食源性微生物MRSA食品安全论文

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1 食品安全与超级细菌       

1.1 超级细菌

2010 年《柳叶刀》杂志首次报道南亚的 “超级细菌”，该菌携带具有泛耐药性 NDM-1 基因，能对绝大多数抗生素耐药；经进一步研究发现，英国卫生部和美国疾控中心均提出携带 NDM-1 基因的细菌具有大范围传播和感染能力。目前，NDM-1 耐药菌在印度肠细菌感染中达 1%-3%；在欧洲、非洲和澳大利亚等地亦已有报道；我国在 2011 年首次发现该类耐药细菌，可见其感染范围和感染率呈扩增趋势。耐药性不改变致病菌的性状，但可让患者在感染后变得无药可治。临床微生物学传统定义的“超级细菌”包括临床上出现的多种耐药菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、抗万古霉素肠球菌（VRE）以及耐多药肺炎链球菌（MDRSP）等。与 NDM-1 耐药菌相比，这些传统的“超级细菌”检出率更高，在感染性疾病中更多见；其中，MRSA 是医院内最常见的病原菌之一，具有高发病率。据美国 CDC 统计，每年约数十万人因感染 MRSA 而住院治疗，院内感染的 MRSA 分离率已高达 80%以上，其多重耐药的特性不但增加了治疗的复杂性和难度，也增加了抗生素的消耗量和医疗费用。

1.2 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是主要的食源性微生物，由其引起的食品中毒事件在革兰氏阳性菌中高居首位；据统计，在美国，由金葡菌引起的食物中毒占 33%，仅次于大肠杆菌；在 1983-1997 年间，每年约 18.5 万人发生葡萄球菌中毒，其中 1750 人住院，总医疗费用达 15 亿美元。金葡菌在加拿大占细菌性食物中毒的 45%，而在某些欧洲国家如匈牙利、芬兰等则占 50%以上。在日本，1980-1999 年间共超过2500 起葡萄球菌中毒报道，受感染人数约 6 万人；而 2000 年因污染金葡菌引起的“雪印奶粉”事件则超过 14000人受感染。在我国，每年由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒事件也是屡见不鲜。金葡菌也是典型的耐药微生物，是潜在的“超级细菌”。1961 年 Jevons 在英国首次发现对甲氧西林耐药的金葡菌（mrsa），MRSA 在 20 世纪 60 年代中期扩展至欧洲及北美等地区，逐渐成为世界范围内的主要医院获得性病原体；在 70 年代末急剧增多并遍及全球，其引起的感染性疾病与乙型肝炎，艾滋病同为当今世界三大感染顽疾[15,16,19,20]。；而从 90 年代开始，MRSA 更突破了以往在医院中检出的局限，进一步在社区中被大量检出，其菌株与耐药特点也随之发生变化。

1.3 MRSA的耐药性

MRSA 从首次发现至今 50 余年中，其耐药范围不断扩大，耐药程度也日益严重。上世纪 80 年代，庆大霉素是一般治疗 MRSA 感染的有效药物，而目前 MRSA 对其耐药率已超过 50%；同期，MRSA 对曾经的保留用药氟喹诺酮类药物高度敏感，但当前 80%以上的 MRSA 对其耐药。研究发现，MRSA 耐药的主要原因是其携带的 mecA 基因编码的一种对 β-内酰胺类抗菌药物具低亲和力的青霉素结合蛋白 PBP2a；mecA 是一个外源基因，来自凝固酶阴性葡萄球菌或肠球菌属，通过转座子或 R 质粒转到原本敏感的金葡菌中，并整合在染色体第 10 节段上，该基因组岛被称为葡萄球菌染色体盒（SCCmec）。PBP2a 蛋白分子量为 78kD，当金葡菌固有的 PBPs 被 β-内酰胺类抗菌药物结合失活后，PBP2a 能替代其发挥转肽酶的功能，促进细胞壁合成，从而产生耐药性[22]。根据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）标准，金葡菌在检出 mecA 基因或者 PBP2a蛋白时即可定义为 MRSA；但菌株的耐药程度有所差异，其主要包括两大类：相对敏感型菌株和高度耐药型菌株。在培养基鉴定菌株耐药时，为克服表型的异质性，传统方法采用不易降解，MRSA 异质性相对较低的苯唑西林，通过适当培养条件如在 30℃或 35℃培养，提高培养基 NaCl 浓度 ( 2 %～4 %)，强化耐药性表达，延长培养时间，来提高准确性[24]。近年来，新型耐药整合子元件在 MRSA 中大量发现，成为 MRSA 耐药性发展的新特点。整合子是一种存在于细菌质粒或染色体上具有移动性的基因捕获和表达的遗传单位，在革兰氏阴性菌中被广泛报道，介导对多种抗生素的耐药性，成为革兰氏阴性菌中耐药性泛滥的主要原因[25-28]。然而在革兰氏阳性菌中一直鲜有报道。笔者根据对 2001 年-2006 年间华南地区的 MRSA 耐药性研究表明[5,6,29-32]，第一类整合子在 MRSA 中普遍存在，但分离率低于常见报道的革兰氏阴性菌，为 46.6%（122/262），远低于常见院内感染微生物如铜绿假单胞菌（一般报道为 80%以上）等；同时，前期研究显示，第一类整合子系统存在与否，对红霉素、庆大霉素、四环素和甲氧苄啶-磺胺甲唑等抗生素的耐药性具有显著影响。然而，这些抗生素均具有较长的历史，并非治疗 MRSA 感染的常用药物，甚至多年前已退出医院常用药物行列。例如，四环素自 1948 年问世至今超过 60 年，是应用最多、最广泛的广谱抗菌素；后来发现其对牙齿、指甲与巩膜等具有严重副作用，随后在临床使用中逐渐淘汰。庆大霉素同样由于具有较大副作用在多年前已退出治疗的一线药物。因此，近年来流行MRSA 中出现的对这些抗生素耐药性可能不由临床环境中抗生素选择压力所产生。可能由于这些药物在畜牧业中仍被大量应用，因此在 MRSA 中出现的对这些药物的耐药性，这也暗示了畜牧业中抗生素的滥用造成了微生物在向“超级细菌”进化，这已经成为食品安全中的一个重要的潜在问题。

2 MRSA的检测

常规方法对 MRSA 的检测包括：苯唑西林纸片扩散法，乳胶凝集试验和苯唑西林琼脂筛选方法。最近，临床和实验室标准化研究所（CLSI）推荐使用的头孢西丁纸片扩散法检测 MRSA[33]，以及还有一些其他的检测方法。常规培养液检测方法通常具有很高灵敏度，但是对于此方法高的灵敏度伴随的是检测速度相对比较慢。

2.1 纸片扩散法

纸片扩散法包括苯唑西林和头孢西丁纸片扩散法，其步骤一般包括制备菌液、接种平板、贴药敏纸片、培养等。前者把菌株在 1μg 苯唑西林 MH 琼脂培养基进行试验，抑菌圈在 35℃经过 24 小时培养确定；其抑菌圈大小是根据 CLSI（2008）的标准进行判断:抑菌环直径≤10 mm 为耐药，11-12 mm 为中介，≥13 mm 为敏感；当抑菌圈直径在 11～12 mm 时判断为中间，需加做 mecA 或 PBP2a 的检测以证实是否为 MRSA。该方法最大优点是快速、简便、价格便宜，易被检验人员接受。在合适的抗生素、pH、及培养温度、菌液的浓度、培养基厚度等条件下，该方法检测 MRSA 是可行的。它对 MRSA 检出敏感性、特异性较高，仍不失为目前临床微生物实验室常规筛检 MRSA 方法之一。但由于多种因素的影响，从表型上进行诊断，其结果略欠准确，致使其特异性低于其他方法。许多研究均发现头孢西丁纸片法相比于苯唑西林纸片法具有更好的灵敏度[34-36]。该法把菌株在带有 30μg 的苯唑西林 MH 琼脂培养基进行试验，抑菌圈是 35℃经过 16-18 小时培养确定：根据CLSI（2008）标准：抑菌环直径≤21 mm 为耐药，≥22 mm 为敏感。该方法优点同样是快速、简便、价格便宜，并且灵敏度高于苯唑西林纸片法。Priya Datta[32]等发现，头孢西丁的纸片法具有 98.5％的灵敏度和 100%的特异性，而苯唑西林纸片法的是 91.4%的灵敏度和 99.2%的特异性。但是作为 CLSI 所推荐的标准，在检测 MRSA时如果与一些其它方法补充可以不会有 MRSA 的漏检。苯唑西林纸片扩散法对于 MRSA 异质性耐药检测较为困难，而头孢西丁能诱导 mecA 基因表达 PBP2a，能更好地检出异质性耐药菌株。

2.2 苯唑西林琼脂筛选

MH 培养基加 NaCl(40 g/L)加苯唑西林(6 μg/ml)，将菌液(0.5 麦氏浊度)画线在培养皿上 35°C 培养 24 h，只要平皿有菌生长，即使是一个菌落也判断为 MRSA，敏感度为 100%。与常规方法相比在 MRSA 检测上并无显著性，但对于其它葡萄球菌，琼脂筛选法有较高的阳性率，因此尤其适用于多种葡萄球菌中 MRSA 的检测。该法操作方法简便、实验成本低，一个平板可同时检测多个样品，检出率高，较为实用，可用于 MRSA的常规检测；尤其当多种检测方法结果不一致时，应以琼脂筛选为准。但是该法耗时长，此外 Swenso 等发现在异质耐药菌株进行试验时该方法敏感性下降，特异性降低且出现边缘性MIC；Diedere等发现CHROM琼脂筛选具有 97.1%的敏感性和 99.2%的特异性，如果筛选周期到由 24 小时变为 48 小时，菌落敏感性将会增加到 100%。

2.3 乳胶凝集试验

凝集试验是一种快速、操作简便的免疫学诊断方法，在临床快速 MRSA 诊断方面应用广泛。其原理是抗 PBP2a 单克隆抗体致敏的乳胶颗粒与 MRSA 的膜蛋白提取物作用，如产生肉眼可见的凝集颗粒证实有PBP2a 存在，判断其为 MRSA。其它还有一些检测存在于细胞膜内 PBP2a 的乳胶试剂，这类检测需要裂解细胞。代表的试剂盒包括 PBP2’Test（Oxoid）、MASTALEX -MRSA（Mast）和 MRSAScreen（Denka Seiken）。研究表明该方法的敏感性≥97%[41-43]，而 Datta 等[36]报道其具有 100%的敏感性和 99.2%的特异性。同时，该方法具有与 mecA 基因检测相关性好、快速简便、特异性强、灵敏度高等特点，且不需特殊仪器和技术，尤其适合用于 MRSA 早期检测，可作为 PCR 法的替代方法；但检测成本较高。

2.4 分子生物学诊断方法

自上世纪90年代起，分子生物学方法在微生物检测中逐渐取代传统方法，主要包括PCR、荧光定量PCR与各种新型核酸扩增技术等。与常规“金标准”方法相比，PCR技术具有较大优势。首先，在耗时方面，由于常规方法基于细菌培养，因此增菌以及选择性培养耗时可长达3天，但PCR由于检出限低，样品中微量的菌体足以启动扩增反应，因此在从样品处理到培养的时间可大为缩减。由于PCR具有高特异性，因此以上方法的增菌与细菌培养（LB培养基）阶段，与“金标准”相比，耗时可降低12-24h。其次，细菌鉴定操作方面，“金标准”方法在细菌培养后，常需通过血浆凝固酶实验鉴定，而PCR通过选取特异的分子靶点，结果特异性高；该方法在鉴定金葡菌特异基因的同时，以所有葡萄球菌的靶点为内参，可信度更高。

再次，PCR方法的高灵敏度和特异性，有助于解决“金标准”方法中假阴性和低敏感度的问题。笔者等以orfX为检测靶点，建立针对MRSA的检测方法，该方法已被证明是一个简单，快速，特异，敏感的检测方法，对于食品检测，医院等机构对MRSA快速鉴定具有重要意义，在未来发展中对简化检测方法的改进具有深远的意义。此外，笔者等[44]建立的多重PCR体系，针对16SrRNA、femA和mecA基因，可用于MRSA检测。除具有常规PCR的优点外，多重PCR能在同一次PCR反应和凝胶电泳分析中，完成多个靶基因的检测，在简便性、耗时方面具有较大优势；本实验建立的多重PCR方法，结果证实其能对葡萄球菌、金葡菌及关键耐药因子进行检测与鉴定。该方法特异灵敏、简便快捷，同时具有适应面广，易于推广和应用等优点。1995年出现的以标记特异性荧光探针为特点的荧光定量PCR技术，实行完全闭管式操作，不仅能大大减少扩增产物的污染机会，提高检测的特异性，且可通过计算机自动分析对扩增产物进行精确定量提高检测的灵敏度，完全克服了普通PCR的缺点，且该方法操作简便迅速，适用于大样本量的筛查该方法可用于检测葡萄球菌及肠毒素。与传统的培养检测技术相比，分子检测技术能够对食品中有害微生物实现快速、准确的检测；与普通的PCR相比，实时荧光定量PCR可以在PCR反应过程中直接检测荧光信号，无需配胶、电泳等步骤，可以更加快速有效地鉴别出MRSA，且可以对靶位基因进行定量检测。Warren等[45]通过特定目标的一种荧光分子信标探针与扩增产物杂交，用实时荧光PCR法直接从鼻咽拭子标本中快速检测MRSA，其敏感性为91.7％，特异性为93.5％，82.5％能显示阳性，97.1％能显示阴性，其中拭样处理和检测时间仅为1.5小时。

Oh等通过Xpert MRSA检测体系，在2小时内完成MRSA检测；Xpert MRSA测试法是一种快速，敏感，临床上有用的检测方法，利用SCCmec上一段特异性序列，特别适用于早期MRSA的检测。Liu等[47]通过使用一种新的集成微流体系统可以检测活MRSA、敏感金葡菌和其它病原体，该微流体系统已被证明具有100％的MRSA检测特异性；从样品预处理到荧光观察，可自动化在2.5小时内完成。Stenholm等[48]用一种即时检测的双光子激发荧光检测技术对243株MRSA进行检测，其中99.0％的MRSA真阳性样品所需时间小于14小时，该法主要优点包括简单的检测程序，试剂消耗低，以及高流量能力。近年来有多重新型核酸技术被报道，其中环介导等温扩增（LAMP）技术是在2000年由Notomi等发明的一种体外等温扩增特异核酸片段的技术[49,50]。自问世以来，数年间已被广泛应用于生物安全、疾病诊断、食品分析及环境监测等领域。该方法在简便、快速、特异性和灵敏度方面具有显著优势。LAMP反应的灵敏度也极高，其灵敏度可达常规PCR的10-100倍（检出限是常规PCR的1/100～1/10拷贝数）。因此，对细菌进行检测时LAMP法在培养时间和所需基因拷贝数等方面具有较大优势。笔者曾过对118株葡萄球菌进行16SrRNA、femA和mecA三个特异性靶点的LAMP检测[3]，其中，16SrRNA-LAMP均检测为阳性，灵敏度与阳性预测值均为100%；而PCR则只检测其中113株葡萄球菌阳性，灵敏度与阳性预测值分别为95.8%与100%。对65株金葡菌和53株凝固酶阴性葡萄球菌，femA-LAMP的灵敏度、阳性预测值与阴性预测值分别为98.5%、100%与98.1%；而PCR则相应为92.3%、100%与91.4%。对70株甲氧西林耐药菌和48株敏感菌，mecA-LAMP的灵敏度、阳性预测值与阴性预测值分别为94.3%、100%与92.3%；而PCR则分别为87.1%、100%与84.2%。同时，笔者利用MRSA中的特异靶点orfX，建立一种针对MRSA的快速检测技术。通过对116株对照菌株进行验证，显示该技术的特异性为100%，能有效针对MRSA进行特异检测。应用该技术检测667株葡萄球菌，包括566株MRSA、25株MSSA、53株MRCNS与23株MSCNS，结果显示，灵敏度达98.4%（557/566），而与之平行对比的PCR技术则仅为91.7%（519/566），阳性预测值与阴性预测值分别为100%和92.7%[51]。此外，笔者利用金葡菌中的特异femA基因，建立一种针对金葡菌的LAMP快速检测体系。通过应用于432株金葡菌（118株临床与314株食源性菌株）的检测鉴定，结果显示，检出率为98.4%，检出限为100 fg DNA/Tube与104CFU/ml[52]。

3 结论

综上所述，抗生素滥用是重要的食品安全问题，其引起的后果不应局限于食物中残留的微量抗生素，而应扩展至由其引起的细菌耐药性乃至超级细菌问题。在典型的食源性微生物金葡菌中，耐药性较为普遍。其中，MRSA 除引起多起食物中毒事件外，同时也是潜在的超级细菌。该类菌株的新型耐药特点显示其耐药性发展和进化可能由大量历史较久、在临床已淡出的抗生素在畜牧业中的滥用影响并决定；但其具体的分子机制有待进一步深入研究。目前，国内外科研工作者已针对 MRSA 菌株的检测开发出了许多适用方法，其中LAMP 法由于具有简便、快速、特异性强和灵敏度高等优势，已获得越来越多的关注，显示出较好的实际应用价值。

作者：邓阳 刘晓晨 李冰 李琳 徐振波 单位：华南理工大学 美国马里兰大学生物医学科学系