PNH诊疗研究进展

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阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)是一种获得性造血干细胞基因突变的克隆性疾病，即PNH患者造血干细胞中染色体Xp22.1上PIG-A基因发生突变，导致部分或完全血细胞膜糖化磷脂酰肌醇(GPI)锚合成障碍，造成血细胞表面锚连蛋白缺失，使细胞抵抗补体攻击的能力减弱，从而导致细胞容易被破坏，发生溶血。临床主要表现为不同程度的骨髓造血功能衰竭、静脉血栓形成和发作性血管内溶血。PNH患者异常克隆与正常造血并存，使本病的发病机制研究和诊断受到很大限制。经典的诊断方法已不能满足临床所需，代之以流式细胞术为代表的现代检测手段。以肾上腺糖皮质激素为代表的传统治疗手段仍然是初发PNH的一线治疗选择，但对临床上大多数难治和复发患者无效。近年来重组人源型抗补体C5单克隆抗体及化疗、干细胞移植、基因治疗在PNH领域的应用取得了一定进展。

1诊断进展

1.1传统诊断

1.1.1血管内溶血证据

血红蛋白尿、血游离血红蛋白增高及结合珠蛋白降低、血清乳酸脱氢酶升高、血清pH值减低;尿潜血和尿含铁血黄素染色(Rous试验)可视为过筛试验，其中Rous试验敏感率可达73%，是诊断慢性血管内溶血的重要指标。

1.1.2骨髓红系造血代偿证据

外周血网织红细胞增高、骨髓涂片和活检可见红系造血代偿性增生。

1.1.3特异性补体溶血试验

常用的有Ham's试验，敏感度较低，但特异度高，此实验是否阳性取决于PNH患者对补体敏感的异常细胞数量，结果易受输血的影响;糖水试验敏感度高但特异度差，易出现假阳性;蛇毒因子溶血试验敏感度为80%。微量补体溶血敏感试验可以检测红细胞破溶所需补体量，借此将PNH红细胞分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。总之上述实验的敏感度和特异度均不高，已逐渐被现代诊断手段所代替。

1.2现代诊断

1.2.1PNH异常克隆的筛选和识别

1.2.1.1流式细胞术直接检测外周血和骨髓血细胞GPI锚连蛋白

迄今为止，已经发现了20余种蛋白在PNH患者血细胞表面表达缺乏，如衰变加速因子(DAF，CD55)、反应性溶血膜抑制物(MIRL，CD59)、C8结合蛋白(HRF)、内毒素受体(CD14)、低亲和力Fc受体(CD16)及尿激酶型纤溶酶原激活剂受体(uPAR，CD87)等。应用流式细胞术检测GPI锚连蛋白缺失细胞数量是诊断PNH最直接、最敏感的方法。PNH克隆累及造血细胞次序为粒细胞、单核细胞、红细胞、淋巴细胞，骨髓PNH克隆出现比外周血早，网织红细胞略早于红细胞。建立PNH诊断至少有一系及以上细胞的2种GPI锚连蛋白缺失。CD59敏感度要高于CD55，CD59－粒细胞可最早被检出，有早期诊断价值，且不受输血影响。CD55和CD59同时部分或完全缺失是PNH的典型表现。对PNH克隆锚连蛋白的不同缺失程度进行量化，可以对PNH进行分型，以便进一步了解并监测病情进展及疗效。例如将PNH红细胞根据CD55、CD59的缺乏程度可以分为三型:Ⅰ型(补体敏感度正常)、Ⅱ型(中度敏感)、Ⅲ型(高度敏感)，临床溶血程度主要取决于Ⅲ型红细胞的多少。外周血和骨髓均可以作PNH克隆分析，要求受检者提供近期输血记录，并对红细胞和粒细胞都做筛查。如果患者在检测前有多次输血或重度溶血，那么PNH筛查可能受到输血的影响，导致错误结果;少数患者(5%)严重溶血后，GPI缺乏的红细胞可能会减少，甚至可能下降到检测限以下，因此只能检测到粒细胞PNH克隆。患者如果有严重的再生障碍性贫血(AA)，可能导致粒细胞数量减低，不足以检测分析。由于PNH的异常细胞起源于造血干细胞，当外周血尚无CD59－细胞时，骨髓中可能已经有CD59－细胞。因此，从疾病的早期诊断的角度考虑，骨髓中CD55－、CD59－检测比外周血更有意义。且骨髓中的有核红细胞不受输血和溶血的影响，可避免出现漏诊。故建议贫血性疾病早期诊断应作骨髓有核红细胞、粒细胞和单核细胞的CD55、CD59检查，能有效提高PNH诊断的特异度和敏感度。此外，近年来有学者力图寻找诊断PNH更敏感的标志物，如使用流式细胞术检测网织红细胞、粒细胞及单核细胞上锚连蛋白CD58和CD59、CD24/66b及CD14的表达等［1］。

1.2.1.2荧光标记气单胞菌溶素前体变异体(FLAER)

近年国内外有应用FLAER技术辅助诊断PNH。Diep等［2］报道嗜水气单胞菌(HEC)毒素能特异地与细胞膜上GPI锚连蛋白结合，随后立即聚合成多聚体，插入细胞膜的脂质双层，在膜上形成孔洞使细胞渗透压改变而溶破。PNH细胞则由于缺乏GPI蛋白使其具抵抗毒素作用而最终保持细胞完好，毒素作用后细胞留存率与CD59－率一致。经过工艺的改进，形成FLAER技术，FLAER是Alexa-488标记的无活性气单胞菌溶素前体的变异体，它同野生型前气单胞菌溶素相似，可特异地结合于GPI锚连蛋白，但并不形成细胞通道，不引起细胞的溶血，因此不会导致细胞死亡。该标记类似于荧光素，可在一定条件下被激发出荧光，可以通过流式细胞仪进行检测，并区分GPI－和GPI+细胞。FLAER作用于所有GPI蛋白，不会因细胞表达GPI蛋白种类和多少的不同造成误差。因此，FLAER是诊断PNH更敏感、特异的方法。同传统的检测CD55、CD59相比，FLAER对检测微小PNH克隆非常敏感，且不受输血和溶血的影响，比CD55、CD59检测更清晰、准确、直观，对一些临床上高度怀疑，而CD55、CD59检测不能确诊的病例，可以结合FLAER检查，获得明确诊断;应用FLAER分析方法诊断并监测PNH患者，可精确分出Ⅱ、Ⅲ型细胞，为判断病情轻重提供依据，有助于PNH患者疾病进展和疗效的判断;对于长期应用免疫抑制治疗的血细胞减少患者，尤其是AA、骨髓增生异常综合征(MDS)等疾病，可监测其是否发生克隆性改变以及早发现病情变化;应用FLAER直接检测GPI蛋白，有助于真正的PNH和部分免疫性血细胞减少症患者的鉴别，明确真正的GPI－细胞［3－4］，而非自身抗体覆盖细胞膜锚连蛋白的假性PNH克隆，即可用于“真、假”PNH的鉴别。

1.2.2PIG-A基因突变检测

PNH是造血干细胞PIG-A基因突变致合成GPI锚所需的1-6-N乙酰氨基葡糖转移酶缺陷，从而使血细胞膜表面GPI锚连蛋白缺失，血细胞对激活补体的敏感性增加而被破坏。PNH的PIG-A基因突变是异质性的，突变位点各不相同。目前，已经报道的PIG-A基因突变有100多种，随机发生于整个编码区，没有突变丛集区或热点［5］。PIG-A基因突变是最特异的诊断PNH的方法，但由于技术问题，目前仅限于研究，尚未用于常规诊断。

2治疗进展

2.1传统治疗

PNH的传统治疗手段仍然是以“保护”PNH克隆，减少补体的攻击和破坏，减轻溶血为目的，并不能根除PNH克隆。目前仍然是以肾上腺糖皮质激素(泼尼松每日0.25～1.00mg/kg)为主，辅以细胞膜稳定剂(维生素E)及抗凝治疗，对多数初诊患者能减轻溶血发作、稳定病情。若为AA-PNH综合征可辅助雄激素、免疫抑制剂等治疗。

2.2现代治疗

2.2.1联合化疗

临床上大多数PNH患者经过一段时间的治疗后会出现激素无效或依赖，即所谓“难治或复发”，此类患者的治疗是棘手的难题。即如何有效地减少PNH异常克隆，最大限度地控制溶血，又尽可能地减少激素用量，防止激素的不良反应是亟待解决的问题。本课题组［6－7］受到白血病化疗的启发，既然PNH也是一种克隆性疾病，即PNH患者体内正常克隆与异常克隆并存，因此我们试验性地采用化疗，利用正常克隆较PNH克隆耐受补体能力强、对造血生长因子反应好、正常造血恢复快的优势，使正常克隆逐步取代PNH克隆而达到治疗目的。我们采用DA(柔红霉素+阿糖胞苷)或HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)方案对部分难治、复发性或对激素依赖、无法减量而出现严重并发症的患者进行化疗，结果显示，8例中PNH克隆明显减少的有5例;6例溶血指标明显好转;8例外周血细胞减少者经血常规检验均有明显进步，6例已脱离输血;所有患者肾上腺糖皮质激素的用量较化疗前减少一半以上，有1例已经脱离激素治疗。在骨髓抑制期，部分患者出现呼吸道或肛周感染、皮肤疱疹，经抗生素及抗病毒治疗感染均得以控制;肝、肾等重要器官功能无明显改变;所有患者无严重、致命的并发症发生。提示化疗能够有效地减少PNH克隆负荷，控制溶血，改善贫血，而且大大减少了激素的用量，是一种较有应用前景的治疗手段。但为避免出现化疗后骨髓抑制期的严重并发症(贫血、出血和严重感染)，化疗采用的剂量应偏小，疗程亦应适当，一旦出现并发症，应给予积极治疗。

2.2.2重组人源型抗补体蛋白C5单克隆抗体(Eeulizumab，Soliris)

PNH是由于补体在红细胞外激活形成C5b-7，然后结合到红细胞膜上再与C8及C9作用形成C5b-9(即膜攻击复合体)，由于红细胞表面缺乏某些锚连蛋白，如C3转化酶衰变加速因子(DAF)(可阻止C3转化酶的形成)，因而大量C3转化为C3b进而形成C5b，以致C5b-9破坏红细胞膜导致溶血。Eeulizumab能特异性地结合到人末端补体蛋白C5，通过抑制人补体C5向C5a和C5b的裂解，以阻断炎症因子C5a的释放及5b-9的形成。

研究表明该抗体对C5有高度亲和力，能阻断C5a和C5b-9的形成，并保护哺乳动物细胞不受C5b-9介导的损伤。由于该单抗抑制机体的免疫系统功能，从而增加了患者对某些严重感染的易感性，据统计服药期间易出现细菌性脑膜炎。临床试验证实Eeulizumab治疗PNH可显著减轻血管内溶血，减少红细胞输注，明显改善PNH患者贫血，减少血栓形成，延长生存期。该药安全，耐受性良好，无明显不良反应发生［8］。Eeulizumab于2007－03－16被美国FDA批准用于治疗PNH，推荐剂量600mg，使用4周，第5周900mg，以后每2周900mg，可成功控制补体依赖性溶血。

2.2.3骨髓移植(BMT)根治

PNH在于消除异常造血干(祖)细胞，重建正常造血功能，目前认为BMT是惟一可能治愈本病的方法。BMT治疗一般仅限于难治性、耐肾上腺皮质激素或有激素禁忌证的PNH患者，适应证为(1)合并骨髓衰竭;(2)难治性PNH，输血依赖性溶血性贫血;(3)反复出现危及生命的血栓栓塞事件;(4)小于20岁的患者［9］。

2.2.4基因治疗

有研究显示，用反转录病毒载体将编码一种跨膜CD59的基因转入PNH克隆，使得CD59得以表达，可减轻细胞对补体的敏感性，减轻溶血。此外，Nishimura等［10］以反转录病毒为载体，将含正常PIG-A基因有效并稳定地转入PNH患者的异常细胞株内，可使其恢复GPI连接蛋白的表达。

总之，目前有关PNH的基因治疗尚处于初期试验阶段，只有深入研究PIG-A基因的突变规律及PNH的发病机制才能有望PNH的基因治疗有所突破。综上所述，经典的补体溶血试验诊断PNH缺乏敏感度和特异度，流式细胞术和分子生物学手段的应用，使PNH的诊断取得了突破性进展;以肾上腺糖皮质激素为代表的传统治疗手段对部分初发PNH可取得一定疗效;重组人源型抗补体C5单克隆抗体、化疗、干细胞移植和基因治疗给激素无效或激素依赖的难治性或复发性PNH患者带来了希望。