分子生物学技术在昆虫生态学中的应用

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摘要：昆虫分子生态学是一门交叉学科，利用现代分子生物学技术研究和解释昆虫生态学的问题。在昆虫分子生态学研究中应用较多的分子生物学标记技术有：同工酶（蛋白质电泳）方法、限制性片段长度多态性（RFLP）方法、随机扩增DNA多态性（PAPD）方法、扩增片段长度多态性(AFLP)及微卫星标记方法（SSR）及单核苷酸多态性(SNP)。

关键词：分子生物学；技术；昆虫生态学

分子生态学是应用分子进化和群体遗传学的理论、分子生物学的技术手段、系统发生学和数学的分析方法及其他学科的知识（如地理学、古气候学等）去研究种群、进化、生态、行为、分类、生物地理演化、生物保护等学科领域的各种问题。它主要通过大量使用分子生物学先进的技术和方法，在分子水平上研究生态现象，阐明生态现象的分子机制。昆虫分子生态学就是以昆虫作为研究对象，应用分子生态学的原理与方法研究昆虫进化和适应机制的一门科学。它主要通过分子生物学的方法检查昆虫种群或个体的遗传变异，分析和解释遗传变异的特点与规律，揭示遗传变异所反应的规律性的东西，从而进一步阐明昆虫之间一级昆虫与环境之间的相互作用关系。其研究的最典型特色是运用分子遗传标记来检测研究对象的遗传变异特征，揭示昆虫的演化规律。在昆虫分子生态学研究中应用较多的分子生物学标记技术有：同工酶（蛋白质电泳）方法、限制性片段长度多态性（RFLP）方法、随机扩增DNA多态性（RAPD）方法、扩增片段长度多态性（AFLP）及微卫星标记方法（SSR）及单核苷酸多态性(SNP)。其中，目前应用最多，最简便的是SSR和SNP技术。下面我们主要介绍在昆虫生态学研究中几种常用分子标记方法。

1.同工酶方法的应用

同工酶是指具有相同或相似催化功能而分子结构不同的一类酶。自从Hunter和Markert创立同工酶酶谱技术后，同工酶谱的变化即可作为鉴定物种、研究分类与进化、遗传与变异的重要指标。在昆虫分子生态学发展之初，同工酶被广泛应用与昆虫的分类、种群间抗性的遗传变异等方面，随着分子生物学技术的广泛应用，同工酶技术已慢慢被淘汰。

2.RFLP技术的应用

RFLP又叫作RestrictionFragmentLengthPolymorphism.即我们所说的限制性内切酶片段长度多态性，而且他作为第一代的生物分子类标记技术，这种技术是指通过已经发现的限制性内切酶来处理不同生物个体的DNA，通过利用限制性内切酶的多种特异性来达到获得不同的DN段的目的，这种技术一般是被应用于分子杂交，放射性同位素的显微技术中，而且也只是主要用于研究生物遗传的研究中，自问世以来已广泛运用于多门生物学科研究中。在昆虫生态学研究中可以用于昆虫遗传谱图的分析、遗传连锁图的构建及数量遗传性状等方面的研究。

3.RAPD技术的应用

RAPD，俗名是随机扩增多态性DNA技术，它是由两位美国科学家Wiliams和Welsh在1990年提出的，而且他们并不是研究的合作者，而是分开研究的，这种技术又被称作任意引物PCR。对于RAPD来说，它所使用的物质是十分不相同的，但是对于现存的所有引发物来说，他对于在DNA序列碱基序列上的特定结合位点来说，一旦这些特异性DNA位点达到了基因组分布的扩增条件，他就会根据DNA碱基对的配位原则，完成DNA另一条链的合成。

4.AFLP技术的应用

植物基因组的AFLP中的酶切，连接和pcr问题，只要酶切出来能看到些许弥散，pcr就应该能看出结果才对，AFLP技术的关键就是把握体系的问题，每一个实验室应该有自己的一套体系，照着做一般没有问题，分子标记，就是纯体力劳动，做得很多一般就会有结果的，这是量变到质变的过程。做AFLP需要用到试剂盒，但试剂盒不如自己做省事，也没必要。除非你做的量少。但是分子标记要的就是大量重复性的劳动。因此，试剂盒不如自己做省事，也没必要，并且试剂盒中很重要的酶往往量不够用，比如T4连接酶和内切酶EcoRI，除非你做的量很少，且不需要摸索体系。酶切出来能看到些许弥散，pcr就应该能看出结果，也不一定。接头制作和连接体系也很重要，连接时间一般影响不是很大。

5.微卫星标记技术在昆虫生态学研究中的应用

微卫星标记ms是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序串联重复而成的DNA序列,其长度一般较短,广泛分布于基因组的不同位置,如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。自1981年Spritz首先在珠蛋白中发现微卫星序列到今天微卫星序列在生物学中的广泛应用,微卫星标记技术走过了近30多年的发展变化。其中，20世纪80、90年代是微卫星技术从开始到逐渐成熟的关键阶段。1982年Hamada等在研究真核生物基因组中Z-DNA形成时发现了一种新的重复因素——选择性的嘌呤-嘧啶聚合物。Jeffreys等通过对小卫星(minisatellite)的DNA指纹图谱鉴定证明了串联重复的DNA具有很高的长度差异性。与此同时，Tautz等的研究表明，这种“神秘而简单冶的DNA序列是遗传变异的重要来源。1989年Tautz首次应用了基于PCR的微卫星分型技术。随着微卫星分子标记的广泛使用，科研工作者对其进化、功能及在基因组中的分布等研究的了解迅速增加。近年来，微卫星分子标记也被广泛应用于昆虫学研究的各个领域。截至2012年6月，共有16396个昆虫上微卫星位点在NCBI中记录，其中双翅目、鳞翅目和膜翅目昆虫的微卫星登录数量最多，占75%。这些微卫星被广泛应用于昆虫遗传作图、种群遗传学研究、个体亲缘关系鉴定等方面。

6.SNP在昆虫分子生态学中的应用

SNP(SingleNucleotidePolymorphism)即单核苷酸多态性标记，又称单核苷酸多态性，指DNA序列中单个碱基的差别，碱基对由于排列方式不同，结合不同脱氧核苷酸对，这些核苷酸对构成密码子，密码子则以不同的排列顺序编码蛋白质，从而形成自然界多种多样的生命。SNP在基因组可以划分为两种形式：一是基因编码区的功能性突变，主要分布在基因编码区，故又称为cSNP，这类SNP较少，其变异率仅占周围序列的1/5，但因其在遗传疾病研究中具有重要意义而备受关注；二是遍布于基因组的大量碱基变异。就现在来说，SNP技术已经开始广泛用于昆虫分子生态学，包括昆虫种间鉴定，遗传图谱的分析、入侵害虫种群间亲缘关系的区分等研究。生态学的发展，SNP技术的萌芽是古人生态意识的总和，在古时，古人并不了解整个自然界，但是他们通过长期的打鱼，农牧以及狩猎积累了大量的朴素的生态学知识，比如说农作物的生长与季候的关系、常见的动物有哪些习性等等，在公园前四世纪时，希腊学者亚里士多德就曾经粗略的描述了动物有种不同的栖息地，还根据动物生活栖息地的特点将其分为了水栖和路栖，根据它的食性分成肉食和草食，还有杂食动物等等。随着人类社会的发展，人们对于生态的认识不再仅仅局限于以往的知识积累，人们通过自己的主动探究从而能够获得有关于自然界的种种知识，最后能够形成一个全面的生态学理念极其生态学系统的认知应用。本文通过描述几种技术在昆虫生态系统的运用从而得到现在科技在生态系统中的应用等等相关关系，这种应用不仅使各种技术得到提高，还对我们生态系统的探索起着极大的作用。

参考文献

[1]郭晓霞，郑哲民，于广志.同工酶在昆虫分类和进化研究中的意义[J].昆虫知识，2000，37（6）：371-374.

[2]陈辉.RFLP和RAPD遗传标记技术及其在昆虫学中的应用[J].陕西林业科技，1999（1）:49-52.

作者:汪霖 邵筠乔 单位:鞍山出入境检验检疫局 辽宁出入境检验检疫局