基因工程综合性实验教学改革实践

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【摘要】综合基因工程实验课称重几个独立的实验内容为一个综合性实验，以充分利用实验教学时间，增加内容，改进试验方法，由学生毒理设计实验方案，独立完成实验内容，让学生在实验教学过程中处于主导地位，达到了培养学生独立思考，独立操作以及独立解决问题的综合能力的目的。

【关键词】基因组；PCR；基因重组；载体构建；筛选；教学改革

基因工程是一门实践性较强的科学，其要求从事基因工程操作的专业技术人员不但要有深厚的理论基础，而且具有较强的动手能力。通过几年的教学实践，我们尝试将基因工程中动物胸腺或脾脏有核细胞基因组DNA的提取、核酸的琼脂糖凝胶电泳、DN段的回收与纯化、PCR反应及其产物检测、限制性内切酶切割DNA、DNA的重组和连接、大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化、重组转化子DNA的鉴定（蓝白斑筛选法）、转化克隆的筛选和鉴定等独立的实验内容整合为综合设计性实验，将原有的验证性实验转化为探索式的设计性实验，根据实验要求，学生自主性选择实验组和，提出实验方案，在老师指导下，独立完成实验内容，达到启发式教学的目的，提高学生学习的积极性和主动性。

一、教师准备

1.确定实验目的。实验前，教师确定本次综合性实验的实验目的为构建小鼠β-actin基因的表达载体，让学生围绕本实验目的，运用所学的理论知识，来设计相应的实验方案，并通过实施自己的实验方案来锻炼学生的综合运用理论知识的能力及实验设计和操作的能力。2.实验材料准备。小鼠，恒温水浴锅，高速离心机，高压灭菌锅，解剖剪，镊子，微量移液器（1000ul、200ul、100ul、20ul、10ul、2.5ul），加样枪头（1000ul、200ul、10ul）离心管，PCR管，琼脂糖凝胶电泳仪，琼脂糖，核酸染料，β-actin基因PCR反应试剂，胶回收试剂，大肠杆菌JM109等3.实验分组。本次实验共有一个年级三个班级的学生参与，根据学号分组，两人一小组，四人一大组，小组人数不可太多，人说太多就会造成有些同学对实验的参与度不够，要让每一个同学都参与到实验当中。4.试验用具准备。固定两个实验室，实验准备老师将实验用到的仪器设备等都准备好，供学生使用。

二、实验过程

1.讨论并制定实验方案。以班级为单位，查阅资料，制定相应的实验方案，实验方案要结合运用动物胸腺或脾脏有核细胞基因组DNA的提取、核酸的琼脂糖凝胶电泳、DN段的回收与纯化、PCR反应及其产物检测、限制性内切酶切割DNA、DNA的重组和连接、大肠杆菌感受态细胞的制备和重组DNA分子的转化、重组转化子DNA的鉴定（蓝白斑筛选法）、转化克隆的筛选和鉴定等基因工程技术，每个班级都要提出一个技术方案或流程。经讨论，最后确定了一个实验目的的三种实验技术方案。方案一：提取小鼠肝脏细胞基因组DNA→琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA→PCR扩增β-actin基因→PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测→表达载体构建→大肠杆菌感受态细胞构建→遗传转化→重组子筛选（蓝白斑筛选）。方案二：提取小鼠肝脏细胞基因组DNA→琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA→PCR扩增β-actin基因→PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测→表达载体构建→遗传转化→重组子筛选（蓝白斑筛选）。方案三：提取小鼠肝脏细胞基因组DNA→琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA→PCR扩增β-actin基因→PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测→胶纯化目的片段→表达载体构建→遗传转化→重组子筛选（蓝白斑筛选）。实验的实施：各班级按照既定的实验方案进行实验，实验过程以小组为单位进行，针对实验方案中的每一步的技术流程进行讨论，总结试验中出现的问题及解决方法。实验结束后每组同学提交一个实验报告，针对试验方法的优缺点展开讨论，提出自己的建议，针对实验结果进行分析。实验结果：三种实验方案都能达到预期实验目标，即通过重组子筛选（蓝白斑筛选）可以得到构建成功的重组表达载体。方案一结果：电泳检测提取基因组DNA，得到条带整齐明亮，且对应Marker质量大小的条带；PCR产物的电泳检测，得到整齐明亮且对应Marker质量大小的单一条带；标准质粒转化制备的感受态大肠杆菌细胞，得到大量蓝斑菌落；重组子筛选得到清晰的蓝白斑菌落。方案二结果：直接用标准的大肠杆菌感受态细胞做遗传转化，降低了感受态细胞制备不成功给实验带来的风险，成功了更高。方案三结果：对PCR产物进行胶纯化，以纯化的片段作为目的片段进行遗传转化，提高了转化子的纯度。讨论与分析：实验结束后，以班级为单位，组织学生讨论，针对本次实验过程中出现的问题进行总结，提出改进方法。总结未得到阳性重组子的小组在试验中的问题，并提出验证方案。

三、讨论

对于这样的综合性实验教学改革，我们总结了近五年的实践经验，每年组织一个年级，三个班级进行实践，大部分同学都能很积极主动的完成实验内容，增强学生对实验课堂的主动性与主导性。并通过这样的实验教学方式巩固理论学习，提高自身的操作技能水平，提高学生的团结协作精神，科研素养及独立解决问题的能力。实验的方案设计、实施操作，数据记载。结果分析等全部过程都由学生独立完成，教师在实验过程中起到辅助作用，充分发挥学生的主导地位，为开放式教学提供了实践经验。

作者:朱婷 石晓卫 张靖 张展召 单位:新乡医学院三全学院生命科学技术学院