茶叶中吡虫啉残留量的测定检验方法

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1实验部分

1.1仪器、试剂与材料

Waters　ACQUITY　UPLCTM–TQD　MS／MS系统（美国waters）；高速匀质机（德国IKA）；氮吹仪（美国Organomation）；离心机（日本日立）；漩涡混合器（德国IKA）；电子天平（FA1104，上海天平仪器厂）等。阿维菌素标准品；吡虫啉标准品（95％）；乙腈（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；乙腈（分析纯）；固相萃取小柱：氨基炭黑柱（500mg／6mL）；水为二次蒸馏水。

1.2标准溶液的配制

精密称量50．0mg阿维菌素和吡虫啉原药于100mL棕色容量瓶中，用甲醇（色谱纯）溶解并定容，配制成500mg／L的标准储备液。

1.3标准曲线

取阿维菌素和吡虫啉标准储备液，分别用甲醇稀释配制成5ng／mL、10ng／mL、50ng／mL、100ng／mL、500ng／mL的标准工作溶液，经液相色谱测定后建立两种目标物浓度与峰面积的回归方程。

1.4色谱质谱条件

色谱柱：UPLC　ACQUITY　BEH，50×2．1mm，1．7μm；采用乙腈和0．005mol／L乙酸铵溶液梯度洗脱，洗脱程0～1min，20％A；1～4min，90％A；4～5min，100％A；5～7min，20％A。流速：0．3mL／min；柱温：40℃；进样量：10μL离子源：ESI，正离子模式；毛细管电压：4．0kV；离子源温度：110℃；脱溶剂气温度350℃；脱溶剂气流量：800L／hr；锥孔反吹气流量50L／hr；锥孔电压：40v；扫描方式：多反应监测（MRM）；离子对：吡虫啉，256／175．1（定量离子对），256／209；阿维菌素，890．5／305．2（定量离子对），890．5／567．3。

2分析步骤

2.1提取

准确称取2．5g（精确至0．01g）均匀试样，用5mL水将试样润湿，放置5min，加入5g无水硫酸钠和15mL乙腈，涡动3min，超声5min，5000r／min离心5min，将上清液转移至浓缩瓶中。用10mL乙腈再提取一次，合并提取液。将提取液于50℃水浴下用旋转蒸发仪浓缩至近干，在残渣中加入2．0mL甲醇＋二氯甲烷溶液，备用。

2.2净化

将炭黑氨基柱用4．0mL甲醇＋二氯甲烷溶液（5＋95）预条件化，加入上述待净化溶液，用10mL具塞试管收集，用2．0mL甲醇＋二氯甲烷溶液（5＋95）洗浓缩瓶后淋洗小柱，重复一次。将收集溶液置于50℃水浴中用氮气吹干，残渣用1．0mL乙腈溶解，在漩涡混合器上混匀，过0．2μm微孔水相滤膜后于高效液相色谱测定。

3结果与讨论

3.1工作曲线

用流动相将混合标准溶液稀释成5ng／mL、10ng／mL、50ng／mL、100ng／mL、500ng／mL，以峰面积为纵坐标，目标化合物的浓度为横坐标，绘制标准曲线。阿维菌素和吡虫啉的相关系数分别为R＝0．9991和R＝0．9985，回归方程分别为y＝2632x＋1033和y＝8150x＋229，在5ng／mL～500ng／mL范围内，阿维菌素和吡虫啉工作曲线线性良好，适合定量分析。

3.2液相色谱、质谱测定条件的优化

阿维菌素和吡虫啉的极性较弱，在反相色谱柱上的保留较强，因此选择较高比例的乙腈作为强洗脱溶剂。母离子扫描显示：阿维菌素和吡虫啉在正离子模式下，目标物检测离子以［M＋NH4］＋形式存在的量较多，在流动相中加入5mmol／L乙酸铵可促进母离子的形成。两种化合物的保留时间、定量离子、定性离子、锥孔电压及碰撞能量。

3.3净化条件的选择

由于茶叶中色素含量较高，所以选取了可以有效吸附色素的色谱柱。结果表明，炭黑氨基柱可以很好的吸附色素和其他杂质，同时，选用合适的洗脱液完全可以将两种化合物洗脱，从而获得较高的添加回收率。普通的氨基柱也可获得较高的添加回收率，但由于不能吸附提取液中的色素，从而增加了对分析柱的污染及对仪器响应的干扰，而选用碱性氧化铝柱和C18SPE柱时不论选择哪种淋洗剂，回收率均小于60％。所以最终选用炭黑氨基柱。淋洗液选用甲醇和二氯甲烷，对二者比例进行了优化，当甲醇和二氯甲烷的比例在1∶99到5∶95之间，回收率均能满足要求，当甲醇和二氯甲烷的比例为5∶95时，回收率达到最大值。

3.4检出限

联合国粮食与农业组织（FAO）与世界卫生组织（WHO）均未制定最高允许残留限量，加拿大和澳大利亚规定油菜籽中最高残留限量为0．05mg／kg。联合国粮农组织和世界卫生组织（FAO）所属的食品中农药残留立法委员会（CCRPF）规定了阿维菌素的每日允许摄入量0．1μg／kg•bw，阿维菌素的最高残留限量（MRL）为5μg／kg，美国农业部下属的食品安全检验局（FSIS）规定的MRL值为20μg／kg，欧盟规定MRL值为0．02mg／kg。加拿大卫生部EMRL2012－45号通报，有害生物管理局修订了吡虫啉的最大残留限量。将吡虫啉在蛋、猪、马、牛、绵羊、山羊、家禽的脂肪、肉以及肉副产品中的最大残留限量修订为0．02×10－6，将吡虫啉在干黄豆和奶类中的最大残留限量分别修订。

3.5方法的准确度与精确度

用上述试验方法，在样品中添加不同水平的阿维菌素和吡虫啉混合标准溶液，进行添加回收率试验，分别进行了5μg／kg、20μg／kg和100μg／kg三个添加水平的两种目标化合物的加标回收实验，每个水平重复测定6次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表2。从表2可以看出，平均回收率范围为81．4％～95．8％，RSD分别为2．0％～8．5％。

3.6应用

该方法已应用于茶叶中阿维菌素类药物残留的检测。在对购自湛江市场的5份绿茶、5份红茶、5份普洱茶的检测中，只有其中一份绿茶检测出10．4μg／kg的吡虫啉。

4结论

本文建立了茶叶中阿维菌素和吡虫啉的超高效液相色谱－串联质谱方法。通过对提取与净化方式进行探讨与优化，在一定程度上减少了茶叶基体对检测的干扰。采用电喷雾电离源，在含有乙酸铵缓冲液的流动相条件下，以选择信号强且稳定的［M＋NH4＋］加合离子峰作为母离子，以基质校正曲线进行定量。方法稳定、可靠、灵敏，能够满足国内外法规对茶叶中阿维菌素和吡虫啉残留的限量要求，可用于茶叶中阿维菌素和吡虫啉两种农药残留的检测与确证。

作者：王立一 杨春亮 王晓芳 单位：中国热带农业科学院农产品加工研究所