化DC， 培养3 d后， 在倒置光学显微镜下观察可见细胞开始呈集簇生长， 部分细胞的细胞膜有突起， 培养至第6天， 可见大部分细胞悬浮生长， 胞体大且外形不规则， 细胞膜呈树突状突起， 胞质丰富， 并具有典型DC形态（图2）， 表明细胞已向DC分化， 可用于进一步表型分析和功能检测。

图2 倒置显微镜下DC的形态特征（略）

Fig 2 The morphology of induced DC observed with inverted microscope(×400)

2.3 诱导DC细胞的表型检测 外周血来源的单核细胞经GMCSF和IL4诱导培养6 d后， 获得未成熟的DC细胞， 采用单独TNFα作用、 TNFα﹢冻融细胞和TNFα﹢凋亡细胞培养24 h后， FCM检测DC表面标志的表达。结果显示条件培养第6天较培养前CD14的表达明显下降， CD1a、 CD80、 CD86的表达上调， CD83的表达为10%左右（图3）。培养7 d后单独TNFα作用和TNFα+冻融细胞作用后CD83表达约35%左右， 两者间无统计学意义（P>0.05）， 但其在TNFα﹢凋亡细胞作用后表达上升为50%， 且与前两者间有统计学意义（P

图3 诱导前、 GMCSF/IL4、 GMCSF/IL4/TNFα诱导后细胞表面标志变化（略）

Fig 3 Alteration of surface markers on preinduced monocytes， GMCSF/IL4 induced and GMCSF/IL4/TNFα induced DC cells

表1 不同肿瘤抗原刺激后DC表面标志的表达（略）

Tab 1 Comparative analysis of surface markers on DC pulsed with different types of tumor antigens

aP

2.4 凋亡细胞可以被DC细胞有效的吞噬 比较DC与凋亡的HO8910细胞和未处理HO8910细胞共培养后， DC对两类细胞的吞噬情况， 结果显示（图4）仅在凋亡组中可见DC膜与凋亡细胞融合、 DC细胞胞体内有凋亡小体、 小颗粒状溶解碎片等一系列DC吞噬凋亡细胞的现象， 而DC对正常的HO8910无吞噬作用。进一步通过FCM检测DC吞噬凋亡细胞在时相上是否存在差异， 结果表明随共培养时间延长， DC的吞噬未见增加， 4 h与24 h之间无统计学意义。

图4 DC对凋亡肿瘤细胞、 未处理的肿瘤细胞吞噬的激光共聚焦扫描（略）

Fig 4 Phagocytosis of dendritic cells against apoptotic and normal HO8910 cell lines

A: Apoptosis HO8910 cell lines; B: HO8910 cell lines.

3 讨论

卵巢癌死亡率极高， 减少卵巢癌复发、 提高预后的一个重要策略是在手术和化疗后再应用如免疫治疗、 分子靶向治疗和基因治疗等巩固疗法［2］。近年来研究表明化疗药物诱导的凋亡肿瘤细胞能够有效激发免疫应答［3］。如果能将卵巢癌免疫治疗与传统治疗方法合理联合将为卵巢癌的治疗开辟新的途径、 带来新的曙光。研究证明肿瘤免疫逃逸的机制不仅由于缺乏抗原， 而且与抗原不能被有效提呈给T细胞而不能产生特异性免疫应答有关［4］。因此肿瘤免疫治疗的一个巨大挑战是如何使抗原被有效提呈而激发有效的抗肿瘤免疫应答。如果化疗诱导的凋亡细胞具有免疫原性、 能被APCs提呈则是化疗联合免疫治疗的基础。

Nowak等［5］学者发现二氟脱氧胞嘧啶核苷介导的凋亡细胞不是耐受原， 凋亡细胞能诱导DC成熟并激活相关的T细胞。另有学者发现化疗诱导的凋亡肿瘤细胞数目增加， 使得APCs吞噬作用加强， APCs被激活后释放更多的前炎性细胞因子， 从而促进APCs对肿瘤抗原的交叉提呈［6］。而Casares等［7］发现丝裂霉素C致凋亡的肿瘤细胞不具有免疫原性。上述研究结果提示， 不同肿瘤细胞经不同化疗药物作用后， 其免疫原性仍然存在不确定性。紫杉醇和铂类是目前国内外公认的卵巢癌一线化疗药物， 本实验中应用紫杉醇联合顺铂诱导卵巢癌细胞株凋亡后， 论证凋亡细胞对DC的影响。应用激光共聚焦显微镜发现与凋亡细胞共培养的DC胞内见吞噬凋亡小体， 且DC胞体中出现小颗粒状溶解碎片， 而DC对正常HO8910无吞噬作用。同时FCM检测发现与凋亡细胞共培养的DC， 其共刺激分子表达较空白组和冻融组显著升高， 因此相同数量凋亡肿瘤细胞的免疫原性强于冻融肿瘤抗原， 表明DC通过吞噬负载凋亡细胞后其成熟度的表达明显增加， 行使抗原提呈的功能显著增强。本实验结果证明紫杉醇+顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞并不隔离抗原， 相反使交叉提呈的肿瘤抗原性显著增加， 促进了DC的成熟与提呈作用。

此外， 本研究中还有一个发现， 即冻融组在加冻融抗原前后， DC的共刺激分子表达无明显改变， DC未被冻融抗原活化。我们认为部分原因有可能是由于加入冻融抗原的效价过低， 但更可能是来源于HO8910的冻融肿瘤抗原本身不具有诱导异体DC活化的抗原表位， 但凋亡组加凋亡细胞后， DC的共刺激分子表达改变明显。本研究认为应用凋亡的细胞作为抗原可能不需要识别肿瘤特异性肽段和受MHC限制， 化疗诱导的凋亡细胞有望成为免疫治疗的自身抗原， 这些对于DC疫苗的制备及化疗联合免疫治疗提供了重要的信息。

肿瘤的免疫治疗规范化是一个尚未解决的问题， 如何将免疫治疗与传统的化疗结合起来更是一个空白的领域。越来越多的研究认为化疗诱导的凋亡细胞促进免疫应答反应。因此如何将免疫治疗与化疗合理结合将是今后致力研究的课题， 本课题为此研究提供了重要理论依据。

参考文献

［1］ Correale P， Cusi MG， Del Vecchio MT， et al. Dendritic cellmediated crosspresentation of antigens derived from colon carcinoma cells exposed to a highly cytotoxic multidrug regimen with gemcitabine， oxaliplatin， 5fluorouracil， and leucovorin， elicits a powerful human antigenspecific CTL response with antitumor activity in vitro［J］. J Immunol， 2005， 175(2): 820-828.

［2］ Coukos G， ConejoGarcia JR， Ronder RB， et al. Immunotherapy for gynaecological malignancies［J］. Expert Opin Biol Ther， 2005， 5(9): 1193-1210.

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［5］ Nowak AK， Lake RA， Marzo AL， et al. Induction of tumor cell apoptosis in vivo increases tumor antigen crosspresentation， crosspriming rather than crosstolerizing host tumorspecific CD8 T cells［J］. J Immunol， 2003， 170(10): 4905-4913.

第4篇：细胞核的功能范文

关键词：包装设计;实用功能;审美价值

中图分类号：J0 文献标志码：A 文章编号：1673-291X（2014）31-0024-02

包装设计是人类文化活动的重要组成部分，体现了人类心智的积极、创造。在中国当代包装设计发展的实践进程中，尤其是在信息时代多元文化语境对中国包装设计的围合影响下，把握和坚持包装设计的文化性，挖掘、整理中国包装设计中优秀丰富的文化内涵，将传统的文化思想精髓同当代设计的要素有机结合起来尤为重要。

一、功能的实用价值

商品的包装强调对客户需要的满足，而产品正是满足消费者需要的组合体，而不单单是实体的组件。还包括消费者对虚荣心的满足、对名誉、威望的获取以效用的增进等等。良好的包装能增加产品的功能、扩大产品的效用，成为产品不可缺少的一部分。包装设计，涉及到功能、材料和形式三个方面的因素。设计师的创造能力，都体现于对这三个要素的良好的处理之中。三个要素中，功能决定形式，功能是主导因素。商品包装举具有以下三个功能：

1.保护功能

保护功能是包装最基本的功能，即使商品不受各种外力的损坏。一件商品，要经多次流通，才能走进商场或其他场所，最终到消费者手中，这期间，需要经过装卸、运输、库存、陈列、销售等环节。在储运过程中，很多外因如撞击、潮湿、光线、气体、细菌等因素，都会威胁到商品的安全。因此，作为一个包装设计师，在开始设计之前，首先要想到包装的结构与材料，保证商品在流通过程中的安全。

2.便利功能

所谓便利功能，也就是商品的包装是否便于使用、携带、存放等。一个好的包装作品，应该以“人”为本，站在消费者的角度考虑，这样会拉近商品与消费者之间的关系，增加消费者的购买欲，对商品的信任度，也促进消费者与企业之间沟通。很多人购买易拉罐装的饮料时，都喜欢开盖时的那一声“啪”带来的。

3.销售功能

人们常说“酒香不怕巷子深”、“一等产品、二等包装、三等价格”，只要产品质量好，就不愁卖不出去。在市场竞争日益强烈的今天，营销推广的作用与重要性也为厂商深谙。人们已感觉到“酒香也怕巷子深”。如何让自己的产品得以畅销，如何让自己的产品从琳琅满目的货架中跳出，只靠产品自身的质量与媒体的轰炸，是远远不够的。

在各种超市与自选卖场如雨生春笋般而起的今天，最直接面向消费者是产品自身的包装。好的包装，能直接吸引消费者的视线，让消费者产生强烈的购买欲，从而达到促销的目的。

正如人们常说的 “包装是沉默的商品推销员”。如今，很多聪明的厂商与广告策划公司，都把包装列为企业的4P策略之一（Position市场、Product产品、Package包装、Prices价格）。把包装融入CI之中，在推销产品的同时，也提升了自身的企业形象。

总之，功能的实用价值是包装设计的最根本属性，一旦失去了其实用价值，任何设计都失去了其存在的意义。

二、艺术的审美价值

1.包装设计的综合性

包装涉及知识范围很广泛，对设计师而言现代社会的消费是―个极富挑战的境地，不能用旧的观念来做现代的设计。因此，设计师除了天赋资质之外，创造的关键是敏感，要对商品、商店、市场和其他流通环节的亲身体验和科学的考察，并不断接触变化中的商业态势，深入理解对产品的设计要求、设计定位，然后再依靠高度的创作冲动，获取设计灵感。全面的包装设计，需对包装装饰与包装结构有所侧重，跨出传统的专业设计的范畴，同时兼备的社会和科学职能所具有的较高的科技知识和文学修养所支配着，这样才能运筹帷幄、自如地解决好商品包装的综合表达能力。

在现代包装设计上，我们提倡大胆创新，要适合现代人的不同层面的精神和情感等因素的需要，敢于冒险而寻求新突破，注重个性体现不同类别的商品设计，从多角度、多方面地创造出与内容相适应的现代包装艺术形式，在技法上允许不同手法交互使用，在印刷上尽取不同工艺之所长。因此，对于工艺制作的选择是保证包装艺术质量的关键。包装设计师不仅要意识到而且要准确地、综合和灵活地运用现代技术，以使现代包装设计艺术给人以丰富的联想和美感，并且能具备可欣赏的、具有高品味、时代感和吸引力的整体形象的独立性，从而让人们在购买商品时得到审美的美学价值。

2.包装设计的独特性

商品包装要突出艺术个性。个性即矛盾的特殊性，人们对现实的审美意识具有无限丰富的多样的个性差异，艺术的发展需要创造，而艺术创造的价值则寓于个性之中，每个艺术种类的个性是它区别于其他艺术种类的独特本质特点。包装设计也是同样，商品在流通时必须通过包装来进行区别。同类的或不同类的商品依靠其独特的包装设计来被消费者识别认定最终认可而购买。

包装设计也要有强烈的视觉冲击力。在琳琅满目的商品世界中，唯有亮丽的色彩，与众不同的图案造型，生动地展现产品个性形象，才能使消费者一见钟情。

现代设计讲求破除规矩、平板的格式，讲究富于创造性的、生气勃勃的审美感已成为一种潮流，以往烦琐绮丽的风格已被现代设计中简洁、大方、明快的格调所取代，给人们在忙碌的生活中得以放松，从而吸引消费者的注意，给消费者以审美愉悦，激发购买欲，所有这些正是包装设计的独特性所带来的效应。

利用包装设计的独特性开拓市场之路、引领市场消费作用不可低估，大有文章可做。

3.包装设计的欣赏性

任何成功的艺术都富有美的价值，而美的艺术必须服务于现实生活，因为每一个艺术作品的产生都包括艺术取材、美的想象和表达，这是客观表现与艺术内容构成的需要。包装设计的艺术特点就是要表现内在的本质，而美必须符合实用、经济和准确，迅速传递商品信息的原则。现代包装在设计上更关注情感，关注家庭，营造生产氛围，这已成为现代包装设计审美特性的一项重要内容。总体来看，这一系列包装，注重实用与审美的统一，设计上更多关注是美学价值的含量，即在统一中求变化，在变化中又有一种完善的整体感，呈现出雅致而高贵的宣染力和优美而深沉的历史文化感。这种变化不仅是人类的富足表现，也是提高人类精神需要的表现，包装所体现的民族风格和时代气魄的美，具有了一定的珍藏价值和欣赏意义。

4.包装设计的传播性

包装设计还具有其审美的传播性。在现代激烈竞争的市场环境中，好的包装设计不仅能让厂商获得丰厚的利润和效益，而且还能使消费者在购买商品使用价值的同时得到美的享受。应该说，商品的外表包装是商品走向市场的必要组成部分。它是直接与顾客相识的首当其冲的因素，消费者正是通过它传达的相关文字、图形、色彩信息，直观有效地认识和把握商品品质的优劣，本身与商品性质的适合度，做出是否喜爱和购买的决策。

包装设计的流行渗透着审美观念的流行。包装设计归根到底是人的设计;是以人的需要为主要功能的设计;是植根于自身的历史背景、文化传统和民族精神的设计，真正流行与审美的设计是真实、科学、合理的设计。包装设计的根本原则是艺术性与功能性的完美结合，任何脱离或有悖于功能性的所谓艺术性，都将失去其存在的意义;任何只注重功能性而没有艺术性的设计，也丧失了包装设计的艺术灵魂。我们要真正做到艺术性与功能性的完美结合，充分发挥出包装设计的实用功能和审美价值，创造出更大的商业和文化价值。

参考文献：

[1] 黄俊彦，邢浩.现代商品包装视觉传达设计[J].包装世界，2005，（3）.

[2] 郑秀敏.浅议现代包装设计[J].甘肃农业，2005，（9）.

第5篇：细胞核的功能范文

【摘要】

目的 观察新诊断老年糖尿病（DM）患者胰岛β细胞功能特点及其与胰淀素、褪黑素的关系。方法 收集初诊DM患者60例，其中老年DM组27例，成年DM组33例，对照组30例。均行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），计算胰岛β细胞功能指数（HOMAβ）。采用ELISA法检测患者空腹血清胰淀素、褪黑素水平。同时测定所有受试者的血脂、体重指数（BMI）和腰臀比（WHR），并对结果进行统计分析。结果 （1）老年DM组与成年DM组比较HOMAβ明显降低〔(58.20±24.89) vs (81.20±40.80)，P

【关键词】 糖尿病；老年；胰岛β细胞功能；胰淀素；褪黑素

老年糖尿病（DM）与成年DM比较具有起病隐匿、症状不典型、进展缓慢等特点，其发病原因尚不明了，胰岛β细胞功能下降是其发病的主要机制之一。胰淀素和褪黑素是分别由胰腺和松果腺分泌的老年相关激素，近年国外有些研究表明胰淀素、褪黑素与老年DM的发生有一定的关系〔1，2〕。本研究通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT），分析老年DM患者的胰岛β细胞功能特点；并检测老年DM患者血清胰淀素、褪黑素的浓度，进一步探讨两种老年相关激素与胰岛β细胞功能的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

病例组60例，为2007年10月至2009年8月期间在我院内分泌科住院及门诊新诊断的2型糖尿病（T2DM）患者，年龄25～94岁，均未接受胰岛素治疗，符合下列标准：（1）行OGTT后均符合1999年WHO T2DM的诊断标准；（2）空腹胰岛素（Fins）≥5 μIU/ml；（3）空腹血糖（FPG）≤10 mmol/L。（4）谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞自身抗体均阴性。按发病年龄分为两组，老年DM组（≥60岁）27例，男14例，女13例，平均年龄（74.59±8.79）岁，成年≥组（25～59岁）33例，男17例，女16例，平均年龄（45.76±8.54）岁。健康老年对照组30例，选择同期健康体检者，年龄、性别与老年糖尿病组相匹配，无吸烟史，排除糖尿病、糖耐量减低、冠心病、高血压、脑血管病及肿瘤等疾病。

1.2 方法

1.2.1 标本收集

所有受试者对本试验知情。老年健康体检者在禁食12～14 h后，在无应激情况下采空腹肘静脉血。60例DM人均做OGTT及胰岛素释放试验，清晨空腹取静脉血后一次性口服75 g葡萄糖，并分别于0.5、1、2、3 h后取静脉血做血糖及胰岛素测定。所有收集的血液分离出血清，于-70 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 检测指标

采用OLYMPUS AU540全自动生化分析仪测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）和血清葡萄糖（GLU）。胰岛素(INS)测定采用电化学发光免疫法，试剂由罗氏公司提供，仪器：电化学发光免疫法测定仪2010Elecsys。胰淀素、褪黑素测定采用ELISA，应用美国R&D公司试剂盒（板内板间变异系数均小于10%），按说明书操作。腰围、臀围、身高、体重由专人测定。

1.2.3 计算指标

体重指数（BMI）=体重（kg）/身高2（m2）。腰臀比（WHR）=腰围（cm）/臀围（cm）。按HOMA模型计算胰岛素抵抗指数〔HOMAIR=(Fins×FPG)/22.5〕及胰岛β细胞功能指数〔HOMAβ=20×Fins/(FPG-3.5)〕。

1.3 统计学分析

所有数据统计采用SPSS13.0软件进行，连续性计量资料以x±s表示，非正态分布的资料以对数转换成正态分布后输入。两组间比较采用独立t检验 ，计数资料比较采用χ2检验。相关分析采用直线相关分析。

2 结 果

2.1 各DM组OGTT各点血糖、胰岛素值的比较

老年DM组OGTT 2 h血糖及胰岛素值均高于成年DM组（均P

2.2 各组研究对象的临床指标比较

老年DM组与成年DM组比较，HOMAβ、TG均明显降低（P

2.3 老年糖尿病组HOMAβ与其他指标的相关性

在老年DM组内，HOMAβ与褪黑素呈明显正相关（r=0.403，P=0.016），与胰淀素(r=-0.461，P=0.003)、HOMAIR(r=-0.238，P=0.009)呈明显负相关，与FPG、INS、TG、WHR则无明显相关性，见表3。表3 老年糖尿病组胰岛β细胞功能与其他指标的相关性(略)

3 讨 论

胰淀素，又称胰岛淀粉样多肽（IAPP），在胰岛β细胞和胰岛素一起表达、合成、分泌，被认为是胰岛素的孪生兄弟，各种影响胰岛素分泌的因素同时也影响胰淀素的分泌。本研究结果显示，老年DM组血清胰淀素水平明显高于老年健康组，与国外〔3〕的研究结果相一致。相关分析还显示HOMAβ与胰淀素、HOMAIR呈明显负相关，说明增高的胰淀素可能是老年糖尿病患者胰岛素分泌缺陷的一个重要原因。胰淀素之所以能够导致胰岛功能受损，一方面可能由于胰淀素能抑制胰岛素的释放，提高血浆游离脂肪酸的水平，抑制肌肉组织对葡萄糖的摄取，抑制肝细胞对葡萄糖的利用和促进葡萄糖的产生而诱导胰岛素抵抗的发生。另一方面，胰淀素可自我聚集、变性、沉积在胰岛β细胞内，通过直接的氧化作用，在细胞膜形成特异性钙离子通道，增加P53和P21的表达等机制引起胰岛β细胞的损伤和凋亡，导致胰岛β细胞绝对数目的减少〔4〕，使胰岛素分泌最终减少。

通过抑制胰淀素的代谢异常、阻止胰淀素的聚集或拮抗其作用，均具有抗老年糖尿病的潜力。以胰淀素为作用靶点的药物将可能成为治疗老年糖尿病的全新手段。

褪黑素，N乙酰5甲氧基色胺，是色氨酸的衍生物。近年研究表明其是迄今已知的最强的自由基清除剂，能对抗氧化应激，对DM及其并发症有一定的治疗作用〔5，6〕。Ha等〔7〕通过实验证明褪黑素在分子水平上对血糖有稳定作用，并进一步推断老化使内源性褪黑素水平下降，可能与老年DM的发生发展有关。本文亦发现，老年DM组血清褪黑素水平明显低于健康对照组，进一步说明了衰老导致的褪黑素水平下降可能为老年DM发生的原因之一。经相关分析，本文还发现HOMAβ与褪黑素呈正相关。大量的动物及人体试验也证明褪黑素能够降低血糖，对胰岛β细胞具有保护作用〔8，9〕。

综上，胰淀素、褪黑素均与老年糖尿病胰岛β细胞功能有一定的相关性，但具体的分子机制目前尚不清楚，仍有待进一步深入研究。由于本研究样本量有限，还需进一步扩大样本量更深入了解胰淀素、褪黑素与老年DM胰岛β细胞功能的相互关系，从而寻求有效预防及治疗老年DM的新途径。

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第6篇：细胞核的功能范文

关键词: 肾病综合征;受体，白细胞介素2;T淋巴细胞;免疫，细胞

摘 要:目的 观察原发性肾病综合征（PNS）患者细胞免疫功能变化. 方法 采用双抗体夹心ELISA法检测血清可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R），流式细胞仪测定外周血T细胞亚群（CD3+ ，CD4+ ，CD8+ ）及红细胞C3b受体花环（RBC-C3b RR）和红细胞免疫复合物花环（RBC-ICR）试验. 结果 原发性肾病综合征组sIL-2R明显高于对照组［（398±122）vs（202±84）pmol・L-1 ，P

+ ，CD8+ 较对照组明显降低（0.50±0.08）vs（0.71±0.07），（0.26±0.07）vs（0.36±0.07），（0.22±0.05）vs（0.31±0.06），P

Keywords:nephrotic syndrome;receptors，interleukin-2;T-lymphocytes;immunity，cellular

Abstract:AIM To investigate cellular immune function and　erythrocyte immune function in patients with primary nephrotic syndrome（PNS）.METHODS Soluble interleukin2receptors（sIL-2R）were detected by ELISA.T-lympho-cyte subsets（CD3+ ，CD4+ and CD8+ ）were also evaluated by flow cytometry（FCM）.The red blood cell C3b receptor rosette（RBC-C3b RR）and the red blood cell immune com-plexs rosette（RBC-ICR）were measured.RESULTS Serum sIL-2R levels were significantly higher in PNS than in normal controls ［（398±122）vs（202±84）pmol・L-1 ，P

0 引言

研究发现，机体免疫功能的异常或紊乱是引起肾脏疾病的基础［1，2］ ，它在肾脏疾病的免疫发病机制中的作用日益受到重视［3，4］ .我们通过检测原发性肾病综合征（PNS）患者血清可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R），T细胞亚群及红细胞免疫功能，旨在探讨PNS患者细胞免疫功能变化的意义.

1 对象和方法

1.1 对象 PNS患者40（男22，女18）例，年龄16～64（平均40）岁，均为住院患者，通过实验检查及临床确诊.对照组20（男13，女7）例，年龄20～40（平均30）岁，血、尿常规及肝肾功能正常.

1.2 方法

1.2.1 血清SIL-2R的测定 采用双抗体夹心ELISA法，试剂盒由第四军医大学免疫学教研室提供，具体操作步骤按说明书进行. 1.2.2 T细胞亚群的测定 取抗凝全血100μL，分别加10μL FITC标记抗CD3、抗CD4、抗CD8和IgG鼠单抗混匀，室温放置15min后，用QPREP自动细胞制备仪（Bekmn-coulter公司产品），加ABC液溶解红细胞和稳定淋巴细胞，轻轻摇荡10min立即用ProfileⅡ型流式细胞仪（美国Coullter公司产品）分析，所用激光光源为15mW氢离子激光，波长为A488nm ，检测1000个以上细胞.

1.2.3 红细胞免疫功能的测定 采用C3b 受体花环（RBC-C3b RR）和红细胞免疫复合物花环（RBC-ICR）试验（第四军医大学免疫学教研室提供）.预备试验:将补体致敏的酵母和未致敏的酵母冻干试剂，按说明书要求溶解、洗涤，配制成1×1011 个・L-1 的密度;另取患者末梢血或肝素125kU・L-1 抗凝血1滴，加入2mL生理盐水，每次经2000r・min-1 离心3min后，配制成1.25×1010 个・L-1 密度的红细胞悬液.

吸取致敏酵母菌悬液与未致敏酵母菌悬液各50μL，分别加入试管中，混匀，置37℃水浴中30min后取出涂片，加2.5g・L-1 戊二醛1滴，轻轻混匀，自然干燥，进行姬姆萨染色，用油镜（Olympus，日本产）观察.1个红细胞上结合两个或两个以上酵母菌者为1个阳性花环细胞，共计数200个红细胞，计算出RBC-C3b RR和RBC-ICR的百分率（%）.

统计学处理:实验数据以x ±s表示，两组间比较采用t检验，用SPLM统计软件包进行统计分析.

2 结果

2.1 sIL2R及T淋巴细胞亚群的变化 PNS患者外周血sIL-2R水平较对照组明显增高，有显著差异（P

+ ，CD8+ 较对照组明显降低，有显著差异（P

表1 sIL-2R及T淋巴细胞亚群的变化　略

2.2 红细胞免疫功能的变化 PNS患者RBC-C3bRR明显低于对照组，有显著差异（P

表2 红细胞免疫功能的变化　略

3 讨论

PNS是由原发性肾脏病引起，并非是细菌等致病因子直接侵犯肾脏引起，而是与免疫反应相关，当致病的抗原进入人体后，被吞噬细胞摄取，淋巴细胞对这些抗原进行识别引起免疫反应，造成肾小球损伤.目前已证实是一组免疫介导性疾病［5］ .T淋巴细胞亚群是构成机体免疫系统的重要因素，体内免疫平衡是通过辅T细胞CD4+ 和抑制性T细胞CD8+ 形成的T细胞网络来维持调节免疫功能的平衡［6］ ，二者的升高与降低，均可使两者的比例失调，导致机体免疫功能的异常或紊乱［7］ .免疫学研究证实，红细胞具有抗原提呈细胞作用，能促进T细胞的免疫功能，扩大细胞免疫效应，参与细胞免疫调控［8］ ，并能清除体内的免疫复合物，促进吞噬细胞的吞噬功能，调节体液免疫和细胞免疫，粘附自身的T细胞，增强T细胞免疫功能，更有效地清除免疫复合物［9］ .本资料显示PNS患者血清sIL-2R水平明显高于对照组（P

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第7篇：细胞核的功能范文

【摘要】 目的 观察连枷胸犬胸壁加压包扎、肋骨牵引和手术内固定的治疗效果。方法 实验用Beagle犬24只，随机分为A组(对照组)、B组(包扎治疗组)、C组(牵引治疗组)和D组(手术固定组)，每组6只，建立大面积(15cm2/kg)浮动胸壁动物摸型。用MPA动物肺功能记录仪、血气分析、胸腔置管等观察犬呼吸频率(RR)、潮气量(Vt)、每分钟静息通气量(VE) 、肺顺应性(CL)、气道阻力(Raw)、动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、动脉血氧饱和度(SaO2)、剩余碱(BE)及胸膜腔内压(IPP)等变化，比较胸壁加压包扎、肋骨牵引固定和手术内固定的治疗效果。结果 浮动胸壁模型完成后，均出现反常呼吸，胸膜腔内压负压绝对值减小(P

【关键词】 连枷胸；生理学；肋骨骨折；牵引术；包扎；内固定

Abstract： Objective To study curative effect of pressure dressing on chest wall，traction and internal fixation on pulmonary function in dogs with flail chest.Methods A total of 24 Beagle dogs were set up as great floating thoracic wall models(15cm2/kg)， then pided into internal fixation group，rib skeletal traction group，pressure dressing group and control group randomly，with 6 dogs in each group.The change of respiratory rate(RR)，tidal volume(Vt)，minute ventilation(VE)，lung compliance(CL)，airway resistance(Raw)，partial pressure of oxygen in artery (PaCO2)，partial pressure of carbon dioxide in artery(PaCO2)，arterial oxygen saturation(SaO2)，base excess(BE)，intrapleural pressure(IPP) were observed and recorded by MPA pulmonary function recorder and blood gas analysis.At last the therapeutic effect was compared among 4 groups.Results Paradoxical respiration occurred；intrapleural pressure decreased(P

Key words：flail chest;physiology;rib fracture;traction;dressing；internal fixation

连枷胸是最严重的胸壁损伤，其病死率达12%～50%［1］。对连枷胸浮动胸壁固定治疗，其固定方法的选择与对连枷胸所牵涉的复杂的病理生理的认识密切相关。近年来，国内外学者大多认为连枷胸所致的呼吸困难主要是由肺挫伤和反常呼吸引起［2］ 。笔者通过动物实验，排除肺挫伤的影响。观察大面积浮动胸壁对犬呼吸功能的影响以及胸壁加压包扎、肋骨牵引和手术内固定治疗的作用。

材料与方法

1 动物分组与模型建立

试验用Beagle犬24只，体重为(10.32±1.56)kg。用3%戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉注射麻醉，气管插管后在右侧胸部相应面积(15cm2/kg)肋骨的两端切开胸壁皮肤，各游离肋骨3cm，保持胸膜完整，切断并剪去肋骨1cm，以确保损伤区域的胸壁能随呼吸自由浮动，缝合切口。模型制成后，随机分为4组，每组各6只犬（雌雄不拘）。A组为对照组，不进行治疗干预；B组为包扎治疗组：以浮动胸壁为中心，选用相应大小的厚棉垫加压包扎，使浮动胸壁极度内陷，进而消除反常呼吸；C组为牵引治疗组：行肋骨巾钳悬吊牵引固定，牵引重量为0.5～1kg，以正好对抗反常呼吸运动为宜；D组行手术切开复位，钢板＋螺丝钉内固定治疗。上述3种治疗方法，在治疗过程中均需保持胸膜腔完整。

2 观察指标

对实验犬行全麻气管插管后，气管插管外接MPA动物肺功能记录仪，测呼吸频率（RR）、潮气量(Vt)、每分钟通气量(VE)、肺顺应性(CL)、气道阻力(Raw)。于术侧腋中线第8肋间置胸腔管，接MPA动物肺功能记录仪测胸膜腔内压（IPP），适时记录测量结果。采抽取动脉血测动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、动脉血氧饱和度(SaO2)、剩余碱（BE）、SB等。分别记录模型建立前、制模1小时、A组制模4小时、B、C、D组模型建立后4小时的上述观察指标。

3 数据处理

所测数据经SPSS 13.0统计软件，采用多个样本均数间的多重比较的统计学方法（SNKq）进行统计学分析。

结 果

浮动胸壁模型完成后，24只犬均出现胸壁反常运动，浮动幅度2～3cm。胸膜腔内压负压绝对值减小(P

讨 论

1 连枷胸行胸壁固定治疗的理论依据

胸壁的完整性对呼吸功能的维持有重要作用。连枷胸肺容量的减少主要是胸壁不稳及肺挫伤所致的纤维化导致。通常将连枷胸分类为前外侧区和后外侧区，两种类型均包含侧面区域，该区有反映呼吸力学的前锯肌指状突的插入。Borrelly等［3］报道前锯肌在连枷区错位复杂的病理生理过程中有重要作用，当涉及肩关节活动或作为吸气肌时，连于每根肋骨上的前锯肌指状突有如拉抽屉一样使连枷区错位，使其向后上方移位，由此产生肋骨断端重叠，并会导致伤者肺容量减少的恶性循环。外科手术固定骨折肋骨可有效防止或中止肋骨错位的恶性循环，早期复位和固定骨折肋骨，恢复胸壁的几何形状，保持胸壁的完整性，避免了因胸壁变形对肺功能的损害。Voggenreiter等［4］证实了对无肺挫伤连枷胸患者首先行手术治疗的重要性。据Clark等［5］统计31％的孤立性肺挫伤患者需要机械通气治疗，而57％的孤立性连枷胸患者需要机械通气治疗，再次强调了胸壁机械性完整性的重要作用。

2 胸壁加压包扎固定的治疗效果

20世纪初期对连枷胸采用捆绑固定的方法进行治疗，当时认为包扎固定可增加胸壁稳定性、减少疼痛和可能有助于咳嗽。本实验结果表明，在大面积连枷胸包扎固定后与对照组比较，IPP、Raw、RR显著升高（P

3 牵引固定的治疗效果

肋骨牵引固定是过去临床常用于浮动胸壁的一种方法，认为牵引固定后连枷胸侧胸壁的几何形状可恢复，胸腔容积可增加，牵引固定保持了胸壁的完整性，避免了因胸壁变形对其下肺区域的压迫，从而能产生足够的潮气量。本实验结果表明：与对照组比较，牵引治疗后Vt、Raw显著升高（P0.1）。说明牵引治疗后实验犬的潮气量虽有部分增加，但IPP、PaO2、PaCO2、SaO2、BE、CL、VE、RR变化不明显，其低氧状态未能得到有效改善。这主要是因为大面积浮动胸壁形成后，牵引固定虽能部分改善通气，但由于牵引外力持续作用于伤侧胸壁，对抗其弹性回缩，被牵引的浮动胸壁无法与健侧胸壁进行协同呼吸运动，无法恢复肋骨生理状态杠杆作用，胸廓生理状态的完整性未能得以恢复，肺的顺应性改善不明显，故呼吸功能仍不能恢复正常，缺氧状态无法得到有效改善。所以，至少对于大面积连枷胸来说，单纯行牵引固定无法达到满意疗效。

4 手术内固定的治疗效果

1975年Richardson等［6］首次报道了用钢丝修复胸骨骨折的方法。连枷胸手术内固定可有效地减少机械通气时间和ICU时间，减少肺炎的发病率及降低病死率，恢复胸壁的几何形状及生理状态的完整性，恢复肋骨生理状态杠杆作用，提高伤侧肺的顺应性，进而改善呼吸功能。本实验结果表明，与对照组比较，手术内固定治疗后PaO2、PaCO2、SaO2、CL、Vt、VE显著升高（P

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第8篇：细胞核的功能范文

【摘要】 目的：探讨他克莫斯（tacrolimus， FK506）对大鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)分化、成熟和免疫学活性的影响. 方法：收集大鼠骨髓源性DCs，加入不同浓度的FK506进行培养，采用流式细胞术行DCs表型分析，ELISA法检测培养上清中IL12 的水平并行体外混合淋巴细胞反应（MLR），观察DCs对同种T细胞的刺激能力. 构建大鼠肾移植模型，于移植前7 d输注FK506处理的DCs，观察移植肾存活时间. 采用ELISA法检测MLR培养上清和移植大鼠血清中TH1/TH2细胞因子IFNγ，IL2，IL4 和IL10的表达水平. 结果：FK506对DCs表面分子(Iad，CD80和CD86)的表达无明显影响(P>0.05)，而IL12的分泌水平降低(P

【关键词】 他克莫斯; 树突状细胞; 免疫耐受; 器官移植

【Abstract】 AIM: To investigate the effect of tacrolimus (FK506) on the differentiation， maturation and function of rat bone marrowderived dendritic cells (DCs). METHODS: We added tacrolimus at concentrations of 5-20 μg/L to the DCs culture and checked the expressions of activation markers (Iad， CD80 and CD86) by flow cytometry， the release of cytokines IL12 by ELISA and the stimulatory capacity of the resulted DCs by mixed lymphocyte reaction (MLR). Thirty Wistar rats were pided into 3 groups (n=10 in each): group A accepted kidneys from SD donors; group B was infused with DCs derived from SD donors 7 d before transplantation; group C was the same as that in group B except the DCs were treated with tacrolimus during culture. The functions of the transplanted kidneys were evaluated by urine volume and ELISA was used to detect the levels of Th1/Th2 cytokines， such as IFNγ， IL2， IL4 and IL10 in the MLR and in the sera of the recipients 7 d after culture or transplantation. RESULTS: Even at the stimulation of lipopolysaicharide (LPS)， in the tacrolimustreated culture， we observed no significant effects on the expressions of activation markers (Iad， CD80 or CD86). The release of IL12 and the stimulatory capacity of tacrolimustreated DCs were reduced， compared with control DCs (P

【Keywords】 tacrolimus; dendritic cells; immune tolerance; organ transplantation

0引言

树突状细胞(dendritic cells， DCs)是专职性抗原递呈细胞(antigenpresent cell，APC)，它与效应T 细胞的相互作用决定着免疫应答的发生(激活/耐受)及强度. 近年来，DCs在移植免疫耐受诱导、自身免疫性疾病和变态反应性疾病的治疗等方面展现出独特的应用价值［1］. 我们观察了他克莫斯（tacrolimus， FK506）对骨髓源性DCs成熟与免疫功能的影响，初步探讨FK506在免疫应答早期抗原提呈过程中的作用.

1材料和方法

1.1材料

健康雄性Winstar大鼠和SD大鼠，体质量250～350 g（上海斯莱克公司），在无特定病原体(specific pathogenfree， SPF)环境中饲养. FK506（日本藤泽制药公司）；重组粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rGMCSF)与外源性脂多糖(LPS)（Sigma公司）；RPMI 1640培养基及胎牛血清（Gibco公司）；PE标记的小鼠抗大鼠Iad，CD80，CD86 mAb（eBioscience公司）；IL12，IL4，IL10，IL2， IFNγ的ELISA试剂盒（Bender公司）；3HTdR（Amersham Life Science公司）. EpicXL型流式细胞仪(美国BeckmanCoulter公司).

1.2方法

1.2.1骨髓来源DCs的提取与鉴定参照文献［2］的方法，取SD大鼠（供者）股骨，冲洗出骨髓细胞，以1∶10的体积比加入37℃预温的TrisNH4Cl去除红细胞；加GNK缓冲液终止反应，离心洗涤2次；用RPMI 1640调细胞密度为1×109/L，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养2 h；轻轻洗去非粘附细胞；在贴壁细胞中加入含10 μg/L rrIL4和10 μg/L rrGMCSF的RPMI 1640完全培养基，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养6～7 d，收集生长状态良好的DCs备用.

1.2.2DCs表型与分泌IL12水平分析将DCs分成4组，每组设3复孔：① 对照组(DCs组)；② FK506处理组(FK506DCs组)：培养液中加入不同浓度FK506（5， 10， 20 μg/L）；③ 脂多糖刺激组(LPSDCs组)：在培养结束前18 h加入100 μg/L LPS；④ FK506处理+脂多糖刺激组(FK506LPSDCs组). 在37℃， 50 mL/L CO2条件下培养7 d，收集培养上清液，ELISA方法检测IL12水平（按试剂盒说明书进行）. 收获细胞（2×109/L）；分别加入PE标记的抗Iad， 抗CD80或抗CD86 mAb(终浓度5 mg/L)，4℃作用45 min；流式细胞仪分析，以中位荧光强度（MFI）作为检测指标.

1.2.3体外混合淋巴细胞反应(MLR)分析取Winstar大鼠（受者）脾脏，制备无菌脾细胞悬液；过尼龙毛柱获取非粘附的T 淋巴细胞作为反应细胞，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养1 h，调细胞密度为1×109/ L. 以25 mg/L丝裂霉素灭活SD大鼠DCs（DCs；LPSDCs；FK506DCs）作为刺激细胞( 2×108/L)，37℃， 50 mL/L CO2条件下培养30 min；刺激细胞/应答细胞( S/E) 以不同浓度比(1∶5， 1∶10， 1∶20)加入96孔细胞培养板中，总反应体积为200 μL，含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基培养72 h；于培养结束前18 h每孔加入3HTdR 3.7×104 Bq；β计数仪测量待测细胞的3HTdR掺入值(cpm).

1.2.4大鼠肾移植模型的建立与分组以SD大鼠为供体、Wistar大鼠为受体，参照文献［3］加以改进，采用肾动脉与腹主动脉端侧吻合、肾静脉cuff套管法吻合、供体膀胱瓣与受体膀胱吻合. 将受者Wistar大鼠分为3组，每组10只.① 对照组(A组)；② DCs 组(B组)：肾移植术前7 d自大鼠尾静脉注入DCs 细胞悬液0.5 mL (4×109/L)；③ FK506DCs 组(C组)：肾移植术前7 d注入FK506DCs细胞悬液0.5 mL (4×109/L). 术后于代谢笼内培养，观察大鼠移植肾存活情况，出现无尿即认为移植肾脏失功能.

1.2.5Th1/Th2细胞因子测定在体外MLR中，加入3HTdR前收集培养上清；动物实验中，移植7 d后抽取受鼠尾静脉血并分离血清，ELISA试剂盒说明书分别检测IFNγ， IL2， IL4和IL10 水平.

统计学处理： 应用SPSS 10.0软件包进行数据处理， 两组间比较采用随机分组t检验方法， 多组间比较采用单因素方差分析方法， 以P

2结果

2.1DCs表型分析FK506DCs组Iad，CD80和CD86的表达水平与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05). LPS刺激后，Iad，CD80和CD86的表达显著增加，与未处理组比较差异有统计学意义(P0.05，表1).表1他克莫斯(FK506)和外源性脂多糖(LPS)对DC表面分子表达的影响 (略)

2.2DCs分泌细胞因子IL12检测在DCs培养的第7日，FK506DCs组培养上清中的IL12水平分别为: 5 μg/L组(105.0±9.5) ng/L；10 μg/L组（74.4±6.6） ng/L； 20 μg/L组（41.7±3.9） ng/L. 明显低于DCs组的(176.8±19.7) ng/L (P

2.3DCs对同种T 细胞MLR检测LPS刺激活化的DCs可以诱导T细胞活化，FK506处理的DCs促进T细胞增殖的能力明显受到抑制，与对照组比较差异有统计学意义(P

2.4移植物的存活时间对照组移植肾脏的存活时间(6.3±0.7) d与DCs组 (7.2±1.4) d比较，差异无统计学意义，FK506DCs组移植肾脏的平均存活时间延长至(19.0±2.3) d，同另两组比较差异有统计学意义(P

2.5Th1/Th2细胞因子检测在体外MLR（图3）和动物实验（图4）中，FK506处理DCs组与DCs组比较，IL2，IFNγ水平均明显降低(P

3讨论

近几年，DCs在移植免疫耐受中的作用逐渐受到重视［1］. DCs是目前发现的功能最强的APCs［4-5］，也是唯一能够激活初始型T 细胞启动初次免疫应答的APCs，调节免疫激活/耐受的平衡［6］. 从上世纪九十年代初开始，FK506作为免疫抑制剂应用于器官移植领域，因为其强效、低毒性等特点，在短短的十几年临床应用过程中，以FK506为基础的免疫抑制方案已经逐步超过以环孢霉素为基础的免疫抑制方案，成为临床器官移植免疫抑制的首选药物. 迄今为止，对FK506免疫抑制效应的理解集中在其对T淋巴细胞的负性调节作用，既抑制T 淋巴细胞的增殖和免疫效应因子如IL2，IFNγ等的分泌. 最近有研究表明［7-9］，FK506也能够影响DCs的成熟和功能，在免疫应答早期既抗原提呈过程中发挥作用.

我们用大鼠骨髓造血干细胞成功地诱导出DCs，并在体外观察FK506对DCs细胞表型和刺激T细胞活化增殖能力的影响. 发现FK506并不影响DCs表面共刺激分子CD80，CD86和MHCII类分子Iad的表达，这些分子是DCs成熟的标志. 在实验中加入LPS刺激加速了DCs的成熟过程，而FK506对这一过程同样无抑制作用，提示FK506并不影响DCs的成熟过程. IL12是DCs成熟过程中分泌的一种主要的效应细胞因子，能促进Th0细胞分化为Th1细胞，从而诱导Th1型细胞介导的免疫反应. FK506处理DCs的IL12分泌水平明显降低， 即使加入LPS刺激后IL12的分泌也无明显增加， 提示FK506抑制DCs的抗原提呈功能可能是通过降低IL12的分泌来完成.

在体外混合淋巴细胞培养中，FK506处理的供者来源的DCs，可明显抑制T 淋巴细胞的增殖与活化，并呈现为剂量依赖关系. 在大鼠体内实验中，FK506DCs回输给受者后可明显延长移植物存活时间. FK506DCs回输作为一种简单易行的方法，更易于进入移植临床，虽然应用FK506诱导免疫耐受尚有待研究，但至少可以降低移植受者术后免疫抑制剂用量，减少药物的毒副作用. 在体外MLR和动物体内实验中，均发现经FK506处理的DCs可显著降低Th1亚群淋巴细胞分泌的细胞因子水平，而Th2亚群细胞因子的分泌水平显著提高，表明FK506处理的DCs能抑制T淋巴细胞向Th1的分化，并诱导其向Th2分化，这可能是移植物长期存活的主要或至少是相关的重要因素. IL10在体内外表达水平的差异说明体内环境远较体外复杂，这可能是某些效果明显的体外研究，进入临床却不尽人意的原因之一. 在临床实践中，部分器官移植受者在因为各种原因的免疫抑制剂裁撤过程中表现出特异的免疫无反应性，我们推测，FK506对DCs的影响可能在这一现象中发挥作用.

总之，探讨FK506对抗原呈递细胞、特别是DCs的作用，必将加深和完善对FK506免疫抑制作用机制的理解，使其更合理的应用于临床，而FK506表现出的诱导免疫耐受的作用也为免疫耐受的诱导方法提供一个全新的切入点.

基金项目：福建省自然科学基金（C0510033）

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第9篇：细胞核的功能范文

[关键词] 精神分裂症；细胞免疫；T淋巴细胞亚群；白介素

[中图分类号] R749.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）02（c）-0012-03

近年来，精神分裂症的免疫功能学逐渐成为了精神病学界的研究热点，神经-内分泌-免疫系统之间的相互作用、相互调节关系日益受到重视。大量研究结果表明，精神分裂症患者很可能存在病毒感染与自身免疫系统的问题。电针治疗是指在刺入人体穴位的毫针上，采用电针机通以微量低频脉冲电流的一种治疗方法，目前在临床上已得到广泛的应用，且取得了较好的治疗效果[1-6]。目前，电针治疗应用于慢性精神分裂症患者的报道并不多见。所以，为了检验电针合并抗精神病药物治疗对慢性精神分裂症患者免疫功能的影响，特进行此次研究。

1 资料与方法

1.1 一般资料

患者均来自呼和浩特市康复医院连续性住院的慢性精神分裂症患者（即经过两种以上药物系统或间断性治疗而无效、且排除其他躯体障碍者）。实验时间从2009年6月～2010年2月。根据DSM-IV有关精神分裂症的诊断标准，随机选取无严重躯体疾病及自身免疫性疾病、无烟酒嗜好和药物滥用、非妊娠和哺乳期的慢性精神分裂症患者65例，并分为药物治疗组和针药治疗组。药物治疗组患者34例，其中，男20例，女14例；年龄19～63岁，平均（44.2±10.1）岁；病程5～38年，平均（19.5±9.5）年。针药治疗组31例，其中，男18例，女13例；年龄20～58岁，平均（40.4±8.5）岁；病程 5～37年，平均（15.8±8.8）年。两组患者年龄和病程等一般情况比较差异均无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。其中药物治疗组患者于实验第1周及第4周脱落2例，针药治疗组于第2周脱落1例。

1.2 方法

1.2.1 药物治疗组 选用氯氮平治疗，剂量150 mg/d，1次/d，每晚口服，治疗观察时间为6周。

1.2.2 针药治疗组 除应用上述药物治疗外，每日针灸1次，并使用电针仪辅助治疗，时间为20 min/次，电量以患者能承受的最大电量为度；选取百会、印堂、四神聪、膻中等穴位，治疗观察时间为6周。选用长2寸的针具，手法为平补平泄。

1.3 临床评估

在治疗开始前及治疗第6周后，由2名经过专业培训的主治医生采用简明精神量表（BPRS）、阴性症状量表（SANS）、阳性症状量表（SAPS）评定所有被试者的精神症状[7-8]。

1.4 实验室检测

所有被试均在治疗前1 d及治疗第6周后早晨6～7点取空腹静脉血5 mL，运用流式细胞术测定T淋巴细胞亚群CD3、CD4、CD8；采用 Elisa法测定白介素2（IL-2）、白介素6（IL-6）水平。CD3、CD4和CD8试剂盒以及流式细胞仪均由BD公司提供；IL-2和IL-6试剂盒由 Beckman公司提供。所有样本均由同一名人员测定，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5 统计学方法

所有数据均采用SPSS 17.0统计软件包进行处理与分析。计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组疗效评定比较

两组患者在治疗6周后的BPRS、SAPS和SANS量表得分显著低于治疗前（P < 0.01）。针药治疗组治疗6周后BPRS、SAPS和SANS量表得分显著低于药物治疗组（P < 0.01）。见表1。

2.2 两组治疗后临床量表的减分率比较

经过6周的治疗后，针药治疗组的临床量表评分减分率显著大于药物治疗组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2。

2.3 T淋巴细胞亚群检测比较

针药治疗组的CD4的水平在治疗后显著高于药物治疗组（P < 0.05），其他因子组间比较差异均无统计学意义（均P > 0.05）。见表3。

2.4 两组治疗前后IL-2、IL-6水平的比较

两组患者治疗前血清IL-2、IL-6比较差异无统计学意义（均P > 0.05）；治疗后针药治疗组血清IL-2、IL-6水平显著低于药物治疗组（P < 0.05、P < 0.01）。见表4。

2.5 安全评估

试验期间，两组患者均未出现不良反应。

3 讨论

随着细胞免疫学的发展.有关精神分裂症患者细胞因子及其受体的研究已成为精神神经免疫学中较为活跃的领域之一。很多研究证实精神分裂症患者存在免疫功能的异常，并且具有自身免疫性疾病的特点，主要是CD3、CD4、IL-2和IL-6的改变与中枢神经递质的异常，尤其是多巴胺能神经元功能亢进，这些变化主要是通过神经-内分泌-免疫网络相互影响。但三者之间的改变何为初始原因，何为继发因素尚难判断，故对精神分裂症进行免疫学研究有助于揭示其病理机制。

以往的一些研究表明[9-15]，额叶-纹状体-丘脑-颞叶回路的功能紊乱是精神分裂症的病理性基础之一，其中尤以海马、杏仁核的功能紊乱为主；免疫学的研究表明IL-2在上述回路中具有较高的代谢和合成密度。因此，增高的IL-2 水平将对上述这些大脑解剖部位产生特异性的影响，从而引起一系列神经递质（如DA 、5-HT、Ach和NE等）的改变， 导致了精神分裂症患者精神症状和认知功能障碍。另外，IL-2能增加多巴胺能神经传递并且参与自身免疫和细胞生长。脑脊液中IL-2的浓度比儿茶酚胺代谢物与疾病复发的关系更紧密。本研究发现药物合并电针治疗组精神分裂症患者血清IL-2水平均显著低于低于药物组，且药物合并电针治疗组各临床量表减分率大于药物组。说明电针合并药物治疗可以更好的降低IL-2水平，从而缓解精神分裂症症状与既往研究相似[19-20]。

IL-6是临床免疫学研究较多的细胞因子之一。既往研究证实DA和5-HT的功能受到IL-6的影响[4-6]。原因是产生IL-6 的淋巴细胞膜上有DA受体和5-HT受体存在，而这可明显提高额前叶与海马的DA和5-HT的活性与浓度。因此，可以说由IL-6浓度或活性的增高所引起的免疫功能的调节紊乱及其所促发的免疫损伤很可能是精神分裂症的主要影响因子之一[21]。而在本实验结果中，针药治疗组的IL-6的水平显著低于药物治疗组且药物合并电针治疗组的BPRS、SPAS、SANS临床量表评分较治疗前均下降。这说明通过电针治疗可能抑制了IL-6的生成，从而对精神分裂症的免疫功能紊乱进行了纠正，使精神症状有所缓解。

目前，从对精神分裂症患者T细胞亚群进行的大量研究中可以看出，精神分裂症患者的外周血中确实存在着T细胞比率显著下降的状况，而辅T淋巴细胞CD4细胞的降低可能是引发这一改变该的主要原因。所以，可以推测，精神分裂症患者体内的β-内啡肽是明显增多的，而β-内啡肽具有降低CD3和CD4细胞的作用，导致精神分裂症患者免疫功能紊乱或降低。此外，也有研究表明，激活的T细胞分泌的IL-2会反过来作用于T细胞使其扩增，而IL-2与其受体的高亲和力结合能使CD4细胞达到完全活化状态。但若是高浓度的IL-2持续对CD4细胞产生过量的信号刺激则会诱发CD4细胞启动凋亡程序，进而导致CD4 以及CD3等免疫细胞的数量降低等。在本实验结果中，针药治疗组治疗后血清的CD4水平显著高于治疗前和高于药物治疗组，与上述研究结果是一致的[3，5]。

大量的研究资料表明[16-17]，针灸能改变机体的特异和非特异性免疫功能，对免疫细胞和免疫分子均有明显的影响。针灸的免疫效应主要表现在经其穴位刺激后能够引起局部的神经或感受器将其传入中枢神经系统，进而刺激神经中枢释放神经递质等一系列变化，最终实现调控机体免疫功能的作用。此外，针灸引起机体交感-肾上腺髓质系统的兴奋，促使其释放儿茶酚胺及阿片类物质等，进而作用于相应受体产生免疫反应。有研究表明，脾虚泄泻模型的大鼠外周血中CD3、CD4和CD8细胞减少，而经针灸天枢穴后其CD3和CD4细胞数量均有所回升，且CD4/CD8比值也升高。本实验结果中针药组CD4水平治疗后高于治疗前，也高于药物组，差异都有统计学意义，与多数研究结果一致[22-25]。

本研究结果显示，经过两种不同方法的治疗，针药组血清CD4水平高于药物组，血清IL-6、IL-2水平低于药物组。针药组BPRS、SAPS、SANS临床量表评分减分率均高于药物组，针药组较药物组临床症状缓解明显。电针合并药物治疗对精神分裂症症状的缓解作用优于单纯药物治疗组：即电针在改善精神分裂症症状的同时可更好地调节与精神分裂症症状相关的细胞免疫因子水平。

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