口腔种植体体内生物学评价方法的研究

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【摘要】口腔种植体的体内生物学评价主要是通过动物实验获得种植体的生物安全性、骨结合效能及稳定性等相关生物学指标，为种植体表面处理改进、结构设计优化、缩短负重时机等提供科学依据。目前，鲜有报道，本文对有关口腔种植体的体内生物学评价方法进行综述。

一、大体观察

在对动物进行种植手术前应确保实验动物无任何不良反应或系统性疾病，种植位点近远中间隙及颌龈间隙量足，黏膜无明显红肿或异常渗出，咬合关系无明显异常，无明显骨壁缺损，尽量统一入组标准。术中及时对动物呼吸、脉搏、心率等生命体征进行检测，防止动物意外死亡。术后按照实验设计定期观察并记录种植位点伤口愈合情况、黏膜情况以及种植体有无松动脱落等。另外部分学者用镊子等金属器械叩击种植体，通过声音及手感对种植体稳定性作出定性评价，但此法重复性差，主观性强、测量结果可靠性较低［3］。

二、牙周健康指标评价

种植体的牙周健康指标能够反映种植体在口内的长期稳定性［4］。根据不同的实验设计，检查种植体周围探诊深度(probingdepth，PD)，牙龈指数(gingivalindex，GI)，探诊出血指数(bleedingonprobing，BOP)，改良出血指数(modifiedsulcusbleedingindex，mSBI)，种植体松动度以及边缘骨吸收程度等指标，来反映种植体在动物体内周围软硬组织的生理变化，评价新型种植体与对照植体的优缺点。目前种植体失败的主要原因是种植体周围炎［5］。以上牙周指标能够对种植体周围炎的发生作出客观定量的评价。

三、实验室检查

国际标准化组织(ISO)文件指出，种植体、修复用合金等17种应用于机体与生物组织直接接触的生物医用材料需要进行相应的实验室检查，为材料的生物安全性提供科学依据［6］。动物的体内实验室检查主要在种植手术前、后2个阶段进行，术前各项指标检测作为对照组以排除由于动物本身全身系统性或代谢性疾病导致的误差。实验室检查的项目主要包括血常规、尿常规、便常规、血气分析、血电解质、肝功能、肾功能、血脂、心肌酶、甲状腺功能、血糖以及血清免疫学检测等。在新型种植体植入前后，比较动物各项检查指标统计学差异，另外也可以与临床中已经使用的种植体做横向对比，讨论新型种植体的生物安全性。除以上体内实验外，种植体的体外实验，包括:溶血实验、细胞毒性实验等因其操作简单、灵敏、重复性好、费用低廉可部分代替体内实验。同时为确保生物材料安全性，节约实验时间，通常应先进行体外检测［7］。近几年随着对种植体周围炎的研究逐步深入，部分学者提出龈沟液中的一些细胞因子是种植体周围炎的启动因子，例如白介素(interleukin，IL)-17A、IL-35和IL-8等［8］，另外，Niimi等［9］通过临床试验认为种植体周围龈沟液的量可以反映种植体周围软组织的炎症程度，因此可以监测种植体周围龈沟液特异性细胞因子和量的表达，进而反映种植体的炎症状态。

四、影像学检查

影像学检查能够在无创条件下，对种植体的位置、周围颌骨形态、骨质密度、不同时点骨吸收程度等进行定量评价。根尖片由于其价格低廉、操作简单、放射剂量小，在种植体的临床试验中更易被患者接受。但是，由于对拍摄角度、曝光量和冲洗条件较难统一调控，导致根尖片检查的可重复性较差［10］。另外，与锥形束CT(CBCT)、显微电子计算机断层摄影(Micro-CT)、核磁共振成像(MRI)相比，根尖片对种植体周围骨密度、骨量吸收、骨小梁排列等细节成像清晰度较差。CBCT在种植临床术前评估中应用广泛，它能够清楚的显示复杂细小的解剖结构，如颏管、副颏管和副颏孔、上颌窦壁、血管、颞下颌关节、骨小梁、下颌切牙管、舌孔和舌管、根管、牙周组织等［11］。相比传统多排螺旋CT，CBCT具有放射剂量低、空间分辨率高、全部1∶1成像、影像细致分明等优势。在动物实验中，CBCT可以定量监测种植体植入后边缘骨吸收情况，并三维重建种植体在骨内位置，合理的评价种植体长期稳定性。Micro-CT的辨析率能达到14μm，相比CBCT对种植体周围组织显像更加细致［12］。计算骨-种植体接触比率曾被认为是观察骨-种植体界面状态的最客观及直接的方法，但缺点是组织切片为二维图像，所得数据不够准确。随着Micro-CT技术的逐渐成熟，已有一部分学者开始利用Micro-CT的高分辨率及三维立体成像的优势，来分析骨-种植体界面，并计算骨-种植体的三维接触比率［13］。另外Micro-CT可以对骨体积、骨密度、骨小梁分离度、骨小梁厚度等进行定量评价，便于实验数据统计分析。为了获得精确的实验结果，使用Micro-CT检测的实验标本最好在动物处死后，取种植位点局部颌骨标本，并用保鲜膜包裹，以免标本脱水干燥而影响组织结构观察［14］。纯钛金属材料种植体的MRI兼容性已经得到大部分基础实验及临床实验证实［15］。MRI不仅能够提供组织精细的解剖影像，而且能对软硬组织中病灶进行精确的定位，但纯钛种植体在MRI检查中，对其周围软组织成像仍有一定伪影，并且伪影面积大小与种植体体积有关［16］。动物体内实验中较少使用MRI检测种植体周围软硬组织变化，通常使用MRI来评价新型种植体的体内兼容性，检测伪影面积对周围软硬组织的影响程度。

五、骨结合效能检测

骨结合是种植体负重的基础，骨结合效能能够反映种植体长期稳定性、种植体结构设计是否合理以及种植体表面处理工艺的优良。研发种植体中对骨结合的检测至关重要。种植体与骨界面之间的应力分为压应力、拉应力和剪应力，分别用推出实验、抗拔实验和扭转实验检测［17］。推出实验是利用万能实验机将标本固定后，沿种植体长轴方向按一定速率加压，直至种植体被推出。抗拔试验是根据实验设计在规定的时间点，用万能实验机固定骨块标本和种植体修复基台，沿种植体长轴方向以一定速率加载拉力，记录即刻拔出作用力。扭转实验在骨结合力的检测中最为常见，它通常用于螺纹形种植体的生物力学测试，而现在大多数种植体表面均有螺纹［18］。扭转实验是用万能实验机固定标本和种植体后，逆时针旋转直至种植体旋出，通过计算机记录每个种植体的扭矩曲线。在扭矩曲线上可以确定骨-种植体界面破坏时的屈服点，得出相应的临界扭矩值。Cornelissen等［19］认为骨-种植体界面的刚性反映骨结合的成熟程度。连接牙种植体表面与周围骨组织发生直接的生物性锁结是保证种植修复义齿成功的基础，种植体在植入后，种植体周围新形成的骨组织逐渐增多并不断成熟，界面的刚性也逐渐增大。

六、牙周测试仪检查

牙周测试仪能够测量种植体骨结合的稳定性，数据具有客观可重复性，不会因操作者不同而出现统计学意义上的显著差异［20，21］。但因其测量耗时，使用时需叩击种植体，对于种植体植入早期时会产生震荡，影响初期稳定性，故无法全程检测种植体的骨结合情况，现已较少使用。

七、组织学评价

种植体研发中组织学评价的应用比较广泛。带种植体的骨组织标本最好制作为不脱钙磨片，因其完整的保存了骨组织的矿化结构，标本染色后可较为清楚的在种植体周围显示新生骨所在区域，有利于骨形态参数的测量［22］。染色方法一般选择亚甲基蓝-碱性品红法、甲苯胺蓝染色法、Coldner’s三色法。不同染色方法显色情况及优缺点如下:①亚甲基蓝-碱性品红法将成骨细胞染为深蓝色、类骨质为蓝绿色、骨组织为紫色，该染色方法在种植体周围观察新生成骨细胞更加清晰;②甲苯胺蓝染色法将骨组织染为蓝色，将纤维染成白色，该染色方法主要显示新生骨的成骨情况;③Coldner’s三色法将成骨细胞染为桔黄色、新生矿化骨为蓝绿色或亮蓝色、成熟骨组织为绿色。在新骨矿化的各个阶段，Coldner’s三色法对种植体周围成骨细胞、类骨质、矿化骨均有清晰的显色。3种显色方法中，Coldner’s三色法更适合区分矿化骨和未矿化骨，以及观察种植体周围骨矿化各个阶段的形态学变化;亚甲基蓝-碱性品红可用来定量统计种植体周围成骨细胞的情况;甲苯胺蓝染色可以与其他染色方法配合进行种植体-骨结合表面新骨形成面积研究的参照［23，24］。

八、电镜观察

电镜观察最大的优势是能够观察种植体骨界面的超微结构，成像更加立体、细致和真实［25］。不同种类的电镜观察方法如下:扫描电镜分辨率高，除了能够观察种植体骨界面超微结构外，还能够配备X射线能谱仪和X射线波谱仪对标本进行定性和无标样定量分析。另外扫描电镜能够测量种植体-骨接触率及种植体与骨之间的间隙距离。种植体与骨之间的间隙距离通常取同一倍数下种植体与骨之间的最大间隙、中等间隙和最小间隙，最后取平均值。透射电镜采用低温离子减薄制片技术，用PhlipsEM-430和X射线双晶衍射仪进行观察分析，界面形成骨组织的标志是出现大小不一的高电子密度钙球或一体化骨钛复合体，通过统计钙球密度和骨钛复合体面积，评价种植体骨结合程度［26］。

九、共振频率分析

近几年来，共振频率(RFA)分析技术在临床中用来评价种植体稳定性，取得了良好的效果［27］。RFA的原理是通过激发与种植体相连的悬臂梁，通过仪器计算悬臂梁的共振频率进而代表种植体的稳定性，所测得的种植体稳定数值称为ISQ值，该值越大，代表种植体的稳定性越好［28］。RFA是一种非破坏性的种植体评价方法，无需敲击种植体，且RFA测量过程不会影响正常的组织愈合，因此RFA可用于种植体骨整合阶段的全程定量监测［29］。

十、口腔黏膜刺激实验

口腔黏膜刺激实验是根据ISO7405-1997国际标准设计的，用来评价与口腔黏膜短期或长期接触的材料对黏膜产生的刺激作用，该实验被国际标准化组织列为评价口腔材料生物安全性的必需实验［30］。种植体的生物安全性至关重要，可将种植体缝合固定在动物颊粘膜上，观察不同时点黏膜组织代谢情况，为种植体的生物安全性提供科学依据。综上所述，口腔种植体研发的体内生物学评价方法多种多样。在研究中，应根据实验目的合理选择检测方法，其中，影像学检查和共振频率分析是检测种植体骨结合过程中比较精确的方法，种植体旋转实验和组织学评价能够定量反映出种植体骨结合效能。因此，笔者认为以上4种方法在种植体评价方法中尤为关键。骨结合和生物安全性两个方面是体内评价的重要内容，如何能够实现在无创条件下，更加直观、准确、高效的评价种植体的骨结合程度和结构设计是否优良，并将其用于临床实践中仍有待于研究。

作者：王凌霄 高振华 李钧 单兆臣 单位：首都医科大学口腔医学院种植中心