健康儿童口腔微生物的定植研究

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[摘要]人体是一个由真核细胞和共生在体内的微生物群落共同构成的超级生物体。口腔，作为微生物进入身体的门户，其微生物群落的正常确立及平衡维持对口腔局部及全身系统的健康都有非常重要的作用。在母体内，婴儿就开始不断发生人与人或人与环境之间的紧密接触，从而与微生物之间建立密切联系。不同的生产方式，不同的喂养方式均能影响微生物在新生儿口腔中的定植。在乳牙列期，乳牙萌出为微生物的定植提供了新的生态位点，口腔微生物的构成随之发生变化。随着恒牙的萌出，口腔环境进一步变化，微生物的定植也发生变化直至成熟，即微生物定植种类更加丰富，牙周致病菌的定植也显著增加。

[关键词]口腔微生物；早期定植；年龄

现代生物学观念认为，人体是一个由真核细胞和共生在体内的微生物群落共同构成的超级生物体[1]。人体的代谢是由宿主自身基因组调节的各种代谢途径以及微生物基因组调节的代谢过程共同组成，这种宿主与微生物之间的共同代谢过程最终调节着宿主的整体健康。人类个体的健康状况与寄居微生物紧密相关。从出生后，婴儿就开始不断发生人与人或人与环境之间的紧密接触，从而与微生物之间建立密切联系。在人体口腔中，微生物定植的第一步就是细菌的黏附。在婴儿期的最初几个月，口腔中能发生细菌黏附的只有黏膜表面，随着牙的萌出，细菌黏附位点显著增加。细菌的黏附不仅发生于细菌与口腔位点之间，也同样发生于细菌相互之间。例如绿色链球菌，以及另一种严格厌氧菌-具核梭杆菌之间即可发生特异性黏附。从婴儿期开始，个体口腔微生物的定植已经有明显的不同，婴儿的照顾者及其他亲密接触者的口腔微生物种类对婴儿口腔微生物的定植有明显影响[2]。同时，婴儿的饮食或药物的应用等也对微生物在口腔的定植产生影响。在乳牙开始萌出后，牙的出现为微生物的定植提供了新的生态位点，口腔微生物的构成有明显改变。在混合牙列期，恒牙开始萌出，口腔微生物构成也发生新的变化。目前随着分子生物学技术的发展，更多的非培养，高通量方式被应用于口腔微生物的检测中，如DNA芯片，高通量测序等。这些方式的应用让研究者对人类口腔微生物的定植产生了新的理解。在这个新的技术时期之前，研究者们推测口腔内存在的细菌约有1000余个种属或者种系型[3]，但目前的研究发现口腔内的微生物种属可能高达19000个[4]，其中绝大多数为不能培养的细菌。同时，目前的研究也发现口腔的感染性疾病，如牙周疾病或是龋病，并非单一菌种感染致病，而是多菌种协同致病的结果[5-6]。口腔微生物在口腔内各个生态位点定植，相互作用，其整体的平衡与失衡与口腔及全身健康息息相关。那么，了解口腔微生物在健康状况下的定植，并进一步对比其在疾病状况下的变化，对进一步了解对口腔这一微生物进入身体的门户至关重要。本文主要对近年来年龄相关的口腔微生物正常定植情况研究进行综述。

1胎儿期

过去，人们一直认为，胎儿在子宫内是在无菌环境下发育完成的。但是，Bearfield等[7]发现，70%孕妇的羊水中出现了口腔微生物的早期定植。其中最常见的微生物为具核梭杆菌，一种牙周可疑致病菌。这也有力解释了为什么孕妇及低体重儿具有高牙周疾病感染风险。在怀孕期间，口腔微生物可能是通过菌血症到达子宫内，尤其是在有母亲有牙周感染的情况下。由此可见，孕妇孕期口腔筛查及口腔健康维系非常重要。

2新生儿期

从出生时，婴儿的口腔内即出现微生物的定植，这一时期定植于口腔的微生物，并不会全部都在口腔中长期的生存下来[8]，但先期定植微生物通过分泌及代谢产物等方式影响随后定植的微生物种类。例如唾液链球菌作为新生儿口腔中最早定植的细菌之一，能够产生胞外聚合物从而为其他细菌提供黏附位点。而这种微生物定植的早期区别能够影响微生物后续定植并最终产生口腔成熟生态系的差别。那么，了解最初在口腔内定植的微生物构成，对研究口腔疾病的发生发展非常重要。不同的生产方式对婴儿的口腔微生物定植产生不同的影响。LifHolgerson等[9]发现，不同生产方式的婴儿口腔微生物可以显著区分为2个类别。Dominguez-Bello等[10]发现，在出生后5min以内，在新生儿身体上即发现细菌定植（口腔、鼻咽部、皮肤及肠道内）。与母体身体不同部位高度分化的微生物定植情况不同的是，新生儿全身的微生物定植情况并没有较大差异。顺产的新生儿其微生物的定植与母体阴道的微生物定植情况相似，以乳杆菌属、普雷沃菌属及纤毛菌属为主。剖腹产的婴儿其微生物定植情况与母体皮肤相似，包括葡萄菌属、棒状杆菌属及丙酸菌属等。在出生后几个小时以内，新生儿的口腔即出现大量微生物定植，其来源为呼吸，喂食，与父母的接触以及医院内接触等。就在这段时期，口腔内微生物的永久性定植开始发生，在24h内，口腔微生物的早期定植已经出现，革兰阳性球菌，如链球菌及葡萄球菌等为优势菌。与成人相比较，3个月的婴儿口腔微生物的丰富度明显较低，但顺产的婴儿口腔中的微生物种类显著多于剖腹产的婴儿。剖腹产的婴儿在口腔中具有独有的Slackiaexigua菌，在76%的剖腹产婴儿中，能够检测到其存在。Slackiaexigua是一种革兰阳性严格厌氧菌，在牙周炎，根管感染及肠脓肿中可以检测到。虽然Slackiaexigua只能在剖腹产婴儿口腔中检测到的确切机制还并不清楚，但LifHolgerson等[9]推测顺产婴儿其口腔内较多的微生物定植可能抑制了Slackiaexigua的生长。随着年龄增长，婴儿口腔内的微生物群落也在进化。随着与外界环境接触的增加，如进食、与其他人或宠物的接触、卫生习惯的建立等，在5个月的婴儿口腔中，其口腔微生物已经与母亲出现明显差异。Cephas等[11]通过454焦磷酸测序发现在无牙颌儿童中有99%的序列可以归为以下6个门：厚壁菌门、变异菌门、放线菌门、梭杆菌门、螺旋体门及拟杆菌门。在无牙颌儿童及母体中，厚壁菌门、变异菌门、放线菌门及梭杆菌门均为优势菌门。在28个具有明显差异的菌属中，链球菌属在婴儿口腔中检出率明显高于成人，韦荣球菌属、奈瑟菌属、罗思菌属、嗜血杆菌属、孪生球菌属、颗粒链菌属、纤毛菌属及梭杆菌属也是婴儿口腔中的优势菌，嗜血杆菌属、奈瑟菌属、韦荣球菌属、梭杆菌属、罗思菌属、密螺旋体及放线菌是成人口腔的优势菌。虽然在婴儿中能检测到的口腔微生物较少，其口腔微生物的多样性确比其父母更高。对于变异链球菌来说，采用剖腹产出生的婴儿感染变异链球菌的概率是顺产婴儿的11.7倍。在6个月大的婴儿中，变异链球菌的感染率即高达50%，其感染的相关因素有高糖摄入，母乳喂养及与母体间的亲密接触等。在感染变异链球菌的婴儿中，其母体的唾液中变异链球菌的含量普遍较高，同时口腔卫生状况差，高牙周炎患病率，较低的社会经济地位及较高的零食摄入次数均会导致变异链球菌的高感染率[12]。

3乳牙列期

乳牙的萌出对微生物的黏附和定植提供了新的生态位点，故其对口腔微生物构成具有深刻的影响。在之前的研究中，有些学者曾将这一时期命名为“感染窗口期”，认为某些致龋菌，如变异链球菌等只在这一时期才开始定植。但最近的研究显示[11]，早在无牙颌时期，就可以检出上述菌属，证明口腔软组织可能起到很重要的“微生物储备库”作用，即使是无牙颌期儿童，其口腔卫生维系仍然不可忽视。Xu等[13]采用454高通量测序对乳牙列儿童进行分析，共发现8个门，15个纲，21个目，30个科，41个属的细菌微生物。无论是否有龋坏，儿童的口腔微生物中有99%的序列可以归为5个门：厚壁菌门、变异菌门、放线菌门、梭杆菌门及拟杆菌门，以及7个属：纤毛菌属、链球菌属、放线菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、奈瑟菌属及韦荣球菌属。Ling等[6]的研究结果也相似。乳牙萌出后，变异链球菌的感染率随年龄增加而增加，2岁的婴儿中，有81%感染变异链球菌[14]。在婴儿中，感染变异链球菌的平均年龄为15.7个月，与变异链球菌感染相关的因素有入睡前含糖液体的摄入，高糖暴露率，零食摄入，与成人分享食物及母体唾液高变异链球菌水平等。与此同时，变异链球菌的低定植率与刷牙，抗生素摄入等呈负相关。三岁时，儿童的唾液微生物群组构成已经非常复杂，但其微生物构成在不同时期，如乳牙列期，混合牙列期及成人期仍在不断变化。乳牙列期儿童较其他时期而言，其口腔微生物构成中具有更多的不动杆菌属，莫拉菌属，水栖菌属等，而随年龄增长，从混合牙列期到成人期，在口腔微生物构成中发现了更多了的韦荣球菌科微生物（韦荣球菌属及月形单胞菌属）及普雷沃菌属，发现肉杆菌科（颗粒链菌属）减少[15]。Kamma等[16]对4~5岁的乳牙列期儿童龈下菌斑进行培养后，共发现41个菌种。而Gizani等[17]在乳牙列和混合牙列期儿童中，均可检测到致龋菌，变异链球菌及血链球菌在软组织，龈下菌斑及龈上菌斑中的检出量随年龄增加而显著增加。致龋性链球菌在软组织，唾液及舌体上比在牙面上更容易定植，这些部位可能是口腔致病菌的“储藏库”。

4混合牙列期

随年龄增加，牙周可疑致病菌牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、福赛斯坦纳菌及4种橙色复合病原体含量也增加[18]。而Cortelli等[19]用PCR技术检测无牙颌新生儿及混合牙列期儿童时，均没有发现牙龈卟啉单胞菌。而齿垢密螺旋体均有检出，提示在无牙颌期，即有齿垢密螺旋体的定植。在混合牙列期儿童中，直肠弯曲菌、中间普雷沃菌、福赛斯坦纳菌、侵蚀艾肯菌等的检出量明显增多，提示这些细菌的大量定植与恒牙的萌出具有相关性。在混合牙列期儿童龈下牙周袋中，齿垢密螺旋体与福赛斯坦纳菌检出量呈现正相关，提示在无牙颌期齿垢密螺旋体的定植与牙萌出后福赛斯坦纳菌的定植可能具有相关性。总的来说，牙的萌出是口腔微生物定植的关键因素。在Cortelli等[20]的研究中，他们发现在0~4个月大的婴儿中，即可检测到直肠弯曲菌，说明直肠弯曲菌的定植不依赖于牙萌出所提供的生态位点，牙龈卟啉单胞菌的定植是从混合牙列期到恒牙列期过渡时才开始出现，福赛斯坦纳菌及中间普雷沃菌定植的时间较早，从混合牙列期，恒牙开始萌出时开始定植。Sakai等[21]发现，在巴西混合牙列期儿童中有高达70%~80%的比例感染伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌及齿垢密螺旋体中的一种。但值得一提的是齿垢密螺旋体在日本混合牙列期儿童中并未被检出，推测其定植可能有地域或饮食因素[22]。

5微生物在口腔不同部位的定植

由于口腔中多定植位点的存在，使口腔微生物组是人体中最为复杂的生态系统。不同的生态定植位点、其氧压力、营养成分、温度及宿主免疫体系均不相同[5]。在口腔基本所有的生态位点上，均有微生物定植，但其定植密度及成分各不相同。与黏膜及唾液相比较，牙面及舌部定居的微生物相对更多。在软组织、唾液、舌部及龈上菌斑中，可以发现有更多的链球菌属。轻型链球菌和口腔链球菌是软组织中含量最大的微生物，唾液链球菌在唾液、软组织及舌部也占有非常大的比例。放线菌属在龈上及龈下菌斑中具有非常高的比例。而在舌部，可以找到更多的嗜乳酸杆菌及革兰阴性杆菌[13]。唾液可以传送游离出来的微生物，起到“传输带”的作用，而舌背部等软组织则在很大程度上起到“微生物储备库”的作用。某些微生物不仅可以在口腔软组织面找到，还可以存在于人体上皮细胞中。如伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌及福赛斯坦纳菌等可以协同作用共同进入宿主上皮细胞内。同时，在口腔上皮细胞内不光能发现口腔致病菌，还能发现全身致病菌的存在，如在颊黏膜上皮中，发现金黄色酿脓葡萄球菌、粪肠球菌及绿脓假单胞菌的定植[23]。说明口腔软组织可能起到全身微生物“储备库”的作用。

6口腔微生物的传播途径

不同的口腔微生物来源均不相同。垂直传播是口腔微生物传播的一个重要途径。母亲及最初的抚养者是婴儿及幼年儿童口腔微生物的最早来源[2]，如通过自然分娩，80%的母亲阴道中的白假丝酵母菌能够在新生儿中发现。而通过哺乳，母乳中特有的微生物也能传播到婴儿体内[24]。30%~60%儿童口腔中的变异链球菌及伴放线放线杆菌与其父母亲口腔中的基因型相同[25]。研究显示，致龋菌的早期定植是龋病的高危因素之一，所以，对儿童的父母或是早期抚养者口腔健康的维系也应该纳入龋病防治的重点。口腔微生物的水平传播也是其传播的一大途径。在过去的30年里，整个社会及经济结构发生了非常大的变化，而这一变化对口腔微生物的构成也会构成非常重要的影响。在家里由家人抚养的儿童和在幼儿园生活的儿童其口腔微生物的来源非常不同，如在12~30个月大在幼儿园生活的儿童中，有29%口腔内变异链球菌的基因型相同，而且与在家抚养的同龄儿童相比，他们与其母亲口腔中变异链球菌的相似度显著降低，提示了水平传播的重要性。总之，在整个儿童时期，口腔微生物都在不断地变迁，进化及成熟。口腔微生物的最初定植，与很多因素，如生产方式，接触人群，喂养方式，生活环境等等均有相关。在不同牙列时期，口腔微生物定植具有其自身特点。目前的研究显示，无论是在健康或是疾病状态，口腔微生物中并没有出现疾病相关“特异性致病菌”。如Ling等[6]用聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳结合454焦磷酸测序技术对乳牙列期儿童的唾液及龈下菌斑进行分析，发现在龋坏儿童中并没有发现特异性致龋菌。有学者发现，10%的有龋儿童及青年人口腔内没有检出变异链球菌，其龋坏的发生更可能是韦荣球菌属、乳杆菌属、双歧杆菌属和丙酸菌属，低pH值非变异链球菌类链球菌属，放线菌属共同作用而成。这提示，口腔微生物群落的整体作用，而非特定细菌的感染导致口腔感染性疾病如龋病等的发生。口腔正常菌群群落的定植和平衡对维持口腔及人体系统健康具有非常重要的意义。

作者：杜芹 邹静 李雨庆 李明云 周学东 单位：口腔疾病研究国家重点实验室 华西口腔医院（四川大学） 四川省人民医院口腔科