脂肪干细胞在泌尿系统疾病中的研究

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摘要：脂肪干细胞（adipose-derivedstemcells,ADSCs）是一类从脂肪分离出来的具有自我更新及多向分化潜能的成体干细胞，AD-SCs具有高度的可塑性，可分化成多种类型的细胞。与其他干细胞相比，ADSCs具有来源充足，取材方便，供体易接受等独特优势，已成为基础医学及临床治疗的研究热点。ADSCs诱导分化和移植可有效治疗多种组织损伤性疾病，改善或修复器官功能，近年来ADSCs作为细胞疗法及组织工程的新型种子细胞在泌尿系统疾病治疗中取得了重大进展。本文重点讨论ADSCs的生物学特性及其在泌尿系统疾病中的应用前景。

关键词：脂肪干细胞；泌尿系统疾病；组织工程

前言

脂肪干细胞（adipose-derivedstemcells，ADSCs）是从脂肪分离获得、属于中胚层来源的间充质干细胞。ADSCs最初是由Zuk等[1]人利用负压抽脂术从脂肪组织悬液中分离培养出的类成纤维样细胞，发现它们在特定诱导条件下，可定向分化成脂肪细胞，软骨细胞，成肌细胞和成骨细胞，并首次证实其为多功能干细胞。近年来，骨髓间充质干细胞（bonemarrowderivedstemcells,BMSCs）一直是国内外学者研究的热点，但由于其提取困难，来源较少，患者因疼痛较难接受等缺点，使其在临床应用过程中受到极大的限制。2003年，DeUgarte实验室首次从同一患者体内提取培养ADSCs和BMSCs，对其比较发现，两者在细胞形态，生长动力学，细胞衰老，多向分化能力及基因转导效率五个方面均无显著性差异[2]。而与BMSCs相比，ADSCs具有来源充足，提取简单，易自体取材，对供体伤害小等独特优势，使其有望成为基础医学研究和临床治疗的新型种子细胞。目前已有文献报道，ADSCs可诱导分化成肾脏上皮细胞，并在膀胱及输尿管修复中取得了初步进展，在很大程度上解决了肾脏和尿路器官的修复与重建及免疫排斥等诸多棘手难题[3-6]。本文主要就ADSCs的生物学特性及其在泌尿系统疾病中的作用和机制作以简要综述。

1ADSCs的生物学特性

1.1ADSCs的细胞形态

ADSCs为贴壁细胞，原代接种后5-7d为生长滞后期，细胞呈梭形或圆形，核多居中，部分细胞可见双核或多核，核浆比较大。经传代后，细胞增殖迅速，体积增大，细胞逐渐趋向成纤维样生长，呈涡旋状紧密排列。ADSCs稳定性相对较好，经多次传代后细胞形态无明显改变[1]。

1.2ADSCs的分离培养与鉴定

目前为止，ADSCs主要的分离培养方式是将手术中取得的脂肪组织进行反复冲洗和剪碎，制成脂肪组织悬液，用胰酶或胶原酶消化、离心后，弃去上层液体和残余脂肪，培养液重悬沉淀后进行培养，大多选用的培养液为经典的10%的胎牛血清成纤维培养液，最后经0.25%胰酶消化，逐次传至第三代后可获得大量的脂肪干细胞系[7-9]。另外，目前尚未研究出鉴定ADSCs的特异性表面标记，主要参照相关的基质细胞及干细胞的特异性标记物进行鉴别。综合以往研究结果发现，ADSCs主要表达CD9、CD10、CD13、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD58、CD59、CD90、CD105、CD146、CD166、SH-3等，不表达CD31、CD34、CD45、HLA-DR，其中对于CD34的表达尚存在争议[10-13]。然而，有研究表明以上这些标记物的表达会因ADSCs获取的部位，供体种类，手术类型，细胞密度及传代次数的不同而具有差异性[14,15]。因此，只凭某些CD分子的表达来鉴定ADSCs是无可信性的，鉴定ADSCs最可行性的方法是进行多系定向诱导分化，检测分化细胞的相应指标，若诱导成功则可间接证实ADSCs具有干细胞特性。如ADSCs向平滑肌分化的潜能可以根据诱导后细胞的形态及特异性标记物来鉴定。若细胞形态由成纤维样变成纺锤状肌束，且α-平滑肌肌动蛋白、肌钙蛋白及肌球蛋白重链表达呈阳性，表明ADSCs已成功诱导分化为向平滑肌细胞[16]。

2ADSCs在泌尿系统疾病中的应用

2.1急性肾损伤

急性肾损伤(acutekidneyinjury,AKI)是一类发病率和死亡率都很高的肾脏疾病，目前临床上最主要的治疗手段是血液透析和肾移植，而前者只能短暂的代替肾脏的一部分功能，后者最大的挑战是肾源短缺。干细胞移植的研究为肾脏疾病的治疗提供了全新的思路和方法。Li等人[3]将人的脂肪干细胞（humanadipose-derivedstemcells，hADSCs）经尾静脉注入至缺血再灌注肾损伤模型的C57BL/6小鼠体内，发现在损伤早期hADSCs即可迁徙至小鼠肾脏，并分化成肾小管上皮细胞，这些分化的细胞逐渐增殖取代死亡的肾脏细胞，这说明，hADSCs有效维持了肾脏结构的完整性和后续的组织修复过程。然而，另有研究表明，经小鼠尾静脉注射后，ADSCs进入血液循环后主要归巢至肺脏，并非受损的肾脏，并且，在手术当天和术后前两天持续尾静脉注射，可有效减轻肾小管上皮细胞坏死及间质炎性细胞浸润的程度[17]。为提高干细胞在肾脏内的归巢效率，Lee等人[18]采用肾内动脉直接注射法，使诱导的干细胞直接进入受损肾脏，结果显示，临近干细胞周围的肾小管上皮细胞凋亡率明显减少，这意味着肾内动脉直接注射可有效增加移植细胞的数目。但该注射法必须借助导尿术和血管造影术或X线才能顺利操作。综上所述，静脉注射虽操作简单、创伤性小，但干细胞向肾脏的归巢数目较少；而肾内动脉直接注射虽能提高干细胞归巢量，但操作较难，创伤性大，并且两种方法中干细胞存活率都很低。针对这一难题，Gao等人[4]首次将ADSCs与组织工程材料--温敏性氯化壳聚糖（chitosanchloride，CSCI）水凝胶相结合，以CSCI水凝胶为载体，直接将ADSCs注射至AKI肾脏皮质之内，结果发现，ADSCs复合CSCI水凝胶共同注射移植不仅能够改善ADSCs在肾脏内的滞留和存活，还可以显著增加微血管密度，进而促进肾小管的修复和再生，而且4周后注射部位CSCI水凝胶为HE染色阴性，这说明CSCI水凝胶具有良好的组织相容性和生物降解性。因此，利用组织工程材料作为ADSCs的细胞载体在很大程度上解决了移植细胞低滞留低存活的难题，在AKI疾病治疗中具有广阔的应用前景。

2.2输尿管损伤

输尿管损伤最常见的诱因为医源性和外伤性，损伤所致的并发症主要表现为输尿管狭窄、缺损，尿外渗及尿路梗阻等。若输尿管缺损程度较小，可采用输尿管断端吻合术或输尿管膀胱吻合术等手术方法进行治疗和修复。而输尿管缺损程度较大或伴随严重并发症者，通常需要进行输尿管代替。目前最常用的输尿管代替物为胃肠道，肠代输尿管法虽然解决了输尿管缺损和尿外渗，但容易引起肠粘连，慢性感染及尿结石等并发症[19]。对此，输尿管组织工程学逐渐成为国内外研究的热点。Zhao等人[20]首次将ADSCs与生物材料相结合用于输尿管组织重建，他们首先将兔来源的ADSCs诱导分化成平滑肌细胞（smoothmusclecells,SMCs），然后将SMCs接种至血管细胞外基质（Vesselextracellularmatrix,VECM）支架的表面，共培养1周后，将携带SMCs的VECM移植到尿路缺损的新西兰白兔动物模型中，16周后取材发现移植处形成复层上皮组织肌束，并且静脉尿路造影未发现输尿管狭窄和肾积水并发症。而后有研究相继报道了一种新型的人工-天然复合型支架材料，该研究以聚乳酸（polylactideacid，PLA）为原料制作输尿管螺旋形支架的内层，以PLA/I型胶原为混合材料制作支架的外层，利用Transwell间接共培养系统诱导hADSCs定向分化为尿路上皮细胞并将其种植于PLA/I型胶原支架的外层后一并植入裸鼠背部皮下组织内，成功构建了输尿管支架皮下植入的动物模型。种植两周后取材，结果显示植入后无动物死亡、无炎症及感染发生，诱导后的hADSCs能浸润至支架的内部并能表达尿路上皮细胞的标志物[5]。以上研究给我们两点提示：第一，ADSCs可作为理想的种子细胞应用于组织工程学；第二，PLA/I型胶原混合型三维新型支架具有良好的生物相容性。相关研究初步证实了ADSCs复合新型支架材料构建的组织工程化输尿管用以体内原位替代的方法是可行的。

2.3下尿路疾病

近年来，各种原因（年龄，糖尿病，肥胖，外伤等）导致的下尿路疾病的发病率越来越高。下尿路功能障碍虽然不能构成生命威胁，但严重降低了患者的生活质量，传统的治疗方法依旧会存在不同程度的缺陷和并发症[21]。干细胞结合组织工程技术在下尿路修复重建中的应用逐渐成为临床治疗的新策略。近些年，许多研究显示ADSCs在膀胱及尿道重建的研究中已取得了初步性的进展，主要以膀胱缺损，神经源性膀胱，压力性尿失禁及尿道缺损等下尿路疾病为研究热点。ADSCs诱导分化成平滑肌细胞和尿路上皮细胞的潜能已被证实[6,22]，这些证据为其在下尿路重建中的应用提供了可行性。Huang等人[23]将ADSCs直接注入至高脂血症大鼠动物模型的膀胱体内，结果发现ADSCs注射组血清总胆固醇和低密度脂蛋白水平显著降低，并伴有血管和神经密度的增加及排尿频率的减少。这说明，ADSCs可用于改善高脂血症引起的膀胱过度综合征尿急尿频的症状。此外，ADSCs的这种作用在糖尿病膀胱功能障碍的2型糖尿病大鼠模型中也得到证实[24]。近年来，随着干细胞和组织工程技术的发展，ADSCs复合组织工程支架材料在膀胱及尿道修复重建中的应用已陆续被报道，而且，相比之下发现支架材料TEPS（Tissue-engineeredprepucescaffold）可增强ADSCs的抗纤维化作用，减少组织化器官纤维瘢痕的形成[25-29]。另外，Yamamoto实验室首次对两例压力尿失禁患者进行自体ADSCs移植注射治疗，他们将处理过的患者自体ADSCs经尿道注射至尿道括约肌和黏膜下层，经过12周的术后观察发现患者尿失禁的次数明显减少，超声波显示尿道血流量显著增加，并且患者术后未出现明显的不良反应[30]。这一结果初步表明，经尿道注射自体ADSCs可成为临床上治疗压力性尿失禁安全可行的手术方法，实现了自体ADSCs移植从动物模型到临床治疗的成功过渡。

3ADSCs治疗泌尿系统疾病的可能机制

尽管ADSCs的相关报道越来越多，但仍然不能确定AD-SCs在泌尿系统疾病中的具体修复机制。ADSCs发挥修复作用的机制既可能为ADSCs多潜能分化，也可能是其自身的旁分泌作用，目前为止两方面都有证据支持。当前普遍认为ADSCs可诱导分化与泌尿性器官相关的多种细胞，如平滑肌细胞及尿路上皮细胞等密切联系，这些来源于ADSCs的细胞逐渐增殖取代死细胞留下的空隙而达到器官修复的作用[3,31-32]。然而，Rehman等人用不含生长因子的5%FBS基础培养基培养hAD-SCs，72h后发现hADSCs自身能够分泌大量的血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、肝细胞生长因子（hepatocytegrowthfactor，HGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、少量的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor,GM-CSF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。在低氧环境刺激下，这些生物活性因子的含量明显增加，其中VEGF增加五倍之多，VEGF含量的增加可明显改善hADSCs移植后血管生成的状态。这意味着，hADSCs可通过调控自身旁分泌效应来应对外界刺激[33]。另有研究发现，ADSCs移植后可通过抗氧化及抗炎性反应特性发挥抗细胞凋亡作用，并能促进肾小管细胞的增殖，从而缓解大鼠急性缺血性肾损伤的症状[34]。以上结果提示我们：将ADSCs或其它干细胞过表达某些生物活性因子后是否能提高干细胞移植后的治疗效果。Song等人建立了HGF过表达的骨髓间充质干细胞系，并将其种植到膀胱出口梗阻（Bladderoutletob-struction,BOO）模型的大鼠体内，结果发现过表达HGF后可显著减少膀胱内胶原沉积[35]，这说明，干细胞过表达HGF后移植可成为膀胱纤维化疾病治疗的新策略。虽然体外过表达在一定程度上能提高干细胞的移植效果，但是需要我们考虑的问题还很多，比如选择的载体是否具有较高的转导效率；怎样确保载体能够长期稳定的在体内表达以及移植后的载体是否会影响宿主细胞的活力等。这些问题的探索和解决将有助于ADSCs在泌尿系统疾病中的临床应用。

4结语

综上所述，ADSCs具有来源广，易获得，诱导分化能力强，病人痛苦小、易接受等诸多优点，已成为组织工程中理想的种子来源，并在肾脏修复、输尿管及下尿路重建中取得了初步性进展，而ADSCs复合支架材料共移植进一步解决了单纯支架移植后导致的支架吸收和挛缩。虽然ADSCs在泌尿系统疾病基础研究中取得了很大的进展，但ADSCs诱导分化及移植最终要过渡到人体内进行研究，而目前对ADSCs的研究仍处于动物试验阶段，并且ADSCs向泌尿系统靶器官的分化机制及其复杂的旁分泌效应依旧处在探索阶段，距临床应用还存在一定的差距，这些问题的解决将有助于我们对ADSCs的研究更加清晰和完整，为泌尿系统组织工程技术在临床应用中带来新的思路和突破。

作者：董孜璞 修有成 赵维明 刘赞 金承俊 夏舜尧 单位：哈尔滨医科大学附属第一医院泌尿外科