自荐信标题精选(九篇)

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第1篇：自荐信标题范文

关键词：充电；表面电位；等离子体；低轨道

1 概述

据统计，空间环境诱发的卫星故障，30%是等离子体对卫星表面充电导致的[1]。引起卫星表面充电的低能量电子和离子密度很大，表面充电经常发生。近年来，航天仿真技术因具有成本低廉，操作性强等优点迅速发展，本文利用欧空局SPIS软件建立等离子体对卫星充电模型并进行仿真计算，研究其对卫星表面充电电位的影响。文中进行电位比较不考虑正负，只考虑数值大小。

2 低轨道卫星表面充电电位变化规律

2.1 低轨道空间等离子体环境

低轨道300km～500km高度等离子体密度最高，也是卫星运行的集中区域[2]，发生充电的几率最大，我们利用SPIS软件进行充电仿真计算，研究等离子体环境对卫星表面充电电位的影响。图1和图2分别是等离子体电子温度Te和离子温度Ti随高度变化图。

2.2卫星表面充电电位仿真计算

表面电位V是表征卫星表面充电特性的最重要参数，假设卫星均匀充电，我们用软件计算卫星充电情况，得出V在Te和Ti变化时随不同时间段变化图3和图4。

图3中，在等离子体密度N=7×1011m-3，Ti=0.086eV（400km）条件下，V在T=175μs时达到最大值，此后保持不变。曲线①为Te=0.190eV时，卫星表面充电电位V=-0.285V；②为Te=0.207eV时，V=-0.327V；③为Te=0.224eV时，V=-0.371V。

图4中，在N=7×1011m-3，Te=0.207eV（400km）条件下，V在T=175μs时达到最大值，此后保持不变。①为Ti=0.121eV时，V=-0.293V；②为Ti=0.086eV时，V=-0.321V；③为Ti=0.060eV时，V=-0.327V。

从图3和图4可知，V在初始阶段变化明显，此后变化趋于平缓，一定时间后达到固定值并保持不变。Te和Ti不同的情况下，V的大小是不同的。在N和Ti一定时，相同时间内，Te越高，V越高。而在N和Te一定时，相同时间内， Ti越高V越低。

2.3 卫星表面充电电位变化理论分析

V变化逐渐趋缓并最终保持不变是因为电子流密度在初始阶段大，V迅速增大，其产生的负电场显著增大，造成流向卫星表面的离子密度流逐渐增大，电子流密度逐渐减小，使V变化缓慢，最终电子流密度和离子流密度达到动态平衡，V达到最大值并保持不变。Te越高V越高，Ti越高V越低是因为随着Ti升高，离子运动速度加快，从而充电过程中，快速移向卫星表面并中和卫星表面的电子，使卫星表面电位降低。

3 结束语

通过利用SPIS软件进行仿真计算我们发现，等离子体中电子温度越高，达到充电平衡时的电位数值越大；而离子温度越高，电位数值越小。与离子温度相比，电子温度的改变引起充电电位的变化更加明显，因此表面充电电位数值随轨道高度增加而逐渐增大。随着高度增加，电子温度继续升高，离子温度变化越来越小。通常情况下，对高度1000km以上低轨道区域进行计算时，不考虑离子温度的影响，可以使模型简单化，提高计算速度并且对结果影响不大。低轨道通信卫星表面充电是影响其运行安全的重要因素，研究等离子体温度对充电电位数值的影响可以为我们对卫星进行防护提高参考。

参考文献

第2篇：自荐信标题范文

关键词：DNA 计算；分子信标；NP\完全问题；Hamilton圈

中图分类号：O157.5文献标志码：A文章编号：1672-1098（2016）01-0030-04

Abstract： In order to solve the classical problems in graph theory and develop a new molecular structure by using DNA， based on the principle that different forms of fluorescent molecular-quenching molecular in the molecular beacon constitutes multi color molecular beacon， the detection model for the solution of Hamilton circle， the NP\complete problem， was given. The model has the advantages of simple encoding， low complexity， easy to detect and so on.

Key words：DNA computing； molecular beacon； NP\complete problem； Hamilton circle

1994年，文献[1]首次在实验室用DNA分子解决了一个含有7个城市的Hmilton有向路问题，自此，诞生了一个新的研究领域――DNA计算。1996年，文献[2]首次建立分子信标（molecularbeacon，MBs）探针，其作为一种新型的荧光探针在近年来得到广泛的应用和发展[3-6]。

继Adleman博士的著名实验之后，有关Hmilton路的一些其他问题的DNA计算也取得了一些进展[7-8]。除了在电子计算机和DNA计算机上的算法研究外，部分学者还在理论上对Hmilton问题进行了一定的讨论[9]。通过选择不同的荧光分子-猝灭分子对可以设计出不同荧光的分子信标（称多色分子信标），每个分子信标与其各自的靶标序列杂交后，会释放不同颜色的荧光，此时，通过荧光检测系统检测不同的颜色来解决问题，这样可以使多个靶核苷酸同时定量测定且加以区别，本文基于上述原理设计了一个Hmilton圈问题解的检测模型。

关于Hmilton问题的部分数学描述如下：包含图G的每个顶点的路称为G的Hmilton路；包含图G的每个顶点的圈称为G的Hmilton圈；一个图包含HaInilton圈，则称这个图是Hmilton图。对于n阶图G，如果G含长度是n的圈，则称G是Hamilton图[10]。Hmilton圈问题是图论最古老的研究课题之一，是至今未解决的世界难题，在许多领域有着重要应用，同时，它也是一个典型的NP-完全问题。

1分子信标原理

分子信标是一种设计巧妙的新型荧光探针，主要由环和茎杆部分组成。环上的寡聚核苷酸序列是分子信标的基因识别区，它能与靶基因自发地进行杂交；茎部是一段5～8mer序列互补的发夹结构。在分子信标的5’端和3’端通过连接臂连接上荧光素和猝灭剂。一般用EDANS（1一氨基萘一8一羧酸）为荧光素，用DABCYL（二甲氨基偶氮苯甲酰）为猝灭剂（见图1）。当茎杆部分解链后“发夹”就会打开从而变成单链分子。在原始状态下，分子信标呈茎环结构，当荧光分子与猝灭分子靠近（约为7～10 nm），即可发生荧光共振能量转移，此时，荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，检测不到荧光信号。分子信标的工作原理如图2所示，当有靶序列存在时，分子信标的环部即可与靶序列特异性结合，形成的双链比分子信标的茎环结构更稳定，荧光分子与猝灭分子分开，荧光分子发出的荧光不能被猝灭分子吸收，这时可检测到荧光，且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的量成正比。本模型利用金属纳米簇作猝灭剂，通过调节金属簇的大小、形状和组成而得到不同种的荧光，形成多色分子信标用于同时定量标记。

2） 由步骤1得到通过图G中的所有顶点的可能路径集，由于使用的分子信标探针P0，P1，P2，P3，P4，P5的荧光不同，可通过荧光检测系统检测出带有（且仅带有）这六种荧光的链，并保留。此时，便得到了通过图G中的每个顶点（且一次）的路径，即hamilton路。

32.3步骤3

以图3a为例，根据步骤1的编码规则，若步骤2所得片段构成hamilton圈，其产物的最后必定为v0编码的前10 bp寡聚核苷酸片段。

制作以v0前10 bp寡聚核苷酸片段互补序列为环部的分子信标探针P（见图4b），与步骤3的生成产物进行反应，通过检测荧光发光点的位置，判断是否为Hamilton圈。

324步骤4

若路径满足上述条件，则说明存在Hamilton圈，对步骤4的结果采用非放射性标记DNA测序的方法，进行测序，读出结果，否则，不存在Hamilton圈。

4结束语

分子信标具有结构简单、灵敏度高及易观测等优点，此技术在特定情况下能够把核酸序列转化为荧光信息。本文基于分子信标的这些特性建立了Hamilton圈问题的分子信标检测模型。通过多色分子信标同时标记，大大减少了DNA计算的过程，具有一定的学术研究意义。此模型的复杂程度与顶点数和顶点的度有关。当然，并非由此模型生成的混合物都是问题的解，还需要通过删选、检测过程进行判断。如果一个图中不存在Hamilton圈，那么最后溶液中就不会生成可以表示Hamilton圈的分子。此外，DNA计算所应用的各种生物技术自身也存在着一定误差，尤其是PCR技术。但随着分子生物学技术的不断发展，这些问题将会得到完善与解决。

参考文献：

[1]ADLEMAN L.Molecular computation of solutions to combinatorial Problems[J].Science，1994，266（11）：

1 021-1 024.

[2]TYAGI S，KZAMER F R.Molecular beacons：Probes that fluoresce upon Hybridization[J].Nat.Biotechnol.1996，14（3）：303-308.

[3]殷志祥，张风月，许进.基于分子信标的DNA计算[J].生物数学学报，2003，18（4）：497-501.

[4]殷志祥，许进.分子信标芯片计算在0-1整数规划问题中的应用[J].生物数学学报，2007，22（3）：1-6.

[5]HUANG XIAOHUI，YIN ZHIXIANG，ZHI LINGYING，et al.Molecularbeacon based on DNA computing model for 0-1 programming problem[C]//Bio-＼inspired Computing，2009：1-5.

[6]YIN ZHIXIANG，SONG BOSHENG，HEN CHENG，et al.Molecularbeacon-＼based DNA computing model for maximum independent set problem[C]//International Computation Technologyand Automation，2010：732-735.

[7]LIU WENBIN，XU JIN.A DNA solution to weighted Hamilton path problem[J].Systems Engineering and Electronics，2002，24（6）：99-102.

[8]GAO LIN，MA RUINIAN，XU JIN.DNA algorithm to the directed shortest hamilton path problem[J].Systems Engineering and Electronics，2002，24（8）：102-105.

[9]LEOBL M，MATAMALA M.Some remarks on cycles in graphs and digraphs[J].Discrete mathematics，2001，23（3）：175-182.

[10]JA BONGDY.Graph theory with applications[M].Macmillan London Press Ltd，1976：57-65.

第3篇：自荐信标题范文

关键词：战略性新兴产业类企业 融资能力 评价指标体系

一、引言

近年来，战略性新兴产业成为国家经济发展重点扶持对象，该产业属于技术依赖型产业，具有资源能耗低、带动系数大、就业机会多、综合效益好、市场前景广等特征。不过，就目前国内该产业发展情况来看，该类产业还处于初级发展阶段，从外部市场到内部管理都没有达到一定水平，资金实力较弱，发展规模偏小，目标市场还未成熟，拥有专利技术较少，研发人才短缺且流动性较大，产业化水平较低，这些问题都严重制约了该类产业的发展。在众多问题中，最根本问题在于该类产业普遍资金实力较弱，因此，解决该类产业资金问题是重中之重。

大部分战略性新兴产业中的企业属于中小企业，因此，该类企业具有大多数国内中小企业的发展特点，所面临的困难也有一定相似性，最大的相似点在于融资困难，各类金融机构对于新兴产业类型的企业重视度不够，贷款程序复杂，条件较高，这些都导致该类企业融资困难，严重限制了该类企业的发展。因此，为准确衡量和评价战略性新兴产业类企业自身的融资实力，有效规避银行放贷风险，提高贷款资金的盈利能力，推动该类产业产业化进程，提升整体产业水平，应从该类企业本身研究衡量其融资能力的指标，并构建一套完整、科学、系统的指标体系。

二、战略性新兴产业类企业融资能力评价指标选取原则及来源

为准确、客观、系统地评价战略性新兴产业的融资能力，保证指标选取的有效性和有用性，依据原则有：量化原则、数据可得性原则、指标代表性原则、相对量指标原则、动态与可持续性原则。

指标选取来源主要结合该类企业在发展过程中面临的各项风险来选择确定，这些风险包括：

第一，技术风险。由于该类产业属于技术依赖型，而现阶段国内相关技术都还在起步阶段，在技术研发过程中可能会存在如技术研发周期较长、技术研发失败、研发机构的合作关系中断、先进技术的应用性较小、科技转化率低等问题，这些问题都严重制约了该类企业的发展。

第二，市场风险。由于战略性新兴产业在我国还属于新兴产业，市场需求还没有足够开发，或者说市场需求不够旺盛，盲目放贷给该类企业可能会导致供需失衡、产能过剩等后果。因此，该类企业的市场风险往往也比较大。

第三，财务风险。受市场环境影响，该类企业初期经营绩效往往不会太好，这会严重影响到企业经营收益情况，如果企业不能持续盈利，现金流断裂会使企业未来发展陷入僵局。

第四，宏观政策风险。这些政策风险主要来自于国家的财税政策、技术政策、行业扶持政策。一旦国家发挥“看得见的手”的作用，对该类产业扶持力度加大，那么就会引起该类产业水平整体提升，盈利能力增强，市场逐步扩大，而如果国家放弃扶持，那么其发展速度会受到严重制约。因此，国家的相关政策在该类产业发展过程中发挥着主导作用。

三、战略性新兴产业类企业融资能力评价指标体系内容

通过分析研究该类企业存在风险，结合实际发展情况，本文构建技术指标、财务指标和宏观环境指标三个一级指标，并分设二级、三级指标来全面衡量评价该类企业的融资能力。

1.技术指标

（1）研发实力指标

①企业研发人员数量比值=研发人员总数/企业员工总数；

②企业研发人员结构比值=研发人员中各类学历人数/企业研发人员总数；

③企业研发经费投入比重=当年研发经费总额/企业当年各项经费总额；

④企业引进人才投入比重=（研发人才引入成本+研发人才培养成本）/ 人力资源总成本；

⑤企业研发合作投入比重=企业与外单位合作研发经费投入额/企业科研经费投入总额。

（2）技术实力指标

①自有技术项目数量比值=企业自主研发专利技术数量/企业技术总数；

②引进技术项目数量比值=企业引进技术项目数量/企业技术总数；

③企业专利产出比率=企业在某技术领域的专利申请量 / 该技术领域所有专利申请量的比例；

④企业科技论文产出比率=企业当年科技数量/行业当年科技总数；

⑤企业技术市场成交率=企业在技术市场中成交合同金额/企业当年科研经费总额；

⑥企业配套技术数量比值=企业配套技术数量/企业技术总数。

2.财务指标

（1）盈利能力指标

①主营业务利润率=利润/主营业务收入净额；

②资产净利率=净利润/平均资产总额；

③净资产收益率=净利润/平均净资产；

④成本费用利用率=利润总额/成本费用总额。

（2）营运能力指标

①应收账款周转率是指应收账款周转次数，即赊销净额/应收账款平均余额；和应收账款周转天数，即日历天数/应收账款周转次数；

②存货周转率包括存货周转次数，即销货成本/存货平均余额；存货周转天数，即日历天数/存货周转次数；

③流动资产周转率，即流动资产周转次数=流动资产周转额/流动资产平均占用额；

④总资产周转率，包括总资产周转次数，即产品销售收入/资产平均总额；总资产周转天数，即日历天数/总资产周转次数。

（3）发展能力

①营业收入增长率=（当年营收额-上年营收额）/上年营收额；

②资本保值增值率=扣除客观因素后的本年末所有者权益总额/年初所有者权益总额；

③总资产增长率=当年总资产增长额/年初资产总额；

④营业利润增长率=当年营业利润增长额/上年营业利润总额；

⑤市场份额增长率=（当年市场份额-上年市场份额）/ 上年市场份额。

（4）财务抗风险能力

该类企业的财务风险主要从企业自身的偿债能力来评价。

①流动比率=流动资产/流动负债；

②速动比率=速动资产/流动负债；

③资产负债率=负债总额/资产总额

④资本负债率=负债总额/所有者权益总额

⑤无形资产负债率=负债总额/无形资产

⑥税费占营运资金比率=企业缴纳税费总额/（流动资产-流动负债）

⑦利息保障倍数=EBIT/利息费用

3.宏观环境指标

（1）政策法律环境指标

①科技资金占财政总支出比例=当地政府财政科技拨款/当地政府财政总支出；

②政府支撑政策条款数量是指政府在相关政策条例中所规定的对该类产业的支撑条款数量；

③企业科技研发经费中政府资金占比=政府科技投入资金/企业总研发经费；

④税收减免幅度=（某项新实施税率-旧实施税率）/旧实施税率；

⑤政府为该类企业提供担保数量是指当地政府为该类企业提供担保的企业总数；

⑥知识产权保护条款数量是指国家法律法规条款中保护该类产业知识产权的条款数量。

（2）市场环境指标

①目标市场人均收入水平主要反映目标市场是否有足够能力支持该类企业的产品或服务；

②目标市场恩格尔系数=目标市场食品支出总额/个人消费支出总额

③该类产业对GDP贡献率=行业产值/GDP总量

④市场潜在需求量主要反映该类产业是否有足够市场需求，该指标涉及到该类产业是否能长足发展；

⑤该行业销售额增长率=（当年行业总销售额-上年行业总销售额）/上年行业总销售额。

（3）技术环境指标

①行业研发经费投入比值=行业研发经费投入额/行业总投入额

②行业技术成果转化率=已产业化的技术成果数量/行业技术成果总量

③行业技术引进消化吸收率=消化吸收的技术数量/引进技术总量

④行业技术市场成交率=技术市场成交合同金额/研发经费支出

⑤技术人才流动率=年技术人才流动量/总人才数量

⑥万人发明专利拥有量=年末发明专利拥有量/年末总人口，指每万人拥有经国内外知识产权行政部门授权且在有效期内的发明专利件数。是衡量一个国家或地区科研产出质量和市场应用水平的综合指标。

四、结论与不足

通过对战略性新兴产业类企业融资能力评价指标体系的构建，为金融机构特别是银行明确了放贷标准，为有效评价其贷款安全性和盈利性打下坚实基础，初步保证银行贷款安全、可靠，同时，对于该类企业，可以使其结合自身实际经营发展情况从以上这些指标着手逐步培养自身的融资能力，提高未来获得银行资金支持的可能性。不过，战略性新兴产业类企业虽然有共同之处，但是由于涉及行业有七项，而以上提出的指标只是针对共性提出的，对于行业特殊性方面，并未能完全体现，因此，还应在实际考察某项具体行业企业时，结合行业特点补充或者减少具体评价指标的项目。

参考文献：

[1]王佩，李芸. 企业融资能力与融资行为分析[J]. 经济师，2001（9）

[2]孙威武. 企业技术创新项目风险评价[J]. 中南财经政法大学学报，2004（1）

[3]潘奇才，刘铁兵. 高技术企业综合水平的评价方法研究[J]. 科研管理，1996（1）

第4篇：自荐信标题范文

[关键词] 新疆紫草;过表达载体;RNAi载体;GATEWAY技术

[收稿日期] 2014-06-18

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81130070，81072989）;国家科技支撑计划项目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）

[通信作者] *郭兰萍，Tel：（010）64011944，E-mail：

[作者简介] 谢腾，硕士，Tel：18310830559，E-mail：

新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst是药用紫草的主要来源[1]，其重要成分紫草素类化合物具有止血、抗癌、抗HIV等多种药理活性[2-4]，同时也是天然的化工染料和食品添加剂[5-6]。

紫草素类化合物通常认为是在限速酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、甲戊二羟酸单酰辅酶A还原酶（HMGR）和对羟基苯甲酸香叶基转移酶（PGT）催化下，通过苯丙氨酸（phenylpropan-oid，PP）-甲羟戊酸（mevalonate，MVA）复合途径合成。PAL是PP途径中的起始代谢酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，进而开启对羟基苯甲酸（PHB）的合成。MVA途径上的HMGR将甲戊二羟酸单酰辅酶A还原为甲戊二羟酸，进而生成PP和MVA途径的中间产物焦磷酸香叶酯（GPP）。最后PHB，GPP在PGT的催化下合成紫草素类化合物前体香叶基-对羟基苯甲酸（GHB）[7-8]。

次生代谢通路上关键酶基因表达的变化会影响次生代谢物的生物合成，可以通过改变某特定基因的表达来调节下游次生代谢，即基因的过表达（或超表达）和RNA干扰（RNA interference， RNAi）技术，控制目标代谢产物的合成。为此，本研究拟构建新疆紫草次生代谢途径中关键酶基因PAL，HMGR，PGT过表达和RNA干扰载体，为培育新疆紫草次生代谢物高产株系和次生代谢相关基因的功能验证奠定基础。

1 材料

新疆紫草愈伤细胞取自中国科学院植物研究所叶和春研究员处。

基因过表达载体pH7WG2D和RNA干扰载体pK7GWIWG2D均由中国中医科学院中药资源中心提供。

2 方法

2.1 目的基因序列的获取和引物设计

在NCBI（http：//ncbi.nlm.nih.gov/）下载目的基因序列：PAL（gi|90994675），HMGR（gi|91208650），PGT（gi|158957516）。

过表达载体的片段为目标基因的全长，引物位于ORF外，RNA干扰的片段引物位于ORF内。使用Primer Premier 5分别设计含CACC接头和不加CACC接头的合适引物。

2.2 新疆紫草cDNA的获得

采用Trizol法新疆紫草愈伤组织细胞总RNA提取，并做RNA质量检测。使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，将新疆紫草新鲜RNA反转录为单链cDNA，并至于-20 ℃保存。

2.3 PCR扩增

2.3.1 通用PCR扩增 使用TaKaRa Ex Taq酶做普通PCR扩增，所用引物不加CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.3.2 菌液PCR扩增 使用TaKaRa Taq酶做菌液PCR扩增，所用引物不加CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.3.3 高保真PCR扩增 使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR酶做高保真PCR扩增，以T载体克隆所得质粒为DNA模版，所用引物含CACC接头。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.4 PCR产物的回收与纯化

PCR扩增产物回收与纯化使用生工SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。将所得到的DNA保存于-20 ℃。

2.5 PCR产物的T载体克隆

PCR产物的T载体克隆使用Promega的pGEM-T EasyVector Systems，4 ℃水浴过夜，转入DH5α，LB平板（氨苄霉素，Amp抗性）培养过夜，筛选菌落并菌液PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.6 转化大肠杆菌

选择Trans5α感受态细胞，吸取200 μL已转化的感受态细胞加到含相应抗生素LB琼脂培养基上，均匀涂开细胞，至液体被吸收，倒置平板，37 ℃过夜培养。筛选菌落并菌液PCR验证，1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.7 质粒提取

质粒DNA提取使用QIAprep Spin Miniprep Kit试剂盒。

2.8 GATEWAY方法构建载体

GATEWAY技术是基于λ噬菌点特异性的成熟重组体系，由BP，LR 2个反应就构成，可同时转化多个基因，较其他载体构建方法快捷高效[9]。BP反应将目的基因从PCR产物重组到供体载体，从而形成入门载体（donor vector），LR反应则将入门克隆重组入目的载体（destination vector）[10-11]。

2.8.1 BP连接反应 使用Invitrogen公司pENTRTM SD/D-TOPO Vector做入门载体连接高保真PCR产物。在微量离心管中配制BP反应混合液（3 μL体系）：1.5 μL ddH2O，0.5 μL 高保真PCR产物，0.5 μL salt solution，0.5 μL 入门载体。22 ℃水浴3 h，转入DH5α，LB平板（卡那霉素，Kana抗性）培养过夜，筛选菌落并菌液PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

2.8.2 LR连接反应 选择BP反应测序成功的质粒，进行LR反应。使用Invitrogen公司LR Clonase Ⅱ enzyme mix介导目的基因从入门载体的连接到入门载体。过表达载体为pH7WG2D，RNA干扰载体为pK7GWIWG2D，在微量离心管中配制LR反应混合液（4 μL体系）：1 μL 入门克隆（50～150 ng），1 μL 目的载体 （150 mg・L-1），1 μL LR Clonase Ⅱ enzyme mix，1 μL ddH2O。25 ℃水浴12 h，加入1 μL proteinase K solution，37 ℃水浴5 min，终止LR反应。将LR连接产物转入DH5α，LB平板（壮观霉素，Spe抗性）培养过夜，筛选菌落并菌液PCR验证。1%琼脂糖凝胶电泳检测并测序。

载体构建的流程见图1。

图1 载体构建流程图

Fig.1 Flow chart of vector construction

3 结果

3.1 引物合成

依据NCBI提供的新疆紫草PAL，HMGR，PGT的cDNA序列，设计并合成目的基因过表达载体和RNA干扰载体构建所需cDNA扩增特异性引物，见表1。

3.2 T载体克隆

将已纯化的过表达和RNAi基因PCR产物与pGEM-T Easy Vector连接，并将产物转入DH5α进行菌液培养，菌液PCR获得目的基因的T载体质粒，见图2。

表1 PAL，HMGR，PGT扩增特异性引物

Table 1 Primers of PAL， HMGR， PGT for overexpression （upper） and RNAi （lower）

引物名称 序列（5′-3′）碱基数片段长度/bp

过表达载体PAL-FTGCTAATACTTCCACACG182 386

PAL-RGAGAACAAAAAGAAATAG18

HMGR-FTGAAACAATCATCACTTAC192 013

HMGR-RTTTATCAATGAGGTGGAC18

PGT-FTAAACATCCCAAACTAAAG191 203

PGT-RAACAAATTTTGATAATGC18

PAL-F-CACCCACCTGCTAATACTTCCACACG222 386

PAL-R-CACCCACCGAGAACAAAAAGAAATAG22

HMGR-F-CACCCACCTGAAACAATCATCACTTAC232 013

HMGR-R-CACCCACCTTTATCAATGAGGTGGAC22

PGT-F-CACCCACCTAAACATCCCAAACTAAAG231 203

PGT-R-CACCCACCAACAAATTTTGATAATGC22

RNA干扰载体PAL-FTGAGTCAATGAAGGGTAGC19490

PAL-RGAGGGGTAGGAATGGAGTAA20

HMGR-FCTCGGTTCCTATGGCTAC18525

HMGR-RCAGGAGCACATCGTCTTG18

PGT-FATTTGGATGGTGGGCAGTT19328

PGT-RTAAAGCGGGTAGGCGATA18

PAL-F-CACCCACCTGAGTCAATGAAGGGTAGC23490

PAL-R-CACCCACCGAGGGGTAGGAATGGAGTAA24

HMGR-F-CACCCACCCTCGGTTCCTATGGCTAC22525

HMGR-R-CACCCACCCAGGAGCACATCGTCTTG22

PGT-F-CACCCACCATTTGGATGGTGGGCAGTT23328

PGT-R-CACCCACCTAAAGCGGGTAGGCGATA22

1.PAL质粒DNA;2.空载质粒DNA;M.2 kb DNA Ladder（图3～5同）。

图2 过表达（上）和RNAi（下）基因的T载体克隆PCR凝胶电泳

Fig.2 T vectors cloned PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3 过表达和RNA干扰载体的构建

3.3.1 高保真PCR 以构建好的pGEM-T质粒为模板，使用加有CACC的特异性引物，用高保真酶Phusion High-fidelity进行PCR扩增，获得过表达基因全长和RNA干扰基因片段，PCR产物进行纯化后，进行下一步的BP反应，见图3。

图3 过表达（上）和RNAi（下）基因高保真PCR凝胶电泳

Fig.3 High-fidelity PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3.2 BP连接反应 获得目的片段后进行BP反应，产物转化DH5α，在Kan抗性的LB培养皿37 ℃培养过夜，挑取单克隆，做菌液PCR鉴定，见图4。提取测序正确样品的质粒进行的LR反应。

图4 过表达（上）和RNAi（下）基因BP反应凝胶电泳

Fig.4 BP reactions PCR gel electrophoresis of overexpression（upper） and RNAi（lower） gene

3.3.3 LR连接反应 BP反应的产物经过LR反应，分别将目的基因克隆到过表达载体pH7WG2D和干扰载体pK7GWIWG2D上，转化DH5α，在Spe抗性的LB培养皿37 ℃培养过夜，挑取单克隆，做菌液PCR鉴定，见图5。测序结果显示与目的基因的序列一致，说明新疆紫草次生代谢关键基因PAL，HMGR，PGT的过表达和RNAi载体构建成功。

图5 过表达（上）和RNAi（下）基因LR反应凝胶电泳

Fig.5 LR reactions PCR gel electrophoresis of overexpression （upper） and RNAi （lower） gene

本研究从NCBI获得新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因，使用Primer Premier 5分别设计了过表达和RNA干扰引物，和对应含CACC接头的引物，并以新疆紫草cDNA为模版PCR克隆得到过表达载体构建所需的全长基因（长度依次为2 086，2 013，1 023 bp）和RNA干扰所需的基因片段（长度依次为490，525，328 bp）。PCR产物经过纯化后连接在pGEM-T EasyVector后使用高保真酶Phusion High-fidelity做PCR，并将产物转入了GATEWAY载体构建技术的BP反应入门载体pENTRTM SD/D-TOPO Vector，在卡那霉素抗性筛选后将新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因的全长转入过表达载体pH7WG2D，并将目的基因的编码区片段转入RNA干扰载体pK7GWIWG2D，经测序验证基因无变异。

4 结论

本研究采用本实验室研究较为成熟的pH7WG2D，pK7GWIWG2D载体，使用GATEWAY载体构建技术分别成功构建了新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因过表达和RNA干扰载体，对于新疆紫草基因功能验证和遗传转化的平台建立起到了关键作用。

植物的代谢无时无刻不受到基因的调控，次生代谢物发生变化，意味着指导其生物合成的代谢通路有所异动，这种异动往往是由于代谢通路上某一个或一类关键酶基因的表达发生了变化，所以可以人为改变某特定基因的表达来调节下游次生代谢，进而控制目标代谢产物的合成。而这种基因表达的改变，莫过于上调或下调其表达量，基因的过表达技术对应着前者，RNA干扰则与后者对应。

目的基因与一个强启动子连接后，在载体的介导下转入植物体，使得目的基因在整个生命过程中都有表达，即实现过表达，这对于基因功能的研究有重要意义[12-19]。例如，将新疆雪莲查尔酮异构酶基因在烟草中的过表达，会使得烟草大量积累黄酮类化合物，总黄酮量能达到对照组的6倍[20]。基因的过表达在对次生代谢进行调控的同时会改变植物的抗性，对于新品种的选育和开发有重要意义[21-22]。例如，崔道雷等的研究表明，过表达转录因子对烟草中过表达云南红梨的PybHLH基因，会显著提高烟草的耐盐性[23]。

RNAi形成的机制在于双链RNA被降解为21～25 bp的siRNA（small interference RNA）并与特异蛋白结合为siRNA诱导干扰复合体，该复合体通过碱基互补配对识别并降解与之高度保守的同源mRNA，从而达到基因缺失的目的[24-25]，反过来就是通过研究RNAi干扰后植物所呈现的功能或表型的改变可以判断扰基因的功能。例如，在宋婕的研究中，SmPAL1基因干扰的株系中咖啡酸的含量明显低于对照组，丹酚酸B的含量却有所提高，同时研究还发现RNAi植株中木质素的含量也会有所降低，由此可以认为SmPAL1基因会促进咖啡酸和木质素的合成[26]。RNA干扰除了可以调控植物次生代谢和验证基因功能外[27-33]，同样可以用于抗性植物的培育[34]。

由于新疆紫草分布区域狭窄，新疆紫草野生种群处于濒危状态，属于国家国家重点保护野生植物[35]。生物工程培养新疆紫草获取次生代谢产物[36]是目前满足日益庞大的紫草素类化合物的工业和社会需求的主要手段[37]，也是新疆紫草目前研究的热点[7-8]。过表达和RNAi载体的构建，是进一步构建过表达株系或RNA干扰株系的先决条件。搭建基于过表达和RNA干扰的遗传研究平台是新疆紫草次生代谢物生物合成研究的不可或缺的部分。

本研究通过GATEWAY技术成功构建了新疆紫草次生代谢关键基因PAL，HMGR，PGT的过表达载体和RNAi载体，同时提供了一套系统的载体构建方法，对于搭建新疆紫草功能基因挖掘和验证的遗传研究平台，和PAL，HMGR，PGT过表达株系和RNAi株系的构建奠定了基础，也填补了新疆紫草在该领域研究的空白，并为中药次生代谢机制的研究提供了丰富的理论支持。

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Overexpression and RNAi vectors built for key secondary metabolic

pathway genes PAL， HMGR， PGT of Arnebia euchroma

XIE Teng1，2， LIU Yu-zhong2， WANG Sheng2， LIU Tan2， KANG Li-ping2， GUO Lan-ping2*

（1. School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu 610031， China;

2. State Key Laboratory of Dao-di Herbs， National Resource Center of Chinese Materia Medica，

China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Arnebia euchroma is the main source for medicinal herb Zicao. and its most important component shikonin compounds have high medicinal and industrial value. This research is aimed to build overexpression vectors and RNAi vectors for key secondary metabolism genes of A. euchroma， and bulid platform for constructions of related transgenic lines using GATEWAY technology. To build genetic material based genetic research platform is to provide a great convenience for digging and functional verification of the genes on secondary metabolic pathway， and also to fill the gaps in transgenic research of A. euchroma. This study is also important for the cultivation of shikonin high-yielding strains of A. euchroma.