生物工程技术在生物净化上的应用

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【摘要】目的：探究在大小鼠生物净化中应用生物工程技术的效果。方法：自2016年1月开始，本研究中心选择常用的C57BL/6J品系小鼠作为研究A组、选择SD大鼠作为研究B组，在繁殖中应用生物工程技术；另选择一部分小鼠与大鼠作为对照A、B组，在其繁殖过程中不做任何干涉随机。每组研究对象15只。实验开始前，对所有鼠的病原微生物进行检测。应用体外受精与胚胎移植的生物工程技术，在HTF培养液中完成受精并发育至2-细胞时期，将胚胎移植入购买来并激素处理过的代孕SPF级ICR雌鼠的输卵管中。代孕ICR雌鼠生下子代，子代3周离乳后，对代孕ICR雌鼠和随机挑选的子代一只进行检测。统计研究A、B组的采集卵子数、2-细胞数与移植胚胎数。统计四组研究对象的平均每胎产仔数、存活率。统计净化前后四组研究对象的病原微生物检出率及净化率。结果：研究A、B组生物工程技术指标（采集卵子数、2-细胞数与移植胚胎数）比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；四组研究对象平均每胎产仔数与存活率比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；四组研究对象在合笼与体外受精前，均尾静脉取血进行血霉菌培养。仔鼠出生3周离乳后，每胎随机选一只与其代孕ICR母鼠一起进行尾静脉取血，进行血霉菌培养，对照A、B组的净化率均显著低于研究A、B组（P<0.05）。结论：在小鼠大鼠的生物净化中应用体外受精与胚胎移植的生物工程技术，在不影响代孕母鼠的生殖能力与子代存活率的情况下，显著地提升了净化率，达到了研究的目的，从而能为临床动物实验提供更多优质可用的实验动物。

【关键词】体外受精；胚胎移植；C57BL/6J小鼠；SD大鼠；病原微生物

1材料与方法

1.1材料

自2016年1月开始，本研究中心选择常用的C57BL/6J品系小鼠作为研究A组、选择SD大鼠作为研究B组，在繁殖中应用生物工程技术；另选择一部分小鼠与大鼠作为对照A、B组，在其繁殖过程中不做任何干涉随机。每组研究对象15只。纳入标准；所选小鼠与大鼠均为8周大；取血样进行培养，结果出现了下面五种病原菌的任意一种：金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎链球菌。排除标准：接种了同种或异种动物的肿瘤组织。

1.2方法

1.2.1体外受精

1.2.1.1应用颈椎脱臼法处死雄性C57BL/6J小鼠与SD大鼠，剖开腹腔，将两侧的睾丸与附睾取出，置于含HTF培养液的EP管中，在超净工作台中分离出附睾，将组织与血块剔除后，将附睾放置于预先经过平衡处理的HTF获能液中处理2h，以完成获能[5]。1.2.1.2体外受精前3d，对雌性C57BL/6J小鼠与SD大鼠进行注射PMSG的处理（7.5IU）。在48h后，继续对供卵的雌性注射7.5IU的hCG。14h后，经过两种激素处理过的雌鼠，颈椎脱臼处死，剖开腹腔后将双侧输卵管分离出来，置于预先经过平衡处理的HTF培养液[6]，分离出卵团。1.2.1.3选择活力旺盛的精子，将其转移进入培养卵的培养液中，置于CO2培养箱中培养6h，完成受精后洗涤受精卵。次日，选择发育到2-细胞阶段的胚胎进行移植。

1.2.2胚胎移植[7]

1.2.2.1在实验开始前两周，对成熟的SPF级ICR雄鼠进行结扎。将雄鼠用3%水合氯醛麻醉后，从睾丸处剪开皮肤，找到输精管，取一段约3mm长的组织，以保证输精管完全断开。待结扎雄鼠恢复一周后，进行试怀孕，以确定将残存在输精管中的精子排除干净，方可进行接下来的假孕操作。1.2.2.2将成熟的SPF级ICR雌鼠与结扎雄鼠以2︰1的比例进行合笼，次日上午8：00~9：00检栓，见栓的雌鼠可以用来做胚胎移植的代孕母鼠[8]。1.2.2.3代孕母鼠用水合氯醛麻醉后，用酒精消毒后置于解剖镜下，小鼠采取俯卧位，在肋骨下缘出剔除毛发，剪开一个约5mm的切口，找到脂肪垫后将卵巢与子宫一并牵引出体外[9]。固定后，在解剖镜下确定输卵管伞部的位置。用自制的移卵吸管吸取满足移植要求的2-细胞胚胎，从输卵管伞部的切口出将胚胎吹入。关腹。将代孕的ICR雌鼠放置在SPF级鼠房[10]，等待其生产。

1.2.3新生仔鼠21d离乳后，与其代孕母鼠，一同进行尾静脉取血，涂抹在培养基上进行培养。培养1周后，与细菌标准品进行对比，以确定是否发生病原微生物的感染[11]。

1.3观察指标

统计研究A、B组的采集卵子数、2-细胞数与移植胚胎数。统计四组研究对象的平均每胎产仔数、存活率。代孕ICR雌鼠生下子代，子代3周离乳后，对代孕ICR雌鼠和随机挑选的子代一只进行检测，统计净化前后四组研究对象的病原微生物检出率及净化率。

1.4统计学处理

采用SPSS18.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x-±s）表示，多组间比较采用方差分析，比较采用t检验；计数资料以率（%）表示，比较采用X2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1研究A、B组的采集卵子数、2-细胞数与移植胚胎数的对比研究A、B组生物工程技术指标（采集卵子数、2-细胞数与移植胚胎数）比较，差异均无统计学意义（P>0.05）.

2.2四组研究对象平均每胎产仔数、存活率对比对四组研究对象的平均每胎产仔数与存活率进行分析，四组比较差异均无统计学意义（P>0.05）。

2.3净化前后四组研究对象的病原微生物检出率及净化率四组研究对象在合笼与体外受精前，均尾静脉取血进行血霉菌培养。仔鼠出生3周离乳后，每胎随机选一只与其代孕ICR母鼠一起进行尾静脉取血，进行血霉菌培养即性成熟后，对照组的净化率显著低于研究组（P<0.05）。

3讨论

20世纪50~60年代，体外受精（invitrofertilization，IVF）与胚胎移植（embryotransfer，ET）开始起步[12]，经过近半个世纪的发展与进步，在小鼠与大鼠中运用这两种技术已经非常成熟并得以广泛应用，在基因敲除动物模型的构建、生物净化、克隆动物的建立中具有相当重要的作用[13]。在动物实验中，最常用的就是SPF级动物，这种动物不仅能排除病原微生物对实验与结果的影响，还可以减少对一起饲养的同类与实验人员健康的不利影响[14]。SPF级动物凭借其对饲养条件要求不高的特点受到了诸多研究人员的青睐，其中C57BL/6J小鼠与SD大鼠是动物实验中常用的两种实验动物。通常在他处动物中心购买的小鼠大鼠，原实验室能够保证动物处于SPF级。由于多种原因，如从动物中心购买后的运输过程、实验室本身的安全级别较低，有可能会使应该是无特定病原体级的小鼠与大鼠感染微生物，无法达到无特定病原体级的实验要求。在过去的时候，对小鼠大鼠进行生物净化，常用的是药物处理，但这种方式的净化率较为低下且成本高[15]。随着生物工程技术的不断发展，有研究表明，胎盘的屏障作用能够防止病原微生物从母体侧进入胎儿的体内。研究人员利用此原理，大力发展体外受精与胚胎移植技术在生物净化中的应用[14]。为此，本院选择部分病原微生物检测不合格的C57BL/6J小鼠与SD大鼠，体外受精后将胚胎移植进入代孕的SPF级ICR雌鼠内，以探究生物工程技术在生物净化中的应用。本研究中，将被微生物污染的雄性C57BL/6J小鼠与SD大鼠在实验室外处死后，取出储存成熟精子的附睾，在超净工作台中分离出精子，在HTF培养液中使精子获能[16]。对雄性进行操作的同时，对同样被污染的雌性C57BL/6J小鼠与SD大鼠，注射PMSG与hCG进行超数排卵的操作，选择形态与功能良好的卵团与运动活跃的精子一同培养完成体外受精的操作。本研究中，应用确定为SPF级ICR结扎雄鼠，与可孕的ICR雌鼠合笼诱导假孕，为接纳体外发育至2-细胞时期的胚胎做好准备[17]。　　目前，应用胚胎移植技术进行生物净化有两种策略，第一种是雌鼠与雄鼠自然合笼交配，从雌鼠的子宫角中分离受精卵，然后移植到代孕雌鼠体内。这种操作需要研究人员从一侧子宫角注射生理盐水将胚胎冲出，所获得的胚胎数目较少，而且需要大量的雌鼠与雄鼠合笼，成本比较高[18]。为了提高净化率的同时尽可能地降低成本，研究人员开发出了生物净化的第二种方法——超数排卵、体外受精与胚胎移植。这种操作方法只需要处死一只雄鼠，大大节省了实验动物的用量，使得净化的速度得以加快，种群得以快速繁殖[19]。　　本研究结果显示，研究A、B组的生物工程技术指标（采集卵子数、2-细胞数与移植胚胎数）比较，差异均无统计学意义（P>0.05）；四组研究对象平均每胎产仔数与存活率比较，差异均无统计学意义（P>0.05），这两个数据说明了生物工程技术对代孕母鼠的生育能力未产生影响，对子代的生存率与质量未产生影响；四组研究对象在合笼与体外受精前，均尾静脉取血进行血霉菌培养。仔鼠出生3周离乳后，每胎随机选一只与其代孕ICR母鼠一起进行尾静脉取血，进行血霉菌培养，对照A、B组的净化率均显著低于研究A、B组（P<0.05）。　　综上所述，在大小鼠的生物净化中应用体外受精与胚胎移植的生物工程技术，在不影响代孕母鼠的生殖能力与子代存活率的情况下，显著地提升了净化率，达到了研究的目的，从而能为临床动物实验提供更多优质可用的实验动物，在实际的研究工作中有较大的应用价值。

作者：刘勇 史嘉翊 刘洁婷 柏合 单位：牡丹江医学院