细胞核的功能精选(九篇)

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第1篇：细胞核的功能范文

[关键词] 组蛋白去乙酰化酶;吸烟;慢性阻塞性肺病

[中图分类号] R563[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2009)07(c)-016-04

Relationship between HDAC activity and lung function as well as smoking in peripheral blood mononuclear cells of COPD patients

CHEN Yanwei1, YANG Jiong2

(1.Department of Pulmonary Medicine, Shenzhen Nanshan Hospital of Guangdong Medical College, Shenzhen518052, China; 2.Department of Pulmonary Medicine, People's Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China)

[Abstract] Objective: To investigate the histone deacetylase (HDAC) activity in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of COPD patients, and determine the relationship between HDAC activity in PBMC and lung function as well assmoking quantity in COPD patients. Methods: COPD patients, healthy smokers and healthy nonsmokers were selected in our study. The peripheral blood of all subjects were obtained, and PBMC was separated via density gradient centrifugation. Histone was extracted and HDAC activity was detected. The lung function, smoking information of all subjects were recorded. Results: HDAC activity in PBMC from COPD patients was decreased by 40% compared with normal nonsmokers [(12.86±6.14) μmol/(L・μg) and (21.39±4.92) μmol/(L・μg), P=0.000)], this decrease showed statistical significance in stage 1, 2 and 3. HDAC activity in PBMC from healthy smoker was 40% lower than healthy nonsmokers [(12.50±4.27) μmol/(L・μg) and (21.39±4.92) μmol/(L・μg), P=0.000]. HDAC activity in PBMC from COPD was negatively correlated with smoking quantity (r=-0.867, P=0.000 for COPD patients; r=-0.607, P=0.000 for all subjects). In COPD patients who smoked more than 35 pack years and smoked less than 35 pack years, the HDAC activity in PBMC of the former decreased more than a half than that of the later. Conclusion: Smoking is one of the important reasons causing the decrease of HDAC activity in PBMC of COPD patients. HDAC activity in PBMC of COPD patients shows zero correlation with lung function (FEV1, FEV1%, FVC, FVC% and FEV1/FVC), suggesting smoking may have different mechanisms on the local and whole damage of lung.

[Key words] Histone deacetylase; Smoking; Chronic obstructive pulmonary disease

肺部炎症是引起慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)气流受限(肺功能)的主要原因。有研究表明,肺部炎症的标志物(IL-8、IL-6、CRP等)与气流受限(肺功能)程度呈正相关。COPD患者肺组织和肺泡巨噬细胞中的HDAC活性与气流受限呈正相关,HDAC活性越低,气道炎症越重,FEV1%越低[1]。HDAC活性降低源于吸烟引起的氧化应激的损伤。吸烟可引起直接肺氧化应激损伤,也可引起间接的系统性氧化应激。

肺泡巨噬细胞由外周血单核细胞迁移至肺分化而来。因此,本研究假设外周血单核细胞中HDAC活性低于健康对照,并观察外周血单核细胞中HDAC活性与COPD患者气流受限(肺功能)的关系,同时观察吸烟量与HDAC活性的关系,以观察HDAC活性是否受吸烟量的影响。

1 对象与方法

1.1 受试者基本情况

收集在武汉大学人民医院体检及就诊的稳定期COPD患者。正常对照为健康志愿者。经患者知情同意,抽取外周静脉血20 ml,加少量肝素抗凝,在4 h内进行外周血细胞分离。

1.2 稳定期COPD诊断及分级标准

参照GOLD(2006修订版)和中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制订的慢性阻塞性肺病诊治指南(2002)。所有患者均除外心、脑血管、肝、肾疾病、糖尿病、肿瘤、风湿、结缔组织疾病,以及肺结核、支气管扩张、支气管哮喘及肺纤维化患者。

1.3 肺功能测定

所有受试者均行肺功能测定,采用Vmax6200(American Sensormedics, Vmax 229 series,Yorba Linda,California)肺功能系统检测FVC、FVC%、FEV1、FEV1%、FEV1/FVC,由同一熟练技师操作,以保证测试的一致性。每位被测试者肺功能测定前3 d内未使用支气管扩张剂,2周内未使用茶碱和激素。

测试方法:吸入200 μg葛兰素后10 min,平静正常呼吸,遂后充分吸气至肺总量位,迅速用最大力呼气,呼气时间≥6 s,或时间-容量曲线显示呼气相平台出现且超过2 s后,用最快速度用力吸气至肺总量位。每个被测试者分别至少测定3次(一般最多不超过8次),每个被测试者最佳值与次佳值2次差异小于5% FVC或0.5 L)。

1.4 人外周血单核细胞分离

人外周血单核细胞分离用密度梯度离心法[2]。将静脉血与Hank's buffered salt solution (HBSS)1×缓冲液1∶1混合后共40 ml,装于50 ml试管中。将混合血与人淋巴细胞分离液(Lymphoprep,Norway,1.077 g/ml)以2∶1体积混合。配平后用TDL-40L高速水平离心机离心,2 000 r/min(1 100 g/min),30 min。吸取中间白色薄雾层于新管。加HBSS于每管,将吸取液与HBSS混匀,HBSS体积大于1倍吸取液体积。配平后1 100 r/min,离心8 min。弃上清,加入HBSS吹打,移入一新试管中离心1 000 r/min,8 min,弃上清。将剩余液体混匀,吸取少量于细胞计数板计数,并用台盼蓝染色鉴定细胞活性。如果细胞总数大于1×107个/ml,活性大于95%,视为合格标本;用1 ml枪头吸取剩余液体于标记Ep管中,-70℃冻存。 1.5 直接组蛋白提取

组蛋白提取用HCl和H2SO4 4℃过夜法[3]。裂解液[10 mmol/L Tris-HCl,pH 6.5,50 mmol/L亚硫酸氢钠,1% Triton X-100, 10 mmol/L MgCl2,8.6%蔗糖,完全蛋白酶抑制剂混合物(罗氏分子生化公司),20 min,4℃];核冲洗缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,13 mmol/L EDTA,pH 7.4)。

将细胞微离心5 min;用冰冻裂解缓冲液反复冲洗片状沉淀物,直至浮于表面的物质清除(每次离心7 500 g/min,5 min)。用核冲洗缓冲液冲洗核片状沉淀物,并且用50 μl 0.2 mol/L HCl和0.2 mol/L H2SO4在蒸馏水中悬浮。4℃过夜提取细胞核,微离心剩余物质10 min,用1 ml冰冻丙酮混合上清液,-20℃过夜。微离心样本10 min,用丙酮冲洗,干燥,并用蒸馏水稀释。含有组蛋白的上清液样品用Bradford protein kit(Bio-Rad)定量。Bradford法(考马斯亮蓝)测组蛋白浓度。

1.6 HDAC活性检测

细胞核提取物HDAC活性检测使用HDAC活性荧光分析试剂盒(Cayman,USA),严格按照试剂盒说明操作。

1.7 统计学处理

结果用SPSS 11.0统计学软件进行分析。数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用方差分析;相关性采用Spearman相关性分析;P

2 结果

2.1 一般资料

COPD患者26例,均为吸烟者,其中,1期7例,2期8例,3期8例,4期3例;健康吸烟者10例;健康非吸烟者13例,所有受试者均为男性,其身高、体重等无显著性差异(P>0.05)。COPD组与健康吸烟组吸烟量无显著性差异(P>0.05)。COPD组平均年龄高于健康吸烟组和健康非吸烟组(P0.05)。

2.2 COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性

COPD患者外周血单核细胞总HDAC活性较健康非吸烟者低40%左右[(12.86±6.14) μmol/(L・μg)和(21.39±4.92) μmol/(L・μg),P=0.000];在1、2、3期达到显著性差异(图1);其活性与健康吸烟者比较,无显著性差异[(12.86±6.14) μmol/(L・μg)和(12.50±4.27) μmol/(L・μg),P=0.864]。健康吸烟者外周血单核细胞中的HDAC活性较健康非吸烟者低40%,与COPD患者比较,无显著性差异(P>0.05)。

图1外周血单核细胞中的HDAC活性比较

Fig. 1Comparison of HDAC activity of PBMC among subgroups

2.3 COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性与肺通气功能的关系

COPD患者外周血单核细胞中HDAC活性与肺通气功能均无统计学相关(表1)。

表1 外周血单核细胞中HDAC活性与FVC、FEV1、FEV1/FVC的关系

Tab.1 Relationship between FVC, FEV1, FEV1/FVC

and HDAC activity of PBMC

2.4 吸烟受试者外周血单核细胞中HDAC活性与吸烟量的关系

外周血单核细胞中的HDAC活性与吸烟量(包年)呈负相关(在COPD患者中,r=-0.867,P=0.000;在所有吸烟者中,r=-0.607,P=0.000)(图2)。

图2外周血单核细胞中HDAC活性与吸烟的关系

(A:COPD患者;B:所有吸烟者)

Fig. 2Relationship between HDAC activity in PBMC and

smoking quantity

(A: COPD patients; B: all subjects enrolled)

吸烟量超过35包年的COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性平均值明显低于吸烟量低于35包年者(图3)。

图3吸烟量对COPD患者外周血单核细胞

中HDAC活性平均值的影响

Fig. 3Effect of smoking quantity on mean HDAC

activity of PBMC in COPD

3 讨论

研究结果显示,COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性低于健康非吸烟者,与健康吸烟者比较,无显著性差异;COPD患者外周血单核细胞中HDAC活性的降低与COPD气流受限(肺功能)无明显相关,与患者吸烟量呈负相关,提示外周血单核细胞中的HDAC活性降低可能是吸烟的直接作用。

稳定期COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性降低与相同吸烟量的非COPD吸烟者的下降相同,而且两组研究对象随吸烟量增加,HDAC的下降更为明显,提示人外周血单核细胞中HDAC下降与吸烟密切相关。

吸烟也可以引起染色体重构[4],影响NF-κB的表达,促使炎症基因表达[5]。吸烟时每喷烟雾中至少含有10种氧化分子[6],这些氧化分子可以产生氧化应激(oxidative stress)。吸烟引起的氧化应激使细胞核HDAC活性降低,同时可以明显降低上皮细胞的HDAC2表达[7-8],使炎症因子表达增加;这种氧激发可以被抗氧化物N-乙酰半胱氨酸所阻断[9]。健康吸烟者肺泡巨噬细胞HDAC活性低于健康不吸烟者[10]。氧化应激可以通过影响细胞核HDAC活性而影响炎症基因的表达。体外研究显示,氧化应激可以明显降低HDAC活性和上皮细胞HDAC2的表达[7]。

本研究通过提纯单核细胞核HDAC并测定其活性,提示外周血单核细胞中的HDAC活性与吸烟量呈负相关。因此,COPD患者外周血单核细胞HDAC活性降低可能系吸烟所致。

本研究显示,COPD患者外周血单核细胞中的HDAC活性降低与COPD气流受限(肺功能)零相关。

肺功能是目前COPD分级的主要依据,主要反映气道的阻塞程度,并不能反映COPD的炎症程度。Ito等[1]发现HDAC活性在COPD患者的支气管组织和肺泡巨噬细胞中降低,这种降低与COPD气流受限(FEV1、FEV1/FVC)呈正相关。而本研究并未发现外周血单核细胞中的HDAC活性降低与COPD气流受限(肺功能)相关,其原因可能与吸烟对肺部和全身的损害不同有关。

吸烟的烟雾中含有众多物质,可以引起直接和间接肺损害。有害成分可以直接影响HDAC的活性或破坏肺组织,引起肺组织的急性损害。只有部分物质可以进入血液(如氧自由基等)并长期在血液中停留。这些物质可以作用于单核细胞,通过抑制HDAC活性来促进炎症介质的产生。即使停止吸烟,炎症基因的表达维持了这种慢性炎症。炎症基因的表达受促炎症转录因子的调节,这些转录因子主导、放大并且维持了COPD的慢性炎症反应。肺部的局部急性炎症与肺功能(气流受限)呈正相关。而本研究显示,在稳定期COPD患者的外周血单核细胞中,HDAC活性与COPD肺功能(气流受限)无关,提示吸烟对肺部的直接损害与全身的间接损害可能源于不同的机制。

[参考文献]

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[2]Cosio BG, Mann B, Ito K, et al. Histone acetylase and deacetylase activity in alveolar macrophages and blood mononocytes in asthma[J]. Am J Respir Crit Care Med,2004,170(2):141-147.

[3]Ito K, Lim S, Caramori G, et al. A molecular mechanism of action of theophylline: induction of histone deacetylase activity to decrease inflammatory gene expression[J]. Proc Natl Acad Sci,2002,99(13):8921-8926.

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[5]Nishikawa M, Kakemizu N, Ito T, et al. Superoxide mediates cigarette smoke-induced infiltration of neutrophils into the airways through nuclear factor-kappa B activation and IL-8 mRNA expression in guinea pigs in vivo [J]. Am J Respir Cell Mol Biol,1999,20(2):189-198.

[6]Yanbaeva DG, Dentener MA, Creutzberg EC, et al. Systemic effects of smoking [J]. Chest,2007,131(5):1557-1566.

[7]Ito K, Hanazawa T, Tomita K, et al. Oxidative stress reduces histone deacetylase 2 activity and enhances IL-8 gene expression: role of tyrosine nitration [J]. Biochem Biophys Res Commun,2004,315(1):240-245.

[8]Tomita K, Barnes PJ, Adcock IM. The effect of oxidative stress on histone acetylation and IL-8 release [J]. Biochem Biophys Res Commun,2003,301(2):572-577.

[9]Cosio BG, Jazrawi E, Ito K, et al. Cigarette smoke decreases steroid responsiveness in monocytes: the role of histone deacetylase [J]. Am J Respir Crit Care Med,2003,167:A804.

第2篇：细胞核的功能范文

【关键词】 结核分枝杆菌; 抗原提呈; T细胞亚群; 流式细胞术; 激光共聚焦显微镜

［Abstract］ AIM: To explore whether the human peripheral γδ T cells stimulated by polypeptide heat resistant antigen from Mycobacterium tuberculosis (MtbHAg) express phenotype and have the fuction of antigen presentation. METHODS: The monocytes isolated by adhesion method from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured with GMCSF， IL4 and induced into the mature dendritic cells by adding LPS. PBMCs were stimulated with MtbHAg and IL2 to expand predominantally γδ T cells that were further purified by flow sorting. The pure T cells were isolated from PBMCs using adhesion revomal and nylon column method， labeled with CFSE， and cultured in alone with Mtb secretory antigen (MtbSAg)， in monocytes with MtbSAg， or with MtbSAg prepulsed dendritic cells or MtbHAg activated γδ T cells for 11 days. The proliferation of the CD4+T cells were measured by flowcytometry. The MtbHAg activated γδ T cells were incubated with FITC labelled MtbSAg for different time， and the ingestion of MtbSAg by γδ T cells was measured by flowcytometry and observed with laser confocal microscopye. RESULTS: The expressions of MHCII and costimulatory molecules CD80 and CD86 on γδ T cells that activated by MtbHAg marketly incrased in comparison with that on the resting γδ T cells. The expanded cell counts and proliferation index of the pure nave T cells that induced by MtbSAg pretreated activated γδ T cells were similar to that induced by mature DC. By using flowcytometer and laser confocal microscope， FITC labellaed MtbSAg was ingested by the activated γδ T cells. CONCLUSION: γδ T cells stimulated by polypeptide MtbHAg express the phenotype of professional antigenpresenting cells and they are able to present MtbSAg to nave T cells to induce the proliferation of CD4+T cells.

［Keywords］Mycobacterium tuberculosis; antigen presentation; T lymphocyte subpopulation; flow cytometry; laser confocal microscope

以往的研究表明机体在抗结核杆菌（Mycobacterium tuberculosis， Mtb）感染免疫中， 主要有αβ T细胞（CD4＋和CD8＋T细胞）和巨噬细胞发挥重要作用， 而近年的许多研究证明， γδ T细胞在抗Mtb感染中也起到重要的防御作用， 并可能通过与其他免疫细胞之间相互作用， 影响机体在抗Mtb感染中的免疫应答过程。在健康人外周血中， γδ T细胞仅占T细胞库的2%～10%， 根据其TCRδ链V区片段不同又可以分为Vδ1+和Vδ2+二种亚型， Vδ1+T细胞主要分布在黏膜上皮和皮肤组织， 而Vδ2+T细胞则主要分布在外周血中。已有研究发现Vδ2+T细胞能识别小分子的非肽类抗原， 并在此类抗原的刺激下产生显著的扩增［1， 2］。有研究发现， 从扁桃体分离的未活化的γδ T细胞用异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate， IPP) 和来自大肠埃希菌的非肽类抗原4羟基3甲基2烯基焦磷酸［(E)4hydroxy3methylbut2enyl pyrophosphate， HMBPP］刺激后， 表达协同刺激分子和MHCⅡ类分子的能力与单核细胞来源的， 脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）刺激诱导成熟的树突状细胞（dendritic cell， DC）相似［3］。但以往的研究， 以及我们以前的实验发现来自结核杆菌的多肽类耐热抗原也可优势扩增人Vδ2+T细胞［4， 5］。本实验中， 我们用多肽类Mtb耐热抗原(Heat resistant antigen， MtbHAg)优势扩增人外周血中的γδ T（Vδ2+）细胞， 观察活化后的γδ T细胞是否能表现出抗原提呈细胞的表型以及是否具有抗原提呈的功能， 探讨γδ T细胞在抗Mtb感染的天然免疫和获得性免疫中的桥联作用。

1 材料和方法

1.1 材料 Mtb耐热抗原(MtbHAg)和Mtb分泌性抗原(MtbSAg)由本实验室从培养的MtbH37Ra株制备获得， 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰胺酯(Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester， CFSE) 购自Molecular Probes公司; RPMI1640培养液(GIBCO公司) 补充L谷氨酰胺2 mmol/L、 二巯基乙醇(2ME)50 μmol/L、 丙酮酸钠1 mmol/L、 庆大霉素50 mg/L和新生小牛血清(NBS， 杭州四季青公司) 100 mL/L后为完全RPMI1640培养液; 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate， FITC) 和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide， DMSO) 购自Merk 公司; 荧光抗体小鼠抗人CD4PE、 小鼠抗人TCRγδPE、 小鼠抗人CD14FITC、 小鼠抗人HLADRPecy 5.5和小鼠抗人CD83FITC等购自Caltag公司; 小鼠抗人CD80FITC和CD86FITC购自eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 γδ T细胞的活化和分选纯化 抽取健康志愿者外周血5～10 mL， 肝素抗凝， 用淋巴细胞分离液和梯度离心法常规分离获取外周血单个核细胞（peripheral blood monouclear cells， PBMC）， 将PBMC用RPMI1640完全培养液调整细胞密度为1×109/L， 加入24孔板， 再加入Mtb耐热抗原(MtbHAg) 2.5 mg/L， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培养5 d后分孔培养， 每隔3 d加入rhIL2 5×104 U/L， 约9 d即可得到富含γδ T细胞的活化T细胞， 经抗TCRPE染色后， 用PBS制备分选用细胞悬液(1×1010/L)， 在流式细胞仪FACSCalibur上进行分选获取纯化的γδ T细胞。

1.2.2 DC的体外培养及检测 常规方法分离获取PBMC， 加入24孔板中， 细胞密度为每孔5×109/L， 37℃、 50 mL/L

CO2培养2 h后吸去悬浮细胞， 并用预热的RPMI1640轻洗培养孔， 以去除残留悬浮细胞， 即获得贴壁细胞。补充培养液后加入rhGMCSF 100 μg/L， IL4 100 μg/L， 第3天时半量换液， 并再次添加GMCSF和IL4， 第6 天半量换液的同时再加入LPS 1 mg/L， 第8天收获悬浮细胞， 分别用小鼠抗人CD83FITC， CD14FITC和HLADRPeCy5.5标记后在流式细胞仪检测外周血单核细胞来源DC的成熟程度。

1.2.3 尼龙毛柱法分离纯化T淋巴细胞 常规方法分离获取PBMC， 调整细胞密度为1×109/L， 加入6孔板中， 2 mL/孔， 置于37℃、 50 mL/L CO2中培养2 h后， 吸出悬浮细胞， 调整细胞密度为1×1010/L， 注入已制备好的尼龙毛柱内， 另加入5 mL的完全RPMI1640液， 密封， 37℃、 50 mL/L CO2中孵育1 h后， 用RPMI1640完全培养液冲洗毛柱， 收集冲洗出来的细胞， 即为纯化T细胞（purified T， pu T)。

1.2.4 CFSE标记pu T 将获得的pu T调整细胞密度为5×109/L， 每毫升细胞悬液加入1 μL CFSE， 使其终浓度为2 μmol/L， 37℃染色10 min后取出用含100 mL/L NBS的完全RPMI1640培养液洗2次后将染色后pu T制成细胞悬液(1×109/L)。此即为CFSE标记的pu T (pu TCFSE)。

1.2.5 FITC标记MtbSAg 将MtbSAg(1 g/L) 1 mL加入已处理过的透析袋中， 扎紧袋口放入pH9.5碳酸盐缓冲液透析过夜， 透析后取出， 加DMSO配制FITC溶液（1 g FITC/L）混合， 使FITC/MtbSAg的比例为50 μg∶1 mg。室温避光在水平振荡器上慢速振摇2 h后转入透析袋中， 对200 mL PBS透析8 h后换液， 共3次。4℃避光保存。

1.2.6 四种不同的培养方法刺激αβ T细胞扩增 CFSE标记的pu T， 调整细胞密度为1×109/L， 加入24孔板培养， 每孔1 mL， 并按以下四种不同方法加入MtbSAg或抗原提呈细胞。a: CFSE标记的pu T单独培养， 同时加入MtbSAg 25 mg/L。b: CFSE标记的pu T中加入单核细胞 (单核细胞: pu TCFSE为1∶100)， 加MtbSAg 25 mg/L。c: 体外培养的单核细胞来源的成熟DC(MDC)与终浓度25 mg/L 的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗涤3次， 加入pu TCFSE (DC∶Pu TCFSE为1∶100) 中培养。d: 流式分选纯化的MtbHAg活化γδT细胞与终浓度为25 mg/L的MtbSAg孵育， 37℃ 2 h后， RPMI1640洗涤3次， 加入到pu TCFSE(活化的γδT细胞: pu TCFSE为1∶100)中培养。上述4种细胞培养在第4天时加IL2 (5万U/L)扩增细胞， 隔天半量换液并添加同量的IL2以维持细胞生长。

1.2.7 FCM和激光共聚焦检测活化γδ T细胞对FITC标记MtbSAg的摄入 将MtbHAg活化的γδ T细胞的密度调整为1×1010/L， 取100 μL细胞悬液， 加FITC标记的MtbSAg 10 μL， 抗TCRγδPE 3 μL， 避光 37℃， 水浴30 min 至120 min后， PBS洗涤3次， 尽量去除残余液体， 加入10 g/L多聚甲醛200 μL 固定后用流式细胞仪检测FITC阳性细胞数， 表示摄入MtbSAg细胞的比率。同时将水浴90 min的试管轻弹混匀后取出2 μL， 加少量甘油混合后滴在载玻片上， 加上盖玻片后即在激光共聚显微镜（Nikon C1 Si）下观察和拍摄记录， 获取的图象文件用Freeviewer软件分析显示。

1.2.8 统计学分析 实验数据以x±s表示， 数据处理采用SPSS13.0统计软件。样本均数的两两比较， 采用t检验， P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血单核细胞来源DC的表型检测 PBMC来源的单核细胞经GMCSF， IL4培养6 d后加入LPS诱导为成熟的DC后， 用FCM检测其表型， 发现HLADR仍为高表达（81.89%)， 代表DC成熟的CD83与培养前低表达（7.83％）相比非常显著地高表达(85.40%)， 而单核细胞的特征标志CD14从培养前的87.2%降低到5.31%。

2.2 活化的γδT细胞表达协同刺激分子 检测健康人外周血中静止的γδ T细胞表面CD80、 CD86和HLADR的表达水平非常低， 分别为(1.37±2.36)%， (4.13±3.33)%和(8.84±5.44)%; 而经MtbHAg活化后γδ T细胞CD80、 CD86和HLADR的表达分别增加到(62.33±7)%、 (89.12±3.5)%、 (80.56±7.29)% (图1)。

2.3 不同培养方法对纯化初始T细胞增殖总数的影响 在4种不同培养方案中， 加入的纯化T细胞数均为1.0×106， 单独加MtbSAg的a组， 和加单核细胞和MtbSAg的b组， 培养到第11天时， 细胞数分别为1.2×106和5.6×106。而纯化T细胞加入预先与MtbSAg处理的DC（c组）和γδ T细胞（d组）， 培养11 d后的细胞数分别为7.79×106和8×106(图2)。

2.4 FCM分析CD4+T细胞的增殖情况和Modfit软件分析CD4+T细胞的增殖指数 用CFSE标记的纯化T细胞用4种方法培养到第11天时， 标记CD4荧光mAb后用流式细胞仪测定和分析， 结果表明纯化T细胞单独加MtbSAg的a组， 增殖的CD4+T细胞仅占4.5%; 加单核细胞和MtbSAg的b组， 增殖的CD4+T细胞所占比例为35.4%， 而加入MtbSAg预处理的成熟DC和活化γδT细胞的c组和d组， 增殖的CD4+T细胞所占比例分别达到56.4%和57.1%（图3A）。用Modfit软件中的增殖分析模块进行分析， 得到CD4+T细胞各代细胞所占百分率， 增殖指数(Proliferation Index， PI， 即增殖后细胞总数与增殖前细胞总数的比值。在加入MtbSAg预处理的DC（c组）和活化γδT细胞（d组）， 培养第11天时CD4+T细胞的PI分别为58.9和51.9， 且增殖的代数主要集中在第9、 10代， 分别为75.93%和75.71%。加入单核细胞的b组CD4+T细胞的PI为24.39， 第9、 10代所占的比例为57.65%， 而仅有纯化T细胞的a组中， CD4+T细胞的PI和第9、 10代所占的比例仅为4.5%和4.04%（图3B）。

2.5 激光共聚焦显微镜观察活化的γδ T细胞摄入SAg MtbHAg刺激活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg在37℃孵育90 min 时， 同时加入抗TCRγδ PE荧光抗体， 在激光共聚焦显微镜下观察， 发现细胞膜被染成红色的γδ T细胞内分布有大量呈绿色荧光（FITC）细小散点物质(图4)。

2.6 流式细胞术检测活化的γδ T细胞摄入MtbSAg MtbHAg激活的γδ T细胞与FITCMtbSAg在37℃孵育时， 加入抗TCRγδ PE荧光抗体， 用流式检测发现， MtbSAg摄入率即γδ T细胞中FITC+细胞百分数随时间延长不断增加。在孵育30、 60和90 min时， 摄入率分别为(26.68±3.58)%、 (48.09±3.29)%和(53.32±3.29)%; 但是在120 min时降低至(31.28±5.80)% (图5)。

3 讨论

为了探讨多肽类抗原激活的人γδ T细胞是否也具有抗原提呈作用， 首先考虑是否有涉及抗原提呈细胞有关的表型分子的表达。本实验采用多肽类的MtbHAg作为优势激活γδ T细胞的抗原， 其中具有激活γδ T细胞效应的主要组分是Mr在10 000～14 000的非分泌性耐热多肽［4， 5］。用这种多肽抗原激活的γδ T细胞在培养增殖到第11天时， 其表面HLADR和协同刺激分子(CD80和CD86)从培养前的低表达（1％～8％）显著上调为高表达（62％～89％）， 表明这些细胞已具有抗原提呈细胞的表型。

Brandes等［3］发现IPP活化γδ T细胞摄入可溶性抗原后与初始αβ T细胞共同培养促使细胞增殖。本实验中纯化T细胞（几乎均是αβ T细胞）与MtbSAg掺入的DC培养11 d后数量增加7倍， 而与MtbSAg掺入的活化γδ T细胞共同培养后， αβ T细胞的数量增加8倍。我们进一步用CFSE标记初始纯T淋巴细胞后， 再与MtbSAg掺入的DC或γδ T细胞培养， 流式细胞术检测后用Modfit软件进行分析CD4+T细胞各代细胞所占百分率， 发现由活化γδ T细胞和成熟DC作为抗原提呈细胞的二组， 培养到晚期时增殖的细胞绝大多数均是集中在第9、 10代。说明引起CD4+T细胞增殖的能力几乎相同。这些结果表明， 用MtbHAg活化的γδ T细胞和成熟DC一样， 具有提呈可溶性抗原给初始T细胞， 引起CD4+T增殖的能力。这与 Brandes报道的用非肽类抗原刺激的γδ T细胞提呈可溶性抗原的结果相一致。

为了证实MtbHAg活化的γδ T细胞能摄入蛋白抗原， 本实验将活化的γδ T细胞与FITC标记的MtbSAg在37℃的条件下孵育， 流式细胞术检测显示γδ T细胞摄入SAg的能力随着时间的增加而增加（30 min 至 90 min）。同时， 在激光共聚焦显微镜下也观察到γδ T细胞能将抗原摄入胞内。

综上所述， 经MtbHAg活化γδ T细胞具有抗原提呈作用， 其功能活性似乎与成熟DC没有明显差别， 但γδ T细胞更容易获取和体外操作。因此， 这种活化的γδ T细胞可在制备疫苗和免疫治疗中成为新的目标［6］。

参考文献

［1］ Hayday A， Theodoridis E， Ramsburg E， et al. Intraepithelial lymphocytes: exploring the third way in immunology［J］. Nat Immunol， 2001， 2(11): 997-1003.

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［3］ Brandes M， Willimann K， Moser B. Professional antigenpresentation function by human γδ T cells［J］. Science， 2005， 309(5732): 264-268.

第3篇：细胞核的功能范文

【摘要】

目的: 本研究旨在探索紫杉醇、 顺铂诱导卵巢癌细胞凋亡后能否具有较强的免疫原性， 并可以被抗原提呈细胞交叉提呈并促进免疫应答。方法: 用巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)和白介素4（IL4）刺激人外周血单核细胞分化诱导为树突状细胞（DC）， 6 d后将DC和经紫杉醇联合顺铂在体外诱导发生凋亡的人卵巢癌细胞株共同培养， 并以冻融细胞共培养DC组和单独DC组作对照， 共培养4 h后， 进行激光扫描共聚焦显微镜观察DC细胞对凋亡细胞的吞噬作用， 同时以流式细胞术(FCM)检测不同培养组DC的分化和成熟程度。结果: 紫杉醇、 顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞可被DC有效吞噬， 与对照组相比， 凋亡组DCs的表达及成熟度均明显增高， 并具有统计学意义（P﹤0.05）。结论: 紫杉醇、 顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞具有较强的免疫原性， 可以促进DC的分化和成熟。

【关键词】 紫杉醇; 顺铂; 树突状细胞; 细胞凋亡; 抗原提呈

［Abstract］ AIM: To explore wheather apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatin could be crosspresented by antigen presenting cells and promote immune responses. METHODS: DCs were generated from peripheral blood monocytes in RPMI1640 supplemented with GMCSF and IL4. After 6 days’ incubation， DCs were further cocultured with either apoptotic HO8910 cell lines induced by paclitaxelcisplatin or control cells for four hours. Maturation of DCs was compared among different groups according to their surface markers through flow cytometry assay and their phagocytosis ability was evaluated by confocal microscopy scanning assay. RESULTS: Apoptotic ovarian cancer cells induced by paclitaxelcisplatincan were phagocytized more efficiently by DCs.Resulting is more cellularity and maturation of DCs in apoptotic cellinduced groups than control group(P

［Keywords］paclitaxel; cisplatin; dendritic cells; apoptotic cells; antigen presentation

化疗药物通过诱导凋亡来杀死肿瘤细胞， 而凋亡的肿瘤细胞是否具有免疫原性一直是倍受争议的话题， 近来研究表明化疗药物诱导的凋亡肿瘤细胞能否有效激发免疫应答， 与肿瘤细胞的性质和化疗药物有关［1］。本研究旨在探索紫杉醇联合顺铂化疗药物诱导卵巢癌细胞凋亡后的免疫原性， 探讨诱导凋亡的肿瘤细胞能否被树突状细胞（dendritic cell， DC）交叉提呈， 从而促进免疫应答， 为临床制定合理的化疗联合免疫疗法治疗肿瘤提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料 紫杉醇、 顺铂购自山东齐鲁制药厂; 淋巴细胞分离液购自上海化学试剂厂; 巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor， GMCSF)、 白介素4（interleukin4， IL4）、 肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα， TNFα）均购自R&D公司; CFSE(carboxyfluorescein succinimidylester)活细胞探针购自Invitrogen公司; 小鼠抗人抗体CD14、 CD80、 CD83、 CD86、 CD1a单克隆抗体(mAb)购自ebioscience公司; AnnexionⅤPI核酸染料购自深圳晶美公司; RPMI1640培养液、 2.5 g/L胰酶、 胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）购自Gibco公司; 人卵巢癌HO8910细胞株为上海市免疫学研究所馈赠; 人浓缩白细胞由自愿者提供。

1.2 方法

1.2.1 人外周血细胞定向诱导分化和培养DC 取60 mL浓缩WBC， PBS稀释至200 mL， 采用淋巴细胞分离液经密度梯度离心分离获取外周血单个核细胞， PBS洗涤细胞2次， 细胞计数， 在6孔板中以无血清RPMI1640培养液悬浮细胞至密度为5×109/L， 置37℃、 50 mL/L CO2培养箱2 h后取出， 洗去悬浮细胞（收集备用）， 加入含GMCSF(100 μg/L)、 IL4(50 μg/L)和100 mL/L FBS的RPMI1640培养液诱导培养贴壁细胞， 第3天半量换液， 第6天收集悬浮细胞， 计数。

1.2.2 HO8910凋亡细胞的制备 将HO8910细胞按紫杉醇和顺铂不同的作用剂量和不同时间分组处理， 紫杉醇顺铂浓度分别为2.5～0.3 mg/L、 25～3 mg/L、 125～15 mg/L、 250～30 mg/L， 分别作用12 h、 24 h和36 h后， 用2.5 g/L胰酶消化贴壁细胞， 将细胞用PBS重悬至1×109/L， 取100 μL， 以药物未处理组为空白对照， 参照Annexin VPI试剂盒说明书检测各组细胞的凋亡率。

1.2.3 HO8910冻融抗原制备 收获HO8910细胞， 用PBS重悬至2×1010/L， 置液氮内10 min， 取出后速投入37℃水浴溶解， 反复5次。以3 000 r/min离心10 min， 收集上清， -80℃保存备用。

1.2.4 DC与凋亡细胞激光共聚焦扫描 消化对数增长期HO8910细胞株， 以PBS 重悬细胞至1×109/L， 加入CFSE终浓度为25 μmol/L， 50 mL/L CO2、 37℃培养箱共孵育30 min， RPMI1640培养液洗涤细胞1次后， 用含100 mL/L胎牛血清（FBS）的RPMI1640液重悬细胞， 并铺板培养。次日加入紫杉醇和顺铂（浓度为250～30 mg/L）， 培养24 h（此条件为1.2.2步骤实验得出诱导细胞凋亡的最佳浓度和时间）后取出， 收集悬浮细胞， 计数。凋亡细胞与培养6 d后的DC以1∶1比例共孵育， 以未处理细胞为对照， 按相同比例和DC共培养， 4 h后取出， 用PBS洗涤细胞， 加入小鼠抗人PECD83抗体， 共孵育30 min后， 用PBS洗涤细胞， 并用40 g/L多聚甲醛固定悬浮细胞， 置于细胞甩片机中1 000 r/min离心3 min， 将细胞固定于载玻片上， 500 mL/L甘油PBS封片， 激光共聚焦显微镜检测。

1.2.5 不同类型肿瘤抗原负载DC表面标志的检测 DC培养至6 d， PBS冲洗收获所有的DC， 分为3组进行实验: 空白组， 单纯DC组; 冻融组: HO8910冻融抗原负载DC组; 凋亡组: 紫杉醇顺铂诱导HO8910凋亡细胞负载DC组。共培养4 h后洗涤细胞， 用100 mL/L FBS1640悬浮细胞， 并加入TNFα至100 μg/L， 培养24 h后流式细胞术(FCM)检测DC细胞表面CD1a、 CD14、 CD80、 CD83、 CD86的表达。

1.2.6 统计学分析 计量资料以x±s表示， 采用SPSS11.5数据包方差分析， P

2 结果

2.1 紫杉醇顺铂诱导人卵巢癌细胞株HO8910凋亡最佳时间与剂量的选择 为确定紫杉醇和顺铂联合诱导人卵巢癌细胞株HO8910的最佳作用剂量和最适作用时间， 我们选取了4个作用浓度和3个作用时间点（见前）处理HO8910细胞， 结果显示紫杉醇顺铂作用浓度为125～15 mg/L， 作用时间12 h后细胞凋亡开始明显增加， 以250～30 mg/L浓度作用24 h细胞基本完全凋亡。显微镜下可见作用24 h后， 细胞呈悬浮状， 部分细胞胞膜不完整。作用36 h后FCM检测结果显示细胞大多呈坏死状态， 显微镜下观察发现细胞呈碎片。上述结果表明， 紫杉醇和顺铂联合诱导HO8910细胞凋亡时， 浓度250～30 mg/L， 作用24 h为凋亡最适剂量、 最佳时间点效应（图1）。

图1 紫杉醇/顺铂作用不同浓度与不同时间细胞的凋亡比例（略）

Fig 1 The percentage of apoptotic cells induced by Paclitaxel/Cisplatin at different concentrations and time points

a: 125 paclitaxel+15 mg/L cisplatin for 12 h; b: 250 paclitaxel+ 30 mg/L cisplatin for 24 h; c: 250 paclitaxel+30 mg/L cisplatin for 36 h.

2.2 外周血单核细胞来源的DC的体外诱导 经常规贴壁法获得外周血单核细胞后， 采用通用的GMCSF和IL4条件培养基体外诱导分化DC， 培养3 d后， 在倒置光学显微镜下观察可见细胞开始呈集簇生长， 部分细胞的细胞膜有突起， 培养至第6天， 可见大部分细胞悬浮生长， 胞体大且外形不规则， 细胞膜呈树突状突起， 胞质丰富， 并具有典型DC形态（图2）， 表明细胞已向DC分化， 可用于进一步表型分析和功能检测。

图2 倒置显微镜下DC的形态特征（略）

Fig 2 The morphology of induced DC observed with inverted microscope(×400)

2.3 诱导DC细胞的表型检测 外周血来源的单核细胞经GMCSF和IL4诱导培养6 d后， 获得未成熟的DC细胞， 采用单独TNFα作用、 TNFα﹢冻融细胞和TNFα﹢凋亡细胞培养24 h后， FCM检测DC表面标志的表达。结果显示条件培养第6天较培养前CD14的表达明显下降， CD1a、 CD80、 CD86的表达上调， CD83的表达为10%左右（图3）。培养7 d后单独TNFα作用和TNFα+冻融细胞作用后CD83表达约35%左右， 两者间无统计学意义（P>0.05）， 但其在TNFα﹢凋亡细胞作用后表达上升为50%， 且与前两者间有统计学意义（P

图3 诱导前、 GMCSF/IL4、 GMCSF/IL4/TNFα诱导后细胞表面标志变化（略）

Fig 3 Alteration of surface markers on preinduced monocytes， GMCSF/IL4 induced and GMCSF/IL4/TNFα induced DC cells

表1 不同肿瘤抗原刺激后DC表面标志的表达（略）

Tab 1 Comparative analysis of surface markers on DC pulsed with different types of tumor antigens

aP

2.4 凋亡细胞可以被DC细胞有效的吞噬 比较DC与凋亡的HO8910细胞和未处理HO8910细胞共培养后， DC对两类细胞的吞噬情况， 结果显示（图4）仅在凋亡组中可见DC膜与凋亡细胞融合、 DC细胞胞体内有凋亡小体、 小颗粒状溶解碎片等一系列DC吞噬凋亡细胞的现象， 而DC对正常的HO8910无吞噬作用。进一步通过FCM检测DC吞噬凋亡细胞在时相上是否存在差异， 结果表明随共培养时间延长， DC的吞噬未见增加， 4 h与24 h之间无统计学意义。

图4 DC对凋亡肿瘤细胞、 未处理的肿瘤细胞吞噬的激光共聚焦扫描（略）

Fig 4 Phagocytosis of dendritic cells against apoptotic and normal HO8910 cell lines

A: Apoptosis HO8910 cell lines; B: HO8910 cell lines.

3 讨论

卵巢癌死亡率极高， 减少卵巢癌复发、 提高预后的一个重要策略是在手术和化疗后再应用如免疫治疗、 分子靶向治疗和基因治疗等巩固疗法［2］。近年来研究表明化疗药物诱导的凋亡肿瘤细胞能够有效激发免疫应答［3］。如果能将卵巢癌免疫治疗与传统治疗方法合理联合将为卵巢癌的治疗开辟新的途径、 带来新的曙光。研究证明肿瘤免疫逃逸的机制不仅由于缺乏抗原， 而且与抗原不能被有效提呈给T细胞而不能产生特异性免疫应答有关［4］。因此肿瘤免疫治疗的一个巨大挑战是如何使抗原被有效提呈而激发有效的抗肿瘤免疫应答。如果化疗诱导的凋亡细胞具有免疫原性、 能被APCs提呈则是化疗联合免疫治疗的基础。

Nowak等［5］学者发现二氟脱氧胞嘧啶核苷介导的凋亡细胞不是耐受原， 凋亡细胞能诱导DC成熟并激活相关的T细胞。另有学者发现化疗诱导的凋亡肿瘤细胞数目增加， 使得APCs吞噬作用加强， APCs被激活后释放更多的前炎性细胞因子， 从而促进APCs对肿瘤抗原的交叉提呈［6］。而Casares等［7］发现丝裂霉素C致凋亡的肿瘤细胞不具有免疫原性。上述研究结果提示， 不同肿瘤细胞经不同化疗药物作用后， 其免疫原性仍然存在不确定性。紫杉醇和铂类是目前国内外公认的卵巢癌一线化疗药物， 本实验中应用紫杉醇联合顺铂诱导卵巢癌细胞株凋亡后， 论证凋亡细胞对DC的影响。应用激光共聚焦显微镜发现与凋亡细胞共培养的DC胞内见吞噬凋亡小体， 且DC胞体中出现小颗粒状溶解碎片， 而DC对正常HO8910无吞噬作用。同时FCM检测发现与凋亡细胞共培养的DC， 其共刺激分子表达较空白组和冻融组显著升高， 因此相同数量凋亡肿瘤细胞的免疫原性强于冻融肿瘤抗原， 表明DC通过吞噬负载凋亡细胞后其成熟度的表达明显增加， 行使抗原提呈的功能显著增强。本实验结果证明紫杉醇+顺铂诱导的凋亡卵巢癌细胞并不隔离抗原， 相反使交叉提呈的肿瘤抗原性显著增加， 促进了DC的成熟与提呈作用。

此外， 本研究中还有一个发现， 即冻融组在加冻融抗原前后， DC的共刺激分子表达无明显改变， DC未被冻融抗原活化。我们认为部分原因有可能是由于加入冻融抗原的效价过低， 但更可能是来源于HO8910的冻融肿瘤抗原本身不具有诱导异体DC活化的抗原表位， 但凋亡组加凋亡细胞后， DC的共刺激分子表达改变明显。本研究认为应用凋亡的细胞作为抗原可能不需要识别肿瘤特异性肽段和受MHC限制， 化疗诱导的凋亡细胞有望成为免疫治疗的自身抗原， 这些对于DC疫苗的制备及化疗联合免疫治疗提供了重要的信息。

肿瘤的免疫治疗规范化是一个尚未解决的问题， 如何将免疫治疗与传统的化疗结合起来更是一个空白的领域。越来越多的研究认为化疗诱导的凋亡细胞促进免疫应答反应。因此如何将免疫治疗与化疗合理结合将是今后致力研究的课题， 本课题为此研究提供了重要理论依据。

参考文献

［1］ Correale P， Cusi MG， Del Vecchio MT， et al. Dendritic cellmediated crosspresentation of antigens derived from colon carcinoma cells exposed to a highly cytotoxic multidrug regimen with gemcitabine， oxaliplatin， 5fluorouracil， and leucovorin， elicits a powerful human antigenspecific CTL response with antitumor activity in vitro［J］. J Immunol， 2005， 175(2): 820-828.

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第4篇：细胞核的功能范文

关键词：PET 连续聚合工艺 节能环保

在连续 PET 装置中，为了使酯化反应和缩聚反应向正反应方向进行，正反应所生成的水和 EG 需及时排出。从反应器顶部排出的这股物料还包括乙醛、二甘醇以及少量低聚物。EG 作为 PET 生产的原料需进行回用，故设置工艺塔进行精馏分离。工艺塔是在 PET 生产过程中用来进行酯化反应的主设备之一，其作用是将酯化系统中产生的水和 EG蒸气的混合物以及从粗 EG 低位收集槽送至的粗EG 进行分离提纯[1]。其所在的系统主要包括以下单元：（ 1） 工艺塔本体；（ 2） 塔釜回流系统；（ 3） 塔项冷凝系统。

一、工艺设计

1.主要工艺设计参数

工作介质： EG，水； 工作压力： 0.115 MPa； 工作温度： 215 ℃； 塔径： 1.3 m； 总高： 约15 m；总体积：约 18 m3；塔釜液位： 约70%。

2.塔结构

优化后的工艺塔结构简示如图 1 所示。

图1 工艺塔结构简图

在塔的上部设置导向装置，该装置可以控制塔器在运行中的挠度，防止运行中塔的晃动，设计时考虑塔在温度变化时的自由伸缩。一般用数个导向轮沿圆周均布，小型塔可以采用用塔箍结构。导向孔的开口方向与塔盘上的液流方向一致。在操作中，从导向孔喷出的少量气体推动塔盘上的液体流动，可以减少塔盘上的液体流动，从而可明显减少塔盘上的液面梯度。液体返混是很小。液体滞止区小，用于气液传质过程具有良好的操作性能。

二、PET连续聚合工艺流程优化

五釜和三釜PET工艺流程的主要特点分别是：（1）三釜流程预缩聚反应器中同时存在真空状态下的醋化反应，优于五釜流程醋化阶段带压操作；（2）三釜流程物料通过反应器的停留时间比五釜流程略短；（3）三釜流程的反应温度要比五釜流程高；（4）三釜流程的动设备比五釜流程少；（5）三釜流程一般采用气相热媒加热；（6）三釜流程的催化剂及其它添加剂是从齐聚物管道上注人的，而五釜流程则在浆料调制时加入[3]。

充分利用原有资源达到继续增产的目标，关键是降低产品的成本，即提高装置生产能力、降低能耗。更换或改造反应器就成了最主要的选择。通过该工艺流程的优化改造后，可实现单线再增量40 t/d。

五釜流程原生产能力是单线160 t/d，经过本次改造后，生产能力达到了200 t/d，其主要工艺参数也向三釜流程工艺参数靠近，如表1所示。

表1 PET四釜流程的主要工艺参数

改造后整个流程的反应时间由5.6h缩短到4.3h，有利于产品质量的提高。同时改造后的工艺参数与三釜流程相比，仍然属于较为温和的工艺，以温度为例：三釜流程的醋化温度为283-285℃，上流式预缩聚反应器（UFPP）温度290-292℃；改造后四釜流程的醋化温度为280-283℃，UFPP温度为285-287℃。

在真空系统流程中，预缩釜出来的工艺气体经预缩一级刮板冷凝器、预缩二级刮板冷凝器后进入四级水蒸气喷射泵抽真空。终缩釜出来的工艺气体经过终缩一级刮板冷凝器、终缩二级刮板冷凝器后进入四级水蒸气喷射泵抽真空。该装置的真空系统采用了 1.5 MPa 水蒸气四级喷射器，每小时消耗 0.856 t 蒸汽和 82 t 循环水。喷射级数多，运行成本较高。而且真空系统总是随着公用工程的波动而变化，影响了 PET 装置的平稳运行。又由于水蒸气不断冲刷，真空泵的喷嘴遭到严重磨损，导致真空系统能力不足。且水蒸气对从聚合反应带出的低聚物溶解性较低，容易堵塞真空系统。在近 10 年的生产过程中，该系统能源消耗较大，产生的喷射泵冷凝液较多（ 含少量 EG） ，污水处理的成本较大，不符合目前国家倡导的节能减排政策。在 PET 装置真空系统的改造设计中，采用三级EG 蒸气喷射泵代替原来的四级水蒸气喷射泵。为得到较高的真空度，EG 蒸气喷射泵采用多级串联的形式。在多级串联喷射系统里，前一级喷射器喷出的气流中不仅有被抽气体，而且还有该级的工作蒸气，使后一级的负担增加，为减少后一级的蒸气消耗，在 2 级喷射之间安装有冷凝器，使混合气体中大部分可凝气体冷凝下来。冷凝器的冷却介质可与混合气体间接或直接接触。混合气体主要成分是EG 和不凝气体，因而冷却介质可用 EG 直接喷淋。其最后一级通过液环泵后将不凝气体排入大气，这样 EG 真空喷射泵在生产过程中就无废水产生。液环泵属于变容式真空泵，靠泵腔容积的变化来实现吸气、压缩和排气的。

三、节能环保的流程改造

（1）改造后的酯化工序。经过改造，采用了1个UF即代替原流程的R-22和R-1，UFPP同时承担R-2的进一步醋化反应的作用，将醋化率从89%左右提高到了99%以上。（2）添加剂注人。根据生产品种，在R-1到E-31的移液管线上，物料进预聚釜UFPP前注入缩聚催化剂、稳定EG和其它各种添加剂，如DEG、Tio2等。经过改造，增加了催化剂溶液、稳定EG、消光剂以及液体DEG等添加剂的添加系统。添加时通过流量计计量，由调节阀控制加人量，通过相应的注射器加人到齐聚物的管线中[4]。（3）预缩聚。设计的UFPP由3部分组成，管式反应加热器、反应塔和醋化分离器。同时UFPP还配备了EG喷淋冷凝系统、真空系统（三级蒸汽喷射泵）和热媒系统。改造后，UFPP同时保证了后期醋化反应和预缩聚反应的正常进行，醋化率和聚合度均能满足生产要求。（4）终缩聚。齐聚物经R-31，首先进人前终缩聚反应器R-32，在卧式单轴反应釜R-32中，聚合体的聚合度由26提高到63左右。再由其出料齿轮泵输送至后终缩聚反应器R-33，在卧式双轴搅拌反应釜R-33中，聚合体的聚合度由63提高到102左右。再由出料齿轮泵送出，经熔体过滤器过滤，除去劣化物和凝聚粒子后，切粒、包装。在终缩聚反应过程中，R-2、R-33反应器的真空分别由四级蒸汽喷射泵和五级蒸汽喷射泵产生；在R-32、R-33反应器的出料熔体管线上，分别设置有毛细管粘度计在线检测物料粘度，以保证产品的粘度稳定[5]。根据真空喷射泵的结构及原理可知： 由于 EG喷射泵是采用原料 EG 作为喷射泵的动力蒸气，缩聚抽出的 EG 全部回收利用，所以几乎不存在 EG 的损失。与水蒸气喷射泵相比较，不存在废水的排出，减少了废水处理的负担。而且喷射级数只有 3 级，比水蒸气喷射泵喷射级数少，运行成本较低； EG 蒸气对从聚合反应带出的低聚物有一定的溶解性，采用 EG 蒸气喷射泵可以大大减少真空系统堵塞的概率。

通过手动打开泵出口压力调节阀，利用燃料油输送泵提供动力进行燃料油循环，仅需要每周机泵试运2 次即可。热媒炉增压泵电机功率为4 kW，按照每kW？h 电0.7 元计算，每年节约费用4×24 ×360 ×0.7 = 24192（ 元） 。

四、结论

结合目前连续聚酯工艺特征及作者多年从事聚酯工程设计和生产的经验，通过对工艺塔中原来 18层塔盘改进为下部用4 层塔盘、上部用 2 层3000 mm填料的结构，改变法兰连接形式，改变加热盘管结构等方法，对工艺塔进行优化设计，并成功运用于连续工程 PET 案例，一次开车成功，目前使用已有4 a，运行稳定。通过优化工艺参数，降低塔顶换热器循环水用量，逐步将工艺塔顶废水温度上调至 50 ℃左右，在保证汽提系统进水温度的情况下，使汽提系统的加热蒸汽得到优化。

参考文献

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第5篇：细胞核的功能范文

【摘要】

目的 观察新诊断老年糖尿病（DM）患者胰岛β细胞功能特点及其与胰淀素、褪黑素的关系。方法 收集初诊DM患者60例，其中老年DM组27例，成年DM组33例，对照组30例。均行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），计算胰岛β细胞功能指数（HOMAβ）。采用ELISA法检测患者空腹血清胰淀素、褪黑素水平。同时测定所有受试者的血脂、体重指数（BMI）和腰臀比（WHR），并对结果进行统计分析。结果 （1）老年DM组与成年DM组比较HOMAβ明显降低〔(58.20±24.89) vs (81.20±40.80)，P

【关键词】 糖尿病；老年；胰岛β细胞功能；胰淀素；褪黑素

老年糖尿病（DM）与成年DM比较具有起病隐匿、症状不典型、进展缓慢等特点，其发病原因尚不明了，胰岛β细胞功能下降是其发病的主要机制之一。胰淀素和褪黑素是分别由胰腺和松果腺分泌的老年相关激素，近年国外有些研究表明胰淀素、褪黑素与老年DM的发生有一定的关系〔1，2〕。本研究通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT），分析老年DM患者的胰岛β细胞功能特点；并检测老年DM患者血清胰淀素、褪黑素的浓度，进一步探讨两种老年相关激素与胰岛β细胞功能的关系。

1 对象与方法

1.1 对象

病例组60例，为2007年10月至2009年8月期间在我院内分泌科住院及门诊新诊断的2型糖尿病（T2DM）患者，年龄25～94岁，均未接受胰岛素治疗，符合下列标准：（1）行OGTT后均符合1999年WHO T2DM的诊断标准；（2）空腹胰岛素（Fins）≥5 μIU/ml；（3）空腹血糖（FPG）≤10 mmol/L。（4）谷氨酸脱羧酶抗体、胰岛细胞自身抗体均阴性。按发病年龄分为两组，老年DM组（≥60岁）27例，男14例，女13例，平均年龄（74.59±8.79）岁，成年≥组（25～59岁）33例，男17例，女16例，平均年龄（45.76±8.54）岁。健康老年对照组30例，选择同期健康体检者，年龄、性别与老年糖尿病组相匹配，无吸烟史，排除糖尿病、糖耐量减低、冠心病、高血压、脑血管病及肿瘤等疾病。

1.2 方法

1.2.1 标本收集

所有受试者对本试验知情。老年健康体检者在禁食12～14 h后，在无应激情况下采空腹肘静脉血。60例DM人均做OGTT及胰岛素释放试验，清晨空腹取静脉血后一次性口服75 g葡萄糖，并分别于0.5、1、2、3 h后取静脉血做血糖及胰岛素测定。所有收集的血液分离出血清，于-70 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 检测指标

采用OLYMPUS AU540全自动生化分析仪测定血清甘油三酯（TG）、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇（HDLC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）和血清葡萄糖（GLU）。胰岛素(INS)测定采用电化学发光免疫法，试剂由罗氏公司提供，仪器：电化学发光免疫法测定仪2010Elecsys。胰淀素、褪黑素测定采用ELISA，应用美国R&D公司试剂盒（板内板间变异系数均小于10%），按说明书操作。腰围、臀围、身高、体重由专人测定。

1.2.3 计算指标

体重指数（BMI）=体重（kg）/身高2（m2）。腰臀比（WHR）=腰围（cm）/臀围（cm）。按HOMA模型计算胰岛素抵抗指数〔HOMAIR=(Fins×FPG)/22.5〕及胰岛β细胞功能指数〔HOMAβ=20×Fins/(FPG-3.5)〕。

1.3 统计学分析

所有数据统计采用SPSS13.0软件进行，连续性计量资料以x±s表示，非正态分布的资料以对数转换成正态分布后输入。两组间比较采用独立t检验 ，计数资料比较采用χ2检验。相关分析采用直线相关分析。

2 结 果

2.1 各DM组OGTT各点血糖、胰岛素值的比较

老年DM组OGTT 2 h血糖及胰岛素值均高于成年DM组（均P

2.2 各组研究对象的临床指标比较

老年DM组与成年DM组比较，HOMAβ、TG均明显降低（P

2.3 老年糖尿病组HOMAβ与其他指标的相关性

在老年DM组内，HOMAβ与褪黑素呈明显正相关（r=0.403，P=0.016），与胰淀素(r=-0.461，P=0.003)、HOMAIR(r=-0.238，P=0.009)呈明显负相关，与FPG、INS、TG、WHR则无明显相关性，见表3。表3 老年糖尿病组胰岛β细胞功能与其他指标的相关性(略)

3 讨 论

胰淀素，又称胰岛淀粉样多肽（IAPP），在胰岛β细胞和胰岛素一起表达、合成、分泌，被认为是胰岛素的孪生兄弟，各种影响胰岛素分泌的因素同时也影响胰淀素的分泌。本研究结果显示，老年DM组血清胰淀素水平明显高于老年健康组，与国外〔3〕的研究结果相一致。相关分析还显示HOMAβ与胰淀素、HOMAIR呈明显负相关，说明增高的胰淀素可能是老年糖尿病患者胰岛素分泌缺陷的一个重要原因。胰淀素之所以能够导致胰岛功能受损，一方面可能由于胰淀素能抑制胰岛素的释放，提高血浆游离脂肪酸的水平，抑制肌肉组织对葡萄糖的摄取，抑制肝细胞对葡萄糖的利用和促进葡萄糖的产生而诱导胰岛素抵抗的发生。另一方面，胰淀素可自我聚集、变性、沉积在胰岛β细胞内，通过直接的氧化作用，在细胞膜形成特异性钙离子通道，增加P53和P21的表达等机制引起胰岛β细胞的损伤和凋亡，导致胰岛β细胞绝对数目的减少〔4〕，使胰岛素分泌最终减少。

通过抑制胰淀素的代谢异常、阻止胰淀素的聚集或拮抗其作用，均具有抗老年糖尿病的潜力。以胰淀素为作用靶点的药物将可能成为治疗老年糖尿病的全新手段。

褪黑素，N乙酰5甲氧基色胺，是色氨酸的衍生物。近年研究表明其是迄今已知的最强的自由基清除剂，能对抗氧化应激，对DM及其并发症有一定的治疗作用〔5，6〕。Ha等〔7〕通过实验证明褪黑素在分子水平上对血糖有稳定作用，并进一步推断老化使内源性褪黑素水平下降，可能与老年DM的发生发展有关。本文亦发现，老年DM组血清褪黑素水平明显低于健康对照组，进一步说明了衰老导致的褪黑素水平下降可能为老年DM发生的原因之一。经相关分析，本文还发现HOMAβ与褪黑素呈正相关。大量的动物及人体试验也证明褪黑素能够降低血糖，对胰岛β细胞具有保护作用〔8，9〕。

综上，胰淀素、褪黑素均与老年糖尿病胰岛β细胞功能有一定的相关性，但具体的分子机制目前尚不清楚，仍有待进一步深入研究。由于本研究样本量有限，还需进一步扩大样本量更深入了解胰淀素、褪黑素与老年DM胰岛β细胞功能的相互关系，从而寻求有效预防及治疗老年DM的新途径。

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第6篇：细胞核的功能范文

关键词: 肾病综合征;受体，白细胞介素2;T淋巴细胞;免疫，细胞

摘 要:目的 观察原发性肾病综合征（PNS）患者细胞免疫功能变化. 方法 采用双抗体夹心ELISA法检测血清可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R），流式细胞仪测定外周血T细胞亚群（CD3+ ，CD4+ ，CD8+ ）及红细胞C3b受体花环（RBC-C3b RR）和红细胞免疫复合物花环（RBC-ICR）试验. 结果 原发性肾病综合征组sIL-2R明显高于对照组［（398±122）vs（202±84）pmol・L-1 ，P

+ ，CD8+ 较对照组明显降低（0.50±0.08）vs（0.71±0.07），（0.26±0.07）vs（0.36±0.07），（0.22±0.05）vs（0.31±0.06），P

Keywords:nephrotic syndrome;receptors，interleukin-2;T-lymphocytes;immunity，cellular

Abstract:AIM To investigate cellular immune function and　erythrocyte immune function in patients with primary nephrotic syndrome（PNS）.METHODS Soluble interleukin2receptors（sIL-2R）were detected by ELISA.T-lympho-cyte subsets（CD3+ ，CD4+ and CD8+ ）were also evaluated by flow cytometry（FCM）.The red blood cell C3b receptor rosette（RBC-C3b RR）and the red blood cell immune com-plexs rosette（RBC-ICR）were measured.RESULTS Serum sIL-2R levels were significantly higher in PNS than in normal controls ［（398±122）vs（202±84）pmol・L-1 ，P

0 引言

研究发现，机体免疫功能的异常或紊乱是引起肾脏疾病的基础［1，2］ ，它在肾脏疾病的免疫发病机制中的作用日益受到重视［3，4］ .我们通过检测原发性肾病综合征（PNS）患者血清可溶性白细胞介素2受体（sIL-2R），T细胞亚群及红细胞免疫功能，旨在探讨PNS患者细胞免疫功能变化的意义.

1 对象和方法

1.1 对象 PNS患者40（男22，女18）例，年龄16～64（平均40）岁，均为住院患者，通过实验检查及临床确诊.对照组20（男13，女7）例，年龄20～40（平均30）岁，血、尿常规及肝肾功能正常.

1.2 方法

1.2.1 血清SIL-2R的测定 采用双抗体夹心ELISA法，试剂盒由第四军医大学免疫学教研室提供，具体操作步骤按说明书进行. 1.2.2 T细胞亚群的测定 取抗凝全血100μL，分别加10μL FITC标记抗CD3、抗CD4、抗CD8和IgG鼠单抗混匀，室温放置15min后，用QPREP自动细胞制备仪（Bekmn-coulter公司产品），加ABC液溶解红细胞和稳定淋巴细胞，轻轻摇荡10min立即用ProfileⅡ型流式细胞仪（美国Coullter公司产品）分析，所用激光光源为15mW氢离子激光，波长为A488nm ，检测1000个以上细胞.

1.2.3 红细胞免疫功能的测定 采用C3b 受体花环（RBC-C3b RR）和红细胞免疫复合物花环（RBC-ICR）试验（第四军医大学免疫学教研室提供）.预备试验:将补体致敏的酵母和未致敏的酵母冻干试剂，按说明书要求溶解、洗涤，配制成1×1011 个・L-1 的密度;另取患者末梢血或肝素125kU・L-1 抗凝血1滴，加入2mL生理盐水，每次经2000r・min-1 离心3min后，配制成1.25×1010 个・L-1 密度的红细胞悬液.

吸取致敏酵母菌悬液与未致敏酵母菌悬液各50μL，分别加入试管中，混匀，置37℃水浴中30min后取出涂片，加2.5g・L-1 戊二醛1滴，轻轻混匀，自然干燥，进行姬姆萨染色，用油镜（Olympus，日本产）观察.1个红细胞上结合两个或两个以上酵母菌者为1个阳性花环细胞，共计数200个红细胞，计算出RBC-C3b RR和RBC-ICR的百分率（%）.

统计学处理:实验数据以x ±s表示，两组间比较采用t检验，用SPLM统计软件包进行统计分析.

2 结果

2.1 sIL2R及T淋巴细胞亚群的变化 PNS患者外周血sIL-2R水平较对照组明显增高，有显著差异（P

+ ，CD8+ 较对照组明显降低，有显著差异（P

表1 sIL-2R及T淋巴细胞亚群的变化　略

2.2 红细胞免疫功能的变化 PNS患者RBC-C3bRR明显低于对照组，有显著差异（P

表2 红细胞免疫功能的变化　略

3 讨论

PNS是由原发性肾脏病引起，并非是细菌等致病因子直接侵犯肾脏引起，而是与免疫反应相关，当致病的抗原进入人体后，被吞噬细胞摄取，淋巴细胞对这些抗原进行识别引起免疫反应，造成肾小球损伤.目前已证实是一组免疫介导性疾病［5］ .T淋巴细胞亚群是构成机体免疫系统的重要因素，体内免疫平衡是通过辅T细胞CD4+ 和抑制性T细胞CD8+ 形成的T细胞网络来维持调节免疫功能的平衡［6］ ，二者的升高与降低，均可使两者的比例失调，导致机体免疫功能的异常或紊乱［7］ .免疫学研究证实，红细胞具有抗原提呈细胞作用，能促进T细胞的免疫功能，扩大细胞免疫效应，参与细胞免疫调控［8］ ，并能清除体内的免疫复合物，促进吞噬细胞的吞噬功能，调节体液免疫和细胞免疫，粘附自身的T细胞，增强T细胞免疫功能，更有效地清除免疫复合物［9］ .本资料显示PNS患者血清sIL-2R水平明显高于对照组（P

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第7篇：细胞核的功能范文

【摘要】 目的 观察连枷胸犬胸壁加压包扎、肋骨牵引和手术内固定的治疗效果。方法 实验用Beagle犬24只，随机分为A组(对照组)、B组(包扎治疗组)、C组(牵引治疗组)和D组(手术固定组)，每组6只，建立大面积(15cm2/kg)浮动胸壁动物摸型。用MPA动物肺功能记录仪、血气分析、胸腔置管等观察犬呼吸频率(RR)、潮气量(Vt)、每分钟静息通气量(VE) 、肺顺应性(CL)、气道阻力(Raw)、动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、动脉血氧饱和度(SaO2)、剩余碱(BE)及胸膜腔内压(IPP)等变化，比较胸壁加压包扎、肋骨牵引固定和手术内固定的治疗效果。结果 浮动胸壁模型完成后，均出现反常呼吸，胸膜腔内压负压绝对值减小(P

【关键词】 连枷胸；生理学；肋骨骨折；牵引术；包扎；内固定

Abstract： Objective To study curative effect of pressure dressing on chest wall，traction and internal fixation on pulmonary function in dogs with flail chest.Methods A total of 24 Beagle dogs were set up as great floating thoracic wall models(15cm2/kg)， then pided into internal fixation group，rib skeletal traction group，pressure dressing group and control group randomly，with 6 dogs in each group.The change of respiratory rate(RR)，tidal volume(Vt)，minute ventilation(VE)，lung compliance(CL)，airway resistance(Raw)，partial pressure of oxygen in artery (PaCO2)，partial pressure of carbon dioxide in artery(PaCO2)，arterial oxygen saturation(SaO2)，base excess(BE)，intrapleural pressure(IPP) were observed and recorded by MPA pulmonary function recorder and blood gas analysis.At last the therapeutic effect was compared among 4 groups.Results Paradoxical respiration occurred；intrapleural pressure decreased(P

Key words：flail chest;physiology;rib fracture;traction;dressing；internal fixation

连枷胸是最严重的胸壁损伤，其病死率达12%～50%［1］。对连枷胸浮动胸壁固定治疗，其固定方法的选择与对连枷胸所牵涉的复杂的病理生理的认识密切相关。近年来，国内外学者大多认为连枷胸所致的呼吸困难主要是由肺挫伤和反常呼吸引起［2］ 。笔者通过动物实验，排除肺挫伤的影响。观察大面积浮动胸壁对犬呼吸功能的影响以及胸壁加压包扎、肋骨牵引和手术内固定治疗的作用。

材料与方法

1 动物分组与模型建立

试验用Beagle犬24只，体重为(10.32±1.56)kg。用3%戊巴比妥钠(25mg/kg)静脉注射麻醉，气管插管后在右侧胸部相应面积(15cm2/kg)肋骨的两端切开胸壁皮肤，各游离肋骨3cm，保持胸膜完整，切断并剪去肋骨1cm，以确保损伤区域的胸壁能随呼吸自由浮动，缝合切口。模型制成后，随机分为4组，每组各6只犬（雌雄不拘）。A组为对照组，不进行治疗干预；B组为包扎治疗组：以浮动胸壁为中心，选用相应大小的厚棉垫加压包扎，使浮动胸壁极度内陷，进而消除反常呼吸；C组为牵引治疗组：行肋骨巾钳悬吊牵引固定，牵引重量为0.5～1kg，以正好对抗反常呼吸运动为宜；D组行手术切开复位，钢板＋螺丝钉内固定治疗。上述3种治疗方法，在治疗过程中均需保持胸膜腔完整。

2 观察指标

对实验犬行全麻气管插管后，气管插管外接MPA动物肺功能记录仪，测呼吸频率（RR）、潮气量(Vt)、每分钟通气量(VE)、肺顺应性(CL)、气道阻力(Raw)。于术侧腋中线第8肋间置胸腔管，接MPA动物肺功能记录仪测胸膜腔内压（IPP），适时记录测量结果。采抽取动脉血测动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)、动脉血氧饱和度(SaO2)、剩余碱（BE）、SB等。分别记录模型建立前、制模1小时、A组制模4小时、B、C、D组模型建立后4小时的上述观察指标。

3 数据处理

所测数据经SPSS 13.0统计软件，采用多个样本均数间的多重比较的统计学方法（SNKq）进行统计学分析。

结 果

浮动胸壁模型完成后，24只犬均出现胸壁反常运动，浮动幅度2～3cm。胸膜腔内压负压绝对值减小(P

讨 论

1 连枷胸行胸壁固定治疗的理论依据

胸壁的完整性对呼吸功能的维持有重要作用。连枷胸肺容量的减少主要是胸壁不稳及肺挫伤所致的纤维化导致。通常将连枷胸分类为前外侧区和后外侧区，两种类型均包含侧面区域，该区有反映呼吸力学的前锯肌指状突的插入。Borrelly等［3］报道前锯肌在连枷区错位复杂的病理生理过程中有重要作用，当涉及肩关节活动或作为吸气肌时，连于每根肋骨上的前锯肌指状突有如拉抽屉一样使连枷区错位，使其向后上方移位，由此产生肋骨断端重叠，并会导致伤者肺容量减少的恶性循环。外科手术固定骨折肋骨可有效防止或中止肋骨错位的恶性循环，早期复位和固定骨折肋骨，恢复胸壁的几何形状，保持胸壁的完整性，避免了因胸壁变形对肺功能的损害。Voggenreiter等［4］证实了对无肺挫伤连枷胸患者首先行手术治疗的重要性。据Clark等［5］统计31％的孤立性肺挫伤患者需要机械通气治疗，而57％的孤立性连枷胸患者需要机械通气治疗，再次强调了胸壁机械性完整性的重要作用。

2 胸壁加压包扎固定的治疗效果

20世纪初期对连枷胸采用捆绑固定的方法进行治疗，当时认为包扎固定可增加胸壁稳定性、减少疼痛和可能有助于咳嗽。本实验结果表明，在大面积连枷胸包扎固定后与对照组比较，IPP、Raw、RR显著升高（P

3 牵引固定的治疗效果

肋骨牵引固定是过去临床常用于浮动胸壁的一种方法，认为牵引固定后连枷胸侧胸壁的几何形状可恢复，胸腔容积可增加，牵引固定保持了胸壁的完整性，避免了因胸壁变形对其下肺区域的压迫，从而能产生足够的潮气量。本实验结果表明：与对照组比较，牵引治疗后Vt、Raw显著升高（P0.1）。说明牵引治疗后实验犬的潮气量虽有部分增加，但IPP、PaO2、PaCO2、SaO2、BE、CL、VE、RR变化不明显，其低氧状态未能得到有效改善。这主要是因为大面积浮动胸壁形成后，牵引固定虽能部分改善通气，但由于牵引外力持续作用于伤侧胸壁，对抗其弹性回缩，被牵引的浮动胸壁无法与健侧胸壁进行协同呼吸运动，无法恢复肋骨生理状态杠杆作用，胸廓生理状态的完整性未能得以恢复，肺的顺应性改善不明显，故呼吸功能仍不能恢复正常，缺氧状态无法得到有效改善。所以，至少对于大面积连枷胸来说，单纯行牵引固定无法达到满意疗效。

4 手术内固定的治疗效果

1975年Richardson等［6］首次报道了用钢丝修复胸骨骨折的方法。连枷胸手术内固定可有效地减少机械通气时间和ICU时间，减少肺炎的发病率及降低病死率，恢复胸壁的几何形状及生理状态的完整性，恢复肋骨生理状态杠杆作用，提高伤侧肺的顺应性，进而改善呼吸功能。本实验结果表明，与对照组比较，手术内固定治疗后PaO2、PaCO2、SaO2、CL、Vt、VE显著升高（P

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第8篇：细胞核的功能范文

[关键词] 伊贝沙坦；比索洛尔；心力衰竭；细胞因子；左心室功能

[中图分类号] R541.6 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2011）32-01-03

The Effects of Combination of Irbesartan and Bisoprolol on Serum Cytokine Levels and Left Ventricular Function Parameters of Patients with Chronic Heart Failure.

ZENG Lizhong XIE Zhenhua YANG Weiping

1.The Chronic Diseases Hospital of Luohu District of Shenzhen City in Guangdong Province，Shenzhen 518023，China；2.Shenzhen City Luohu District Hospital for Chronic Diseases，Shenzhen 518023，China；3. Guangdong Province Huizhou Central People’s Hospital，Huizhou 516001，China

[Abstract] Objective To investigate the effects of combination of irbesartan and bisoprolol on the serum cytokine levels and left ventricular function of patients with chronic heart failure. Methods We chose 80 cases of chronic heart failure patients and randomly divided them. The patients in treatment group were administrated combination of irbesartan 150mg Qd and bisoprolol 5mg Qd for one year，and those in control group were only administrated irbesartan 150mg Qd for one year. Before and after the treatment，the levels of serum cytokine levels and left ventricular function parameters were measured，and the side effects of two groups were also observed. Results In both groups，the levels of the serum levels of cytokines including interleukin-1（IL-1），interleukin-6（IL-6） and tumor necrosis factor-α（TNF-α） were lower than those before treatment（P＜0.05）. Compared with the control group，the changes in treatment group were significant（P＜0.05）. The left ventricular functions of both groups were significantly improved（P＜0.05），and more significant changes were found in patients of treatment group（P＜0.05）. Conclusion Combination of irbesartan and bisoprolol can effectively lower the serum levels of cytokines in patients with chronic heart failure，and improve their left ventricular function. Therefore，it can be an ideal method of therapy for the patients with chronic heart failure.

[Key words] Irbesartan；Bisoprolol；Heart failure；Cytokine；Left ventricular function

慢性心力衰竭是指由各种心脏疾病导致心功能不全的一种常见临床综合征，绝大多数情况下是指心肌收缩力下降使心排出量不能满足机体代谢需要，器官组织灌流不足，同时出现体循环和（或）肺循环淤血，是各种器质性心脏病发展的最终阶段，也是导致心脏病患者死亡的重要原因。研究表明，慢性心力衰竭是一个以免疫激活和低程度的慢性炎症为特点的疾病。一些炎症因子能通过促进心肌细胞肥厚、心肌收缩功能恶化以及诱导心肌细胞凋亡，在心衰的发展过程中具有重要作用。其中，血清肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-1（Interleukin-1，IL-1）及白细胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）等细胞因子异常激活参与了心力衰竭和心肌重构的发生过程，是心力衰竭重要的发病机制[1-3]。

伊贝沙坦（安博维，杭州赛诺菲-安万特民生制药有限公司）作为血管紧张素Ⅱ受体阻滞剂，是高血压和慢性心衰治疗的一线药物[4，5]。比索洛尔是选择性β-肾上腺素受体阻断剂，能抑制慢性心力衰竭患者的心肌重塑，降低心衰死亡率[6]。本研究随机选择慢性心衰患者80例，探讨合用伊贝沙坦和比索洛尔对慢性心衰患者细胞因子和左室功能的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

采用随机的方式选择2006年10月～2008年9月在本院住院或门诊就诊的慢性心衰患者共80例，随机分成治疗组和对照组。在强心和利尿等常规治疗基础上，治疗组口服伊贝沙坦150mg/d，比索洛尔5mg/d；对照组口服伊贝沙坦150mg/d，疗程为1年。其中，治疗组共40例，男性29例，女性11例，平均（67±11）岁，按NYHA心功能分级为Ⅱ级31例，Ⅲ级9例；对照组40例，男性28例，女性12例，平均年龄（68±10）岁，Ⅱ级32例，Ⅲ级8例。两组患者在年龄、性别和心功能分级上均无显著差异（P=0.62，0.47，0.85）。入选的患者依据病史、症状、体征、超声心动图和X线检查等确诊慢性心衰，并除外急性脑血管病、肝肾功能不全和恶性肿瘤者。

1.2 检测指标

服药前和及服药后1年清晨抽取空腹血10mL，离心取血清置于-80℃冰箱保存待测。用酶联免疫吸附法（ELISA法）测定血清IL-1、IL-6和TNF-α水平，试剂盒产于福建迈新生物公司，严格按照说明书操作。采用美国HP-1000型超声心动图机检测左室功能指标：左心室射血分数（EF）、心输出量（CO）、左室舒张末期容量（LVEDV）和左心室小径缩短率（FS）。同时严密观察患者不良反应。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0软件进行统计学分析。所有数据用（χ±s）表示，组间比较采用分组t检验，治疗前后比较采用配对t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者血清IL-1、IL-6和TNF-α水平比较

两组患者治疗前血清IL-1、IL-6和TNF-α水平无明显差异（P＞0.05）。治疗后两组患者IL-1、IL-6和TNF-α水平降低（P＜0.05），但治疗组降低较对照组更为明显（P＜0.05）。见表1。

2.2 两组患者左心室功能指标比较

治疗前治疗组和对照组左心室功能指标无显著差异（P＞0.05）；治疗后两组患者左心室功能均明显改善（P＜0.05），治疗组改善更加明显（P＜0.05）。见表2。

2.3 两组患者血压和心率比较

治疗组和对照组患者血压和心率治疗前无显著差异（P＞0.05）。治疗后两组患者血压和心率均有下降（P＜0.05），但是两组相比无明显差异（P＞0.05）。见表3。

2.4 不良反应观察

治疗组发生低血压3例，不良反应发生率是7.5%，对照组发生低血压2例，不良反应发生率是5%，两组无显著性差异（P=0.54）。所有患者未出现血管神经性水肿和肾功能不全等严重不良反应。

3 讨论

报道表明细胞因子在慢性心力衰竭病理生理和发病机制中起着重要的作用。慢性心力衰竭患者常伴炎症细胞因子的过度激活，导致IL-1、IL-6和TNF-α等细胞因子的过度分泌，促进心肌重塑， 引起心肌细胞凋亡、坏死和间质增生，造成心肌受损与加重心功能恶化，是慢性心力衰竭发生发展的重要机制[7]。其中，IL-1是由单核巨噬细胞产生的多肽物质，具有广泛的生物学活性，在调节机体免疫应答和炎症反应中起着重要的作用。IL-1能通过影响基因水平上的C型利钠肽表达，促进其在心衰中自分泌和内分泌作用，参与慢性心衰过程中的左心室心肌重塑[8]。IL-6是由一种具有多种生物学活性的细胞因子，可介导炎症细胞激活和炎症因子释放，导致炎症细胞聚集和心肌细胞损害。TNF-α是重要的炎性介质，可以通过促进内皮素-1产生，导致炎症和心肌细胞坏死，降低心肌收缩力，引起心肌损伤[9]。此外，TNF-α还可通过激活基质金属蛋白酶和抑制基质金属蛋白酶抑制剂表达参与细胞外基质重塑，促进心肌重塑，加重左心室衰竭的发生。IL-1、IL-6和TNF-α可通过心肌细胞与细胞因子受体反应，提高诱生型一氧化氮合成酶活性，削弱儿茶酚胺正性肌力作用，诱导氧自由基生成，促进心肌细胞凋亡及坏死，加速促进心肌重构。心肌损伤又可引起上述细胞因子过度分泌，形成恶性循环，促进心衰发生发展。因此，炎症细胞因子的过度激活是慢性心衰的重要发病机制。

伊贝沙坦能较完全地阻断血管紧张素Ⅱ和醛固酮的过度激活，是当前慢性心衰治疗的一线用药。本研究发现对照组患者经伊贝沙坦治疗后，细胞因子水平明显降低，左室功能改善，表明伊贝沙坦能有效抑制细胞因子的分泌，改善左室功能。血管紧张素Ⅱ与受体结合后，作用于核转录因子NF-κB并上调多种炎症细胞因子的基因转录，诱导IL-1和IL-6等多种炎症细胞因子分泌[10]。所以，伊贝沙坦可能通过阻断血管紧张素Ⅱ受体，抑制IL-1、IL-6和TNF-α等细胞因子的基因转录和分泌，抑制炎症反应并改善左心室功能。血管紧张素Ⅱ还能通过拮抗血管紧张素Ⅱ缩血管作用，增加肾脏血流，促进ET清除[11]，阻断ET和血管紧张素Ⅱ介导的细胞信号转导途径引起的心肌重塑，同时减少缓解肽降解，增加缓解肽水平，拮抗心肌细胞凋亡，防止心肌损伤和心功能受损。

比索洛尔是一种选择性β1受体阻滞剂，在目前各种选择性β1受体阻滞剂异性最高，能较完全地阻断神经内分泌系统过度激活产生的不良作用，是具有良好心血管保护作用的药物。本文发现联用伊贝沙坦和比索洛尔能更显著降低慢性心衰患者细胞因子水平，改善左心室功能，这表明比索洛尔可以协同伊贝沙坦，发挥抑改善左心室功能和心肌保护的作用。研究表明，炎症细胞因子的分泌与交感神经兴奋和儿茶酚胺产生增加有关[12]，所以，比索洛尔可能通过选择性阻断β1受体，抑制交感神经系统的过度激活，减少儿茶酚胺的产生，抑制上述细胞因子的基因转录及其分泌，降低血清IL-1、IL-6和TNF-α水平，改善左心室功能。同时，本研究发现两组患者治疗后血压和心率无显著差异，说明比索洛尔对慢性心衰患者细胞因子和左心室功能的作用与其对血压和心率的影响无关。同时，两组患者治疗不良反应较少，说明联用伊贝沙坦和比索洛尔有较好安全性。

总之，与单用伊贝沙坦相比，联用伊贝沙坦和比索洛尔能更有效降低慢性心衰患者细胞因子水平，改善其左心室功能，是慢性心力衰竭理想的治疗方案。

[参考文献]

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第9篇：细胞核的功能范文

本研究从[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]种植体周围炎患者脱落种植体周围骨组织中获取成骨细胞，通过对炎症与正常组织来源的成骨细胞进行对比，探讨种植体周围炎对成骨细胞生物学行为的影响，为种植修复提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 临床样本收集

种植体周围炎的骨组织样本来自中国总医院种植科，选取患者年龄小于等于60岁、种植体植入年限小于等于3年、种植于磨牙区且因种植体周围炎出现种植体脱落的患者4例，刮取种植体附着以及种植窝中的骨组织。正常组织来源的样本来自中国总医院口腔外科，选取4例身体健康的相同年龄段的第三磨牙拔除术患者，夹取舌侧骨板。所有患者均排除牙周炎，且近期没有急性感染、糖尿病、家族遗传病和骨质疏松症等全身系统性疾病。本研究已经中国总医院伦理委员会批准，且每例患者均签署了知情同意书。

1.2 成骨细胞的分离培养与纯化

PBS反复冲洗5次组织块，将较大的组织块剪为1 mm3大小，转移至离心管中，加入含有13.7 g·L-1 Ⅳ型胶原酶（北京索莱宝科技有限公司）和5 g·L-1胰蛋白酶（Amresco公司，美国）的消化液，37 ℃震荡消化45 min。1 000 r·min-1离心8 min，去上清，加入H-DMEM培养液（GIBCO公司，美国）和10%胎牛血清（Invitrogen公司，美国），吸管反复吹打成细胞悬液，接种培养皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱内培养。24 h后观察细胞贴壁及生长情况，待铺皿80%进行传代。采用反复贴壁法[3]对细胞进行纯化。

1.3 碱性磷酸酶鉴定染色

将第3代分离纯化后的成骨细胞以每孔1×104个的密度接种于24孔板，细胞达70%时，用4%多聚甲醛在4 ℃固定30 min。PBS反复冲洗后，使用碱性磷酸酶试剂盒（Sigma公司，美国）染色1 h。PBS反复冲洗后，在倒置相差显微镜下进行常规观察及照相。

1.4 MTT法检测成骨细胞的增殖能力

取对数生长期第3代细胞，经胰蛋白酶消化后离心加入DMEM（10%胎牛血清）终止成细胞混悬液，调整密度为2×104个·mL-1接种于96孔板，每孔0.2 mL。贴壁后隔天换液，连续培养8 d。每隔24 h取3孔，每孔加入20 μL 5 g·L-1 MTT溶液，37 ℃、5%

CO2[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]孵箱中孵育4 h，加入二甲基亚砜200 μL。采用酶联免疫检测仪490 nm波长下检测吸光度值，实验重复3次。

1.6 Western blot法检测成骨细胞相关蛋白OCN的表达

取第3代细胞进行接种，培养7 d后，将细胞用0.01 mol·L-1 PBS反复冲洗3遍，裂解细胞提取蛋白。取等量蛋白经8%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上，脱脂奶粉封闭过夜。加入鼠抗人OCN（Abcam公司，英国）（1︰1 000稀释）和β-actin（1︰2 000稀释），37 ℃孵育2 h，洗膜后，经辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG2a（Abcam公司，英国）（1︰4 000稀释）孵育50 min，化学发光法显示抗原抗体复合物，X线片显影并定影，所有杂交信号经成像分析仪系统测定条带密度进行定量分析，以目的蛋白灰度值与内参β-actin的比值表示蛋白的表达水平。

1.7 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，独立样本t检验进行两组间比较，P<0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 成骨细胞的分离培养及纯化

种植体周围炎来源的成骨细胞与正常组织来源的成骨细胞在培养过程中状态基本相同，10～14 d时从组织块中爬出，形状多为不规则形和三角形（图1）。反复贴壁法纯化成骨细胞贴壁后，2种来源的细胞在形态学上无明显差异，细胞均呈长梭形和多边形，胞核可见多核仁，呈圆形或椭圆形（图2）。

2.2 碱性磷酸酶鉴定染色

细胞固定后按碱性磷酸酶活性检测试剂盒要求进行检测，可见蓝黑色颗粒沉积在胞浆碱性磷酸酶活性部位（图3）。2种来源细胞都表现出了碱性磷酸酶阳性，但正常组织来源的成骨细胞比种植体周围炎来源成骨细胞内可见更多染色颗粒。

2.3 2种来源的成骨细胞增殖能力的比较

MTT检测结果（图4）表明，正常组织来源与种植体周围炎来源的成骨细胞都表现出了一定的体外扩增能力，从第4天起2种来源细胞的增殖能力出现统计学差异（P<0.05），种植体周围炎来源的成骨细胞的增殖活力明显低于正常组织来源的成骨细胞。

2.5 2种来源的成骨细胞相关蛋白的比较

Western blot检测结果表明，培养7 d时，与正常组织来源的成骨细胞相比，种植体周围炎来源的成骨细胞OCN的表达降低，相对灰度值分析表明种植体周围炎来源的成骨细胞OCN的表达水平约为正常组织来源的1/3（P<0.05）（图6）。

3 讨论

骨结合是牙种植手术的基础。种植体与颌骨骨性结合面的形成与种植区的骨密度密切相关，骨密度越高，种植体与骨的结合率就越高[4]。种植体周围炎正是在炎性微环境下，破坏了种植体与颌骨的骨结合，从而使种植体周围支撑骨组织的功能丧失。成骨细胞在骨组织的修复和改建中起到重要作用，是维持骨组织新陈代谢[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]的主要细胞；因此，研究炎症组织来源的成骨细胞很有意义。

本研究从种植体周围炎种植体脱落患者的颌骨骨组织中分离培养获得了炎症组织来源的成骨细胞，通过比较炎症组织来源的成骨细胞和正常组织来源的成骨细胞的增殖能力以及相关骨组织修复基因的表达等生物学功能变化，探讨炎性微环境对成骨细胞生物学功能的影响。

本实验选用的成骨细胞均为第4代以内的细胞，结果表明，炎症组织来源的细胞在体外培养后仍然具有一定的炎症组织来源特异性。炎性细胞因子和种植体周围炎致病菌的毒力因子会导致成骨细胞的增殖能力显著 下降。本研究结果显示，种植体周围炎来源的成骨细胞虽然在形态学上并没有表现出和正常组织来源的成骨细胞有明显差异，但是在细胞增殖活力方面表现出了不同，种植体周围炎来源的成骨细胞的增殖活力整体低于正常组织来源的成骨细胞。笔者认为这是由于种植体周围炎的炎性微环境抑制了成骨细胞的增殖能力。

Runx2和Col Ⅰ是反应成骨细胞分化能力的重要指标，Runx2是成骨细胞分化的关键转录因子，在骨组织的形成与重建过程中具有重要的作用[5]。炎性因子会影响Runx2的表达从而抑制成骨细胞的分化能力[6-7]。Col Ⅰ是成骨细胞分化成骨的重要基质。研究[8]表明，种植体周围炎的龈沟液中Col Ⅰ水平下降。本研究结果显示，种植体周围炎来源的成骨细胞的Runx2和Col Ⅰ表达水平相比正常组织来源显著下降，表明炎性微环境可影响成骨细胞的成骨分化能力，抑制Runx2和Col Ⅰ的正常表达，这与Liu等[9]对干细胞的研究结果一致。

OCN与成骨细胞的矿化紧密相关，在一定程度上反应了成骨细胞矿化的能力。学者[10]研究证实炎性微环境会降低[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]OCN的表达。本研究中，种植体周围炎来源的成骨细胞由于在炎性微环境下降低了OCN mRNA的表达，从而导致OCN蛋白水平也明显降低。可见炎性微环境抑制了成骨细胞矿化的能力。

炎性微环境下成骨细胞的生物学功能受多方面调控，通过对比种植体周围炎来源的成骨细胞和正常组织来源的成骨细胞的生物学功能变化，可以确定炎性微环境下成骨细胞的生物学功能受到影响，成骨分化及矿化能力显著降低，这是种植体周围骨组织吸收的重要原因。其具体机制尚需进一步的深入研究。